KR101618595B1

KR101618595B1 - 토마티딘을 함유하는 미숙 토마토 분해물 제조 방법 및 이를 함유하는 화장료 조성물

Info

Publication number: KR101618595B1
Application number: KR1020140181621A
Authority: KR
Inventors: 이근수; 배준태; 김진화; 송민현; 표형배
Original assignee: 한불화장품주식회사
Priority date: 2014-12-16
Filing date: 2014-12-16
Publication date: 2016-05-10

Abstract

본 발명은 미숙 토마토로부터 화장품 주성분 및 지표성분으로 활용 가능한 토마티딘을 0.5% 이상 함유하는 미숙 토마토 분해물을 제조하는 방법과 이를 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로서, 좀 더 구체적으로는 미숙 토마토로부터 토마틴을 추출하는 공정, 이를 휘발성 유기산을 이용하여 분해하는 공정 및 휘발성 산을 제거하는 공정으로 이루어진 토마티딘을 0.5% 이상 함유하는 미숙 토마토 분해물을 제조하는 방법 및 토마티딘을 0.5% 이상 함유하는 미숙 토마토 분해물을 유효성분으로 0.001 ~ 30.0중량%, 바람직하게는 0.01 ~ 5중량%를 함유하는 것을 특징으로 하며 활성산소 소거효과, 피부 잔주름 개선효과, 피부 탄력 개선효과, 노화방지 효과가 우수한 화장료 조성물에 관한 것이다.

Description

토마티딘을 함유하는 미숙 토마토 분해물 제조 방법 및 이를 함유하는 화장료 조성물{Immature tomato hydrolysates that have high tomatidine content, preparation method thereof and cosmetic composition containing the same}

본 발명은 미숙 토마토로부터 화장료 조성물을 제조하는 방법과 이를 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로서, 좀 더 구체적으로는 미숙 토마토로부터 토마틴(tomatine)을 분리하고, 이를 산 분해하여 토마티딘(tomatidine)을 함유하는 미숙 토마토 분해물을 제조하는 방법 및 토마티딘을 함유하는 미숙 토마토 분해물을 유효성분으로 함유하는 MMP-1 생합성 감소 및 타입 1 프로콜라겐 생합성 촉진효과, 피부 주름 개선효과 및 피부 탄력개선 효과 등이 우수한 화장료 조성물에 관한 것이다.

광노화는 피부가 자외선 등의 광에 반복적으로 노출되어 피부의 외양 또는 기능이 변화되는 것을 의미한다 [Ridder GM 등: J. Am. Acad. Dermatol., 25, 751-760(1991)]. 좀 더 구체적으로 말하자면, 광노화는 자외선에 의해 피부의 주요 구성물질인 지질, 단백질, 다당류 및 핵산 등이 손상되어 피부세포 및 조직이 파괴되고, 결국 피부노화 현상이 생겨나는 것이다. 특히 피부의 결합조직인 콜라겐, 히알루론산, 엘라스틴, 프로테오글라이칸, 피브로넥틴 등이 절단되어 피부 탄력에 지장을 주고 광노화의 주요 현상인 깊은 주름을 형성하게 되고 이것이 더 심해질 경우 DNA 변이에 의해 돌연변이, 암 유발, 면역기능 저하의 사태에 이르게 된다.

생체 내에서 콜라겐과 같은 세포 외 기질의 합성과 분해는 적절하게 조절되지만 노화가 진행되면서 특히 자외선에 만성적으로 노출되는 부위에서는 그 합성이 감소하고 분해는 촉진되는데, 자외선 등에 의해 콜라겐을 분해하는 효소인 기질금속단백질 분해효소(matrixmetalloproteinase, 이하 MMP라 칭함) 발현이 촉진되어 피부 탄력이 저하되고 주름이 형성된다.

토마토는 가지과에 속하는 일년생 작물로서 원산지는 남미 안데스 산맥의 고랭지대로 알려져 있으며, 보통 원산지에는 많은 종류의 야생종이 생육하는데, 페루, 에쿠아도르, 볼리비아 지방 등에서 수많은 야생종이 발견되며, 특히 안데스 산맥 중부지대에는 야생종과 재배종이 폭 넓게 분포한다. 2002년 미국 시사주간지 타임지에 10대 건강식품으로 선정될 정도로 세계적인 건강식품이며, 세계 각국에서 해마다 생산량이 증가하고 있고 우리나라에서도 기후 풍토가 적합하여 전국에 걸쳐 재배되고 있는 대표적인 과채류이다.

토마토는 대부분 빨간색의 성숙 토마토로 전 세계에서 채소 작물 중 가장 많이 생산되고 소비되는 채소로, 그 생산 규모와 교역 규모는 꾸준히 증가하고 있다. 토마토는 대부분 생과로 섭취하고 사용 목적에 따라 조리용, 생식용, 가공용 품종으로 나누어지며, 전 세계적으로 토마토를 이용한 요리가 7만개 이상 알려져 있다. 이러한 성숙 토마토에 함유된 대표적인 라이코펜(lycopene)은 항산화 물질로 각종 암과 혈관 질환에 대한 연구뿐만 아니라 광손상으로부터 피부를 보호하고 강력한 항산화제 기능으로 임상시험을 통해 거친 피부 개선 효과가 있는 것으로 밝혀졌다 [Edward G: J. National Cancer Institue, 91, 317-331(1999), Davin M 등: Euro. J. Pharma. Biopharma., 69, 943-947(2008)]. 하지만, 라이코펜(lycopene) 구조는 환구조가 없는 대칭형 평면구조로 공액 이중 결합이 많아 산화적 분해에 민감한 구조이며, 온도와 빛, 산소에 민감하며 이중 결합을 불안정하게 만드는 활성물질 등에 의해 분해가 쉽게 되는 불안정한 구조이다. 이러한 현상으로 인해 라이코펜을 상업적으로 이용하기 위해서는 캡슐형이나 올레오레진(oleoresin) 형태로 사용해야 하는 문제점이 있다.

토마토는 개화 후 약 50일 정도면 빨간색의 성숙 토마토로 성장하며, 개화 후 10일에서 20일 사이의 미숙 토마토에는 글리콜알칼로이드계의 토마틴(tomatine) 성분이 다량 함유되어 있고, 토마틴은 인체 박테리아의 항생물질로 작용하고 척추동물에서는 항염증 효과 및 사이토카인 유도작용, 항암 효과가 있는 것으로 밝혀졌다. 하지만, 라이코펜 함량이 많은 성숙 토마토는 생과로 소비될 뿐만 아니라 식품, 의약 그리고 화장품 산업분야에 널리 사용되고 있지만, 미숙 토마토를 활용한 예는 없다. 특히 화장품 분야에서는 미숙 토마토의 사용이 극히 제한적인데, 그 이유는 미숙 토마토에 함유된 토마틴 성분의 생물학적 특성에 관해서는 명확하지는 않으나 미생물이나 곤충에게 독성으로 작용해 외부로부터 자신을 보호하는 기능으로 세포독성을 나타내어 피부 자극을 유발할 수 있으며, 미숙 토마토 추출물의 강한 알카리성의 물리화학적 특성이 화장품 제형의 안정성에 영향을 미치기 때문이다.

본 발명의 목적은 토마티딘을 0.5% 이상 함유하는 미숙 토마토 분해물을 화장품 원료로서의 상용성을 높이고, 산업적인 면에서 좀 더 효율적이며 다양하게 이용 가능하도록 하고, 이를 유효한 성분으로 함유하는 항노화 기능성 화장료 조성물을 제공하려는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 화장료에 적용 가능하고 화장료에 함유시 활성산소 소거효과, MMP-1 생합성 감소 및 타입 1 프로콜라겐 생합성 촉진효과, 피부 주름 개선효과 등이 우수한 항노화 효과를 나타내는 미숙 토마토 분해물을 함유하는 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 토마티딘을 0.5% 이상 함유하는 미숙 토마토 분해물을 제조하는 방법을 제공하려는 것이다.

이에, 본 발명자들은 미숙 토마토로부터 항노화 기능성 화장품 주성분 및 지표성분으로 활용 가능한 토마티딘 함량이 높은 분해물을 제조하여, 미숙 토마토에 다량 함유된 토마틴보다 세포독성이 현전히 낮은 것으로 보고된[Choi 등: J. Agric. Food Chem., 60, 3891-3899(2012)] 토마티딘(tomatidine)의 유효성분의 함량이 증가된 미숙 토마토 분해물이 피부 자극완화 및 화장품 제형의 안정성을 개선시키고, 항노화 기능성 화장료 조성물로서의 효능을 기대할 수 있음을 알게 되었다.

본 발명은

1단계: 개화 후 10일 이상 30일 미만이며 토마틴(tomatine)을 함유하는 미숙 토마토에 토마틴을 추출하기 위한 추출용매로서 유기용매, 바람직하게는 추출액 중량 대비 20중량% 내지 80중량% 범위의 에틸알코올과 5중량% 내지 10중량% 범위의 아세트산을 첨가하여 20~100℃로 가온, 냉각 및 여과하여 얻어진 추출물을 감압 농축하여 용매를 제거한 건고물을 제조하는 공정,

2단계: 제조된 미숙 토마토 건고물을 염산(hydrochloric acid), 아세트산(acetic acid), 개미산(formic acid), 낙산(butyric acid), 프로피온산(propionic aci1d), 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid, TFA), 펜타플루오로프로피온산(pentafluoropropionic acid, PFPA), 헵타플루오로부티르산(heptaflurobutyric acid, HFBA), 노나플루오로펜타논산(nonafluoro pentanoic acid, NFPA), 트리데카플루오로 헵타논산(tridecafluoroheptanoic acid, TDFHA), 펜타데카플루오로옥타논산(pentadecafluorooctaonoic acid, PDFOA)으로부터 선택된 1종 이상의 휘발성 산 1~6 N 용액에 분산하여 밀폐된 용기에서 80~125 ℃ 반응 온도를 유지하며 산 분해를 진행한 후 여과하여 미숙 토마토 분해물을 제조하는 공정,

3단계: 제조된 미숙 토마토 분해물을 감압 농축하여 휘발성 산과 용매를 제거한 후 이를 다시 정제수에 용해하는 과정을 반복하여, 휘발성 산과 불순물을 제거하는 공정을 포함하는, 토마티딘을 0.5중량% 이상 함유하는 미숙 토마토 분해물 제조 방법에 관한 것이다.

이와 같이 제조된 미숙 토마토 분해물은 그대로 사용이 가능하며, 경우에 따라 한외여과 (Ultrafiltration) 장치와 겔크로마토그램을 이용하여 토마티딘 함량을 높인 미숙 토마토 분해물로 분획할 수 있으며, 다양한 목적에 사용할 수 있다.

이와 같이 제조된 미숙 토마토 분해물은 진공농축법으로 농축하여 사용할 수 있으며, 스프레이 드라이어를 이용하여 분말상의 미숙 토마토 분해물을 얻거나, 동결건조법을 이용하여 건조를 하고 적당한 크기로 분쇄를 하면 미숙 토마토 분해물 과립 및 세립을 얻을 수 있다.

또한, 본 발명의 미숙 토마토 분해물의 제조 방법에 있어서 산 분해에 이용된 휘발성 산이 염산(hydrochloric acid), 아세트산(acetic acid), 개미산(formic acid), 낙산(butyric acid), 프로피온산(propionic aci1d), 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid, TFA), 펜타플루오로프로피온산(pentafluoropropionic acid, PFPA), 헵타플루오로부티르산(heptaflurobutyric acid, HFBA), 노나플루오로펜타논산(nonafluoro pentanoic acid, NFPA), 트리데카플루오로헵타논산(tridecafluoroheptanoic acid, TDFHA) 및 펜타데카플루오로옥타논산(pentadecafluorooctaonoic acid, PDFOA)으로부터 선택된 1종 이상의 휘발성 산인 것을 특징으로 하는데 이는 이외의 산은 감압 농축 등의 제조 과정 중 제거가 어려워, 제조가 완료된 원료 내에 불순물의 형태로 남을 수 있으며, 중화 과정을 통해 이를 중화할 경우 화장품 제형 중 유액과 겔 제형의 안정성에 심대한 영향을 미치는 염의 농도가 증가할 수 있다는 단점이 있다.

또한, 본 발명의 미숙 토마토 분해물 제조방법에 있어서, 상기 미숙 토마토 함유 토마틴 건고물을 분산하여 산 분해 하는 휘발성산 용액의 농도가 1~6 N 인 것을 특징으로 하는데, 1 N 미만에서 반응을 진행하는 경우, 분해 반응 속도와 토마틴의 분해율이 낮아 제조된 미숙 토마토 분해물 중 토마티딘 함량의 저하 및 분해 공정 소요 시간 증가로 인한 공정비용 증가를 일으킬 수 있으며, 6 N을 넘는 경우 반응 속도가 너무 빨라 원하는 산물을 얻기 위한 반응 속도의 조절이 힘들고, 탈수 축합반응 등의 불순물 생성 가능성이 있어 본 발명에서 요구하는 토마티딘을 0.5중량% 이상 함유하는 미숙 토마토 분해물의 생성이 어려우며, 경제성이 낮아진다.

또한, 본 발명의 미숙 토마토 분해물 제조방법에 있어서, 상기 미숙 토마토 함유 토마틴 건고물을 분산하여 산분해하는 온도 조건이 80~125 ℃인 것을 특징으로 하는데, 80 ℃ 미만에서는 분해 반응 속도와 토마틴의 분해율이 낮아 제조된 미숙 토마토 분해물의 토마티딘 함량 저하 및 분해 공정 소요 시간 증가로 인한 공정비용 증가를 일으킬 수 있으며, 125 ℃를 초과하는 온도는 가압 공정으로 추가적인 설비 사용으로 인한 공정 비용 증가와, 휘발성 산의 휘발로 인한 원료 손실, 환경적 오염 요인 제거를 위한 비용 등이 발생하는 등 본 발명에서 요구하는 토마티딘을 0.5% 이상 함유하는 미숙 토마토 분해물의 생성이 어려우며, 경제성이 낮아진다.

또한, 본 발명의 미숙 토마토 분해물 제조방법에 있어서, 제조된 미숙 토마토 분해물에 함유되어 있는 토마티딘의 함량이 0.5중량% 이상인 것을 특징으로 하는 데, 토마티딘 함량이 중량대비 0.5% 미만인 경우, 본 발명이 목적으로 하는 화장료, 특히 주름개선 등의 항노화 기능성 화장품 활성 성분으로 활용하기에는 함량이 낮은 단점이 있다.

또한, 본 발명은 미숙 토마토 분해물 제조방법에 있어서, 제조된 미숙 토마토 분해물의 함량이 화장료 조성물 전체에 대해서 동결건조중량 기준 0.001-30.0중량%인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공한다. 상기 추출물의 함량이 0.001중량% 미만인 경우에는 피부개선 효과가 거의 없으며, 30.0중량% 이상인 경우에는 함유량 증가에 대한 효과 증대 정도가 미미하여 경제적이지 못하다.

본 발명은 토마티딘 함량 0.5중량% 이상인 미숙 토마토 분해물 제조 방법으로 제조된 미숙 토마토 분해물에 관한 것이다. 본 발명에 의한 미숙 토마토 분해물은 추출시간 등에 따라 통상 토마티딘 함량이 0.5~30중량% 범위 내이며, 최대값은 40중량%를 넘지 않을 것으로 예상한다.

또한, 본 발명은 토마티딘 함량이 높은 미숙 토마토 분해물 제조 방법으로 제조된 미숙 토마토 분해물을 주요 활성성분으로 함유하는 노화 방지 효능을 나타내는 화장료 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 토마티딘 함량이 높은 미숙 토마토 분해물 제조 방법으로 제조된 미숙 토마토 분해물을 주요 활성성분으로 함유하는 피부 주름개선 효과를 지니는 화장료 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 토마티딘 함량이 높은 미숙 토마토 분해물 제조 방법으로 제조된 미숙 토마토 분해물을 주요 활성성분으로 함유하는 피부 탄력개선 효과를 지니는 화장료 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 화장료 조성물이 화장수, 젤, 수용성 리퀴드, 크림, 에센스, 수중유(O/W)형 및 유중수(W/O)형의 제형 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 토마티딘을 0.5%이상 함유하는 미숙 토마토 분해물을 주요 활성성분으로 함유하는 항노화 기능성 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 미숙 토마토 분해물을 주요 활성성분으로 함유하는 조성물은 피부 흡수력이 뛰어나고, 기존의 미숙 토마토 단순 추출물보다 부작용이 없으면서, 활성산소 소거효과와 자외선 조사에 의한 MMP 발현 조절효과를 나타내었다.

또한, 본 발명의 조성물은 피부 주름 개선효과, 피부 탄력 개선효과 등 노화 방지 효과를 나타내었다.

따라서, 이러한 미숙 토마토 분해물을 함유하는 화장수, 크림, 유액, 팩, 파우더 등의 화장료 조성물은 활성산소 소거효과와 콜라겐 분해효소 활성 조절효과, 피부 주름 개선 효과, 피부 탄력 개선 효과, 노화 방지 효과 등 우수한 효과를 나타낸다.

이하, 실시예를 통해 본 발명의 구성을 좀더 구체적으로 설명한다. 단, 이들 실시예는 본 발명의 예시적인 기재일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되는 것은 아니다.

실시예 1: 미숙 토마토 추출물 제조

세절하여 음건한 개화 후 10~30일의 미숙 토마토를 70% 에틸알코올과 1.0% 아세트산에 10중량%로 분산한 후, 밀폐된 용기로 옮겨, 교반하면서 80 ℃로 4시간 추출한 후, 와트만(Whatman) #2 여과지로 여과하였다. 여과된 추출물은 50 ℃ 이하에서 감압농축 및 동결건조시켜 분말상 추출물을 제조하였다.

실시예 2: 미숙 토마토 분해물 제조

실시예 1에서 수득한 미숙 토마토 추출물 10g을 트리플루오로아세트산 (trifluoroacetic acid, TFA) 2N 용액 1 리터에 분산한 후, 밀폐된 용기에서 100 ℃ 반응온도를 유지하며 2시간 동안 산 분해를 진행하였다. 여과한 분해물을 50 ℃ 이하에서 감압농축하고 이를 다시 정제수에 용해하여 감압농축하는 과정을 3회 반복하여 휘발성 산과 용매를 제거하였다. 제조된 미숙 토마토 추출물의 산 분해물은 6.7g이었다.

실시예 1 내지 2에서 수득한 미숙 토마토 추출물과 미숙 토마토 분해물에 함유되어 있는 주요 성분을 HPLC법에 의한 분석방법[(Taveira M등: Food Chemistry, 135, 748-755(2012)]으로 미숙 토마토 추출물과 분해물의 토마틴과 토마티딘 성분의 변화량을 측정하였으며, 표준품 토마틴과 토마티딘은 크로마덱스(Chromadex, USA)에서 구입하여 비교 분석한 결과를 표 1에 나타내었다.

실시예 3: NBT 법을 이용한 항산화 효과 측정 실험

실시예 1 내지 2에서 수득한 미숙 토마토 추출물과 미숙 토마토 분해물의 항산화 효과를 확인하기 위해 실험실 조건에서 항산화제로 잘 알려진 BHT (Butylated hydroxytoluene)를 비교시료로 하고 NBT (Nitro Blue Tetrazolium)법을 이용하여 항산화 활성을 측정하였다.

항산화 효과를 측정하기 위해서 크산틴과 크산틴옥시다제에 의해 생성되는 활성산소를 NBT법에 의해 측정하고 피검물질이 활성산소를 제거하는 효과, 즉 활성산소 소거효과를 평가한다. 크산틴과 크산틴옥시다제에 의해 활성산소를 생성시킨다. 이 활성산소가 니트로블루테트라졸리움(Nitro Blue Tetrazolium; NBT)과 반응하여 이것에 의해 생성되는 청색을 파장 560nm에서 측정하는 것으로 활성산소 소거율을 측정한다.

측정방법으로서

1. 0.05M Na₂CO₃ ------------------------------------- 2.4 ㎖

2. 3mM 크산틴 용액---------------------------------- 0.1 ㎖

3. 3mM EDTA 용액------------------------------------ 0.1 ㎖

4. BSA 용액----------------------------------------- 0.1 ㎖

5. 0.72mM NBT 용액---------------------------------- 0.1 ㎖

6. 크산틴 옥시다제 용액----------------------------- 0.1 ㎖

7. 6mM CuCl₂ 용액----------------------------------- 0.1 ㎖

바이엘병에 1, 2, 3, 4, 5를 가하고 여기에 시료용액 0.1 ㎖를 첨가하고 25 ℃에서 10분간 방치한다.

6을 가하여 빨리 교반하고 25 ℃에서 20분간 배양한다.

그 후 7을 가하여 반응을 정지시키고 560nm에서의 흡광도 St를 측정한다.

공시험은 시료용액 대신에 증류수를 사용한 것을 상기와 똑같이 조작해 흡광도 Bt를 측정한다.

역시, 시료용액의 블랭크(Blank)는 6 대신에 증류수를 사용해 똑같이 조작하여 흡광도 Bo를 측정한다.

효과는 수학식 1에 의하여 산출하였으며, 그 결과는 표 2에 나타내었다.

St : 시료용액의 효소 반응 후의 560nm에서의 흡광도

Bt : 공시험용액의 효소 반응 후의 560nm에서의 흡광도

So : 시료용액의 효소 무첨가시 반응 전의 560nm에서의 흡광도

Bo : 공시험용액의 효소 무첨가시 반응 전의 560nm에서의 흡광도

표 2에서 확인할 수 있듯이 실시예 2의 미숙 토마토 분해물은 BHT보다 우수한 항산화력을 갖고 있음이 확인되었다.

실시예 4: 자유라디칼 소거활성 측정 실험

실시예 1 내지 2에서 수득한 미숙 토마토 추출물과 미숙 토마토 분해물의 자유라디칼 소거활성을 측정하기 위해 실험실 조건에서 BHT와 같은 항산화제를 비교시료로 하고 DPPH법을 이용하여 자유라디칼 소거활성을 측정하였다.

DPPH법은 DPPH {2,2-Di(4-tert-octylphenyl)-1-picrylhydrazyl free radical}라는 유리기를 사용하여 환원력에 의한 자유라디칼 소거활성을 측정한다. 피검물질에 의해 DPPH가 환원되어 흡광도가 감소하는 정도를 공 시험액의 흡광도와 비교하여 파장 560nm에서 자유라디칼 소거율을 측정한다. DPPH 자유라디칼 소거활성 측정을 위하여 각 시료 0.1% 농도로 준비하였다. 상기 농도의 시료를 96웰 플레이트에 각각 넣고, 여기에 100uM 메탄올용액으로 제조된 DPPH를 첨가하여 용액의 총 부피가 200 ㎕가 되도록 하였다. 이것을 37 ℃에서 30분간 방치한 후 560nm에서 흡광도를 측정하였다. 자유라디칼 소거활성(%)은 다음의 수학식 2로 산출하였다.

A: 본 발명의 시료를 처리하지 않은 대조군 웰의 흡광도

B: 본 발명의 시료를 처리한 실험군 웰의 흡광도

표 3에서 확인할 수 있듯이 실시예 2의 미숙 토마토 분해물은 항산화제로 많이 이용되고 있는 BHT보다 우수한 항산화 효과를 나타냄을 알 수 있었다.

실시예 5: 시료의 세포독성 확인 시험

실시예 1 내지 2에서 수득한 미숙 토마토 추출물과 미숙 토마토 분해물 시료 처리에 의한 피부세포의 세포독성을 평가하였다. 섬유아세포 (fibroblast)를 24-웰 시험 플레이트에 1×10⁵개씩 넣고 24시간 동안 부착시켰다. 각 웰을 PBS (Phosphate buffered saline)로 1회 세척하고 각 웰에 세포배양 배지(DMEM에 10% FBS가 첨가된 것) 1 ㎖와 적절한 농도로 희석한 실시예 1 내지 2를 각각 처리한 후 24시간 동안 배양하였다. 24시간이 지나면 배지를 제거하고, 각 웰 당 세포배양 배지 500 ㎕와 MTT {3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyl tetrazolium bromide} 용액(2.5mg/㎖) 60 ㎕를 넣은 후 2시간 동안 37 ℃ CO₂ 배양기에서 배양하였다. 배지를 제거하고 아소프로판올-HCl(0.04N)을 500 ㎕씩 넣어주었다. 5분간 진탕하여 세포를 용해시키고 상등액 100씩을 96-웰 시험 플레이트에 옮긴 후, 마이크로플레이트 판독기에서 565nm 흡광도를 측정하였다. 수학식 3에 의해 세포생존율(%)을 측정하였으며, 세포의 생존에 영항을 미치지 않는 시료의 농도를 결정하였다.

Bo : 세포배양배지만을 발색 반응한 웰의 565nm 흡광도

Bt : 시료를 처리하지 않고 발색 반응한 웰의 565nm 흡광도

St : 시료를 처리하고 발색 반응한 웰의 565nm 흡광도

표 4와 같이 실시예 2의 미숙 토마토 분해물은 100% 세포 생존 농도가 0.5%으로 세포독성이 낮아 매우 안전한 것으로 확인되었다. 이에 비해 실시예 1의 미숙 토마토 추출물은 0.5% 처리시 세포 생존율이 32.4%로 상대적으로 피부 세포에 대한 세포독성이 높음을 확인하였다. 또한, 미숙 토마토 추출물과 분해물에 각각 다량 함유된 토마틴과 토마티딘의 세포 생존율을 확인한 결과, 처리농도 0.1% 처리시 세포 생존율은 각각 21%와 99.7%였다.

따라서, 실시예 1 내지 2의 세포 생존율의 차이는 미숙 토마토 추출물에 함유된 토마틴과 미숙 토마토 분해물에 함유된 토마티딘에 의한 것임을 확인하였고, 미숙 토마토 추출물의 산 분해 과정 중 토마틴 함량이 줄고, 반면 토마티딘 함량이 증강된 미숙 토마토 분해물은 세포독성이 낮아졌음을 알 수 있다.

실시예 6: 세포 내 활성산소 소거효과

실시예 1 내지 2에서 수득한 미숙 토마토 추출물과 미숙 토마토 분해물을 자외선에 의해 세포 내에서 생성되는 활성산소 생성 억제효과 즉, 활성산소 소거효과를 알아보기 위하여 비교시료로 EGCG (Epigallocatechin gallate)를 선정하고, 형광물질을 이용하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.

실험에 사용한 세포주는 독일 암연구센터의 퓌세니그 박사(Dr. Fusenig)로부터 분양받은 인간 각질세포 HaCaT 세포주(Human keratinocytes HaCaT cell line)로서 이를 형광측정용 96웰 블랙 플레이트(well black plate)에 웰당 2.0×10⁴개로 분주하고 페니실린/스트렙토마이신 (penicillin/streptomycin) 첨가된 DMEM (Dulbeccos Modification of Eagles Medium, FBS 10%, Gibco, USA)배지를 사용하여 37 ℃, 5% CO₂ 조건에서 1일간 배양한 후, 실시예 1 내지 2에서 수득한 미숙 토마토 추출물과 미숙 토마토 분해물을 각각 0.01% 농도로 처리하였다.

시험시료를 넣고 24시간 배양한 후 HCSS (HEPES-buffered control salt solution)로 세척하여 남아있는 배지를 제거하고 HCSS에 20 μM로 준비된 DCFH-DA (2',7'- dichlorodihydro-fluorescein diacetate, Molecular Probes, USA)를 100 ㎕ 가하고 37 ℃, 5% CO₂ 조건에서 20분간 배양한 후, HCSS로 세척하였다. 이후 농도별로 처리된 HCSS를 100 ㎕ 가한 후 초기에 활성산소로 산화된 DCF (dichlorofluorescein)의 형광도를 형광플레이트리더 (Ex;485 nm, Em;530nm)로 측정하였다. 이후 UVB (20mJ/㎠)를 조사하고 각각의 시료를 처리 후 형광도를 형광플레이트 리더 (Ex;485nm, Em;530nm)로 측정하였다.

표 5와 같이, 실시예 2에서 수득한 미숙 토마토 분해물은 활성산소 소거효과에 비교 시료로 많이 이용되고 있는 EGCG보다 우수한 활성산소 소거 효과가 있음을 알 수 있었다.

실시예 7: 인 비트로 MMP -1 활성저해 실험

MMP-1 활성 저해 효과를 측정하기 위하여 형광 분석법을 이용하였다. 실험에 사용한 기질은 형광물질이 표지된 DQ-Collagen, 효소(collagenase)는 Molecular probe사(Eugene, OR, USA)에서 시판중인 제품을 사용하였으며, 반응완충액(0.5 M Tris-HCl, 1.5 M NaCl, 50 mM CaCl₂, 2 mM sodium azide, pH 7.6)은 10배 희석 후 사용하였다. 반응완충액 100 ㎕에 0.25 ㎎/㎖로 반응완충액에 용해한 DQ collagen 20 ㎕와 실시예 1 내지 2에서 수득한 미숙 토마토 추출물과 미숙 토마토 분해물을 각각 0.1중량%로 40 ㎕을 첨가하고 0.5 unit로 희석한 콜라게나아제(collagenase) 40 ㎕을 첨가한다. 암소, 실온에서 20분 경과 후 형광 분광광도계(Perkin Elmer, UK)를 이용하여 흡수파장 495 nm, 방출파장 515 nm로 형광값을 측정하며, 대조군으로서 효소액 대신 반응완충액을 효소와 동량 첨가하여 형광값을 측정하였으며 시료 자체의 형광값도 측정하여 효소활성 계산시 보정하였다.

결과는 표 6과 같이 실시예 2의 미숙 토마토 분해물 0.1% 처리시 클로스트리디움 콜라게나제의 콜라겐 분해활성을 94% 억제하였으며 이는 녹차추출물의 저해 효과보다 우수하게 나타났다.

실시예 8: 자외선 조사 후 MMP -1 발현억제 평가

실시예 1 내지 2에서 수득한 미숙 토마토 추출물과 미숙 토마토 분해물의 UV 조사 및 시료 첨가 후 MMP-1 농도를 측정하기 위해서 효소면역 시험법(ELISA)을 실시하였다.

UV 챔버를 이용하여 인간 진피 섬유아세포에 UVA를 6.3J/㎠의 에너지로 조사하였다. 자외선 조사량과 배양시간은 예비실험을 통하여 섬유아세포에서 MMP 발현량이 최대가 되는 조건을 확립하였다. 음성 대조군은 은박지로 싸서 UVA의 환경에 같은 시간을 유지시켰다. UVA 방출량은 UV 라디오미터를 이용하여 측정하였다. UVA가 조사되는 동안의 세포는 이전에 분주된 배지 그대로이고 UVA를 조사한 후 샘플이 들어간 배지로 교환하여 24시간 배양 후 배지를 회수하여 96웰에 코팅하였다. 일차항체(MMP-1 (Ab-5) 단일클론항체)를 처리하고 37 ℃에서 60분간 반응시켰다. 이차항체인 안티마우스 IgG(whole mouse, alkaline phosphatase conjugated)를 다시 60분 정도 반응시킨 후, 알카린 포스파타제 기질용액(1 ㎎/㎖ ρ-nitrophenyl phosphate in diethanolamine 완충용액)을 상온에서 30분간 반응시키고 마이크로플레이트 리더로 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군으로는 시료를 첨가하지 않은 것을 사용하였다.

자외선 조사시 발현이 유도되는 MMP-1에 대하여 시료를 처리하지 않은 대조군에 비하여 실시예 2에서 수득한 미숙 토마토 분해물은 0.01% 처리농도에서 83%의 억제율을 보였으며 이는 대조군으로 사용한 EGCG의 억제율에 비해 우수한 결과를 나타내었다.

실시예 9: 타입 1 프로콜라겐 생합성 촉진 효과

실시예 1 내지 2에서 수득한 미숙 토마토 추출물과 미숙 토마토 분해물을 첨가한 후 피부기질 성분인 타입 1 프로콜라겐의 생합성을 촉진시키는 효과를 알아보기 위하여 프로콜라겐 분석(procollagen assay)을 하기와 같은 방법으로 실시하였다.

신생아의 포피조직에서 분리한 사람 진피 섬유아세포(human dermal fibroblast)는 Modern Tissue Technology(MTT, Korea)로부터 분양받아 DMEM/F-12 (3:1)배지에 10% 우태아혈청(FBS)을 첨가하여 1×10⁴cell/㎠ 농도로 배양하였다. 70-80% 정도 자라면 1:3의 비율로 분주하여 계대 배양하였고, 3~4차 계대배양된 세포를 실험에 이용하였다.

프로콜라겐의 양을 측정하는 실험을 위해서 섬유아세포를 48 웰 플레이트(well plate)에 90% 이상 배양한 후 실시예 1 내지 2에서 수득한 미숙 토마토 추출물과 미숙 토마토 분해물을 각각 0.02% 농도로 가하고, 24시간 후에 배지 중에 유리된 프로콜라겐의 양을 프로콜라겐타입-1C-펩타이드 EIA 키트(procollagen type-1 C-peptide EIA kit)(MK101, Takara, Japan)를 사용하여 측정하였다.

결과는 표 8에 나타냈으며 실시예 2의 미숙 토마토 분해물은 0.02% 처리시 프로콜라겐의 생합성이 각각 41% 촉진하였으며 이는 세포신호전달 물질은 TGF-β와 유사한 효과를 나타내었다.

실시예 10 및 비교예 1

실시예 2에서 수득한 미숙 토마토 분해물을 함유한 화장료를 제조하여 사람을 대상으로 피부 탄력 개선 효과 및 주름 개선 효과를 비교예 1과 비교실험을 행하여 평가하였다.

비교실험에 사용된 화장료는 크림형태이고, 그 조성은 표 9에 나타낸 바와 같다. 우선 표 9에 기록되어 있는 나)상을 가열하여 70 ℃에 보존한다. 이것에 가)상을 가하여 예비유화 후 호모믹서로 균일하게 유화하고 다음에 서서히 냉각하여 크림 (실시예 10, 비교예 1)을 제조한다. 실험자 (20세-35세의 여성) 20명을 대상으로 얼굴 오른쪽 부위에는 실시예 10에서 제조된 크림을, 얼굴 왼쪽 부위에는 비교예 1에서 제조된 크림을 각각 1일 2회씩 연속 2개월간 도포하였다.

실험완료 후 피부 탄력 개선 효과는 제품 사용 전과 2개월간 사용 후에 피부탄력측정기 (cutometer SEM 575, C+K Electronic Co., Germany)를 이용하여 측정하였다. 실험결과는 하기 표 10에 Cutometer SEM 575의 R7값으로 기재하였는데 R7값은 피부의 점탄성(viscoelasticity)의 성질을 나타낸다. 표 10에서 나타난 바와 같이 미숙 토마토 분해물을 함유한 크림을 도포한 실험자의 피부 탄력개선 효과가 우수함을 알 수 있다.

실험자 (20세-35세의 여성) 20명을 대상으로 얼굴 오른쪽 부위에는 실시예 10에서 제조된 크림을 얼굴 왼쪽 부위에는 비교예 1에서 제조된 크림을 각각 1일 2회씩 연속 2개월간 도포하였다.

실험완료 후 피부 주름 개선 효과는 제품 사용 전과 2개월간 사용 후에 피부의 주름개선효과를 알아보기 위하여 실리콘 재질의 모사판 (replica)을 제작하여 지정 부위의 주름의 상태를 화상분석기인 비지오미터 (visiometer: SV60, C+K Electronic Co., Germany)로 측정하였다. 그 결과를 하기 표 11에서 나타내었으며, 이 결과는 2개월 후의 각각의 파라미터(parameter) 값에서 2개월 전 파라미터 값을 뺀 것의 평균을 나타낸 것이다. 즉, 이 값이 음수가 나올수록 주름 개선 효과가 높다는 것을 의미한다. 따라서 표 11과 같이 실시예 2의 미숙 토마토 분해물을 함유한 실시예 10의 피부 주름 개선 효과가 크게 증진되었음을 확인할 수 있었다.

실시예 11: 미숙 토마토 분해물을 함유한 화장수의 제조

95% 에탄올 8g에 폴리피로리돈 0.05g, 올레일알콜 0.1g, 폴리옥시에틸렌모노올레이트 0.2g, 향료 0.2g, 파라옥시안식향산메틸에스테르 0.1g, 소량의 산화방지제, 소량의 색소를 혼합용해 한다. 실시예 2의 미숙 토마토 분해물 0.05g, 글리세린 5g을 정제수 85.33g에 용해한 것에 상기 혼합액을 첨가한 후 교반하여 피부개선효과가 있는 화장수를 얻었다.

실시예 12: 미숙 토마토 분해물을 함유한 유액의 제조

세틸알콜 1.2g, 스쿠알란 10g, 바세린 2g, 파라옥시안식향산에틸에스테르 0.2g, 글리세린모노에스테아레이드 1g, 폴리옥시에틸렌(20몰부가)모노올레이트 1g 및 향료 0.1g을 70 ℃에서 가열, 혼합, 용해하고, 실시예 2의 미숙 토마토 분해물 0.5g, 디프로필렌글리콜 5g, 폴리에틸렌글리콜-1500 2g, 트리에탄올아민 0.2g, 정제수 76.2g을 75 ℃로 가열해서 용해시킨다. 양자를 혼합하여 유화시킨 후 냉각하여 수중유 (O/W)형의 피부개선효과가 있는 유액을 얻었다.

실시예 13: 미숙 토마토 분해물을 함유한 미용액의 제조

95% 에틸알콜 5g에 폴리옥시에틸렌솔비탄모노올레이트 1.2g, 키툴로오즈 0.3g, 히야론산나트륨 0.2g, 비타민 E-아세테이트 0.2g, 감초산 나트륨 0.2g, 파라옥시안식향산에틸에스테르 0.1g, 실시예 2의 미숙 토마토 분해물 1g 및 적량의 색소를 혼합하여 피부개선효과가 있는 미용액을 얻었다.

Claims

개화 후 10~30일 된 미숙 토마토에 휘발성 산을 가하여 분해하여 얻어지며, 토마티딘을 0.5~40.0중량% 함유하는 미숙 토마토 분해물을 0.001 내지 40.0중량% 함유하는 것을 특징으로 하는 미숙 토마토 분해물을 함유하는 화장료 조성물.
청구항 1에 있어서,
상기 화장료 조성물은 항노화 기능성 화장료 조성물임을 특징으로 하는 미숙 토마토 분해물을 함유하는 화장료 조성물.
청구항 1에 있어서,
상기 화장료 조성물은 피부 탄력 개선 효과를 나타내는 것을 특징으로 하는 미숙 토마토 분해물을 함유하는 화장료 조성물.
청구항 1에 있어서,
상기 화장료 조성물은 피부 주름 개선 효과를 나타내는 것을 특징으로 하는 미숙 토마토 분해물을 함유하는 화장료 조성물.
청구항 1에 있어서,
상기 미숙 토마토 산 분해물은
1단계: 개화 후 10~30일의 미숙 토마토를 유기용매로 추출하여 용매를 제거한 건고물을 제조하는 공정;
2단계: 제조된 미숙 토마토 건고물을 휘발성 산 용액에 분산하여 산 분해를 진행한 후 여과하여 미숙 토마토 분해물을 제조하는 공정;
3단계: 제조된 미숙 토마토 분해물에서 휘발성 산과 용매를 제거하는 공정;을 포함하는 방법에 의하여 제조됨을 특징으로 하는 미숙 토마토 분해물을 함유하는 화장료 조성물.
청구항 1에 있어서,
상기 휘발성 산은 염산(hydrochloric acid), 아세트산(acetic acid), 개미산(formic acid), 낙산(butyric acid), 프로피온산(propionic aci1d), 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid, TFA), 펜타플루오로프로피온산(pentafluoropropionic acid, PFPA), 헵타플루오로부티르산(heptaflurobutyric acid, HFBA), 노나플루오로펜타논산(nonafluoro pentanoic acid, NFPA), 트리데카플루오로 헵타논산(tridecafluoroheptanoic acid, TDFHA), 펜타데카플루오로옥타논산(pentadecafluorooctaonoic acid, PDFOA)으로부터 선택된 1종 이상의 휘발성 산임을 특징으로 하는 미숙 토마토 분해물을 함유하는 화장료 조성물.