KR20190079338A - 개나리 꽃 추출물의 분획물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 개나리 꽃 추출물의 분획물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 개나리 꽃 추출물을 물을 포함하는 용매로 제1분획하고, 에틸아세테이트 및 부탄올을 포함하는 용매로 제2분획하여 수득된 개나리 꽃 추출물의 분획물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백, 항산화 또는 항염증용 화장료 조성물; 상기 개나리 꽃 추출물의 분획물을 제조하는 방법; 개나리 꽃으로부터 페놀릭 화합물을 분리하는 방법; 및 신규한 페놀릭 화합물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 개나리 꽃 추출물의 분획물은 페놀릭 화합물을 고농도로 함유하며, 세포에 대한 독성이 없고, 피부 미백, 항염증 또는 항산화 활성이 우수하므로, 화장료 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

개나리 꽃 추출물의 분획물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물 {A cosmetic composition comprising fractions of extracts of flower of Forsythia koreana as an active ingredient}

본 발명은 개나리 꽃 추출물의 분획물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 개나리 꽃 추출물을 물을 포함하는 용매로 제1분획하고, 에틸아세테이트 및 부탄올을 포함하는 용매로 제2분획하여 수득된 개나리 꽃 추출물의 분획물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백, 항산화 또는 항염증용 화장료 조성물; 상기 개나리 꽃 추출물의 분획물을 제조하는 방법; 개나리로부터 페놀릭 화합물을 분리하는 방법; 또는 신규한 페놀릭 화합물에 관한 것이다.

현대인들의 생활수준 향상과 더불어 노령인구가 증가함에 따라 노화방지, 주름개선, 미백, 자외선 차단 등과 관련된 기능성 화장품에 대한 관심과 수요가 증가하고 있는 추세이다. 그러나, 기초 화장품 또는 기능성 화장품은 대부분 화학물질로 제조되기 때문에 인체에 대한 안전성 문제가 꾸준히 제기되었다. 이에 따라, 천연, 유기농 원료를 함유한 제품에 대한 관심이 증가하고 있으며, 관련 제품의 시장 규모 또한 증가하고 있다.

예를 들어, 수수의 황국균 발효 추출물을 포함하는 피부 개선용 화장료 조성물(한국 공개특허공보 제10-2017-0122421호), 갈근 추출물을 포함하는 천연 리포좀을 포함하는 화장료 조성물(한국 등록특허공보 제10-1790850호), 생지황, 구기자, 황금 및 백지 혼합 추출물을 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물(한국 등록특허공보 제10-1753304호) 등이 개발된바 있다.

한편, 개나리(Forsythia koreana)는 쌍떡잎식물 용담목 물푸레나무과의 낙엽 관목으로, 이의 뿌리, 줄기, 잎, 열매 등이 약용으로 사용되고 있다. 특히, 개나리 열매는 연교로 불리며 한방에서는 한열, 발열, 화농성질환, 림프선염, 소변불리, 종기, 신장염, 습진 등에 처방되고 있으며, 다양한 약용 성분이 포함되어 있다고 알려져 있다. 다만, 약리 활성 규명에 대한 대부분의 연구가 연교에 집중되어 있어, 개나리의 다른 부위에 대한 활발한 연구가 필요한 실정이다.

이러한 배경하에, 본 발명자들은 피부 상태를 개선하기 위한 화장료 조성물의 원료를 개발하기 위하여 연구한 결과, 개나리 꽃 추출물의 분획물, 특히 물, 에틸아세테이트, 부탄올 등을 이용하여 분획한 분획물은 페놀릭 화합물을 고농도로 함유하여 항산화 효과, 멜라닌 합성 억제 효과, 항염증 효과 등이 우수함을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 개나리 꽃 추출물의 분획물을 유효성분으로 포함하는, 피부 미백, 항산화 또는 항염증용 화장료 조성물로서, 상기 분획물은 개나리 꽃 추출물을 물을 포함하는 용매로 제1분획하고, 에틸아세테이트 및 부탄올을 포함하는 용매로 제2분획하여 수득된 것인, 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 (a) 개나리 꽃을 용매로 추출하여 개나리 꽃 추출물을 수득하는 단계, (b) 상기 개나리 꽃 추출물을, 물을 포함하는 용매로 분획하여 개나리 꽃 제1분획물을 수득하는 단계, 및 (c) 상기 개나리 꽃 제1분획물을, 에틸아세테이트 및 부탄올을 포함하는 용매로 분획하여 개나리 꽃 제2분획물을 수득하는 단계를 포함하는, 페놀릭 화합물을 고농도로 함유하는 개나리 꽃 추출물의 분획물을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 (a) 개나리 꽃을 용매로 추출하여 개나리 꽃 추출물을 수득하는 단계, (b) 상기 개나리 꽃 추출물을 용매로 분획하여 개나리 꽃 분획물을 수득하는 단계, 및 (c) 상기 분획물로부터 화학식 3, 8, 9, 10, 11 및 12로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 페놀릭 화합물을 분리하는 단계를 포함하는, 개나리 꽃으로부터 페놀릭 화합물을 분리하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 화학식 8, 10 또는 12 중 어느 하나로 표시되는 화합물 또는 이의 염을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 하나의 양태는 개나리 꽃 추출물의 분획물을 유효성분으로 포함하는, 피부 미백, 항산화 또는 항염증용 화장료 조성물로서, 상기 분획물은 개나리 꽃 추출물을 물을 포함하는 용매로 제1분획하고, 에틸아세테이트 및 부탄올을 포함하는 용매로 제2분획하여 수득된 것인, 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 개나리 꽃 추출물을 물을 포함하는 용매로 제1분획하고, 에틸아세테이트 및 부탄올을 포함하는 용매로 제2분획하여 수득한 분획물은, 상기 추출물에 비하여 페놀릭 화합물을 고농도로 포함하고 있으며, 피부 미백, 항산화 및 항염증 효과가 더욱 우수하므로 화장료 조성물로서 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 용어, "개나리 꽃"은 개나리(Forsythia koreana)의 꽃을 의미한다. 상기 개나리 꽃의 추출물이 항산화 효과가 있음은 공지된 바 있으나, 피부 미백 또는 항염증 효과에 대해서는 공지된 바 없고, 상기 추출물보다 페놀릭 화합물을 고농도로 포함하는 개나리 꽃 추출물의 분획물을 제조하는 방법에 대해서는 개시된바 없다. 특히, 상기 분획물의 피부 미백, 항산화 또는 항염증 효과에 대해서는 개시된바 없으며, 본 발명자들에 의해 최초로 규명되었다.

상기 개나리 꽃은 상업적으로 판매되는 것을 구입하거나, 자연에서 채취 또는 재배된 것을 사용할 수 있다.

본 발명의 용어, "추출물"은 상기 개나리 꽃을 추출 처리하여 얻어지는 추출액, 상기 추출액의 희석액이나 농축액, 상기 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 상기 추출액의 조정제물이나 정제물, 또는 이들의 혼합물 등, 추출액 자체 및 추출액을 이용하여 형성 가능한 모든 제형의 추출물을 포함한다.

상기 개나리 꽃을 추출하는 방법은 특별히 제한되지 않으며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방법에 따라 추출할 수 있다. 상기 추출 방법의 비제한적인 예로는, 열수 추출법, 초음파 추출법, 여과법, 환류 추출법 등을 들 수 있으며, 이들은 단독으로 수행되거나 2종 이상의 방법을 병용하여 수행될 수 있다.

또한, 상기 개나리 꽃을 추출하는데 사용되는 추출 용매의 종류는 특별히 제한되지 않으며, 당해 기술 분야에서 공지된 임의의 용매를 사용할 수 있다. 상기 추출 용매의 비제한적인 예로는 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올 또는 이들의 혼합 용매 등을 들 수 있으며, 이들은 단독으로 사용되거나 1종 이상 혼합하여 사용될 수 있다. 구체적으로, 메탄올 또는 에탄올 수용액이 사용될 수 있으며, 상기 메탄올 또는 에탄올 수용액은 70 내지 90%(v/v), 더욱 구체적으로 75 내지 85%(v/v), 가장 구체적으로 80 %(v/v) 메탄올 또는 에탄올일 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 용어, "분획물"은 여러 다양한 구성 성분들을 포함하는 혼합물로부터 특정 성분 또는 특정 성분 그룹을 분리하기 위하여 분획을 수행하여 얻어진 결과물을 의미한다.

상기 분획물을 얻는 분획 방법은 특별히 제한되지 않으며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방법에 따라 수행될 수 있다. 상기 분획 방법의 비제한적인 예로는, 다양한 용매를 처리하여 수행하는 용매 분획법, 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 통과시켜 수행하는 한외여과 분획법, 다양한 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)를 수행하는 크로마토그래피 분획법, 및 이들의 조합 등이 있다.

또한, 상기 분획물을 얻는데 사용되는 분획 용매의 종류는 당해 기술 분야에서 공지된 임의의 용매를 사용할 수 있다. 상기 분획 용매의 비제한적인 예로는 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올 등의 극성 용매; 헥산(Hexane), 에틸 아세테이트(Ethyl acetate) 등의 비극성 용매; 또는 이들의 혼합용매 등을 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 1종 이상 혼합하여 사용될 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 구체적으로, 물, 부탄올, 헥산, 에틸아세테이트 또는 이들의 혼합용매가 사용될 수 있다.

구체적으로, 상기 분획물은 개나리 꽃 추출물을 물을 포함하는 용매로 제1분획하고, 에틸아세테이트 및 부탄올을 포함하는 용매로 제2분획하여 수득할 수 있다. 또한, 상기 제1분획 및 제2분획은 3회 내지 5회, 구체적으로 4회 반복 수행될 수 있다.

이때, 상기 제1분획은 헥산, 에틸아세테이트 및 물로 구성된 용매로 분획하여 수득된 물 분획물일 수 있고, 상기 제2분획은 에틸아세테이트, 부탄올 및 물로 구성된 용매로 분획하여 수득된 에틸아세테이트 및 부탄올 분획물일 수 있다.

구체적으로, 상기 제1분획에 사용되는 용매 내 헥산 및 에틸아세테이트는 1:0.5 내지 1:1.5의 부피비, 더욱 구체적으로 1:1의 부피비로 혼합된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 더욱 구체적으로, 상기 헥산 및 에틸아세테이트의 혼합용매와 물은 1:0.5 내지 1:1.5의 부피비, 더욱 구체적으로 1:1의 부피비로 혼합된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 상기 제2분획에 사용되는 용매 내 에틸아세테이트 및 부탄올은 1:8 내지 1:12의 부피비로 혼합된 것일 수 있고, 구체적으로 1:10의 부피비로 혼합된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 더욱 구체적으로, 상기 에틸아세테이트 및 부탄올의 혼합용매와 물은 1:0.5 내지 1:1.5의 부피비, 더욱 구체적으로 1:1의 부피비로 혼합된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 실시예에서는, 건조한 개나리 꽃을 80% 메탄올을 이용하여 개나리 꽃 추출물을 수득하였고, 상기 추출물을 헥산, 에틸아세테이트 및 물이 혼합된 용매로 분획하여 물 분획물인 제1분획을 수득하였으며, 상기 제1분획을 에틸아세테이트, 부탄올 및 물이 혼합된 용매로 분획하여 에틸아세테이트 및 부탄올 분획물(FK9)인 제2분획을 수득하였다(도 10). 특히, 상기와 같은 용매 및 방법을 통해 제조한 분획물 FK9는 다른 용매/방법으로 사용하여 분획된 분획물보다 항산화 활성, 멜라닌 합성 저해 및 항염증 효과가 현저히 우수함을 확인하였다(도 14 및 15).

이는, 본 발명의 개나리 꽃 추출물의 분획물은 화장료 조성물의 유효성분으로서 매우 유용하게 사용될 수 있음을 시사하는 것이다.

본 발명의 목적상, 상기 분획물은 상기 추출물에 비하여 페놀릭 화합물을 고농도로 함유하는 것일 수 있다.

본 발명의 용어, "페놀릭 화합물"(phenolic compound)은 페놀 화합물로도 불리는, 방향족 고리를 갖는 화합물을 총칭한다. 일반적으로 타닌, 페닐프로파노이드(플라보노이드, 리그난 등)으로 분류되며, 항산화 효과가 우수하다고 알려져 있다.

본 발명에서, 상기 분획물이 고농도로 함유하는 페놀릭 화합물은 코리아나사이드 C(koreanaside C), 루틴(rutin), 마타이레시노사이드(matairesinoside), 코리아나사이드 A(koreanaside A), 악틴(arctiin), 마타이레시놀(matairesinol)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 용어, "코리아나사이드 C(koreanaside C)"는 하기 화학식 10으로 표시되는 것일 수 있다. 코리아나사이드 C는 기존에 공지되지 않은 신규한 화합물로서, 그 구조는 물론 개나리 꽃에 존재하는 것 또한 본 발명자들에 의해 처음으로 규명되었다.

[화학식 10]

본 발명의 용어, "루틴(rutin)"은 하기 화학식 14로 표시되는 것일 수 있다. 루틴은 플라보놀 배당체(글리코시드)로서, 회화나무, 메밀 등의 식물에서 분리되고 있으며, 모세혈관을 강화시키는 작용이 있고, 뇌출혈, 방사선 장애, 출혈성 질병 등을 예방하는 데 사용할 수 있다고 알려져 있다.

[화학식 14]

본 발명의 용어, "마타이레시노사이드(matairesinoside)"는 하기 화학식 7로 표시되는 것일 수 있다. 마타이레시노사이드는 리그난 배당체로서, 마삭줄, 당개나리 등의 식물에서 분리되고 있다.

[화학식 7]

본 발명의 용어, "코리아나사이드 A(koreanaside A)"는 하기 화학식 8로 표시되는 것일 수 있다. 코리아나사이드 A는 기존에 공지되지 않은 신규한 화합물로서, 그 구조는 물론 개나리 꽃에 존재하는 것 또한 본 발명자들에 의해 처음으로 규명되었다.

[화학식 8]

본 발명의 용어, "악틴(arctiin)"는 하기 화학식 6으로 표시되는 것일 수 있다. 악틴은 2,3-디벤질부티로락톤계 리그난 배당체로서, 우엉의 종자에 포함되어 있다고 알려져 있으며, 이를 가수 분해하면 D-글루코오스와 악티게닌이 생성된다.

[화학식 6]

본 발명의 용어, "마타이레시놀(matairesinol)"은 하기 화학식 4로 표시되는 것일 수 있다. 마타이레시놀은 리그난 유도체의 일종으로, 소나무과, 홍화씨 등에 포함되어 있다고 알려져 있다.

[화학식 4]

본 발명의 용어, "피부 미백"은 멜라닌 색소의 합성을 저해함으로써 피부 톤을 밝게 할 뿐만 아니라, 자외선, 호르몬 또는 유전에 기인한 기미나 주근깨 등의 피부 과색소 침착을 개선하는 것을 의미한다. 상기 피부 미백은 멜라닌 합성 저해에 의해 달성될 수 있다.

또한, 본 발명의 용어, "항산화"는 산화를 억제하는 작용으로서, 세포의 산화적 스트레스를 감소시키는 것을 의미한다. 활성 산소종(reactive oxygen species, ROS)에 의해 발생되는 산화적 스트레스는 세포와 조직에 비가역적인 손상을 야기하므로, 이를 억제하는 항산화 활성은 세포의 손상을 감소시켜 노화를 억제할 수 있고, 나아가 피부 주름, 피부 톤, 피부 탄력 등을 개선할 수 있다.

또한, 본 발명의 용어, "항염증"은 염증을 억제하는 것을 의미한다. 염증 반응은 생체 내 복구체계의 증강 및 손상을 감소시키기 위하여 야기되는데, 그 정도가 심하거나 오랜 기간 지속되면 세포의 손상이 야기되어 다양한 염증성 질환이 발병될 수 있다. 이를 억제하는 항염증 활성은 세포의 손상을 감소시킬 수 있으므로, 여드름 또는 모낭염의 개선, 모공 축소 등의 효과를 나타낼 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 상기 개나리 꽃 추출물의 분획물을 조성물 총 중량 대비 0.0001 내지 80 중량%, 구체적으로 0.0005 내지 70 중량%, 더욱 구체적으로 0.001 내지 60 중량% 포함할 수 있다. 상기 함량이 0.0001 중량% 미만이면 본래 목적하는 활성을 충분하게 달성할 수 없어 바람직하지 못하며, 80 중량%를 초과하면 증가하는 함량만큼 뚜렷한 효과의 증대가 기대되지 않아 비경제적이며, 화장료 조성물의 안전성에 문제를 발생시킬 수 있다.

본 발명에 따른 화장료 조성물은 용액, 외용연고, 크림, 폼, 영양화장수, 유연화장수, 팩, 유연수, 유액, 메이크업베이스, 에센스, 비누, 액체 세정료, 입욕제, 선스크린-크림, 선오일, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 패취 및 스프레이로 구성된 군으로부터 선택되는 제형으로 제조할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명의 화장료 조성물은 일반 피부 화장료에 배합되는 화장품학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 추가로 포함할 수 있으며, 통상의 성분으로 예를 들면 유분, 물, 계면활성제, 보습제, 저급 알콜, 증점제, 킬레이트제, 색소, 방부제, 향료 등을 적절히 배합할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 화장품학적으로 허용 가능한 담체는 제형에 따라 다양하다.

본 발명의 제형이 연고, 페이스트, 크림 또는 젤인 경우에는, 담체 성분으로서 동물성 유, 식물성 유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크, 산화아연 또는 이들의 혼합물이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는, 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록사이드, 칼슘 실케이트, 폴리아미드 파우더 또는 이들의 혼합물이 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진제를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되며, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알콜, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일이 이용될 수 있으며, 특히, 목화씨 오일, 땅콩 오일, 옥수수 배종 오일, 올리브오일, 피마자 오일 및 참깨 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알콜, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 비누인 경우에는 담체 성분으로서 지방산의 알칼리 금속 염, 지방산 헤미에스테르 염, 지방산 단백질 히드롤리제이트, 이세티오네이트, 라놀린 유도체, 지방족 알콜, 식물성 유, 글리세롤, 당 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 다른 하나의 양태는 (a) 개나리 꽃을 용매로 추출하여 개나리 꽃 추출물을 수득하는 단계, (b) 상기 개나리 꽃 추출물을, 물을 포함하는 용매로 분획하여 개나리 꽃 제1분획물을 수득하는 단계, 및 (c) 상기 개나리 꽃 제1분획물을, 에틸아세테이트 및 부탄올을 포함하는 용매로 분획하여 개나리 꽃 제2분획물을 수득하는 단계를 포함하는, 페놀릭 화합물을 고농도로 함유하는 개나리 꽃 추출물의 분획물을 제조하는 방법을 제공한다.

이때, 상기 "개나리 꽃", "추출물", "분획물" 및 "페놀릭 화합물"에 대한 설명은 전술한 바와 같다.

상기 단계 (a)는, 개나리 꽃을 용매로 추출하여 개나리 꽃 추출물을 수득하는 과정이다.

이때, 상기 추출 용매로는 메탄올 또는 에탄올 수용액이 사용될 수 있으며, 상기 메탄올 또는 에탄올 수용액은 70 내지 90%(v/v), 더욱 구체적으로 75 내지 85%(v/v), 가장 구체적으로 80 %(v/v) 메탄올 또는 에탄올일 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.

상기 단계 (b)는, 상기 단계 (a)를 통해 수득한 개나리 꽃 추출물을, 물을 포함하는 용매로 분획하여 개나리 꽃 제1분획물을 수득하는 과정이다.

이때, 상기 물을 포함하는 용매는 특별히 제한되지 않으나, 헥산, 에틸아세테이트 및 물로 구성된 용매일 수 있고, 더욱 구체적으로 상기 용매 내 헥산 및 에틸아세테이트는 1:0.5 내지 1:1.5의 부피비, 더욱 구체적으로 1:1의 부피비로 혼합된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 가장 구체적으로, 상기 헥산 및 에틸아세테이트의 혼합용매와 물은 1:0.5 내지 1:1.5의 부피비, 더욱 구체적으로 1:1의 부피비로 혼합된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 상기 제1분획은 3회 내지 5회, 구체적으로 4회 반복 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 단계 (c)는, 상기 단계 (b)를 통해 수득한 개나리 꽃 제1분획물을, 에틸아세테이트 및 부탄올을 포함하는 용매로 분획하여 개나리 꽃 제2분획물을 수득하는 과정이다.

이때, 상기 에틸아세테이트 및 부탄올을 포함하는 용매는 특별히 제한되지 않으나, 에틸아세테이트, 부탄올 및 물로 구성된 용매일 수 있고, 더욱 구체적으로 상기 용매 내 에틸아세테이트 및 부탄올은 1:8 내지 1:12의 부피비, 가장 구체적으로 1:10의 부피비로 혼합된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 더욱 구체적으로, 상기 에틸아세테이트 및 부탄올의 혼합용매와 물은 1:0.5 내지 1:1.5의 부피비, 더욱 구체적으로 1:1의 부피비로 혼합된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 단계 (a) 내지 (c)를 통해 제조된, 본 발명의 개나리 꽃 추출물의 분획물은 상기 추출물에 비하여 페놀릭 화합물을 고농도로 함유하는 것일 수 있으며, 또한 상기 분획물은 피부 미백, 항산화 또는 항염증 활성을 갖는 것일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는, 건조한 개나리 꽃을 80% 메탄올을 이용하여 개나리 꽃 추출물을 수득하였고, 상기 추출물을 헥산 및 에틸아세테이트가 1:1로 혼합된 혼합용매와 물이 혼합된 용매로 분획하여 물 분획물을 수득하였으며, 상기 물 분획물에 에틸아세테이트 및 부탄올이 1:10으로 혼합된 혼합용매와 물이 혼합된 용매로 분획하여 에틸아세테이트 및 부탄올 분획물(FK9)을 수득하였다(도 10). 특히, 상기 분획물 FK9에는 상기 추출물보다 코리아나사이드 C, 루틴, 마타이레시노사이드, 코리아나사이드 A, 악틴, 마타이레시놀 등의 페놀릭 화합물이 1.6배 내지 8배 이상 더 높은 함량으로 포함되어 있음을 확인하였고(표 1 및 도 12), 세포 독성이 없어 안전한 것을 확인하였으며(도 13), 나아가 항산화, 멜라닌 합성 저해 및 항염증 효과가 상기 추출물보다 현저히 우수함을 확인하였다(도 14 및 15).

이는, 본 발명에 따른 방법은 페놀릭 화합물을 고농도로 함유하는 개나리 꽃 추출물의 분획물의 제조에 매우 유용하게 사용될 수 있음을 시사하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 양태는 (a) 개나리 꽃을 용매로 추출하여 개나리 꽃 추출물을 수득하는 단계, (b) 상기 개나리 꽃 추출물을 용매로 분획하여 개나리 꽃 분획물을 수득하는 단계, 및 (c) 상기 분획물로부터 화학식 3, 8, 9, 10, 11 및 12로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 페놀릭 화합물을 분리하는 단계를 포함하는, 개나리 꽃으로부터 페놀릭 화합물을 분리하는 방법을 제공한다.

이때, 상기 "개나리 꽃", "추출물", "분획물" 및 "페놀릭 화합물"에 대한 설명은 전술한 바와 같다.

본 발명에서는, 에피피노레시놀(Epipinoresinol), 타이노포사이드 A(tinosposide A), 코리아나사이드 A(koreanaside A), 코리아나사이드 B(koreanaside B), 코리아나사이드 C(koreanaside C) 및 니코티플로린(nicotiflorin)의 페놀릭 화합물이 개나리 꽃에 포함되어 있음을 처음으로 규명한바, 개나리 꽃으로부터 상기 페놀릭 화합물을 분리하는 방법을 제공한다.

상기 단계 (a)는, 개나리 꽃을 용매로 추출하여 개나리 꽃 추출물을 수득하는 과정이다.

이때, 상기 추출 용매로는 메탄올 또는 에탄올 수용액이 사용될 수 있으며, 상기 메탄올 또는 에탄올 수용액은 70 내지 90%(v/v), 더욱 구체적으로 75 내지 85%(v/v), 가장 구체적으로 80 %(v/v) 메탄올 또는 에탄올일 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.

상기 단계 (b)는, 상기 단계 (a)를 통해 수득한 개나리 꽃 추출물을 용매로 분획하여 개나리 꽃 분획물을 수득하는 과정이다.

이때, 상기 용매는 특별히 제한되지 않으나, 에틸아세테이트, 부탄올 및 물로 구성된 용매일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

구체적으로, 상기 단계 (b)는 하기의 두 단계를 추가로 포함할 수 있다:

(1) 개나리 꽃 추출물을 에틸아세테이트 및 물을 포함하는 용매로 분획하여 에틸아세테이트 분획물 및 물 분획물을 수득하는 단계; 및

(2) 상기 물 분획물을 부탄올 및 물을 포함하는 용매로 분획하여 부탄올 분획물 및 물을 포함하는 단계.

또한, 상기 단계 (1)에서, 상기 용매 내 에틸아세테이트 및 물은 1:0.5 내지 1:1.5의 부피비, 구체적으로 1:1의 부피비로 혼합된 것일 수 있으며,

상기 단계 (2)에서, 상기 용매 내 부탄올 및 물은 1:0.5 내지 1:1.5의 부피비, 구체적으로 1:1의 부피비로 혼합된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 단계 (c)는, 상기 단계 (b)를 통해 수득한 개나리 꽃 분획물로부터 화학식 3, 8, 9, 10, 11 및 12로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 페놀릭 화합물, 구체적으로 에피피노레시놀, 타이노스포사이드 A, 코리아나사이드 A, 코리아나사이드 B, 코리아나사이드 C 또는 니코티플로린을 분리하는 과정이다.

더욱 구체적으로, 상기 단계 (b)를 통해 수득한 개나리 꽃 에틸아세테이트 분획물로부터 화학식 3으로 표시되는 에피피노레시놀을 분리할 수 있고,

상기 단계 (b)를 통해 수득한 개나리 꽃 물 분획물의 부탄올 분획물로부터 각각 화학식 8, 9, 10, 11 및 12로 표시되는 코리아나사이드 A, 타이노스포사이드 A, 코리아나사이드 C, 니코티플로린 및 코리아나사이드 B를 분리할 수 있다.

상기 화합물을 분리하는 방법은 특별히 제한되지 않으며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방법에 따라 수행될 수 있다. 상기 분획 방법의 비제한적인 예로는, 다양한 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)를 수행하는 크로마토그래피 분획법 등이 있으며, 구체적으로 컬럼 크로마토그래피 방법을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

이때, 상기 컬럼 크로마토그래피는 당해 기술 분야에서 공지된 임의의 용매를 사용하여 수행될 수 있으며, 구체적으로 헥산, 에틸아세테이트, 클로로포름, 메탄올, 아세톤, 물 또는 이들의 혼합용매가 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 용어, "에피피노레시놀(epipinoresinol)"은 하기 화학식 3으로 표시되는 것일 수 있다. 에피피노레시놀은 페노레시놀의 이성질체로서 소나무 속 식물에 다량 존재한다고 알려져 있다. 그러나, 개나리 꽃에 존재함은 본 발명자들에 의해 처음으로 규명되었다.

[화학식 3]

본 발명의 용어, "코리아나사이드 A(koreanaside A)"는 하기 화학식 8로 표시되는 것일 수 있다. 코리아나사이드 A는 기존에 공지되지 않은 신규한 화합물로서, 그 구조는 물론 개나리 꽃에 존재하는 것 또한 본 발명자들에 의해 처음으로 규명되었다.

[화학식 8]

본 발명의 용어, "타이노스포사이드 A(tinosposide A)"는 하기 화학식 9로 표시되는 것일 수 있다. 타이노스포사이드 A는 니토스포라 시넨시스(Tinospora sinensis)에 존재함이 알려져 있었으나, 개나리 꽃에 존재함은 본 발명자들에 의해 처음으로 규명되었다.

[화학식 9]

본 발명의 용어, "코리아나사이드 C(koreanaside C)"는 하기 화학식 10으로 표시되는 것일 수 있다. 코리아나사이드 C는 기존에 공지되지 않은 신규한 화합물로서, 그 구조는 물론 개나리 꽃에 존재하는 것 또한 본 발명자들에 의해 처음으로 규명되었다.

[화학식 10]

본 발명의 용어, "니코티플로린(nicotiflorin)"은 하기 화학식 11로 표시되는 것일 수 있다. 니코티플로린은 감자의 병원균 저항성에 관여하며, 윤노리나무의 뿌리, 봉작고사리의 잎 등 다양한 식물에 존재한다고 알려져 있다. 그러나, 개나리 꽃에 존재함은 본 발명자들에 의해 처음으로 규명되었다.

[화학식 11]

본 발명의 용어, "코리아나사이드 B(koreanaside B)" 하기 화학식 12로 표시되는 것일 수 있다. 코리아나사이드 B는 기존에 공지되지 않은 신규한 화합물로서, 그 구조는 물론 개나리 꽃에 존재하는 것 또한 본 발명자들에 의해 처음으로 규명되었다.

[화학식 12]

본 발명의 일 실시예에서는, 건조한 개나리 꽃을 80% 메탄올을 이용하여 개나리 꽃 추출물을 수득하였고, 상기 추출물을 물, 부탄올 및 에틸아세테이트가 혼합된 용매로 분획하여 각각 물, 부탄올 및 에틸아세테이트 분획물을 수득하였다(도 1). 이후, 상기 분획물에 대한 컬럼크로마토그래피를 통해 악티게닌(arctigenin), 필리게닌(phylligenin), 에피피노레시놀(epipinoresinol), 마타이레시놀(matairesinol), 피노레시놀(pinoresinol), 악틴(arctiin), 마타이레시노사이드(matairesinoside), 코리아나사이드 A(koreanaside A), 타이노스포사이드 A(tinosposide A), 코리아나사이드 C(koreanaside C), 니코티플로린(nicotiflorin), 코리아나사이드 B(koreanaside B), 8'-(3,4-디히드록시페놀)에틸-O-α-L-람노피라노실-(1→4)-2-O-(E)-카페오일-α-L-아라비노피라노시드, 루틴(rutin) 등 14종의 페놀릭 화합물을 분리하였고, 특히 상기 에피피노레시놀, 타이노스포사이드 A, 코리아나사이드 A, 코리아나사이드 B, 코리아나사이드 C 및 니코티플로린이 개나리 꽃에 포함되어 있음을 처음으로 규명하였다(도 1 내지 6).

이는, 본 발명에 따른 방법은 개나리 꽃 추출물로부터 상기의 페놀릭 화합물을 분리하는데 매우 유용하게 사용될 수 있음을 시사하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 양태는 하기 화학식 8, 10 또는 12 중 어느 하나로 표시되는 화합물 또는 이의 염을 제공한다.

[화학식 8]

[화학식 10]

[화학식 12]

상기 화학식 8, 10 또는 12 중 어느 하나로 표시되는 화합물은 지금까지 전혀 알려진 바 없으며, 본 발명자에 의하여 최초로 규명되었다.

본 발명에서, 상기 화합물은 이성질체가 존재할 수 있으며, 비대칭 탄소중심을 가질 수 있으므로, R 또는 S 이성질체, 라세미체, 부분입체이성질체 혼합물 및 개개 부분입체이성질체로서 존재할 수 있고, 상술한 모든 이성질체 및 혼합물은 본 발명의 범위에 포함된다.

본 발명에서, 상기 화합물의 염은 양이온과 음이온이 정전기적 인력에 의해 결합하고 있는 물질을 의미하며, 통상적으로 금속염, 유기염기와의 염, 무기산과의 염, 유기산과의 염, 염기성 또는 산성 아미노산과의 염 등이 될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는, 개나리 꽃의 추출물의 분획물에서 분리한 화합물에 대하여 ¹H-NMR, ¹³C-NMR, gHMBC, CD 또는 HR-FAB-MS의 분석을 수행한 결과 기존에 보고되지 않은 신규한 화합물임을 확인하였고(도 4 내지 6), 이를 코리아나사이드 A, B 또는 C로 명명하였다.

본 발명에 따른 개나리 꽃 추출물의 분획물은 페놀릭 화합물을 고농도로 함유하며, 세포에 대한 독성이 없고, 피부 미백, 항염증 또는 항산화 활성이 우수하므로, 화장료 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 개나리 꽃 추출물 및 이의 에틸아세테이트, 부탄올 및 물 분획물을 수득하는 과정을 보여주는 개략도이다.
도 2는 개나리 꽃 메탄올 추출물 및 상기 추출물의 에틸아세테이트(EtOAc) 분획물에서 화합물을 분리한 과정을 보여주는 개략도로서, 악티게닌(arctigenin), 필리게닌(phylligenin), 에피피노레시놀(epipinoresinol), 마타이레시놀(matairesinol), 피노레시놀(pinoresinol)이 분리되었음을 보여준다.
도 3은 개나리 꽃 메탄올 추출물 및 상기 추출물의 부탄올(n-BuOH) 분획물에서 화합물을 분리한 과정을 보여주는 개략도로서, 악틴(arctiin), 마타이레시노사이드(matairesinoside), 코리아나사이드 A(koreanaside A), 타이노스포사이드 A(tinosposide A), 코리아나사이드 C(koreanaside C), 니코티플로린(nicotiflorin), 코리아나사이드 B(koreanaside B), 8'-(3,4-디히드록시페놀)에틸-O-α-L-람노피라노실-(1→4)-2-O-(E)-카페오일-α-L-아라비노피라노시드, 루틴(rutin)이 분리되었음을 보여준다.
도 4는 코리아나사이드 A의 화학 구조를 규명하기 위한 분석 결과를 보여주는 스펙트럼 및 그래프로서, A는 ¹H-NMR, B는 ¹³C-NMR, C는 gHMBC, D는 CD 및 E는 HR-FAB-MS의 결과에 관한 것이다.
도 5는 코리아나사이드 B의 화학 구조를 규명하기 위한 분석 결과를 보여주는 스펙트럼 및 그래프로서, A는 ¹H-NMR, B는 ¹³C-NMR, C는 gHMBC, D는 CD 및 E는 HR-FAB-MS의 결과에 관한 것이다.
도 6은 코리아나사이드 C의 화학 구조를 규명하기 위한 분석 결과를 보여주는 스펙트럼 및 그래프로서, A는 ¹H-NMR, B는 ¹³C-NMR, C는 gHMBC, D는 HR-FAB-MS의 결과에 관한 것이다.
도 7은 개나리 꽃 추출물의 분획물에서 분리한 화합물의 DPPH 라디칼 소거능을 보여주는 그래프이다.
도 8은 개나리 꽃 추출물의 분획물에서 분리한 화합물의 NO 생성 억제능을 보여주는 그래프이다.
도 9는 개나리 꽃 추출물의 분획물에서 분리한 화합물의 멜라닌 합성 억제능을 보여주는 이미지 및 그래프로서, A는 지브라피시의 멜라닌 생성 정도 및, B는 지브라피시에서 생성된 점의 크기에 관한 것이다.
도 10은 페놀릭 화합물을 고함유하는 개나리 꽃 추출물의 분획물을 수득하는 과정을 보여주는 개략도이다.
도 11은 각 용매의 사용에 따른, 개나리 꽃 추출물의 분획물의 TLC 결과를 보여주는 이미지로서, A는 헥산 및 에틸아세테이트의 혼합용매를 이용하여 분획한 분획물에 포함되어 있는 페놀릭 화합물, B는 에틸아세테이드 및 부탄올의 혼합용매를 이용하여 분획한 분획물에 포함되어 있는 페놀릭 화합물을 보여준다.
도 12는 개나리 꽃 추출물(A) 및 상기 추출물의 분획물(B)의 HPLC 분석 결과를 보여주는 크로마토그램으로서, 상기 추출물 또는 분획물에 포함되어 있는 페놀릭 화합물의 양을 보여준다.
도 13은 개나리 꽃 추출물 및 상기 추출물의 분획물의 세포 독성을 보여주는 그래프로서, A는 섬유아세포 및 B는 각질형성세포의 세포 생존율에 관한 것이다.
도 14는 개나리 꽃 추출물 및 상기 추출물의 분획물의 DPPH 라디칼 소거능을 보여주는 그래프로서, A는 상기 추출물 또는 분획물, 및 B는 토코페롤에 관한 것이다.
도 15는 개나리 꽃 추출물 및 상기 추출물의 분획물의 멜라닌 합성 억제능을 보여주는 이미지 및 그래프로서, A는 지브라피시의 멜라닌 생성 정도, B는 지브라피시에서 생성된 점의 크기, 및 C는 지브라피시에서 생성된 멜라닌의 총 양에 관한 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1. 개나리 꽃 추출물의 분획물로부터 화합물의 분리 방법

개나리 꽃 추출물의 분획물에 포함되어 있는 다양한 화합물을 규명 및 분리하고자 하였다.

구체적으로, 도 1에 나타낸 바와 같이, 건조된 개나리 꽃(962g)을 80% 메탄올(MeOH, 33L×2)을 이용하여 실온에서 24시간 동안 추출하였고, 이를 여과 및 농축시켰다. 이후, 수득한 메탄올 추출물에 물(500 ㎖)을 연속적으로 부었고, n-부탄올(n-BuOH, 450 ㎖×2) 또는 에틸 아세테이트(EtOAc, 500 ㎖×2)를 이용하여 추출하였다. 상기 추출물들을 농축시켜 EtOAc 분획물(FKE, 45g), n-BuOH 분획물(FKB, 110g) 및 물 분획물(FKW, 395g)의 잔류물을 얻었다.

먼저, 도 2에 나타낸 바와 같이, 상기 EtOAc 분획물에서 악티게닌(arctigenin), 필리게닌(phylligenin), 에피피노레시놀(epipinoresinol), 마타이레시놀(matairesinol), 피노레시놀(pinoresinol)의 화합물을 분리하였다. 특히, 상기 에피피노레시놀이 개나리 꽃에 포함되어 있음은 기존에 공지된바 없으며, 본 발명에서 처음으로 규명하였다.

구체적으로, 상기 EtOAc 분획물을 SiO₂ c.c.(SiO₂ Column chromatography, φ 12×17 cm)을 이용하여 n-헥산-EtOAc(10:1→2:1→1:1, 각각 14 ℓ) → CHCl₃-MeOH-물(30:3:1→20:3:1→10:3:1→65:35:10, 각각 15 ℓ)로 용출하였고, 12개의 분획물(FKE-1 ~ FKE-12)을 얻었다.

상기 12개의 분획물 중에서, FKE-10 분획물[1.9 g, 용리액/총 부피(Ve/Vt) 0.072-0.088]을 SiO₂ c.c.(φ 4.5×15 cm)을 이용하여 CHCl3-EtOAc(10:1→3:1, 각각 5.6 ℓ)로 용출하였고, 19개 분획물(FKE-10-1 ~ FKE-10-19)의 분획물을 얻었다.

상기 19개의 분획물 중에서, FKE-10-10 분획물[127.8 mg, Ve/Vt 0.043 - 0.050]을 ODS c.c.(φ 3×6 cm)을 이용하여 아세톤-물(1:3→1:1, 각각 730 ㎖)로 용출하였고, 6개의 분획물(FKE-10-10-1 ~ FKE-10-10-6)을 얻었다. 이후, 상기 6개의 분획물 중 FKE-10-10-2 분획물에서 악티게닌(arctigenin)[119.2 mg, Ve/Vt 0.082-0.110, TLC(Kieselgel 60 F₂₅₄) R_f 0.62, CHCl₃-EtOAc(1:1), TLC(RP-18F_254S) R_f 0.72, 아세톤-물(3:1)]을 분리하였다.

또한, 상기 19개의 분획물 중에서, FKE-10-12 분획물[78.1mg, Ve/Vt 0.055-0.070]을 ODS c.c.(φ 2×5 cm)를 이용하여 아세톤-물(1:1, 480 ㎖)로 용출하였고, 7개의 분획물(FKE-10-12-1 ~ FKE-10-12-7)을 얻었다. 이후, 상기 7개의 분획물 중 FKE-10-12-4 분획물에서 필리게닌(phylligenin)[23.2 mg, Ve/Vt 0.500-0.667, TLC (Kieselgel 60 F₂₅₄) R_f 0.45, CHCl₃-EtOAc(3:1), TLC(RP-18F_254S) R_f 0.51, 아세톤-물 (2:1)]을 분리하였다.

또한, 상기 19개의 분획물 중에서, FKE-10-14 분획물[220.0mg, Ve/Vt 0.736-0.780]을 ODS c.c.(φ 2.5×5 cm)를 이용하여 아세톤-물(2:1→1:1, 각각 2.2 ℓ)로 용출하였고, 8개의 분획물(FKE-10-14-1 ~ FKE-10-14-8)을 얻었으며, 상기 8개의 분획물 중 FKE-10-14-2 분획물[69.0 mg, Ve/Vt 0.736-0.780]을 SiO₂ (φ 2×10 cm) 컬럼을 이용하여 CHCl₃-EtOAc(5:1, 500 ㎖)로 용출하였고, 3개의 분획물(FKE-10-14-2-1 ~ FKE-10-14-2-3)을 얻었다. 이후, 상기 3개의 분획물 중 FKE-10-14-2-1 분획물에서 에피피노레시놀(epipinoresinol)[27.6 mg, Ve/Vt 0.000-0.275, TLC (Kieselgel 60 F₂₅₄) R_f 0.50, CHCl₃ - EtOAc(3:1), TLC(RP-18F_254S) R_f 0.53, 아세톤-물(2:1)]을 분리하였고, 상기 3개의 분획물 중 FKE-10-14-2-3 분획물에서 마타이레시놀(matairesinol)[12.9 mg, Ve/Vt 1.000, TLC(Kieselgel 60 F₂₅₄) R_f 0.50, CHCl₃-EtOAc(3:1), TLC(RP-18F_254S) R_f 0.53, 아세톤-물(2:1)]을 분리하였다.

또한, 상기 19개의 분획물 중에서, FKE-10-15 분획물[450.0mg, Ve/Vt 0.780-0.860]을 ODS c.c.(φ 3×5 cm)을 이용하여 아세톤-물(3:1→2:1→1:1, 각각 350 ㎖)로 용출하였고, 5개의 분획물(FKE-10-15-1 ~ FKE-10-15-5)을 얻었으며, 상기 5개의 분획물 중에서 FKE-10-15-1 분획물[42.0 mg, Ve/Vt 0.000-0.017]을 SiO₂ c.c.(φ 3×30 cm)을 이용하여 n-헥산-EtOAc(1:3, 550 ㎖)로 용출하였고, 7개의 분획물(FKE-10-15-1-1 ~ FKE-10-15-1-7)을 얻었다. 이후, 상기 7개의 분획물 중 FKE-10-11-1-4 분획물에서 피노레시놀(pinoresinol)[11.1 mg, Ve/Vt 0.855-0.909, TLC (Kieselgel 60 F₂₅₄) R_f 0.35, CHCl₃-EtOAc(3:2), TLC(RP-18F_254S) R_f 0.42, 아세톤-물(1:1)]을 분리하였다.

다음으로, 도 3에 나타낸 바와 같이, 상기 부탄올 분획물에서 악틴(arctiin), 마타이레시노사이드(matairesinoside), 코리아나사이드 A(koreanaside A), 타이노스포사이드 A(tinosposide A), 코리아나사이드 C(koreanaside C), 니코티플로린(nicotiflorin), 코리아나사이드 B(koreanaside B), 8'-(3,4-디히드록시페놀)에틸-O-α-L-람노피라노실-(1→4)-2-O-(E)-카페오일-α-L-아라비노피라노시드, 루틴(rutin)의 화합물을 분리하였다. 특히, 상기 타이노스포사이드 A, 코리아나사이드 A, 코리아나사이드 B, 코리아나사이드 C 및 니코티플로린이 개나리 꽃에 포함되어 있음은 기존에 공지된바 없으며, 본 발명에서 처음으로 규명하였다.

구체적으로, 상기 BuOH 분획물을 SiO₂ c.c.(φ 11×15 cm)을 이용하여 CHCl₃-MeOH-물(30:3:1→20:3:1→10:3:1, 각각 43 ℓ)→EtOAc-n-BuOH-물(4:5:1, 45 ℓ)로 용출하였고, 15개의 분획물(FKB-1 ~ FKB-15)을 얻었다.

이후, 상기 15개의 분획물 중 FKB-2 분획물에서 악틴(arctiin)[8.0 g, Ve/Vt 0.038-0.070, TLC(Kieselgel 60 F₂₅₄) R_f 0.45, CHCl₃-MeOH-물(15:3:1), TLC(RP-18F_254S) R_f 0.65, 아세톤-물(1:1)]을 분리하였다.

또한, 상기 15개의 분획물 중 FKB-3 분획물[20.8g, Ve/Vt 0.071-0.122]을 SiO₂ c.c.(φ 2×10 cm)를 이용하여 CHCl₃-MeOH-물(25:3:1→10:3:1, 각각 3 ℓ)로 용출하였고, 14개의 분획물(FKB-3-1 ~ FKB-3-14)을 얻었다. 이후, 상기 14개의 분획물 중 FKB-3-5 분획물에서 마타이레시노사이드(matairesinoside)[8.8 g, Ve/Vt 0.855-0.909, TLC(Kieselgel 60 F₂₅₄) R_f 0.45, CHCl₃-MeOH-물(10:3:1), TLC(RP-18F_254S) R_f 0.52, 아세톤-물(2:3)]를 분리하였다.

또한, 상기 15개의 분획물 중 FKB-4 분획물[11.5g, Ve/Vt 0.154-0.363]을 SiO₂ c.c.(φ 5.5×15 cm)을 이용하여 CHCl₃-MeOH-물(25:3:1, 7.7 ℓ)로 용출하였으며, 10개의 분획물(FKB-4-1 ~ FKB-4-10)을 얻었다. 상기 10개의 분획물 중에서 FKB-4-6 분획물[4.9g, Ve/Vt 0.316-0.411]을 ODS c.c.(φ 5×6 cm)을 이용하여 아세톤-물(1:2, 2 ℓ)로 용출하였고, 4개의 분획물(FKB-4-6-1 ~ FKB-4-6-4)을 얻었다. 상기 4개의 분획물 중에서 FKB-4-6-1[2.2 g, Ve/Vt 0.000-0.571] 분획물을 ODS c.c.(φ 4×6 cm)을 이용하여 아세톤-MeOH-물 (1:1:4, 2.6 ℓ)로 용출하였고, 7개의 분획물(FKB-4-6-1-1 ~ FKB-4-6-1-7)을 얻었다. 이후, 상기 7개의 분획물 중 FKB-4-6-1-4 분획물로부터 코리아나사이드 A(koreanaside A)[219.8 mg, Ve/Vt 0.712-0.731, TLC(Kieselgel 60 F₂₅₄) R_f0.51, CHCl₃-MeOH-물(8:3:1), TLC(RP-18F_254S) R_f 0.20, 아세톤-MeOH-물(1:1:4)]를 분리하였다. 또한, 상기 10개의 분획물 중에서 FKB-4-7 분획물[1.2g, Ve/Vt 0.413-0.531]을 SiO₂ c.c.(φ 4×15 cm)을 이용하여 CHCl₃-MeOH-물(25:3:1, 3.5 ℓ)로 용출하여 6개의 분획물(FKB-4-7-1 ~ FKB-4-7-6)을 얻었고, 상기 6개의 분획물 중에서 FKB-4-7-6 분획물로부터 타이노스포사이드 A(tinosposide A)[242.4 mg, Ve/Vt 1.000, TLC(Kieselgel 60 F₂₅₄) R_f 0.45, CHCl₃-MeOH-물(7:3:1), TLC(RP-18F_254S) R_f 0.55, 아세톤-물(2:3)]를 분리하였다.

또한, 상기 15개의 분획물 중 FKB-6 분획물[3.1 g, Ve/Vt 0.413-0.486]을 SiO₂ c.c.(φ 5×17 cm)을 이용하여 CHCl₃-MeOH-물(12:3:1→10:3:1, 3.8 ℓ)로 용출하였고, 16개의 분획물(FKB-6-1 ~ FKB-6-16)을 얻었다. 상기 16개의 분획물 중에서 FKB-6-12 분획물[1.6 g, Ve/Vt 0.382-0.547]을 ODS c.c.(φ 4×6 cm)을 이용하여 MeOH-물(1:3, 2.0 ℓ)로 용출하였고, 12개의 분획물(FKB-6-12-1 ~ FKB-6-12-12)을 얻었다. 이후, 상기 12개의 분획물 중 FKB-6-12-8 분획물에서 코리아나사이드 C(koreanaside C)[219.8 mg, Ve/Vt 0.105-0.210, TLC(Kieselgel 60 F₂₅₄) R_f 0.51, CHCl₃-MeOH-물(7:3:1), TLC(RP-18F_254S) R_f 0.42, 아세톤-물(1:3)]를 분리하였다.

또한, 상기 15개의 분획물 중 FKB-8 분획물[2.9g, Ve/Vt 0.594-0.693]을 ODS c.c.(φ 6×20 cm)을 이용하여 아세톤-물(1:1, 1.2 ℓ)로 용출하였고, 8개의 분획물(FKB-8-1 ~ FKB-8-8)을 얻었다. 상기 8개의 분획물 중 FKB-8-1 분획물[2.0 g, Ve/Vt 0.000-0.203]을 SiO₂ c.c.(φ 3.5×17 cm)을 이용하여 EtOAc-n-BuOH-물(40:3:1→35:3:1→30:3:1→25:3:1→20:3:1, 각각 1 ℓ)로 용출하였고, 12개의 분획물(FKB-8-1-1 ~ FKB-8-1-12)을 얻었다. 상기 12개의 분획물 중 FKB-8-1-11 분획물[762.5 mg, Ve/Vt 0.145-0.363]을 SiO₂ c.c.(φ 3.5×16 cm)을 이용하여 EtOAc-n-BuOH-물(11:3:1, 3.2 ℓ)로 용출하였고, 10개의 분획물(FKB-8-1-11-1 ~ FKB-8-1-11-10)을 얻었다. 상기 10개의 분획물 중 FKB-8-1-11-2 분획물에서 니코티플로린(nicotiflorin)[85.0 mg, Ve/Vt 0.290-0.322, TLC (Kieselgel 60 F₂₅₄) R_f 0.54, EtOAc-n-BuOH-물(8:3:1), TLC(RP-18 F_254S) R_f 0.29, 아세톤-MeOH(2:1)]을 분리하였고, 상기 10개의 분획물 중 FKB-8-1-11-5 분획물에서 코리아나사이드 B(koreanaside B)[55.6 mg, Ve/Vt 0.380-0.473, TLC(Kieselgel 60 F₂₅₄) R_f 0.45, EtOAc-n-BuOH-물(8:3:1), TLC(RP-18 F_254S) R_f 0.82, 아세톤-MeOH(2:1)]을 분리하였다.

또한, 상기 15개의 분획물 중 FKB-10 분획물[11.0 g, Ve/Vt 0.811-0.835]을 SiO₂ c.c.(φ 6×25 cm)를 이용하여 EtOAc-n-BuOH-H₂O(16:3:1, 5 ℓ)로 용출하여 5개의 분획물(FKB-10-1 ~ FKB-10-5)을 얻었다. 이후, 상기 5개의 분획물 중 FKB-11-1 분획물에서 8'-(3,4-디히드록시페놀)에틸-O-α-L-람노피라노실-(1→4)-2-O-(E)-카페오일-α-L-아라비노피라노시드[1.3 g, Ve/Vt 0.000-0.056, TLC (Kieselgel 60 F₂₅₄) R_f 0.51, EtOAc-n-BuOH-H₂O(16:3:1), (RP-18 F_254S) R_f 0.5, 아세톤-물(1:2)]을 분리하였고, 상기 5개의 분획물 중 FKB-11-4 분획물에서 루틴(rutin)[98.0 mg, Ve/Vt 0.500-1.000, TLC(Kieselgel 60 F₂₅₄) R_f 0.31, EtOAc-n-BuOH-H₂O(16:3:1), (RP-18 F_254S) R_f 0.48, 아세톤-물(1:2)]을 분리하였다.

종합하면, 개나리 꽃 80% 메탄올 추출물의 에틸아세테이트 또는 부탄올 분획물로부터 하기 화학식 1의 악티게닌, 하기 화학식 2의 필리게닌, 하기 화학식 3의 에피피노레시놀, 하기 화학식 4의 마타이레시놀, 하기 화학식 5의 피노레시놀, 하기 화학식 6의 악틴, 하기 화학식 7의 마타이레시노사이드, 하기 화학식 8의 코리아나사이드 A, 하기 화학식 9의 타이노스포사이드 A, 하기 화학식 10의 코리아나사이드 C, 하기 화학식 11의 니코티플로린, 하기 화학식 12의 코리아나사이드 B, 하기 화학식 13의 8'-(3,4-디히드록시페놀)에틸-O-α-L-람노피라노실-(1→4)-2-O-(E)-카페오일-α-L-아라비노피라노시드, 하기 화학식 14의 루틴의 총 14종 화합물을 수득할 수 있었으며, 특히 상기 에피피노레시놀, 타이노스포사이드 A, 코리아나사이드 A, 코리아나사이드 B, 코리아나사이드 C 및 니코티플로린이 개나리 꽃에 포함되어 있음을 처음으로 규명하였다.

나아가, 도 4 내지 6에서 볼 수 있듯이, 코리아나사이드 A, 코리아나사이드 B 및 코리아나사이드 C에 대하여 ¹H-NMR, ¹³C-NMR, gHMBC, CD 또는 HR-FAB-MS의 분석을 수행한 결과, 상기 3종의 화합물은 기존에 보고되지 않은 신규한 화합물임을 확인하였다.

[화학식 1]

[화학식 2]

[화학식 3]

[화학식 4]

[화학식 5]

[화학식 6]

[화학식 7]

[화학식 8]

[화학식 9]

[화학식 10]

[화학식 11]

[화학식 12]

[화학식 13]

[화학식 14]

실시예 2. 개나리 꽃 추출물의 분획물로부터 수득한 화합물의 생리 활성 확인

실시예 2-1. 항산화 활성 확인

상기 실시예 1을 통해 분리한, 14종 화합물의 항산화 활성을 확인하고자 하였다.

구체적으로, 악티게닌, 필리게닌, 에피피노레시놀, 마타이레시놀, 피노레시놀, 악틴, 마타이레시노사이드, 코리아나사이드 A, 타이노스포사이드 A, 코리아나사이드 C, 니코티플로린, 코리아나사이드 B, 8'-(3,4-디히드록시페놀)에틸-O-α-L-람노피라노실-(1→4)-2-O-(E)-카페오일-α-L-아라비노피라노시드, 루틴의 DPPH 라디칼 소거능을 확인하였다.

DPPH 라디칼 소거능을 측정하기 위하여, 0.9 ㎖의 시료(500 ppm)를 0.1 mM 라디칼 DPPH 용액이 들어있는 메탄올 1.9 ㎖에 넣고, 37℃에서 30분간 방치하였다. 이후, UV-가시광선 분광 광도계를 사용하여 517 nm에서 광학 밀도(OD)를 측정하였다. α-토코페롤(α-tocopherol)을 양성 대조군으로 사용하였으며, 전자 공여능(EDA, %)은 하기의 수학식 1을 사용하여 계산하였다.

[수학식 1]

EDA(%) = (대조군의 OD - 샘플군의 OD) × 100 / 대조군의 OD

그 결과, 도 7에서 볼 수 있듯이, 8'-(3,4-디히드록시페놀)에틸-O-α-L-람노피라노실-(1→4)-2-O-(E)-카페오일-α-L-아라비노피라노시드를 제외하고, 신규 화합물인 코리아나사이드 A, 코리아나사이드 B, 및 코리아나사이드 C를 비롯하여 대부분의 화합물이 우수한 항산화 활성을 나타내는 것을 확인하였다.

상기 결과를 통해, 본 발명에 따른 방법으로 개나리 꽃 추출물의 분획물로부터 분리한 화합물들은 높은 항산화 활성을 나타내므로, 항산화 용도를 갖는 다양한 조성물의 형태로 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있었다.

실시예 2-2. 항염증 활성 확인

상기 실시예 1을 통해 분리한, 14종 화합물의 항산화 활성을 확인하고자 하였다.

구체적으로, 화합물의 NO 생성 억제 효과를 확인함으로써 항산화 활성을 측정하였다. NO의 양은 안정한 산화 산물인 아질산염의 양을 측정함으로써 확인하였다. RAW 264.7 세포(1×10⁴ 세포/웰)를 96웰 세포 배양 플레이트에서 12-18 시간 동안 배양한 후, 무혈청 상태에서 1 ㎍/㎖의 LPS를 처리하였다. 이후, 50, 100 및 200 μM의 다양한 농도의 화합물을 함유하는 배지에서 24시간 동안 배양하였고, 세포 배양 상등액 100 ㎕를 새로운 96-웰 플레이트에서 그리스 시약(Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA) 100 ㎕와 혼합한 후, 550 nm에서 흡광도를 측정하였다. 아질산염 농도는 아질산 나트륨 표준 곡선과 비교하여 결정하였으며, 블루틴(Butein, Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)을 양성 대조군으로 사용하였다.

그 결과, 도 8에서 볼 수 있듯이, 악티게닌, 마타이레시노사이드, 필리게닌, 에피피노레시놀의 화합물은 양성 대조군보다도 현저히 높은 NO 억제 활성을 나타내며, 악틴, 마타이레시놀, 타이노스포사이드 A, 코리아나사이드 A 및 코리아나사이드 B도 양성 대조군보다 우수한 NO 억제 활성을 나타냄을 알 수 있었다.

상기 결과를 통해, 본 발명에 따른 방법으로 개나리 꽃 추출물의 분획물로부터 분리한 화합물들은 높은 항염증 활성을 나타내므로, 항염증 용도를 갖는 다양한 조성물의 형태로 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있었다.

실시예 2-3. 미백 효과 확인

상기 실시예 1을 통해 분리한, 14종 화합물의 미백 효과를 확인하고자 하였다.

구체적으로, 제브라피시(zebrafish)에 대한 멜라닌 합성 억제능을 확인함으로써 미백 효과를 확인하였다. 제브라피시는 경희대학교 동물관리 및 사용위원회(KHUASP(SE)-15-10)가 승인한 표준 프로토콜에 따라 사용하였다. 72 hpf(hours post-fertilization)의 제브라피시 배아에 화합물을 처리하였고, 양성 대조군으로는 PTU(1-phenyl-2-thiourea)를 사용하였다. 이후, 지브라피시의 눈을 제외하고 머리-등쪽 영역에 생성된 검은 점을 IX71 현미경(올림푸스, 일본)을 사용하여 촬영하였으며, Image J 소프트웨어(미국 NIH)를 사용하여 검은 반점의 크기를 측정하였다. 또한, 멜라닌의 함량을 분석하기 위하여, 지브라피시 배아를 단백질 추출 버퍼(20 mM HEPES, 100 mM KCl, 5% 글리세롤, 5 mM EDTA, 1mM MgCl₂, 1 mM DTT, 0.1% 트리톤 X-100)을 이용하여 추출한 뒤, 15분간 원심 분리하여 총 멜라닌을 추출하였다. 이후, 추출된 멜라닌을 1N NaOH 1 ㎖에 100℃에서 30분 동안 용해시켰고, 마이크로 플레이트 리더(Bio-rad, USA)를 이용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하여 멜라닌 생성 정도를 확인하였다.

그 결과, 도 9의 A 및 B에서 볼 수 있듯이, 정상 대조군과 비교 시, 13종의 화합물을 처리한 지브라피시의 경우 멜라닌 합성이 현저히 억제되는 것을 확인하였다. 특히, 상기와 같은 멜라닌 합성 억제능은 개나리 꽃 메탄올 추출물과 유사하거나 더 우수한 정도의 효과임을 확인하였다.

상기 결과를 통해, 본 발명에 따른 방법으로 제조한 개나리 꽃 추출물의 분획물은 우수한 멜라닌합성 저해능을 나타내므로, 미백 용도를 갖는 다양한 조성물의 형태로 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있었다.

실시예 3. 페놀릭 화합물을 고함유하는 개나리 꽃 추출물의 분획물의 제조방법

상기 실시예 1 및 2를 통해 개나리 꽃 추출물의 분획물에는 다양한 페놀릭 화합물이 포함되어 있으며, 특히 항산화 활성, 항염증 활성 및 미백 활성이 우수함을 확인한바, 상기 화합물들을 고농도로 포함하고 있는 분획물을 제조하고자 하였다.

구체적으로, 하기의 1 내지 9 단계를 통해 페놀릭 화합물을 높은 농도로 함유하고 있는 개나리 꽃 추출물의 분획물을 제조하였다.

단계 1: 개나리(Forsythia koreana) 꽃을 7.33 kg을 채집하였다.

단계 2: 상기 개나리 꽃을 실온에서 50시간 가량 건조시켜 1.67 kg의 건조된 개나리 꽃을 얻었다.

단계 3: 상기 건조한 개나리 꽃을 80% 메탄올(MeOH) 또는 70% 에탄올(EtOH) 90 ℓ에 담구어 하룻동안 실온에 방치하였다.

단계 4: 하루 뒤 상기 용액을 여과지로 걸러 용매만을 수득하였다.

단계 5: 상기 3 및 4번 단계를 4회 반복하여, 총 360 ℓ의 용매를 수득하였다.

단계 6: 상기 용매를 농축하여 952 g의 개나리 꽃 용매 추출물을 얻었다.

단계 7: 분획 깔대기를 활용하여 개나리 꽃 용매 추출물을 n-헥산 및 EtOAc가 1:1로 섞여있는 용매와 물(상기 용매와 물은 1:1의 부피비로 혼합됨)을 4 L씩 넣고 계통분획을 총 4회 실시하였다.

단계 8: 상기 7번 과정을 통해 얻어진 분획 중 극성분획을 EtOAc 및 n-BuOH가 1:10으로 섞여있는 용매와 물(상기 용매와 물은 1:1의 부피비로 혼합됨)을 3 L씩 넣고 계통분획을 총 4회 실시하였다.

단계 9: 상기 단계 1 내지 8의 과정을 통해 280 g의 개나리 꽃 추출물의 분획물을 얻었다.

상기의 과정은 도 10에 자세히 나타내었으며, 수득한 개나리 꽃 추출물의 EtOAc 및 n-BuOH 분획물은 "FK9"로 명명하였다.

한편, 상기 분획물의 제조에 사용한 용매는, 분획물이 페놀릭 화합물을 높은 농도로 포함할 수 있도록 하는 것을 사용하였다.

구체적으로, 상기 실시예 1 및 2를 통해 우수한 항산화, 항염증, 미백 활성을 가지고 있다고 확인한 페놀릭 화합물 중 가장 비극성 물질인 마타이레시놀과 가장 극성물질인 루틴을 기준으로 하여, 상기 화합물보다 더 비극성이거나 더 극성인 물질들을 제거함으로써 상기의 페놀릭 화합물을 고농도로 포함하는 분획물을 제조하고자 하였다. 이를 위해 마타이레시놀을 포함하지만 그보다 더 비극성인 물질을 포함하지 않는 용매; 및 루틴을 포함하지만 루틴보다 더 극성인 물질을 포함하지 않는 용매의 비율을 조건을 확인하였다.

그 결과, 도 11의 A 및 B에 나타낸 바와 같이, 마타이레시놀을 포함하지만 그보다 더 비극성인 물질을 포함하지 않는 용매는 헥산과 에틸아세테이트가 1:1의 부피비로 섞인 혼합용매이고, 마찬가지로 루틴을 포함하지만 루틴보다 더 극성인 물질을 포함하지 않는 혼합용매는 에틸아세테이트 및 부탄올이 1:10의 부피비로 섞인 혼합용매임을 확인하였다.

상기 결과를 통해, 헥산과 에틸아세테이트가 1:1의 부피비로 섞인 혼합용매; 및 에틸아세테이트 및 부탄올이 1:10의 부피비로 섞인 혼합용매를 사용하는 경우 페놀릭 화합물을 고함유하는 개나리 꽃 추출물의 분획물을 제조할 수 있음을 알 수 있었다.

실시예 4. 개나리 꽃 추출물의 분획물에 포함된 페놀릭 화합물의 함량 분석

상기 실시예 3에서 제조한 개나리 꽃 추출물, 또는 이의 분획물에 포함된 페놀릭 화합물의 함량을 HPLC(Agilent technology 1200 series, Agilent), MS (Triple Quad, Agilent)를 이용하여 분석하였다.

구체적으로, YMC-triart C18(2.0×100 mm, 3 ㎛) 컬럼 및 UV 탐지기(280 nm)를 사용하였으며, 이동상으로는, 증류수에 0.1% 포름산(CHCl₃)을 넣어 용매 A를 제조하였고, 아세토니트릴(Acetonitrile)에 0.1% 포름산을 넣어 용매 B를 제조하였다. 이후, 용매 A 및 용매 B의 비율(용매 A/용매 B) 및 노출 시간을 다음과 같이 조절하였다: 5%(0.01 분) → 13%(5분) → 13%(15분) → 17%(18분) → 17%(20분) → 25%(25분) → 100%(37분) → 100%(40분). 유량은 0.4 ㎖/분, 주입량 3 ㎕(50% MeOH) 및 컬럼 온도는 25℃로 조절하였다.

	MeOH 추출물 (%)	고함유 분획 (%)	증가율 (%)
코리아나사이드 C(koreanaside C)	1.06	1.69	160.56
루틴(rutin)	0.44	0.90	202.64
마타이레시노사이드(matairesinoside)	0.20	0.67	332.54
코리아나사이드 A(koreanaside A),	0.19	0.65	352.14
악틴(arctiin)	0.28	0.51	185.83
마타이레시놀(matairesinol),	0.13	1.07	801.61
악티게닌(arctigenin),	0.10	0.10	104.75

그 결과, 상기 표 1, 및 도 12의 A 및 B에서 볼 수 있듯이, 대부분의 주요 화합물은 추출물에 비하여 분획물에 더 많은 양으로 포함되어 있음을 확인하였다. 특히, 코리아나사이드 C, 루틴, 마타이레시노사이드, 코리아나사이드 A, 악틴, 마타이레시놀이 추출물에 비하여 분획물에 더 많은 양으로 포함되어 있었고, 1.6배 내지 8배 이상 더 높은 함량으로 포함되어 있음을 확인하였다.

상기 결과를 통해, 본 발명에 따른 방법으로 제조한 개나리 꽃 추출물의 분획물은 추출물에 비하여 다양한 페놀릭 화합물을 고농도로 포함하고 있음을 알 수 있었고, 이에 따라 다양한 생리 활성을 나타낼 것임을 알 수 있었다.

실시예 5. FK9 분획물의 생리 활성 확인

실시예 5-1. 세포 독성 확인

상기 실시예 3 및 4를 통해 상기 방법으로 제조한 개나리 꽃 추출물의 분획물(FK9)은 페놀릭 화합물을 높은 농도로 포함하고 있음을 확인한바, 이의 생리활성을 확인하고자 하였다.

먼저, 상기 분획물 "FK9"의 세포 독성을 확인하였다. 구체적으로, 개나리 꽃 메탄올 추출물(MeOH ext.), 상기 추출물의 헥산 분획물(n-hexane fr.), 에틸아세테이트 분획물(EtOAc fr.) 부탄올 분획물(n-BuOH fr.), 물 분획물(water fr.), FK9(HE=1:1-EB=1:10 fr., n-헥산 및 EtOAc가 1:1로 섞여있는 용매; 및 EtOAc 및 n-BuOH가 1:10으로 섞여있는 용매로 분획한 분획물), 에틸아세에이트 및 부탄올이 1:10으로 혼합된 용매로 분획한 분획물(EB=1:10 fr.)을 섬유아세포인 Hs68 세포주와 각질형성세포인 HaCaT 세포주에 처리하였고, 상기 세포의 생존율을 MTT 어세이를 통해 확인하였다.

그 결과, 도 13의 A 및 B에서 볼 수 있듯이, FK9 분획물은 섬유아세포 및 각질형성세포의 세포 증식에 영향을 미치지 않으며, 상기 FK9 분획물을 비롯한 다른 추출물 또는 분획물들도 심각한 세포 독성을 야기하지 않는 것을 확인하였다.

상기 결과를 통해, 본 발명에 따른 방법으로 제조한, 페놀릭 화합물을 고함유하는 개나리 꽃 추출물의 분획물은 피부 세포에 대하여 독성을 나타내지 않으므로 피부 안전성이 우수하여, 화장료 조성물의 형태로 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있었다.

실시예 5-2. 항산화 활성 확인

상기 실시예 3을 통해 제조한, 페놀릭 화합물을 높은 농도로 포함하고 있는 개나리 꽃 추출물의 분획물 "FK9"의 항산화 활성을 확인하고자 하였다.

구체적으로, 개나리 꽃 메탄올 추출물(MeOH ext.), 상기 추출물의 헥산 분획물(n-hexane fr.), 에틸아세테이트 분획물(EtOAc fr.) 부탄올 분획물(n-BuOH fr.), 물 분획물(water fr.), FK9(HE=1:1-EB=1:10 fr., n-헥산 및 EtOAc가 1:1로 섞여있는 용매; 및 EtOAc 및 n-BuOH가 1:10으로 섞여있는 용매로 분획한 분획물), 에틸아세에이트 및 부탄올이 1:10으로 혼합된 용매로 분획한 분획물(EB=1:10 fr.)의 DPPH 라디칼 소거능을 상기 실시예 2-1의 방법에 따라 확인하였다.

그 결과, 도 14에서 볼 수 있듯이, 추출물 또는 다른 분획물들에 비하여, FK9 분획물이 가장 높은 DPPH 라디칼 소거능을 나타냄을 확인하였다.

상기 결과를 통해, 본 발명에 따른 방법으로 제조한, 페놀릭 화합물을 고함유하는 개나리 꽃 추출물의 분획물은 현저하게 우수한 항산화 활성을 나타내므로, 항산화 용도를 갖는 다양한 조성물의 형태로 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있었다.

실시예 5-3. 미백 효과 확인

상기 실시예 3을 통해 제조한, 페놀릭 화합물을 높은 농도로 포함하고 있는 개나리 꽃 추출물의 분획물 "FK9"의 미백 효과를 확인하고자 하였다.

구체적으로, 개나리 꽃 메탄올 추출물(MeOH ext.), 상기 추출물의 헥산 분획물(n-hexane fr.), 에틸아세테이트 분획물(EtOAc fr.) 부탄올 분획물(n-BuOH fr.), 물 분획물(water fr.), FK9(HE=1:1-EB=1:10 fr., n-헥산 및 EtOAc가 1:1로 섞여있는 용매; 및 EtOAc 및 n-BuOH가 1:10으로 섞여있는 용매로 분획한 분획물), 에틸아세에이트 및 부탄올이 1:10으로 혼합된 용매로 분획한 분획물(EB=1:10 fr.)의 미백 효과를 상기 실시예 2-3의 방법에 따라 확인하였다.

그 결과, 도 15의 A 내지 C에서 볼 수 있듯이, 추출물 또는 다른 분획물들에 비하여, FK9 분획물이 가장 높은 멜라닌 합성 억제능을 나타냄을 확인하였다. 특히, FK9 분획물을 처리한 제브라피시의 경우, 양성 대조군인 PTU를 처리한 것보다 형성되는 검은 점의 크기가 더 작으며, 형성되는 멜라닌의 총 양도 정상 대조군에 비하여 현저히 감소하는 것을 확인하였다.

상기 결과를 통해, 본 발명에 따른 방법으로 제조한, 페놀릭 화합물을 고함유하는 개나리 꽃 추출물의 분획물은 우수한 멜라닌 합성 저해능을 나타내므로, 미백 용도를 갖는 다양한 조성물의 형태로 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있었다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변경된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (21)

1. 개나리 꽃 추출물의 분획물을 유효성분으로 포함하는, 피부 미백, 항산화 또는 항염증용 화장료 조성물로서,
   상기 분획물은 개나리 꽃 추출물을 물을 포함하는 용매로 제1분획하고, 에틸아세테이트 및 부탄올을 포함하는 용매로 제2분획하여 수득된 것인, 화장료 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 개나리 꽃 추출물은 메탄올 수용액을 용매로 추출한 것인, 화장료 조성물.
3. 제1항에 있어서, 상기 제1분획은 헥산, 에틸아세테이트 및 물로 구성된 용매로 분획하여 수득된 물 분획물인 것인, 화장료 조성물.
4. 제1항에 있어서, 상기 제1분획은 3회 내지 5회 반복 수행되는 것인, 화장료 조성물.
5. 제1항에 있어서, 상기 제2분획은 에틸아세테이트, 부탄올 및 물로 구성된 용매로 분획하여 수득된 에틸아세테이트 및 부탄올 분획물인 것인, 화장료 조성물.
6. 제5항에 있어서, 상기 용매 내 에틸아세테이트 및 부탄올은 1:8 내지 1:12의 부피비로 혼합된 것인, 화장료 조성물.
7. 제6항에 있어서, 상기 용매 내 에틸아세테이트 및 부탄올은 1:10의 부피비로 혼합된 것인, 화장료 조성물.
8. 제1항에 있어서, 상기 제2분획은 3회 내지 5회 반복 수행되는 것인, 화장료 조성물.
9. 제1항에 있어서, 상기 분획물은 페놀릭 화합물을 고농도로 함유하는 것인, 화장료 조성물.
10. 제9항에 있어서, 상기 페놀릭 화합물은 코리아나사이드 C(koreanaside C), 루틴(rutin), 마타이레시노사이드(matairesinoside), 코리아나사이드 A(koreanaside A), 악틴(arctiin), 마타이레시놀(matairesinol)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것인, 화장료 조성물.
11. (a) 개나리 꽃을 용매로 추출하여 개나리 꽃 추출물을 수득하는 단계,
    (b) 상기 개나리 꽃 추출물을, 물을 포함하는 용매로 분획하여 개나리 꽃 제1분획물을 수득하는 단계, 및
    (c) 상기 개나리 꽃 제1분획물을, 에틸아세테이트 및 부탄올을 포함하는 용매로 분획하여 개나리 꽃 제2분획물을 수득하는 단계를 포함하는,
    페놀릭 화합물을 고농도로 함유하는 개나리 꽃 추출물의 분획물을 제조하는 방법.
12. 제11항에 있어서, 상기 개나리 꽃 추출물의 분획물은 메탄올 수용액을 용매로 추출한 것인, 방법.
13. 제11항에 있어서, 상기 제1분획은 헥산, 에틸아세테이트 및 물로 구성된 용매로 분획하여 수득된 물 분획물인 것인, 방법.
14. 제11항에 있어서, 상기 제1분획은 3회 내지 5회 반복 수행되는 것인, 방법.
15. 제11항에 있어서, 상기 제2분획은 에틸아세테이트, 부탄올 및 물로 구성된 용매로 분획하여 수득된 에틸아세테이트 및 부탄올 분획물인 것인, 방법.
16. 제11항에 있어서, 상기 용매 내 에틸아세테이트 및 부탄올은 1:8 내지 1:12 의 비율로 혼합된 것인, 방법.
17. 제11항에 있어서, 상기 용매 내 에틸아세테이트 및 부탄올은 1:10의 비율로 혼합된 것인, 방법.
18. 제11항에 있어서, 상기 제2분획은 3회 내지 5회 반복 수행되는 것인, 방법.
19. 제11항에 있어서, 상기 개나리 꽃 추출물의 분획물은 피부 미백, 항산화 또는 항염증 활성을 갖는 것인, 방법.
20. (a) 개나리 꽃을 용매로 추출하여 개나리 꽃 추출물을 수득하는 단계,
    (b) 상기 개나리 꽃 추출물을 용매로 분획하여 개나리 꽃 분획물을 수득하는 단계, 및
    (c) 상기 분획물로부터 화학식 3, 8, 9, 10, 11 및 12로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 페놀릭 화합물을 분리하는 단계를 포함하는, 개나리 꽃으로부터 페놀릭 화합물을 분리하는 방법:
    [화학식 3]
    

    

    
    [화학식 8]
    

    

    
    [화학식 9]
    

    

    
    [화학식 10]
    

    

    
    
    [화학식 11]
    

    

    
    [화학식 12]
    

    

    .
21. 하기 화학식 8, 10 또는 12 중 어느 하나로 표시되는 화합물 또는 이의 염:
    [화학식 8]
    

    

    
    [화학식 10]
    

    

    
    [화학식 12]
    

    

    .

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