KR100983526B1

KR100983526B1 - 백수 추출물을 함유하는 화장료 조성물

Info

Publication number: KR100983526B1
Application number: KR1020080026715A
Authority: KR
Inventors: 이동환; 김진화; 이근수; 오정영; 장영학; 표형배
Original assignee: 한불화장품주식회사
Priority date: 2008-03-24
Filing date: 2008-03-24
Publication date: 2010-09-24
Also published as: KR20090101535A

Abstract

본 발명은 백수 추출물을 주요 활성성분으로 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로서, 좀더 구체적으로는 구과목 측백나무과에 속하는 백수 추출물을 활성성분으로 0.001 - 30.0중량%, 바람직하게는 0.01 - 5중량%를 함유하는 것을 특징으로 하며 활성산소 소거효과, 티로시나제 활성 억제효과와 멜라닌 생합성 억제효과, 피부 주름 개선효과가 우수한 화장료 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 의하면 백수 추출물은 활성산소 소거효과뿐만 아니라, 미백효과와 사람 섬유아세포에서 MMP-1 생합성 저해효과와 타입 1 프로콜라겐의 생합성 촉진 효과에 의한 피부 탄력 및 잔주름 개선효과를 가지는 기능성 화장료를 제공할 수 있다.

백수 추출물, 화장료, 항노화, 항산화, 주름 개선, 미백

Description

백수 추출물을 함유하는 화장료 조성물{A cosmetic composition containing Cupressus funebris extract}

본 발명은 백수 추출물을 주요 활성성분으로 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로서, 좀 더 구체적으로는 백수 추출물 0.001 ~ 30.0중량%를 함유하며 활성산소 소거효과, 티로시나제 활성 억제효과와 멜라닌 생합성 억제효과, 피부 주름 개선효과가 우수한 화장료 조성물에 관한 것이다.

사람의 피부는 나이를 먹으면서 피부 노화와 색소 침착에 의해 끊임없이 변한다. 이러한 피부색을 결정하는 인자에는 기본적으로 인종과 지역, 성별, 나이에 따른 차이를 배제하면 기미, 주근깨와 자외선 노출로 인한 태닝과 같은 부분, 또는 전체적인 색소침착, 그 외에 여드름 및 흉터, 각질의 분포 상태와 혈액 순환, 스트레스, 건강상태 등이 있다. 이상의 인자들 가운데에서도 가장 중요한 인자는 색소침착이다.

피부색에 영향을 주는 색소로는 멜라닌, 카로틴, 헤모글로빈 등이 있는데 이 중 가장 중요한 것은 멜라닌으로 생합성에 영향을 미치는 가장 큰 요인은 자외선과 체내 호르몬 분비 정도이다. 멜라닌의 생합성은 아미노산의 일종인 티로신이 멜라노사이트의 멜라노좀에서 티로시나제(tyrosinase)에 의해 산화되어 디하이드록시 페닐알라닌(dihydroxy phenylalanine)으로 전환되는 것을 시작으로 계속되는 일련의 산화과정을 거쳐 갈색(pheomelanin), 흑색(eumelanin)의 중합체로 형성된다. 이러한 생합성 과정은 멜라노좀이라는 특수한 형태의 갈색 세포내 소기관에서 진행되며 멜라닌 과립을 포함한 멜라노좀은 핵 주변 부위에서 수지상 돌기 끝부분으로 이동, 케라티노사이트의 식세포작용에 의해 세포질 내로 이동하고 이들은 케라티노사이트의 핵 주변에 축적된다. 멜라닌의 합성과 멜라노좀의 수, 주위의 케라티노사이트로의 이동은 일차적으로는 유전적 영향을 크게 받으며 부분적으로는 호르몬과 자외선 등에 영향을 받는다. 그 밖에 티로시나제의 발현 및 멜라닌의 합성, 전송에 관여하는 세포내 조절인자인 싸이토카인(cytokine), 구리, 아연, 철 등의 금속 이온 및 인터페론, 프로스타글란딘, 히스타민 등이 관여하는 것으로 알려져 있다(박수남 : 대한화장품학회지, 25: 77-127, 1999). 따라서 피부색을 결정짓는 멜라닌의 합성을 억제하고 이에 관여하는 효소인 티로시나제의 활성을 억제하여 피부의 미백효과를 기대할 수 있다.

다음으로, 피부색과 함께의 노화의 특징을 나타내는 인자는 주름의 생성과 탄력의 저하이다. 피부노화는 내인성 노화(intrinsic, chronological aging)와 광노화(phtoaging) 두 가지로 나눌 수 있다[Gilchrest BA: J. Am. Acad. Dermatol.,21, 610-613(1989)]. 내인성 노화는 연령이 증가함에 따라 생체의 생리 적인 기능이 저하되어 자연적으로 유발되는 노화현상이다[Braverman IM 등: J. Invest. Dermatol., 78, 434-443(1982)]. 광노화는 피부가 광에 반복적으로 노출되어 피부의 외양 또는 기능이 변화되는 것을 의미한다[Ridder GM등: J. Am. Acad. Dermatol., 25, 751-760(1991)]. 또한, 피부노화는 자외선, 스트레스, 질병상태, 환경인자, 상처, 나이가 들어감에 따라 활성산소종이 활성화되어 야기될 수 있으며, 이런 상태가 심화될 경우 생체 내에 존재하는 항산화 방어망을 파괴하고, 세포 및 조직을 손상시켜 성인병 및 노화를 촉진하게 된다. 좀 더 구체적으로 말하자면, 피부의 주요 구성물질인 지질, 단백질, 다당류 및 핵산 등이 산화되어 피부세포 및 조직이 파괴되고, 결국 피부노화 현상이 생겨나는 것이다. 특히 단백질의 산화는 피부의 결합조직인 콜라겐, 히알루론산, 엘라스틴, 프로테오글라이칸, 피브로넥틴 등이 절단되어 심한 과다 염증반응과 피부의 탄력에 지장을 주게 되고 이것이 더 심해질 경우 DNA의 변이에 의해 돌연변이, 암의 유발, 면역기능 저하의 사태에 이르게 된다. 그러므로 신체의 대사 과정 중 발생하는 활성산소종이나 자외선 조사, 염증반응에 의해 매개되는 활성산소종을 소거하여 세포막을 보호하고, 또 이미 손상 받은 세포는 활발한 신진대사에 의해 재생화시켜서 세포를 증식시켜야 피부는 빠르게 회복되고 건강한 피부를 유지할 수 있다.

또한, 생체 내에서 콜라겐과 같은 세포외 기질의 합성과 분해는 적절하게 조절되나 노화가 진행되면서 그 합성이 감소하며 콜라겐을 분해하는 효소인 기질금속단백질 분해효소 (matrixmetalloproteinase, 이하 ‘MMP’라 칭함)의 발현이 촉진되어 피부의 탄력이 저하되고 주름이 형성된다. 또한 자외선 조사와 자유 라디칼에 의해 이러한 분해효소가 활성화되기도 한다. 기질 금속단백질 분해효소(MMP)는 사람 피부의 각질형성세포(keratinocyte)와 섬유아세포(fibroblast)를 비롯한 체내 다양한 세포로부터 분비되는데, 칼슘 및 아연 의존성 엔도펩티다제(Endopeptidase)로 중성 pH에서 작용하며 기질로써 여러 가지 세포외 기질을 이용한다. MMP는 그 기질특이성에 따라 MMP-1, MMP-2, MMP-9로 크게 분류되는데, MMP-1은 간질의 효소인 섬유아세포 타입 콜라게나제이며 기질로는 콜라겐타입 Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅶ,Ⅷ,Ⅹ 및 젤라틴이 있으며 원래 콜라겐 길이의 3/4이나 1/4 길이의 펩타이드로 잘라 비특이적인 효소(gelatinase)의 작용이 용이하도록 한다. MMP-2는 72 kD의 젤라티네이즈(A)가 이에 속하며 기질로는 젤라틴, 콜라겐 타입 Ⅳ,Ⅴ,Ⅶ,Ⅹ, 엘라스틴 및 피브로넥틴을 분해한다. 또한 메탈로엘라스타아제(Metalloelastase)는 MMP-13으로 엘라스틴을 분해한다. 사람 피부의 진피층 대부분을 차지하는 콜라겐 타입 Ⅰ과 Ⅲ, 엘라스틴, 피브로넥틴 등은 피부에 강도와 장력을 부여하는데 자외선과 자유 라디칼 등에 의해 비정상적으로 활성화된 MMP에 의해 단백질이 분해되면 주름과 탄력저하, 피부 처짐 등의 노화현상이 가속화된다. 특히 결합 단백질 중 가장 큰 비중을 차지하는 타입Ⅰ콜라겐을 분해하는 MMP-1의 활성과 생합성을 억제함으로써 피부 결합단백질을 보호하여 주름생성과 탄력저하를 예방할 수 있다. 그러므로, 자외선에 의해 세포 내에서 활성화가 유도되는 MMP 발현을 조절하거나 그 활성을 억제할 수 있는 물질의 개발이 요구되고 있다. 지금까지 화장료의 소재로서 사용된 원료들은 단순히 MMP 효소 활성만을 억제하는 것이 대부분이었다.

최근 여러 화학물질 등에 의한 피부 자극을 줄이기 위해 천연 추출물로부터 얻어진 항산화, 주름완화, 미백 등의 기능을 가진 기능성 화장료(functional cosmetics)에 많은 관심이 집중되고 있다. 천연 재료는 피부에 부작용이 적을 뿐 아니라, 최근 천연 재료를 이용한 화장품에 대한 소비자들의 호응이 높아짐에 따라 화장품 원료로서 개발가치가 한층 늘어나고 있다. 예를 들어, 미국 특허공보 US 5,972,341는 코미포라(Commiphora)속 식물, 특히, 코미포라 무쿨(Commiphora mukul) 추출물의 주름개선 효과에 관하여 기술하고 있다. 일본특허공개 평9-672662 는 히알우로니다제(Hyaluronidase)억제 효능을 가지는 해초류 추출물들에 관하여 기술하고 있다. 일본특허공개 평10-85905은 와카메(Wakame)로부터 추출된 푸코이단 (Fucoidan)의 피부감촉 개선효과에 관하여 기술하고 있다. 일본특허공개 평2-245087은 사르가숨(Sargassum)속 추출물의 항산화 효과에 관하여 기술하고 있다; 일본특허공개 평3-294384는 히지키아(Hizikia)속으로부터 추출된 항산화 조성물에 관하여 기술하고 있다. 일본특허공개 평7-10769는 수렴효과(astringent effect)가 있는 페오피시에강(Phaeophyceae) 추출물에 관하여 기술하고 있다.

본 발명은 여러 천연물들 중 측백나무과의 백수 추출물을 선택하여, 이의 화장료로서의 효능을 확인하고 그 사용방법을 개발함으로써, 다양한 화장료 원료의 선택범위를 높이고자 하였다.

또한 본 발명은 백수 추출물을 원료로 사용하여 좀 더 피부자극이 없으면서도 소정의 기능성 효과를 나타내는 화장료를 제공하려는 것을 목적으로 한다. 즉, 본 발명의 목적은 화장료에 적용 가능하고 화장료에 함유시 멜라닌의 생성 및 이와 관련된 효소의 활성을 억제하여 우수한 미백효과를 나타내는 천연 추출물 화장료를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 피부 화장료에 적용 가능하고 화장료에 함유시 활성산소 소거효과, MMP-1 생합성 감소 및 타입 1 프로콜라겐 생합성 촉진효과, 피부 주름 개선효과 등 우수한 항노화 효과를 나타내는 천연 추출물 화장료를 제공하는 것이다.

이에, 본 발명자들은 이제까지 알려지지 않은 여러 천연물에 있어서 화장품으로의 응용 가능성을 연구한 결과, 겉씨식물 구과목 측백나무과의 백수를 선정하고 이로부터 추출물을 제조하여, 활성산소 소거효과, 티로시나제 활성 억제효과와 멜라닌 생합성 억제효과로 인한 미백 효과 및 피부 주름 개선효과를 측정하여 우수한 결과를 얻었고, 화장료로서의 효능을 기대할 수 있다는 것을 발견하게 되었다.

백수(Cupressus funebris)는 겉씨식물 구과목 측백나무과에 속하는 상록 침엽교목으로서, 관상용, 목재용으로 쓰이며, 아시아, 유럽, 북아메리카의 온화한 기후대와 아열대지방에 널리 퍼져 있다. 높이 20m에 달하며 수관은 원뿔 모양이고 수피는 검은빛을 띤 갈색이며 두꺼운 비늘처럼 벗겨진다. 잔 가지는 가늘고 밑으로 처지며, 잎은 비늘같이 생긴다. 열매는 구과로서 꽃이 핀 다음해 여름에 익는다. 모양은 둥글고 지름 8∼12mm로 4쌍의 열매조각이 있다. 중국에서는 소나무와 더불어 사찰과 묘지에 심으며, 잎이 달린 가지, 열매, 뿌리를 약용한다. 중국 양쯔강 연안에 분포한다.

본 발명은 백수 추출물을 함유하는 화장료 조성물에 관한 것이다. 상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 백수의 수피, 가지, 잎 및 뿌리를 추출용매로서 정제수, 메탄올, 에탄올, 글리세린, 에틸아세테이트, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 디클로로메탄 및 헥산 중에서 선택된 1종 이상의 용매를 사용하여 추출한 것을 특징으로 하는 식물 추출물을 주요 활성성분으로 함유하는 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명은 상기 추출물이 상온에서 냉침, 가열 여과하여 얻어진 액상물, 추가로 용매를 감압농축 또는 동결건조하여 얻은 것임을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 백수 추출물의 함량이 화장료 조성물 전체에 대해서 동결건조중량 기준 0.001-30.0중량%인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공한다. 상 기 추출물의 함량이 0.001중량% 미만인 경우에는 피부개선 효과가 거의 없으며, 30.0중량% 이상인 경우에는 함유량 증가에 대한 효과 증대 정도가 미미하여 경제적이지 못하다.

나아가, 본 발명은 상기 화장료 조성물이 화장수, 젤, 수용성 리퀴드, 크림, 에센스, 기타 수중유(O/W)형 및 유중수(W/O)형의 기초화장료 제형과 수중유형 또는 유중수형 메이크업베이스, 파운데이션, 스킨커버, 립스틱, 립글로스, 페이스파우더, 투웨이케익, 아이섀도, 치크칼라 및 아이브로우펜슬 중에서 선택되는 것을 특징으로 한다.

본 발명은 백수 추출물을 원료로 사용하여 좀 더 피부자극이 없으면서도 소정의 기능성 효과를 나타내는 화장료를 제공한다.

나아가, 본 발명은 멜라닌의 생성 및 이와 관련된 효소의 활성을 억제하여 우수한 미백효과를 나타내는 백수 추출물을 함유한 화장료 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 활성산소 소거효과, MMP-1 생합성 감소 및 타입 1 프로콜라겐 생합성 촉진효과, 피부 주름 개선효과 등 우수한 항노화 효과를 나타내는 백수 추출물을 함유한 화장료 조성물을 제공한다.

이하, 실시예를 통해 본 발명을 좀더 구체적으로 설명한다. 단, 이들 실시예는 본 발명의 예시적인 기재일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되는 것은 아니다.

실시예 1: 백수 추출물 제조

세절하여 음건한 백수(Cupressus funebris)를 95%(V/V) 에탄올 수용액으로 5시간씩 3회 환류추출하고 냉침한 후, 와트만(Whatman) #5 여과지로 여과하였다. 여과된 추출물은 50℃ 이하에서 감압농축 및 동결건조시켜, 감압농축물 및 동결건조물이 0.001~30.0중량% 함유되게 정제수, 에탄올, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 중에서 선택된 1종 이상의 용매를 사용하여 백수 추출물을 제조하였다.

실시예 2: NBT 법을 이용한 항산화 효과 측정 실험

실시예 1에서 수득한 백수 추출물의 항산화 효과를 확인하기 위해 실험실 조건에서 항산화제로 잘 알려진 BHT(Butylated hydroxytoluene)를 비교샘플로 하고 NBT(Nitro Blue Tetrazolium)법을 이용하여 항산화 활성을 측정하였다.

항산화 효과를 측정하기 위해서 크산틴과 크산틴옥시다제에 의해 생성되는 활성산소를 NBT법에 의해 측정하고 피검물질이 활성산소를 제거하는 효과, 즉 활성산소 소거효과를 평가한다. 크산틴과 크산틴옥시다제에 의해 활성산소를 생성시킨다. 이 활성산소가 니트로블루테트라졸리움(Nitro Blue Tetrazolium;NBT)과 반응하여 이것에 의해 생성되는 청색을 파장 560nm에서 측정하는 것으로 활성산소 소거율을 측정한다.

측정방법으로서 0.05M Na₂CO₃(2.4㎖, pH 10.2), 3mM 크산틴 용액(0.1㎖), 3mM EDTA 용액(0.1㎖), 우혈청 알부민(BSA 0.15%) 용액(0.1㎖), 0.72mM NBT(nitroblue tetrazolium) 0.75mM 용액(0.1㎖)를 가하고 여기에 시료용액 0.1㎖를 첨가하고 25℃에서 10분간 방치한다. 크산틴 옥시다제 용액(공시험의 흡광도가 0.2~0.23 범위에 들도록 즉, 흡광도가 A₅₆₀=0.3/20분이 되도록 함) 0.1㎖를 가하여 빨리 교반하고 25℃에서 20분간 배양한다. 그 후 6mM CuCl₂ 용액 0.1㎖을 가하여 반응을 정지시키고 560nm에서의 흡광도 St를 측정한다. 공시험은 시료용액 대신 증류수를 사용한 것을 상기와 똑같이 조작해 흡광도 Bt를 측정한다. 시료용액의 효소 무첨가시 반응 전 560nm 흡광도 So를 측정하고, 시료용액의 블랭크(Blank)는 상기 크산틴 옥시다제 용액 대신에 증류수를 사용해 똑같이 조작하여 흡광도 Bo를 측정한다.

효과는 수학식 1에 의하여 산출하였으며, 그 결과는 표 1에 나타내었다.

활성산소 소거율(%) = 〔1-(St-So)/(Bt-Bo)〕X 100

St : 시료용액의 효소 반응 후의 560nm에서의 흡광도

Bt : 공시험용액의 효소 반응 후의 560nm에서의 흡광도

So : 시료용액의 효소 무첨가시 반응전의 560nm에서의 흡광도

Bo : 공시험용액의 효소 무첨가시 반응전의 560nm에서의 흡광도

표 1에서 확인할 수 있듯이 백수 추출물은 BHT(Butylated hydroxytoluene)보다 우수한 항산화력을 갖고 있음이 확인되었다.

시료명	활성산소 소거율(%)
백수 추출물 0.1중량%	96.3%
백수 추출물 0.01중량%	70.4%
백수 추출물 0.001중량%	20.2%
BHT(Butylated hydroxytoluene) 0.1중량%	89.3%

실시예 3: 자유라디칼 소거활성 측정 실험

실시예 1에서 수득한 백수 추출물의 자유라디칼 소거활성을 측정하기 위해 실험실 조건에서 BHT(Butylated hydroxytoluene)와 같은 항산화제를 비교샘플로 하고 DPPH법을 이용하여 자유라디칼 소거활성을 측정하였다.

DPPH법은 DPPH(2,2-Di(4-tert-octylphenyl)-1-picrylhydrazyl free radical)라는 유리기를 사용하여 환원력에 의한 자유라디칼 소거활성을 측정한다. 피검물질에 의해 DPPH가 환원되어 흡광도가 감소하는 정도를 공시험액의 흡광도와 비교하여 파장 560nm에서 자유라디칼 소거율을 측정한다.

DPPH 자유라디칼 소거활성 측정을 위하여 0.1%, 0.01%, 0.001% 농도의 백수 추출물을 준비하였다. 상기 농도의 추출물을 96웰 플레이트에 각각 넣고, 여기에 100uM 메탄올용액으로 제조된 DPPH를 첨가하여 용액의 총 부피가 200㎕가 되도록 하였다. 이것을 37℃에서 30분간 방치한 후 560nm에서 흡광도를 측정하였다. 자유라디칼 소거활성(%)은 다음의 수학식 2와 같이 산출하였다.

자유 라디칼 소거활성(%)= 100-(B/A)X100

A: 본 발명의 백수 추출물을 처리하지 않은 대조군 웰의 흡광도

B: 본 발명의 백수 추출물을 처리한 실험군 웰의 흡광도

표 2에서 확인할 수 있듯이 백수 추출물은 항산화제로 많이 이용되고 있는 BHT(Butylated hydroxytoluene)보다 우수한 항산화 효과를 나타냄을 알 수 있었다.

시료명	자유 라디칼 소거 활성(%)
백수 추출물 0.1중량%	96.3%
백수 추출물 0.05중량%	92.2%
백수 추출물 0.025중량%	68.8%
BHT(Butylated hydroxytoluene) 0.1중량%	81%

실시예 4: 티로시나제 억제효과 측정 실험

본 실시예는 실시예 1에서 수득한 백수 추출물의 미백효과를 확인하기 위해 티로시나제(tyrosinase)라는 효소의 기능이 억제되는 정도를 보고 미백효과를 판단한 것이다.

티로시나제는 생체 내에서 티로신(tyrosine)이라는 물질의 산화과정을 촉진하여 멜라닌이 생성되게 도와주는 효소이다. 본 실시예에서는 이 효소의 기능을 억제하여 티로신이 산화되어 멜라닌이라는 흑색의 고분자를 형성하는 것을 억제하는 정도를 측정하는 방법(Pomerantz S. H.: J. Biochem ., 24: 161 - 168, 1996)을 응용하여 미백효과를 판정하였다.

각 시료들의 티로시나제 저해활성은 시료 15㎕를 96 웰 플레이트에 넣고, 50mM 인산 완충액(pH 6.5) 150μℓ, 1.5mM L-티로신 용액 25㎕를 넣은 후, 머쉬룸 티로시나제(1,500units/ml, Sigma사) 10㎕를 첨가하여 37℃에서 20분간 반응시킨 후, 마이크로플레이트 판독기(microplate reader, ELx800, 미국)를 사용하여 490nm에서 흡광도를 측정하여 티로시나제에 대한 저해율을 측정하였다. 티로시나제에 대한 저해율(%)은 수학식 3에 의하여 계산하였으며, IC₅₀값은 티로시나제 효소 활성을 50% 저해하는 물질의 농도이다.

저해율(%) = [(D-C)-(B-A)]/(D-C)× 100

A : 시료를 넣은 웰의 반응전 흡광도

B : 시료를 넣은 웰의 반응후 흡광도

C : 시료를 넣지 않은 웰의 반응전 흡광도

D : 시료를 넣지 않은 웰의 반응후 흡광도

티로시나제 활성 저해효과를 시험한 결과, 표 3에서 확인할 수 있듯이 백수 추출물의 IC₅₀값은 0.07%로 나타나 기존에 알려진 미백제인 알부틴보다 우수하며, 코직산, 유용성 감초추출물과 유사한 티로시나제 활성 억제 효과를 나타내었다.

시료명	티로시나제 활성 저해율(IC₅₀)
백수 추출물	0.07%
코지산(kojic acid)	0.04%
알부틴(arbutin)	0.47%
상백피 추출물	10.20%
유용성 감초 추출물	0.08%

실시예 5: B16F1 멜라노싸이트를 이용한 멜라닌 생성 억제효과 측정 실험

본 실시예는 실시예 1에서 수득한 백수 추출물의 미백효과를 확인하기 위해 B16F1 멜라노싸이트에 대한 멜라닌 생성 억제 정도를 보고 미백 효과를 판단한 것이다.

본 실시예에 사용된 B16F1 멜라노싸이트는 마우스에서 유래한 세포균주이며, 멜라닌이라는 흑색색소를 분비하는 세포이다. 이 세포의 인공배양 중에 시료를 처리하여 멜라닌색소가 감소하는 정도를 비교 평가하였다. 본 실시예에 사용된 B16F1 멜라노싸이트는 ATCC(American Type Culture Collection, 기탁번호: 6323)로부터 분양받아 사용하였다.

B16F1 멜라노싸이트의 멜라닌 생합성 억제효과 측정은 다음과 같이 행하였다. B16F1 멜라노싸이트를 6 웰 플레이트에 각 웰당 2×10⁶ 농도로 분주하고 세포를 부착시킨 후 독성을 유발하지 않는 농도로 시료를 처리하여 72시간 동안 배양하였다. 72시간 배양 후 세포를 트립신-EDTA로 떼어낸 후, 세포 수를 측정한 다음 원심분리하여 세포를 회수하였다. 세포 내 멜라닌의 정량은 로탄(Lotan : Cancer Res ., 40: 3345-3350, 1980)의 방법을 약간 변형하여 실시하였다. 셀 펠릿을 PBS(phosphate buffered saline)로 1회 세척한 후 균질화 버퍼액(50mM 소듐 포스페이트, pH 6.8, 1% Triton X-100, 2mM PMSF(phenylmethanesulphonylfluoride)) 1㎖를 첨가하여 5분간 와류하여 세포를 파쇄하였다. 원심분리(3,000rpm, 10분)하여 얻은 세포 여액에 1N NaOH{10% DMSO(Dimethyl sulfoxide) 포함}를 첨가하여 추출된 멜라닌을 용해한 후 마이크로 플레이트 판독기로 405nm에서 멜라닌의 흡광도를 측정한 다음 멜라닌을 정량하여 시료의 멜라닌 생성 저해율(%)을 측정하였다. B16F1 멜라노싸이트의 멜라닌 생성 저해율(%)은 수학식 4에 의하여 계산하였으며, IC₅₀값은 멜라닌 생성을 50% 저해하는 물질의 농도이다.

저해율 (%) = [(A-B)/A]×100

A : 시료를 첨가하지 않은 웰의 멜라닌 양

B : 시료를 첨가한 웰의 멜라닌 양

B16F1 멜라노싸이트의 멜라닌 생성 억제 효과를 시험한 결과, 표 4에서 확인할 수 있듯이 백수 추출물의 IC₅₀값은 0.10%로 나타나 기존에 미백제로 널리 알려진 하이드로퀴논, 유용성 감초 추출물보다는 미약하지만, 알부틴보다 우수한 효과를 나타내었다.

시료명	멜라닌 생성 저해율(IC₅₀)
백수 추출물	0.10%
하이드로퀴논(hydroquinone)	0.03%
알부틴(arbutin)	0.46%
상백피 추출물	5.32%
유용성 감초 추출물	0.04%

실시예 6: 인비트로 MMP -1 활성저해 실험

MMP-1 활성 저해 효과를 측정하기 위하여 형광 분석법을 이용하였다. 실험에 사용한 기질은 형광물질이 표지된 DQ^TM-콜라겐, 효소(collagenase)는 Molecular probe사(Eugene, OR, USA)에서 시판중인 제품을 사용하였으며, 반응완충액(0.5M Tris-HCl, 1.5M NaCl, 50mM CaCl₂, 2mM 소듐 아자이드, pH 7.6)은 10배 희석 후 사용하였다. 반응 완충액 100㎕에 0.25㎎/㎖로 반응 완충액에 용해한 DQ^TM-콜라겐 20㎕와 백수 추출물(0.01~0.1중량%) 40㎕을 첨가하고 0.5단위(unit)로 희석한 콜라게나제 40㎕을 첨가한다. 암소, 실온에서 20분 경과 후 형광 분광광도계(Perkin Elmer, UK)를 이용하여 흡수파장 495nm, 방출파장 515nm로 형광값을 측정하며, 대조군으로서 효소액 대신 반응 완충액을 효소와 동량 첨가하여 형광값을 측정하였으며 시료 자체의 형광값도 측정하여 효소활성 계산시 보정하였다.

결과는 표 5에 나타냈으며 백수 추출물 0.05% 처리시 클로스트리디움 콜라게나제의 콜라겐 분해활성을 약 61% 억제하였으며, 이는 같은 농도의 녹차추출물의 저해 효과보다 우수한 결과이다.

시료명	콜라게나제 활성 저해율
백수 추출물 0.1중량%	88.7%
백수 추출물 0.05중량%	61.2%
백수 추출물 0.025중량%	23.3%
녹차 추출물 0.2중량%	70%

실시예 7: 자외선 조사 후 백수 추출물에 의한 MMP -1 발현억제 평가

본 실험예는 실시예 1에서 수득한 백수 추출물의 UV 조사 및 시료 첨가 후 MMP-1 농도를 측정하기 위해서 효소면역 시험법(ELISA)을 실시하였다.

UV 챔버를 이용하여 인간 진피 섬유아세포에 UVA를 6.3J/㎠의 에너지로 조사하였다. 자외선 조사량과 배양시간은 예비실험을 통하여 섬유아세포에서 MMP 발현량이 최대가 되는 조건을 확립하였다. 음성 대조군은 은박지로 싸서 UVA의 환경에 같은 시간을 유지시켰다. UVA 방출량은 UV 라디오미터를 이용하여 측정하였다. UVA가 조사되는 동안의 세포는 이전에 분주된 배지 그대로이고 UVA를 조사한 후 샘플이 들어간 배지로 교환하여 24시간 배양 후 배지를 회수하여 96웰에 코팅하였다. 일차항체(MMP-1 (Ab-5) 단일클론항체)를 처리하고 37℃에서 60분간 반응시켰다. 이차항체인 알칼라인 포스파타제 결합된 안티마우스 IgG(whole mouse, alkaline phosphatase conjugated)를 다시 60분 정도 반응시킨 후, 알카린 포스파타제 기질용액(다이에탄올아민 완충용액 내에 1㎎/㎖ ρ-나이트로페닐인산 함유)을 상온에서 30분간 반응시키고 마이크로플레이트 판독기로 405nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군으로는 시료를 첨가하지 않은 것을 사용하였다.

결과는 표 6에 나타냈으며 자외선 조사 시에 발현이 유도되는 MMP-1에 대하여 시료를 처리하지 않은 대조군에 비하여 백수 추출물은 63% 이상의 억제율을 보였으며 이는 비교군으로 사용한 레티놀의 억제율과 유사한 결과를 나타내었다.

시험군	MMP-1 발현억제율
대조군	-
백수 추출물 0.01중량%	63.2%
백수 추출물 0.005중량%	26.6%
레티놀 0.005중량%	38.0%

실시예 8: 타입 1 프로콜라겐 생합성 촉진 효과

본 실험예는 실시예 1에서 수득한 백수 추출물 첨가 후 피부기질 성분인 타입 1 프로콜라겐의 생합성을 촉진시키는 효과를 알아보기 위하여 프로콜라겐 분석(procollagen assay)을 하기와 같은 방법으로 실시하였다.

신생아의 포피조직에서 분리한 사람진피섬유아세포(human dermal fibroblast)는 Modern Tissue Technology(MTT, Korea)로부터 분양받아 DMEM/F-12(Dulbecco’s MEM : Ham’s Nutrient Mixture F-12)(3:1)배지에 10% 우태아혈청(Fetal Bovine Serum)을 첨가하여 1× 10⁴cell/㎠ 농도로 배양하였다. 70-80% 정도 자라면 1:3의 비율로 분주하여 계대 배양하였고, 3~4차 계대 배양된 세포를 실험에 이용하였다.

프로콜라겐의 양을 측정하는 실험을 위해서 섬유아세포를 48 웰 플레이트(well plate)에 90% 이상 배양한 후 백수 추출물을 0.01%(v/v), 0.05%(v/v), 0.001%(v/v) 농도로 가하고, 24시간 후에 배지 중에 유리된 프로콜라겐의 양을 프로콜라겐타입-1C-펩타이드 EIA 키트(procollagen type-1 C-peptide EIA kit)(MK101, Takara, Japan)를 사용하여 측정하였다.

결과는 표 7에 나타냈으며 백수 추출물을 0.005% 처리시 프로콜라겐의 생합성이 40.1% 촉진되었으며 이는 세포신호전달 물질인 TGF(Tissue Growth Factor)-β와 유사한 효과를 나타내었다.

시료명	프로콜라겐 생합성 촉진효과
백수 추출물 0.005중량%	40.1%
백수 추출물 0.0025중량%	26.9%
백수 추출물 0.0001중량%	9.8%
TGF-β 0.001중량%	35.2%

실시예 9 및 비교예 1

본 실시예는 실시예 1에서 수득한 백수 추출물을 함유한 화장료를 제조하여 사람을 대상으로 피부 탄력 개선 효과 및 주름 개선 효과를 비교예 1과 비교실험을 행하여 평가하였다.

비교실험에 사용된 화장료는 크림형태이고, 그 조성은 표 9에 나타낸 바와 같다. 우선 표 9에 기록되어 있는 나)상을 가열하여 70℃에 보존한다. 이것에 가)상을 가하여 예비유화 후 호모믹서로 균일하게 유화하고 다음에 서서히 냉각하여 크림(실시예 9, 비교예 1)을 제조한다. 실험자(20세-35세의 여성) 20명을 대상으로 얼굴 오른쪽 부위에는 실시예 9에서 제조된 크림을 얼굴 왼쪽 부위에는 비교예 1에서 제조된 크림을 각각 1일 2회씩 연속 2개월간 도포하였다.

실험완료 후 피부 탄력 개선 효과는 제품 사용 전과 2개월간 사용 후에 피부탄력측정기(cutometer SEM 575, C+K Electronic Co., Germany)를 이용하여 측정하였다. 실험결과는 하기 표 9에 Cutometer SEM 575의 △R7값으로 기재하였는데 R7값은 피부의 점탄성(viscoelasticity)의 성질을 나타낸다. 표 9에서 나타난 바와 같이 백수 추출물을 함유한 크림을 도포한 실험자의 피부 탄력개선 효과가 우수함을 알 수 있다.

실시예 9			비교예 1
가	스테아릴 알콜	8	8
	스테아린산	2	2
	스테아린산 콜레스테롤	2	2
	스쿠알란	4	4
	2-옥틸도데실알콜	6	6
	폴리옥시에틸렌(25몰부가)알콜에스테르	3	3
	글리세릴모노스테아린산아스테르	2	2
나	백수 추출물	1	-
	프로필렌글리콜	5	5
	정제수	잔량	잔량

주)단위: 중량%

실험제품	피부탄력효과(△R7)
실시예 9	0.27
비교예 1	0.14

n=20, p＜0.05

실험자(20세-35세의 여성) 20명을 대상으로 얼굴 오른쪽 부위에는 실시예 9에서 제조된 크림을 얼굴 왼쪽 부위에는 비교예 1에서 제조된 크림을 각각 1일 2회씩 연속 2개월간 도포하였다.

실험완료 후 피부 주름 개선 효과는 제품 사용 전과 2개월간 사용 후에 피부의 주름개선효과를 알아보기 위하여 실리콘 재질의 모사판(replica)을 제작하여 지정 부위의 주름의 상태를 화상분석기인 비지오미터(visiometer: SV60, C+K Electronic Co., Germany)로 측정하였다. 그 결과를 하기 표 10에서 나타내었으며, 이 결과는 2개월 후의 각각의 파라미터(parameter)값에서 2개월 전 파라미터 값을 뺀 것의 평균을 나타낸 것이다. 즉, 이 값이 음수가 나올수록 주름 개선 효과가 높다는 것을 의미한다. 따라서 표 10에서 나타나듯 백수 추출물을 함유한 실시예 9의 피부 주름 개선 효과가 크게 증진되었음을 확인할 수 있었다.

실험제품	R1	R2	R3
실시예 9	-0.32	-0.25	-0.13
비교예 1	-0.12	-0.10	-0.03

R1: 주름 등고선의 최고치와 최저치의 차이값

R2: 주름 등고선을 임의로 5칸씩 나눈 후 그 중 R1값들의 평균

R3: 5개씩 나눈 R1값 중 최고치

이하에 그 외의 실시예를 나타내었다. 즉, 실시예 1에서 수득한 백수 추출물을 함유한 화장수, 유액 및 미용액을 실시예 10 내지 12에서 제조하였다. 이들 백수 추출물을 함유한 화장수, 유액 및 미용액은 활성산소 소거효과, 티로시나제 활성 억제효과와 멜라닌 생합성 억제효과로 인한 미백 효과, 피부 주름의 개선효과 등 피부개선에 우수한 효과를 나타내었다.

실시예 10: 실시예 1에서 수득한 백수 추출물을 함유한 화장수의 제조

95% 에탄올 8g에 폴리피로리돈 0.05g, 올레일알콜 0.1g, 폴리옥시에틸렌모노올레이트 0.2g, 향료 0.2g, 파라옥시안식향산메틸에스테르 0.1g, 소량의 산화방지제, 소량의 색소를 혼합용해 한다. 실시예 1에서 수득한 백수 추출물 0.05g, 글리세린 5g을 정제수 85.33g에 용해한 것에 상기 혼합액을 첨가한 후 교반하여 피부개선효과가 있는 화장수를 얻었다.

실시예 11: 실시예 1에서 수득한 백수 추출물을 함유한 유액의 제조

세틸알콜 1.2g, 스쿠알란 10g, 바세린 2g, 파라옥시안식향산에틸에스테르 0.2g, 글리세린모노에스테아레이드 1g, 폴리옥시에틸렌(20몰 부가)모노올레이트 1g 및 향료 0.1g을 70℃에서 가열혼합용해하고, 실시예 1에서 수득한 백수 추출물 0.5g, 디프로필렌글리콜 5g, 폴리에틸렌글리콜-1500 2g, 트리에탄올아민 0.2g, 정제수 76.2g을 75℃로 가열해서 용해시킨다. 양자를 혼합하여 유화시킨 후 냉각하여 수중유(O/W)형의 피부개선효과가 있는 유액을 얻었다.

실시예 12: 실시예 1에서 수득한 백수 추출물을 함유한 미용액의 제조

95% 에틸알콜 5g에 폴리옥시에틸렌솔비탄모노올레이트 1.2g, 키툴로오즈 0.3g, 히아루론산나트륨 0.2g, 비타민 E-아세테이트 0.2g, 감초산 나트륨 0.2g, 파라옥시안식향산에틸에스테르 0.1g, 실시예 1에서 수득한 백수 추출물 1g 및 적량의 색소를 혼합하여 피부개선효과가 있는 미용액을 얻었다.

Claims

삭제
백수(Cupressus funebris) 추출물을 함유하는 피부 주름개선용 화장료 조성물.
삭제
백수(Cupressus funebris) 추출물을 함유하는 피부 미백 화장료 조성물.
제2항 또는 제4항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 화장수, 젤, 수용성 리퀴드, 크림, 에센스, 기타 수중유 (O/W)형 및 유중수 (W/O)형의 기초화장료 제형과 수중유형 또는 유중수형 메이크업베이스, 파운데이션, 스킨커버, 립스틱, 립그로스, 페이스파우더, 투웨이케익, 아이섀도, 치크칼라 및 아이브로우펜슬류 제형 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.