KR101146634B1 - 온주 밀감 과피 추출물의 분획물 및 그것의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 온주 밀감 과피 추출물의 분획물 및 그것의 용도를 개시한다. 구체적으로 본 발명은 온주 밀감 과피 추출물을 극성이 강한 용매층으로 분획하여 얻어진 분획물과 그 분획물의 항산화제, 피부 미백제, 자외선 차단제 및 피부 주름 개선제로서의 용도를 개시한다.

온주 밀감 과피, 추출물, 분획물, 항산화제, 피부 미백제, 자외선 차단제, 피부 주름 개선제

Description

온주 밀감 과피 추출물의 분획물 및 그것의 용도{Fraction of Citrus unshiu Fruit Peel Extract and Use Thereof}

본 발명은 온주 밀감 과피 추출물의 분획물 및 그것의 용도에 관한 것으로서, 구체적으로 본 발명은 온주 밀감 과피 추출물을 극성이 강한 용매층으로 분획하여 얻어진 분획물과 그 분획물의 항산화제, 피부 미백제, 자외선 차단제 및 피부 주름 개선제로서의 용도에 관한 것이다.

사람의 피부는 나이를 먹으면서 피부 노화와 색소 침착에 의해 끊임없이 변한다. 이러한 피부색을 결정하는 인자에는 기본적으로 인종과 지역, 성별, 나이에 따른 차이를 배제하면 기미, 주근깨와 자외선 노출로 인한 태닝과 같은 부분적 또는 전체적인 색소 침착, 그 외에 여드름 및 흉터, 각질의 분포 상태와 혈액 순환, 스트레스, 건강 상태 등이 있다. 이상의 인자들 가운데에서도 가장 중요한 인자는 색소 침착이다.

피부색에 영향을 주는 색소로는 멜라닌, 카로틴, 헤모글로빈 등이 있는데 이 중 가장 중요한 것은 멜라닌으로서 멜라닌 생합성에 영향을 미치는 가장 큰 요인은 자외선이다. 멜라닌 생합성은 아미노산의 일종인 티로신이 멜라노사이트의 멜라노좀에서 티로시나제(tyrosinase)에 의해 디하이드록시 페닐알라닌(dihydroxy phenylalanine)으로 전환되는 것을 시작으로 계속되는 일련의 과정을 거쳐 갈색(pheomelanin), 흑색(eumelanin)의 중합체로 형성된다. 이러한 생합성 과정은 멜라노좀이라는 특수한 형태의 갈색 세포내 소기관에서 진행되며 멜라닌 과립을 포함한 멜라노좀은 핵 주변 부위에서 수지상 돌기 끝부분으로 이동한 다음 케라티노사이트의 식세포작용에 의해 세포질 내로 이동하고 이들은 케라티노사이트의 핵 주변에 축적된다. 멜라닌 합성과 멜라노좀 수, 주위의 케라티노사이트로의 이동은 일차적으로는 유전적 영향을 크게 받으며 부분적으로는 호르몬과 자외선 등에 영향을 받는다. 그밖에 티로시나제 발현 및 멜라닌 합성, 전송에 관여하는 세포내 조절인자인 싸이토카인(cytokine), 구리, 아연, 철 등의 금속 이온 및 인터페론, 프로스타글란딘, 히스타민 등이 관여하는 것으로 알려져 있다(박수남 : 대한화장품학회지, 25: 77-127, 1999). 따라서 피부색을 결정짓는 멜라닌 합성을 억제하고 이에 관여하는 효소인 티로시나제 활성을 억제하여 피부 미백효과를 기대할 수 있다.

다음으로 피부색과 함께의 노화의 특징을 나타내는 인자는 주름 생성과 탄력 저하이다. 피부노화는 내인성 노화(intrinsic, chronological aging)와 광노화(phtoaging) 두 가지로 나눌 수 있다[Gilchrest BA: J. Am. Acad. Dermatol.,21, 610-613(1989)]. 내인성 노화는 연령이 증가함에 따라 생체의 생리적인 기능이 저하되어 자연적으로 유발되는 노화현상이다[Braverman IM 등: J. Invest. Dermatol., 78, 434-443(1982)]. 광노화는 피부가 자외선 등의 광에 반복적으로 노출되어 피부의 외양 또는 기능이 변화되는 것을 의미한다[Ridder GM등: J. Am. Acad. Dermatol., 25, 751-760(1991)]. 좀 더 구체적으로 말하자면, 광노화는 자외선에 의해 피부의 주요 구성물질인 지질, 단백질, 다당류 및 핵산 등이 손상되어 피부세포 및 조직이 파괴되고, 결국 피부노화 현상이 생겨나는 것이다. 특히 피부의 결합조직인 콜라겐, 히알루론산, 엘라스틴, 프로테오글라이칸, 피브로넥틴 등이 절단되어 피부 탄력에 지장을 주고 광노화의 주요 현상인 깊은 주름을 형성하게 되고 이것이 더 심해질 경우 DNA 변이에 의해 돌연변이, 암 유발, 면역기능 저하의 사태에 이르게 된다.

생체 내에서 콜라겐과 같은 세포외기질의 합성과 분해는 적절하게 조절되지만 노화가 진행되면서 특히 자외선에 만성적으로 노출되는 부위에서는 그 합성이 감소하고 분해는 촉진되는데, 자외선 등에 의해 콜라겐을 분해하는 효소인 기질금속단백질 분해효소(matrixmetalloproteinase, 이하 ‘MMP’라 칭함) 발현이 촉진되어 피부 탄력이 저하되고 주름이 형성된다.

기질 금속단백질 분해효소(MMP)는 사람 피부의 각질형성세포(keratinocyte)와 섬유아세포(fibroblast)를 비롯한 체내 다양한 세포로부터 분비되는데, 칼슘 및 아연 의존성 엔도펩티다제(Endopeptidase)로 중성 pH에서 작용하며 기질로써 여러 가지 세포외기질을 이용한다. MMP는 그 기질특이성에 따라 MMP-1, MMP-2, MMP-9로 크게 분류된다. MMP-1은 간질의 효소인 섬유아세포 타입 콜라게나제이며 기질로는 콜라겐타입 Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅶ,Ⅷ,Ⅹ 및 젤라틴이 있으며 원래 콜라겐 길이의 3/4이나 1/4 길이의 펩타이드로 잘라 비특이적인 효소(젤라티네이즈 등)의 작용이 용이하도록 한다. MMP-2는 72kD의 젤라티네이즈(A)가 이에 속하며 젤라틴, 콜라겐 타입 Ⅳ,Ⅴ,Ⅶ,Ⅹ, 엘라스틴 및 피브로넥틴을 분해한다. 또한 MMP-13은 메탈로엘라스타아제(Metalloelastase)로서 엘라스틴을 분해한다. 사람 피부의 진피층 대부분을 차지하는 콜라겐 타입 Ⅰ과 Ⅲ, 엘라스틴, 피브로넥틴 등은 피부에 강도와 장력을 부여하는데 자외선과 자유라디칼 등에 의해 비정상적으로 활성화된 MMP에 의해 단백질이 분해되면 주름과 탄력저하, 피부 처짐 등의 노화현상이 가속화된다. 특히 결합단백질 중 가장 많은 비율을 차지하는 타입Ⅰ콜라겐을 분해하는 MMP-1의 활성과 생합성을 억제함으로써 피부 결합단백질을 보호하여 주름생성과 탄력저하를 예방할 수 있다. 그러므로 자외선에 의해 세포 내에서 활성화가 유도되는 MMP 발현을 조절하거나 그 활성을 억제할 수 있는 물질의 개발이 요구되고 있다. 지금까지 피부 외용제의 소재로서 사용된 원료들은 단순히 MMP 효소 활성만을 억제하는 것이 대부분이었다.

자외선에 의한 노화를 방지하기 위하여 자외선 차단제가 함유된 제품을 피부에 직접 도포하는 방법이 가장 일반화되어 있으나, 1988년 레티노인산이 노화된 피부의 거칠음 및 잔주름 완화에 효과가 있다고 보고되었고(K.S. Weiss et al, JAMA, 259, 527-532, 1988), 전세계적으로 피부 노화를 억제 혹은 개선시키는 물질을 개발하기 위한 연구가 활발히 진행되고 있다. 이 중 비타민 A, C ,E 등 비타민류의 유도체 및 AHA(alpha -hydroxy acid)는 현재까지 알려진 대표적인 노화피부 개선 물질이다(Hermitte, Cosmetics & Toiletries, 107, 63-67, 1992, D.R. Rosenthal et al, J. Invest. Dermatol., 95, 510-515, 1990, T.D.Ditre et al, J. Invest. Dermatol, 34, 187-195, 1996). 하지만, 이들은 매우 불안정하여 사용상 문제점이 있거나, 또는 가시적 효과를 나타내기엔 다소 미흡하다는 문제점이 있다.

최근 여러 화학물질 등에 의한 피부 자극을 줄이기 위해 천연 추출물로부터 얻어진 주름완화, 미백 등의 기능을 가진 기능성 화장품(functional cosmetics)에 많은 관심이 집중되고 있다. 천연 재료는 피부에 부작용이 적을 뿐 아니라, 최근 천연 재료를 이용한 피부 외용제에 대한 소비자들의 호응이 높아짐에 따라 광노화 방지 화장료 조성물 원료로서 개발가치가 한층 늘어나고 있다. 예를 들어 일본특허공개 평9-672662 는 히알우로니다제(Hyaluronidase)억제 효능을 가지는 해초류 추출물들에 관하여 기술하고 있다. 일본특허공개 평10-85905은 와카메(Wakame)로부터 추출된 푸코이단 (Fucoidan)의 피부감촉 개선효과에 관하여 기술하고 있다. 일본특허공개 평2-245087은 사르가숨(Sargassum)속 추출물의 항산화 효과에 관하여 기술하고 있다. 일본특허공개 평3-294384는 히지키아(Hizikia)속으로부터 추출된 항산화 조성물에 관하여 기술하고 있다. 일본특허공개 평7-10769는 수렴효과(astringent effect)가 있는 페오피시에강(Phaeophyceae) 추출물에 관하여 기술하고 있다. 미국특허 제5,508,033호는 감귤과피류를 포함하는 항라디칼 활성이 있는 화장료에 관하여 기술하고 있고, 일본 공개특허 2008-056643호는 항산화활성, 세포대사활성, 피부노화방지 등의 기능을 갖는 감귤과피(Sargassum fulvellum) 추출물 함유 화장료가 개시되어 있으며, 일본 공개특허 1998-330280호에는 콜라겐 생산 촉진, 주름 또는 탄력성 저하를 억제하는 감귤과피 추출물 함유 화장료가 개시 되어 있다. 국내 특허 제810134호에는 감귤과피 또는 톳을 수세 및 탈염하는 단계; 엔도-β1,4-글루카나제, 알긴산 리아제(Alginic acid lyase) 및 엑소셀룰로즈(exocellulose)로 이루어진 1차 효소분해하는 단계; 및 아라바나제(Arabanase), 셀루라제 및 β1,4-글루카나제로 이루어진 2차 효소로 분해하는 일련의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 감귤과피 또는 톳의 효소 분해물 및 이의 제조방법이 개시되어 있고, 이를 화장료 등으로 이용할 수 있다고 개시되어 있다. 국내공개특허 2009-27387호는 피부 주름 및 탄력 개선용 화장료로 사용 가능한 괭생이 감귤과피 추출물을 개시한다.

이에, 본 발명자들은 여러 천연물들에 있어서 미백 및 노화 방지 화장료 조성물로의 응용 가능성을 연구한 결과, 온주 밀감 과피를 선정하여 추출물을 제조하고 여러 용매로 분획하는 과정에서 항산화 활성, 멜라닌 생성 억제 활성 등이 높은 분획물을 얻을 수 있었다.

본 발명의 기술적 과제는 높은 항산화 활성, 미백 활성, 자외선 차단 활성, 피부 탄력 개선 활성 및/또는 피부 주름 개선 활성을 가지는 온주 밀감 과피 추출물의 분획물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 기술적 과제는 상기 분획물을 포함하는 피부 항산화용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 기술적 과제는 상기 분획물을 포함하는 자외선 차단용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 기술적 과제는 상기 분획물을 포함하는 피부 주름 개선용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명자들은 온주 밀감(Citrus unshiu) 과피를 80% 에탄올로 추출하여 동결건조 분말(이하 "온주 밀감 과피의 80% 에탄올 추출물")을 얻고, 그 분말을 물, 메탄올 및 에탄올의 혼합물(고극성 용매층)과 헥산, 디클로로메탄 및 클로로포름의 혼합물(저극성 용매층)로 분획하였을 때, 온주 밀감 과피의 고극성 용매층의 분획물의 경우 상기 온주 밀감 과피의 80% 에탄올 추출물이나 온주 밀감 과피의 저극성 용매층의 분획물에 비하여, 월등하게 높은 항산화 활성, 미백 활성, 자외선 차단 활성, 피부 탄력 개선 활성 및 피부 주름 개선 활성을 가짐을 확인할 수 있었다.

또한 본 발명자들이 확인한 바에 따르면, 상기 온주 밀감 과피의 고극성 용매층의 분획물은 온주 밀감 과피의 저극성 용매층의 분획물에 비하여 몰식자산을 매우 높은 함량으로 함유하고 있었는데, 이 몰식자산은 항산화 활성, 주름 개선 활성, 미백 개선 활성 등을 갖는 것으로 알려진 물질이다(Luigi Sartor et al., Biochemical Pharmacology Vol 64, Issue 2, 15 July 2002, Pages 229-237; Sundaram Jagan et al., Molecular and Cellular Biochemistry (2008) 319:51-59, October 21, 2008).

본 발명은 이러한 실험 결과에 기초하여 제공되는 것이다.

일 측면에 있어서, 본 발명은 항산화 활성, 미백 활성, 자외선 차단 활성, 및/또는 피부 주름 개선 활성을 가지는 온주 밀감 과피 추출물의 극성이 강한 용매층의 분획물로 파악할 수 있다.

본 명세서에서, "온주 밀감 과피 추출물"이란 추출 방법을 불문하고, 추출 대상을 온주 밀감 과피로 하고, 추출 용매를 물, 탄소수 1~5의 알콜 또는 이들의 혼합 용매로 하여 상기 추출 대상을 상기 추출 용매에 침지시켜 얻어진 추출물을 의미하며, 그 추출물로부터 추출 용매가 제거된 농축된 액상의 추출물 또는 고형상의 추출물을 포함하는 의미이다. 추출 방법을 불문하므로 추출 대상인 온주 밀감 과피를 추출 용매에 침지시키는 단계를 통하여 추출하는 한, 추출 방법은 냉침, 환류, 가온, 초음파 등 임의의 방식이 모두 적용될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 그럼에도 상기 "온주 밀감 과피 추출물"은 바람직하게는 추출 대상인 온주 밀감 과피를 물과 에탄올의 혼합 용매 특히 80% 에탄올로 추출하여 얻어진 추출물을 의미한다.

또한 본 명세서에서, "온주 밀감 과피 추출물의 극성이 강한 용매층의 분획물"이란 상기 정의된 온주 밀감 과피 추출물을, 물, 탄소수 1~5의 알콜 및 이들의 혼합 용매로 구성된 군에서 선택된 극성이 강한 용매와 n-헥산, 메틸렌클로라이드, 클로로포름 및 이들의 혼합 용매로 구성된 군에서 선택된 극성이 약한 용매로 분획하였을 때 얻어지는 극성이 강한 용매층의 분획물을 의미하며, 그 분획물로부터 분획 용매가 제거된 농축된 액상의 분획물 또는 고형상의 분획물을 포함하는 의미이 다. 바람직하게는 추출 대상인 온주 밀감 과피를 물과 에탄올의 혼합 용매 특히 80% 에탄올로 추출하여 얻어진 추출물을 물, 메탄올 및 에탄올로 구성된 혼합 용매와 메틸렌클로라이드, 클로로포름 및 n-헥산으로 구성된 혼합 용매로 분획하였을 때 얻어지는 물, 메탄올 및 에탄올로 구성된 혼합 용매층의 분획물을 의미한다. 가장 바람직하게는 80% 에탄올로 추출하고 그 추출 용매를 제거하여 얻어진 추출물을, 물, 메탄올 및 에탄올이 3:4:3의 부피비로 구성된 혼합 용매와 메틸렌클로라이드, 클로로포름 및 n-헥산이 1:2:7의 부피비로 구성된 혼합 용매로 분획하였을 때 얻어지는 물, 메탄올 및 에탄올의 혼합 용매층의 분획물을 의미한다.

또한 본 명세서에서, "항산화 활성"이란 활성산소종 예컨대 일중항산소(singlet oxygen), 초과산화이온(superoxide anion), 수산화자유기, 과산화수소(hydrogen peroxide) 등의 제거 활성을 의미하며, 바람직하게는 아래의 실험예에서 항산화 활성을 슈퍼옥사이드 소거 활성 및 DPPH 라디칼 소거 활성 통하여 살펴봤다는 점에서 슈퍼옥사이드 소거 활성 및/또는 DPPH 라디칼 소거 활성을 의미한다.

또한 본 명세서에서, "미백 활성"은 멜라닌 생성 억제 활성으로 정의된다.

다른 측면에 있어서, 본 발명은 전술한 바의 본 발명의 온주 밀감 과피 추출물의 극성이 강한 용매층의 분획물을 유효성분으로 하는 항산화제 조성물에 관한 것이다.

본 명세서에서 "유효성분"이란 단독으로 목적하는 활성을 나타내거나 또는 그 자체는 활성이 없는 담체와 함께 활성을 나타낼 수 있는 성분을 의미한다.

또한 본 명세서에서, "항산화"는 활성산소종이 일으키는 질병의 병리적 증상의 개선, 치료 및 그러한 병리적 증상의 발병 억제/지연을 의미한다. 활성산소종이 일으키는 질병으로서는 동맥경화, 중풍, 심근 경색, 기미, 주근깨, 잔주름, 암, 백혈병, 교원병(collagen disease)(膠原病, 피부, 관절, 혈관 등 신체의 결합조직에 이상이 생기는 질병), 남성의 생식 기능 저하, 뇌졸증, 심근경색, 당뇨병성 혈관장애, 고지혈증, 급성염증, 류마티스 질환, 알콜성 간염 등을 들 수 있다(Harrison et al, Am J Cardiol, 2003. 2; 91(3A): 7A-11A; Behrend et al, Biochem Soc Trans, 2003. 12; 31: 1441-1444; Agarwal et al, Fertil Steril, 2003. 4; 79(4): 829-843; (Orr, W. C. and Sohal, R.S., Science , 1994, 263, 1128-1130; Sohal, R. S. et al ., J. Biol. Chem ., 1995, 270, 15671-15674). 바람직하게는 본 발명의 항산화제 조성물이 주로 피부 외용제 조성물로 적용될 것이란 점을 고려할 때, "항산화"는 활성 산소종이 일으키는 피부와 관련된 질병 즉 기미, 주근깨 및 주름의 개선, 치료 및 그러한 증상의 발병 억제/지연을 의미한다.

본 발명의 항산화제 조성물에 있어서, 그 유효성분인 온주 밀감 과피 추출물의 극성이 강한 용매층의 분획물은 항산화 활성을 나타낼 수 있는 한 임의의 양(유효량)으로 포함될 수 있는데, 통상적인 유효량은 조성물 전체 중량을 기준으로 할 때 0.001 중량 % 내지 99.900 중량 % 범위 내에서 결정될 것이다. 여기서 "유효량"이란 활성산소종이 일으키는 증상의 개선, 치료, 또는 이러한 증상의 발현 억제/지연을 유도할 수 있는 유효성분의 양을 말한다. 이러한 유효량은 당업자의 통상의 능력 범위 내에서 실험적으로 결정될 수 있다.

또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 전술한 바의 본 발명의 온주 밀감 과피 추출물의 극성이 강한 용매층의 분획물을 유효성분으로 하는 피부 미백제 조성물로 파악될 수 있다.

본 명세서에서, "피부 미백"이란 멜라닌 생성이 억제됨에 따른 결과로서 이해된다. 멜라닌은 티로시나제(tyrosinase)에 의하여 생성되는데, 티로신(tyrosine)이 산화되어 도파(DOPA, 3,4-dihydro xyphenylalanine)로, 도파가 다시 산화되어 도파퀴논(dopaquinone)으로 바뀐 후, 비효소적인 산화반응을 거쳐 만들어진다. 이러한 멜라닌은 자외선을 차단하여 진피 이하의 피부 기관을 보호해주는 동시에, 피부 생체 내에 생겨난 자유 라디칼 등에 의한 피부내 단백질과 유전자들의 손상을 보호해주는 유용한 역할을 하지만, 멜라닌이 필요 이상으로 많이 생성되면 기미나 주근깨, 검버섯 등과 같은 과색소침착증을 유발하고 피부 노화를 가져온다. 따라서 "피부 미백"이란 멜라닌의 증가에서 비롯되는 증상 즉 기미, 주근깨, 검버섯 및/또는 피부노화의 개선으로 이해될 수 있다.

본 발명의 피부 미백제 조성물에 있어서, 그 유효성분의 유효량과 관련하여서는 본 발명의 항산화제 조성물과 관련하여 설명한 바가 그대로 준용된다.

또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 전술한 바의 본 발명의 온주 밀감 과피 추출물의 극성이 강한 용매층의 분획물을 유효성분으로 하는 자외선 차단제 조성물로 파악될 수 있다.

본 명세서에서, "자외선 차단"이란 자외선(UVA 및/또는 UVB)에 의하여 발생하거나 악화(惡化)되는 증상, 예컨대 피부암, 주름, 멜라닌 합성 촉진, 홍반, 주근 깨, 부종 등의 증상을 개선시킬 수 있는 효능으로서 정의된다. 그러므로 예컨대 본 발명의 자외선 차단제 조성물은 자외선에 의하여 발생하는 피부암의 예방용 조성물이나 자외선에 의하여 악화되는 피부암의 경감용 조성물을 포함하는 의미로서 간주된다.

본 발명의 자외선 차단제 조성물에 있어서도, 그 유효성분의 유효량과 관련하여서는 본 발명의 항산화제 조성물과 관련하여 설명한 바가 그대로 준용된다.

또 다른 측면에 있어서, 전술한 바의 본 발명의 온주 밀감 과피 추출물의 극성이 강한 용매층의 분획물을 유효성분으로 하는 피부 주름 개선제 조성물로 파악될 수 있다.

피부 주름은 일반적으로 자외선, 활성산소 등 여러 유해물질에 의한 피부 탄력을 유지하는 콜라겐(collagen)이나 엘라스틴(elastin)의 감소가 그 원인이 되어 발생하는데, 섬유아세포가 이 콜라겐이나 엘라스틴의 생성에 관여하는 것으로 알려져 있다(Ingrid Emerit et al. Free radical and aging, 1992; Arther K. Balin et al. Aging and the skin, 1998; Hermitte, Cosmetics amp, Toiletries, 107, 63-67, 1992; D.R. Rosenthal et al, J. Invest. Dermatol., 95, 510-515, 1990; T.D.Ditre et al, J. Invest. Dermatol, 34, 187-195, 1996).

전술하였듯이, 본 발명의 온주 밀감 과피 추출물의 극성이 강한 용매층의 분획물은 피부 주름의 원인이 되는 자외선, 활성산소 등의 차단?제거 효과를 가지고 있으며, 또한 아래의 실험예는 온주 밀감 과피의 80% 에탄올 추출물에 비해서는 5배 높은 농도 그리고 온주 밀감 과피의 저극성 용매층의 분획물에 비하여서는 20배 높은 농도에서, 콜라겐이나 엘라스틴의 생성에 관여하는 섬유아세포에 대해 세포독성을 전혀 나타내지 않음을 보여주고 있다.

특히 아래의 실험예는 임상실험을 통하여 본 발명의 온주 밀감 과피 추출물의 극성이 강한 용매층의 분획물이 피부 주름을 감소시키고 피부 탄력을 개선하였음을 보여주고 있다.

전술한 바에 기초할 때, 본 명세서에 있어서, 상기 "피부 주름 개선"은 피부 주름 감소, 억제, 예방뿐만 아니라 피부 탄력의 증가를 포함하는 의미로서 정의된다.

본 발명의 주름 개선제 조성물에 있어서도, 그 유효성분의 유효량과 관련하여서는 본 발명의 항산화제 조성물과 관련하여 설명한 바가 그대로 준용된다.

본 발명의 항산화제 조성물, 피부 미백제 조성물, 자외선 차단제 조성물 및 피부 주름 개선제 조성물(이하 "본 발명의 조성물")은 구체적인 양태에 있어서, 화장품 조성물로서 파악될 수 있다.

본 발명의 조성물이 화장품 조성물로서 파악될 경우, 그 화장품 조성물은 다양한 형태로 제조될 수 있는데, 예컨대, 에멀젼, 로션, 크림(수중유적형, 유중수적형, 다중상), 용액, 현탁액(무수 및 수계), 무수 생성물(오일 및 글리콜계), 젤, 마스크, 팩 또는 분말 등의 형태로 제조될 수 있다.

본 발명의 조성물은 그 유효성분인 온주 밀감 과피 추출물의 극성이 강한 용매층의 분획물 이외에 화장품 제제에 있어서 수용가능한 담체를 포함할 수 있다.

여기서 "화장품 제제에 있어서 수용가능한 담체"란 화장품 제제에 포함될 수 있는 이미 공지되어 사용되고 있는 화합물 또는 조성물이거나 앞으로 개발될 화합물 또는 조성물로서 피부와의 접촉시 인체가 적응 가능한 이상의 독성, 불안정성 또는 자극성이 없는 것을 말한다.

상기 담체는 본 발명의 피부 미백용 화장품 조성물에 그것의 전체 중량에 대하여 약 1 중량 % 내지 약 99.99 중량 %, 바람직하게는 조성물의 중량의 약 50 중량% 내지 약 99 중량 %로 포함될 수 있다.

그러나 상기 비율은 본 발명의 화장품의 제조되는 전술한 바의 형태에 따라 또 그것의 구체적인 적용 부위(얼굴이나 손)나 그것의 바람직한 적용량 등에 따라 달라지는 것이기 때문에, 상기 비율은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 안 된다.

한편, 상기 담체로서는 알코올, 오일, 계면활성제, 지방산, 실리콘 오일, 습윤제, 보습제, 점성 변형제, 유제, 안정제, 자외선 차단제, 발색제, 향료 등이 예시될 수 있다.

상기 담체로서 사용될 수 있는 알코올, 오일, 계면활성제, 지방산, 실리콘 오일, 습윤제, 보습제, 점성 변형제, 유제, 안정제, 자외선 차단제, 발색제, 향료 로 사용될 수 있는 화합물/조성물 등은 이미 당업계에 공지되어 있기 때문에 당업자라면 적절한 해당 물질/조성물을 선택하여 사용할 수 있다.

한편, 본 발명의 조성물은 다른 구체적인 양태에 있어서 약제학적 조성물로 파악될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 통상은 외용제 제형으로 피부에 국소적으로 직 접 투여된다.

또 본 발명의 약제학적 조성물은 제제화할 경우에는 통상적으로 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제 및 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제제화할 수 있으며, 크림, 로션, 연고(반고형의 외용약), 마이크로로에멀젼, 젤, 페이스트, 경피제제(TTS)(예컨대 패치제, 붕대 등) 등으로 제형화될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 1일 투여량은 통상 0.001 ~ 150 mg/kg 체중 범위이고, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 본 발명의 약제학적 조성물의 실제 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중, 및 환자의 중증도 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되어지는 것이므로 상기 투여량은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 아니된다.

본 발명의 조성물은 또 다른 구체적인 양태에 있어 비누 조성물로서 파악될 수 있다.

본 발명의 조성물이 비누 조성물로서 파악될 경우에, 본 발명의 비누 조성물은 비누 기재에 유효성분인 온주 밀감 과피 추출물의 극성이 강한 용매층의 분획물을 포함하여 제조될 수 있으며, 첨가제로서 피부 보습제, 유화제, 경수연화제 등을 포함하여 제조될 수 있다.

상기 비누 기재로서는 야자유, 팜유, 대두유, 파마자유, 올리브유, 팜핵류 등의 식물유지 또는 우지, 돈지, 양지, 어유 등의 동물유지 등이 사용될 수 있고, 상기 피부 보습제로서는 글리세린, 에리트리톨, 폴리에틸렌글리콜, 프로필렌글리 콜, 부틸렌글리콜, 펜틸렌글리콜, 헥실글리콜, 이소프로필미리스테이트, 실리콘 유도체, 알로에베라, 솔비톨 등이 사용될 수 있으며, 상기 유화제로서는 천연오일, 왁스 지방알콜, 탄화수소류, 천연식물 추출물 등이 사용될 수 있고, 상기 경수연화제로서는 테트라소듐 이디티에이 등이 사용될 수 수 있다.

본 발명의 비누 조성물은 또한 첨가제로서 항균제, 분산제, 거품억제제, 용매, 물때 방지제, 부식 방지제, 향료, 색소, 금속 이온봉쇄제, 산화방지제, 방부제 등을 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 비누 조성물에 있어서, 비누 기재나 첨가제는 당업계에 일반적으로 사용되고 있는 함량으로 포함될 수 있는데, 비누 기재는 일반적으로 비누 조성물의 전체의 함량을 기준으로 하였을 때 99.9 중량 % 내지 50 중량 %로 첨가될 수 있으며, 첨가제는 1 중량 % 내지 20 중량 %로 첨가될 수 있다.

전술한 바와 같이, 본 발명은 높은 항산화 활성, 미백 활성, 자외선 차단 활성, 피부 탄력 개선 활성 및/또는 피부 주름 개선 활성을 가지며, 몰식 자산 함량이 높은 온주 밀감 과피 추출물의 분획물을 제공할 수 있다.

본 발명의 온주 밀감 과피 추출물의 분획물은 피부 외용제 특히 화장품으로 제제화되어 항산화제, 자외선 차단제, 피부 미백제, 피부 주름 개선제 등의 용도로 사용될 수 잇다.

이하, 실시예 및 실험예를 통해 본 발명을 좀 더 구체적으로 설명한다. 단, 이들 실시예 및 실험예는 본 발명의 예시적인 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예 및 실험예에 국한되는 것은 아니다.

<실시예> 온주 밀감 과피 추출물의 제조 및 그 분획물의 제조

<실시예 1> 온주 밀감 과피 추출물 제조

세절하여 음건한 감귤(온주 밀감) 과피을 80%(V/V) 에탄올 수용액으로 5시간씩 3회 환류추출하고 냉침한 후, 와트만(Whatman) #5 여과지로 여과하였다. 여과된 추출물은 50℃ 이하에서 감압농축 및 동결건조시켜 감귤과피 추출물을 제조하였다.

<실시예 2> 온주 밀감 과피 추출물의 극성이 강한 용매층의 분획물 제조

실시예 1에서 수득한 감귤과피 추출물의 동결건조물 10g을 정제수, 메탄올 및 에탄올을 3:4:3의 부피비로 혼합한 고극성 혼합용매 1ℓ에 고르게 분산 용해한 후, 헥산, 디클로로메탄, 클로로포름을 7:2:1의 부피비로 혼합한 저극성 혼합용매 1ℓ와 혼합 교반하였다. 교반한 혼합액을 실온에서 밀봉상태로 8시간 정치한 후 저극성 혼합용매층과 고극성 혼합용매층을 조심스럽게 분리하였다. 회수된 고극성 혼합용매층은 와트만(Whatman) #5 여과지로 여과한 후 50℃ 이하에서 감압농축 및 동결건조시켜 몰식자산 고함량 감귤과피 추출물을 제조하였다.

<실시예 3> 온주 밀감 과피 추출물의 극성이 약한 용매층의 분획물 제조

상기 실시예 2에서 분리된 저극성 혼합용매층을 와트만(Whatman) #5 여과지로 여과한 후 30℃ 이하에서 감압농축 및 동결건조시켜 몰식자산 저함량 감귤과피 추출물을 제조하였다.

<실험예> 온주 밀감 과피 추출물 및 그 분획물의 생리활성 실험

<실험예 1> 섬유아세포에 대한 세포독성 실험

상기 실시예 1 내지 3에서 수득한 감귤과피 추출물 및 그 분획물의 섬유아세포에 대한 세포독성을 평가하였다.

섬유아세포(fibroblast)를 24-웰 시험 플레이트에 1x10⁵개씩 넣고 24시간 동안 부착시켰다. 각 웰을 PBS(Phosphate buffered saline)로 1회 세척하고 각 웰에 세포배양 배지(DMEM에10% FBS가 첨가된 것) 1㎖와 적절한 농도로 희석한 상기 각 실시예의 시료를 처리한 후 24시간 동안 배양하였다. 24시간이 지나면 배지를 제거하고, 각 웰 당 세포배양 배지 500㎕ 배지와 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) 용액(2.5㎎/㎖) 60㎕를 넣은 후 2시간 동안 37℃ CO₂ 배양기에서 배양하였다. 배지를 제거하고 이소프로판올-HCl(0.04N)을 500㎕씩 넣어주었다. 5분간 진탕하여 세포를 용해시키고 상등액 100㎕씩을 96-웰 시험 플레이트에 옮긴 후, 마이크로플레이트 판독기에서 565㎚ 흡광도를 측정하였다. 아래의 식에 의해 세포생존율(%)을 측정하였으며, 세포의 생존에 영향을 미치지 않는 시료의 농도를 결정하여 아래의 표 1에 나타내었다.

세포생존율(%) =〔(St-Bo)/(Bt-Bo)〕X 100

Bo : 세포배양배지만을 발색 반응한 웰의 565㎚ 흡광도

Bt : 시료를 처리하지 않고 발색 반응한 웰의 565㎚ 흡광도

St : 시료를 처리하고 발색 반응한 웰의 565㎚ 흡광도

세포의 생존에 영향을 미치지 않는 시료의 농도

시료명	100% 세포 생존 농도
실시예 1의 추출물	0.1%
실시예 2의 추출물	0.5%
실시예 3의 추출물	0.025%

상기 표 1에서 확인할 수 있듯이, 실시예 1의 감귤과피 추출물의 100% 세포생존 농도는 0.1%로 통상의 식물 추출물과 유사한 세포 독성을 가지는 것으로 확인되었다. 또한 실시예 3의 극성이 약한 용매층의 분획물은 100% 세포 생존 농도가 0.025%로 세포 독성이 크게 증가한 것을 확인하였다. 이에 비해 실시예 2의 극성이 강한 용매층의 분획물은 100% 세포 생존 농도가 0.5%로 세포독성이 크게 개선되어 상대적으로 피부 자극 유발 가능성이 낮고 안전한 것으로 확인되었다.

<실험예 2> NBT법을 이용한 항산화 효과 측정 실험

상기 실시예 1 내지 3에서 수득한 감귤과피 추출물과 그 분획물의 항산화 효과를 확인하기 위해 실험실 조건에서 항산화제로 잘 알려진 BHT(Butylated hydroxytoluene)를 비교 샘플로 하고 NBT(Nitro Blue Tetrazolium)법을 이용하여 항산화 활성을 측정하였다.

항산화 효과를 측정하기 위해서 크산틴과 크산틴옥시다제에 의해 생성되는 활성산소를 NBT법에 의해 측정하고 피검물질이 활성산소를 제거하는 효과, 즉 활성산소 소거효과를 평가하였다. 활성산소는 크산틴옥시다제에 의해 크산틴으로부터 생성된다. 이 활성산소가 니트로블루테트라졸리움(Nitro Blue Tetrazolium;NBT)과 반응하여 생성되는 청색을 파장 560nm에서 측정함으로써 활성산소 소거율을 측정할 수 있다.

측정 방법으로서 0.05M Na2CO3(2.4ml), 3mM 크산틴 용액(0.1ml), 3mM EDTA 용액(0.1ml), BSA 용액(0.1ml), 0.72mM NBT 용액(0.1ml)를 가하고 여기에 각 시료 용액 0.1ml을 첨가하고 25℃에서 10분간 방치한다. 크산틴 옥시다제 용액(0.1ml)을 가하여 빨리 교반하고 25℃에서 20분간의 배양을 개시한다. 그 후 6mM CuCl₂ 용액(0.1ml)을 가하여 반응을 정지시키고 560nm에서의 흡광도 St를 측정한다. 공시험은 시료 용액 대신에 증류수를 사용한 것을 상기와 똑같이 조작해 흡광도 Bt를 측정한다. 그리고 효소를 사용하지 않고 시료 용액만을 첨가한 경우의 흡광도(So) 및 효소와 시료 용액 모두를 첨가지 아니한 경우의 흡광도(Bo) 모두 동량의 증류수를 사용하여 상기와 동일한 방법으로 측정하였다.

항산화 효과를 아래의 식에 의하여 산출하였으며, 그 결과는 아래의 표 2에 나타내었다.

억제율(%) = 〔1-(St-So)/(Bt-Bo)〕X 100

St : 시료 용액의 효소 반응 후의 560nm에서의 흡광도

Bt : 공시험 용액의 효소 반응 후의 560nm에서의 흡광도

So : 시료 용액의 효소 무첨가시 반응 전의 560nm에서의 흡광도

Bo : 공시험 용액의 효소 무첨가시 반응 전의 560nm에서의 흡광도

항산화 효과

시료명	함량	항산화 효과(%)
실시예 1의 추출물	0.5중량%	42.1%
실시예 1의 추출물	0.1중량%	16.2%
실시예 2의 분획물	0.1중량%	92.7%
실시예 2의 분획물	0.02중량%	43.6%
실시예 3의 분획물	0.5중량%	48.3%
실시예 3의 분획물	0.1중량%	21.2%
BHT	0.1중량%	89.3%

상기 표 2에서 확인할 수 있듯이, 실시예 1의 온주 밀감 과피 추출물 및 실시예 3의 극성이 약한 용매층의 분획물은 BHT보다 낮은 미약하고 유사한 항산화력을 갖고 있음이 확인되었다. 하지만, 실시예 2의 극성이 강한 용매층의 분획물은 BHT보다 우수한 항산화력을 갖고 있음이 확인되었다. 즉 실시예 2의 극성이 강한 용매층의 분획물은 항산화 활성이 현저히 개선되었음을 알 수 있다.

<실험예 3> 자유라디칼 소거 활성 측정 실험

실시예 1 내지 3에서 수득한 감귤과피 추출물 및 그 분획물의 자유라디칼 소거활성을 측정하기 위해 실험실 조건에서 BHT를 비교샘플로 하고 DPPH법을 이용하여 자유라디칼 소거 활성을 측정하였다.

DPPH법은 DPPH(2,2-Di(4-tert-octylphenyl)-1-picrylhydrazyl free radical)라는 유리기를 사용하여 환원력에 의한 자유라디칼 소거 활성을 측정한다. 피검물질에 의해 DPPH가 환원되어 흡광도가 감소하는 정도를 공시험액의 흡광도와 비교하여 파장 560nm에서 자유라디칼 소거율을 측정한다.

DPPH 자유라디칼 소거 활성 측정을 위하여 0.1%, 0.01%, 0.001% 농도의 각 시료를 준비하였다. 상기 농도의 시료를 96웰 플레이트에 각각 넣고, 여기에 100uM 메탄올용액으로 제조된 DPPH를 첨가하여 용액의 총 부피가 200㎕가 되도록 하였다. 이것을 37℃에서 30분간 방치한 후 560nm에서 흡광도를 측정하였다. 자유라디칼 소거 활성(%)을 아래의 식으로 산출하여 아래의 <표 3>에 나타내었다.

자유라디칼 소거활성(%)= 100-(B/A)X100

A: 본 발명의 감귤과피 추출물을 처리하지 않은 대조군 웰의 흡광도

B: 본 발명의 감귤과피 추출물을 처리한 실험군 웰의 흡광도

자유라디칼 소거 활성 측정

시료명	함량	항산화 효과(%)
실시예 1의 추출물	0.5중량%	19.3%
실시예 1의 추출물	0.1중량%	9.7%
실시예 2의 분획물	0.1중량%	84.6%
실시예 2의 분획물	0.02중량%	22.2%
실시예 3의 분획물	0.5중량%	22.3%
실시예 3의 분획물	0.1중량%	12.1%
BHT	0.1중량%	81.0%

상기 표 3에서 확인할 수 있듯이, 실시예 1의 온주 밀감 과피 추출물 및 실시예 3의 극성이 약한 용매층의 분획물은 BHT보다 낮은 미약하고 유사한 항산화력을 갖고 있음이 확인되었다. 하지만, 실시예 2의 극성이 강한 용매층의 분획물은 BHT보다 우수한 항산화력을 갖고 있음이 확인되었다. 즉 실시예 2의 극성이 강한 용매층의 분획물은 항산화 활성이 현저히 개선되었음을 알 수 있다.

<실험예 4> 멜라닌 생성 억제효과 측정 실험

상기 실시예 1 내지 3에서 수득한 온주 밀감 과피 추출물 및 그 분획물의 미백효과를 확인하기 위해 B16F1 멜라노싸이트에 대한 멜라닌 생성 억제 정도를 확인하였다.

본 실시예에 사용된 B16F1 멜라노싸이트는 마우스에서 유래한 세포 균주이며, 멜라닌이라는 흑색색소를 분비하는 세포이다. 이 세포의 인공배양 중에 시료를 처리하여 멜라닌 색소가 감소하는 정도를 비교, 평가하였다. 본 실험예에 사용된 B16F1 멜라노싸이트는 ATCC(American Type Culture Collection, 기탁번호: 6323)로부터 분양받아 사용하였다.

B16F1 멜라노싸이트의 멜라닌 생합성 억제 효과 측정은 다음과 같이 행하였다. B16F1 멜라노싸이트를 6 웰 플레이트에 각 웰당 2×10⁶ 농도로 분주하고 세포를 부착시킨 후 독성을 유발하지 않는 농도로 시료를 처리하여 72시간 동안 배양하였다. 72시간 배양 후 세포를 트립신-EDTA로 떼어낸 후 세포수를 측정한 다음 원심분리하여 세포를 회수하였다. 세포내 멜라닌의 정량은 로탄(Lotan : Cancer Res., 40: 3345-3350, 1980)의 방법을 약간 변형하여 실시하였다. 셀 펠릿을 PBS로 1회 세척한 후 균질화 완충액(50mM 소듐 포스페이트, pH 6.8, 1% Triton X-100, 2 mM PMSF) 1㎖를 첨가하여 5분간 와류하여 세포를 파쇄하였다. 원심분리(3,000rpm, 10분)하여 얻은 세포 여액에 1N NaOH(10% DMSO)를 첨가하여 추출된 멜라닌을 용해한 후 마이크로 플레이트 판독기로 405nm에서 멜라닌의 흡광도를 측정한 다음 멜라닌을 정량하여 시료의 멜라닌 생성 저해율(%)을 측정하였다.

B16F1 멜라노싸이트의 멜라닌 생성 저해율(%)은 아래의 식에 의하여 계산하였으며, 멜라닌 생성을 50% 저해하는 물질의 농도 값(IC₅₀값)으로 시료의 멜라닌 생성 저해율을 아래의 <표 4>에 나타내었다.

저해율 (%) = [(A-B)/A]×100

A : 시료를 첨가하지 않은 웰의 멜라닌 양

B : 시료를 첨가한 웰의 멜라닌 양

멜라닌 생성 저해율

시료명	멜라닌 합성 저해 효과 (IC50)
실시예 1의 추출물	0.55%
실시예 2의 분획물	0.23%
실시예 3의 분획물	0.81%
알부틴	0.46%
유용성 감초 추출물	0.04%

B16F1 멜라노싸이트의 멜라닌 생성 억제 효과를 시험한 결과, 상기 표 4에서 확인할 수 있듯이 실시예 2의 극성이 강한 용매층의 분획물의 IC₅₀값은 0.23%로 나타나 기존에 알려진 미백제인 유용성 감초 추출물보다는 미약하지만, 알부틴보다 우수한 효과를 나타내었다. 하지만, 실시예 1 추출물의 IC₅₀값은 0.55%, 실시예 3의 분획물의 IC₅₀값은 0.81%로 나타나 알부틴보다 낮은 멜라닌 생성 억제 효과를 나타내었다.

즉 실시예 2의 몰식자산 고함량 감귤과피 추출물은 미백 활성이 현저히 개선되었음을 알 수 있다.

<실험예 5> 자외선 차단 효과 실험

상기 실시예 1 내지 3에서 수득한 감귤과피 추출물 및 그 분획물의 자외선 차단 효과를 UV 조사 및 시료 첨가 후 MMP-1 농도를 효소면역시험법(ELISA)으로 측정하여 평가하였다.

UV 챔버를 이용하여 인간 진피 섬유아세포에 UVA를 6.3J/㎠의 에너지로 조사하였다. 자외선 조사량과 배양 시간은 예비실험을 통하여 섬유아세포에서 MMP 발현량이 최대가 되는 조건을 확립하였다. 음성 대조군은 은박지로 싸서 UVA 환경에 같은 시간을 유지시켰다. UVA 방출량은 UV 라디오미터를 이용하여 측정하였다. UVA가 조사되는 동안의 세포는 이전에 분주된 배지 그대로이고 UVA를 조사한 후 시료가 첨가된 배지로 교환하여 24시간 배양 후 배지를 회수하여 96웰에 코팅하였다. 일차항체(MMP-1 (Ab-5) 단일클론항체)를 처리하고 37℃에서 60분간 반응시켰다. 이차항체인 안티마우스 IgG(whole mouse, alkaline phosphatase conjugated)를 다시 60분 정도 반응시킨 후, 알칼린 포스파타제 기질 용액(1㎎/㎖ ρ-나이트로페닐인산 in 다이에탄올아민 완충용액)을 상온에서 30분간 반응시키고 마이크로플레이트 판독기로 405nm에서 흡광도를 측정하여 아래의 표 5에 나타내었다. 대조군으로는 시료를 첨가하지 않은 것을 사용하였다.

시료명	함량	MMP-1 발현억제율
대조군	-	-
실시예 1의 추출물	0.1 중량%	52.6%
실시예 1의 추출물	0.02 중량%	15.7%
실시예 2의 분획물	0.1 중량%	64.8%
실시예 2의 분획물	0.02 중량%	22.3%
실시예 3의 분획물	0.02 중량%	12.9%
레티놀	0.005 중량%	38%

상기 표 5에서 알 수 있듯이 자외선 조사시 발현이 유도되는 MMP-1에 대하여 시료를 처리하지 않은 대조군에 비하여 실시예 1의 감귤과피 추출물 및 실시예 2의 극성이 강한 용매층의 분획물은 0.1 중량% 농도에서 50% 이상의 억제율을 보였으며 이는 대조군으로 사용한 레티놀에 비해서는 상대적으로 낮은 억제율이지만, 천연물 추출물로서는 매우 우수한 결과를 나타내었다. 하지만, 실시예 3의 극성이 약한 용매층의 분획물은 높은 용해도 및 세포 독성으로 인해 0.025 중량% 이하의 농도에서 실험이 가능하였으며, 저해 활성도 매우 낮은 것으로 확인되었다.

<실험예 6> 몰식자산 함량 비교 시험

실시예 1 및 2에서 수득한 온주 밀감 과피 추출물과 그것의 극성이 강한 용매층의 분획물의 몰식자산 함량을 HPLC를 이용하여 아래의 방법으로 분석하였다.

분석 장비는 워터스사의 Alliance 2695와 역상 C-18 컬럼(Xterra), 가드컬럼을 이용하였으며, 이동상용매로는 메탄올과 정제수를 농도구배 조건으로 분리하였다. 또한, 피크의 끌림현상은 pH 4.75 초산 완충액을 첨가하여 개선하였다. 전개조건은 분당 유속은 0.8mL이며, 초기 이동상 조건은 정제수 75%, 메탄올 20% 및 초산 완충액 5% 조건이며, 초기 5분간 동일한 조건으로 전개하고, 최종 이동상 용매 조성인 정제수 15%, 메탄올 80%, 초산 완충액 5% 조건이 되도록 농도구배를 60분간 주어 분리하였다. 플라보노이드 함량은 워터스사의 2695 PDA(photodiode array) detector를 이용하여 흡광도 280 nm로 고정하여 측정된 피크의 면적으로 분석하였다.

우선 도 1에 다수의 플라보노이드를 대상으로 한 표준물질 혼합액을 측정한 결과를 나타내었다. 그 결과, 몰식자산은 약 7.8분의 지연시간으로 검출되었다. 이러한 결과를 바탕으로 실시예 1 및 2의 감귤과피 추출물과 그 분획물을 확인한 결과, 도 2에서 확인할 수 있듯이, 실시예 1의 온주 밀감 과피 추출물은 몰식자산을 포함한 다양한 플라보노이드의 함량이 매우 낮은 수준인 것으로 확인되었으며, 이에 비해 도 3의 결과에서 확인할 수 있듯이, 실시예 2의 극성이 강한 용매층은 지연 시간 약 7.8분 근방의 몰식자산을 고함량으로 함유하고 있는 것으로 확인되었다.

즉 실시예 2의 극성이 강한 용매층의 분획물은 실시예 1의 감귤과피 추출물에 비해 몰식자산의 함량이 현저히 개선되었음을 알 수 있다.

<실험예 7> 피부 탄력 개선 효과 및 피부 주름 개선 효과 실험

상기 실시예 2에서 수득한 몰식자산 고함량 온주 밀감 과피 추출물의 분획물을 함유한 화장료 조성물을 제조하여(제조예의 화장료 조성물) 사람을 대상으로 피부 탄력 개선 효과 및 주름 개선 효과를 평가하였다. 이 때 비교 실험을 위하여 그 분획물이 함유되지 아니한 화장료 조성물(비교예의 화장료 조성물)을 비교예로 사용하였다.

제조예 및 비교예의 화장료 조성물은 크림 형태이고, 그 조성은 아래의 표 6에 나타낸 바와 같다.

우선 표 6에 기록되어 있는 나)상을 가열하여 70℃에 보존한다. 이것에 가)상을 가하여 예비유화 후 호모믹서로 균일하게 유화하고 다음에 서서히 냉각하여 크림 형태의 화장료 조성물을 제조한다. 실험자(20세-35세의 여성) 20명을 대상으로 얼굴 오른쪽 부위에는 제조예의 크림을, 얼굴 왼쪽 부위에는 비교예의 크림을 각각 1일 2회씩 연속 2개월간 도포하였다. 실험 완료 후 피부 탄력 개선 효과는 제품 사용 전과 2개월간 사용 후에 피부탄력측정기(cutometer SEM 575, C+K Electronic Co., Germany)를 이용하여 측정하였다. 실험 결과는 아래의 표 7에 Cutometer SEM 575의 △R7값으로 기재하였는데 R7값은 피부의 점탄성(viscoelasticity) 성질을 나타낸다.

화장료 조성물의 성분 조성 및 성분 함량(중량%)

제조예			비교예
가	스테아릴 알콜	8	8
	스테아린산	2	2
	스테아린산 콜레스테롤	2	2
	스쿠알란	4	4
	2-옥틸도데실알콜	6	6
	폴리옥시에틸렌(25몰부가)알콜에스테르	3	3
	글리세릴모노스테아린산아스테르	2	2
나	실시예 2의 분획물	1	-
	프로필렌글리콜	5	5
	적량	적량	적량

피부 탄력 개선 효과

실험 제품	피부탄력효과(△R7)
제조예	0.29
비교예	0.14
*n=20, p＜0.05

상기 표 7의 결과는 상기 실시예 2의 몰식자산 고함량 온주 밀감 과피 추출물의 분획물을 함유한 크림이 높은 피부 탄력 개선 효과를 가짐을 보여준다.

한편 주름 개선 효과의 실험도 상기 제조예의 화장료 조성물과 비교예의 화장료 조성물로 수행하였다.

실험자(20세~35세의 여성) 20명을 대상으로 얼굴 오른쪽 부위에는 제조예의 크림을 얼굴 왼쪽 부위에는 비교예의 크림을 각각 1일 2회씩 연속 2개월간 도포하였다. 실험 완료 후 피부 주름 개선 효과는 제품 사용 전과 2개월간 사용 후에 피부의 주름 개선 효과를 알아보기 위하여 실리콘 재질의 모사판(replica)을 제작하여 지정 부위의 주름의 상태를 화상분석기인 비지오미터(visiometer: SV60, C+K Electronic Co., Germany)로 측정하였다.

그 결과를 2개월 후의 각각의 파라미터 값에서 2개월 전 파라미터 값을 뺀 것의 평균값으로 아래의 표 8에 나타내었다. 이 값은 음수가 나올수록 주름 개선 효과가 높다는 것을 의미한다.

실험제품	R1	R2	R3
제조예	-0.29	-0.24	-0.13
비교예	-0.14	-0.11	-0.05
R1: 주름 등고선의 최고치와 최저치의 차이값 R2: 주름 등고선을 임의로 5칸씩 나눈 후 그 중 R1값들의 평균 R3: 5개씩 나눈 R1값 중 최고치

상기 표 8의 결과는 상기 실시예 2의 분획물이 함유된 크림의 피부 주름 개선 효과가 그것이 함유되지 아니한 크림에 비해 매우 높음을 보여준다.

도 1은 플라보노이드 표준물질 혼합액의 HPLC 분석 결과이다.

도 2는 온주 밀감 과피 추출물(실시예 1의 추출물)의 HPLC 분석 결과이다.

도 3는 온주 밀감 과피 추출물의 분획물(실시예 2의 분획물)의 HPLC 분석 결과이다.

Claims (11)

1. (a) 항산화 활성, 미백 활성, 자외선 차단 활성 및 피부 주름 개선 활성을 가지며,

   (b) 온주 밀감 과피를 물, 탄소수 1~5의 알콜 또는 이들의 혼합 용매에 침지시켜 얻어진 추출물을 물, 탄소수 1~5의 알콜 및 이들의 혼합 용매로 구성된 군에서 선택된 극성이 강한 용매와, n-헥산, 메틸렌클로라이드, 클로로포름 및 이들의 혼합 용매로 구성된 군에서 선택된 극성이 약한 용매로 분획하였을 때 극성이 강한 용매층에서 얻어지는

   온주 밀감 과피 추출물의 분획물.
2. (a) 항산화 활성, 미백 활성, 자외선 차단 활성 및 피부 주름 개선 활성을 가지며,

   (b) 온주 밀감 과피를 물과 에탄올의 혼합 용매에 침지시켜 얻어진 추출물을 물, 메탄올과 에탄올의 혼합 용매와, n-헥산, 메틸렌클로라이드 및 클로로포름의 혼합 용매로 분획하였을 때 물, 메탄올과 에탄올의 혼합 용매층에서 얻어지는

   온주 밀감 과피 추출물의 분획물.
3. (a) 항산화 활성, 미백 활성, 자외선 차단 활성 및 피부 주름 개선 활성을 가지며,

   (b) 온주 밀감 과피를 80% 에탄올에 침지시킨 후 추출 용매를 제거하여 얻어진 온주 밀감 과피 추출물 분말을, 물, 메탄올과 에탄올의 혼합 용매와, n-헥산, 메틸렌클로라이드 및 클로로포름의 혼합 용매로 분획하였을 때 물, 메탄올과 에탄올의 혼합 용매층에서 얻어지는

   온주 밀감 과피 추출물의 분획물.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 온주 밀감 과피 추출물의 분획물을 유효성분으로 하는 항산화제 화장품 조성물.
5. 삭제
6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 온주 밀감 과피 추출물의 분획물을 유효성분으로 하는 피부 미백제 화장품 조성물.
7. 삭제
8. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 온주 밀감 과피 추출물의 분획물을 유효성분으로 하는 자외선 차단제 화장품 조성물.
9. 삭제
10. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 온주 밀감 과피 추출물의 분획물을 유효성분으로 하는 피부 주름 개선제 화장품 조성물.
11. 삭제

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