본 발명은 개나리 열매(연교)로부터 마타이레시놀 및 악티게닌의 분리 및 정제방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 개나리 열매(연교)의 메탄올추출물을 효소를 이용하여 가수분해 처리 후 다이아이온 HP-20 수지 또는 실리카겔 칼럼 크로마토그래피 그리고 세파덱스 LH-20 칼럼 크로마토그래피를 순차적으로 실시하여 식물성 여성호르몬 리그난화합물인 마타이레시놀 및 악티게닌을 분리 및 정제하는 방법에 관한 것이다.
연교(Forsythiae Fructus, 連翹)는 물푸레나무과(Oleaceae)에 속하는 낙엽관 목인 개나리나무(신리화)의 과실로서 예로부터 한방에서 해독, 배농, 소염 및 이뇨제로 형개연교탕, 시호청간탕, 방풍통성산, 은교산, 상국음, 형방패독산 및 십미패독산 등의 한방처방에 사용되어왔다(이상인, 본초학, p 514-515, 1982; 한대석, 생약학, p285-287, 1998; 생약학교재 편찬위원회, 생약학, p 310-311, 1998). 개나리 종류로는 의성개나리(Forsythia viridissima Lindley), 개나리(F. koreana Nakai) 또는 중국 개나리(F. suspensa Vahl.) 등이 알려져 있으며, 이 중 의성 개나리만이 열매와 씨를 맺는다(한대석, 생약학, p 285-287, 1998; 생약학교재 편찬위원회, 생약학, p 310-311, 1998). 연교는 특이한 향기가 있고 맛은 약간 수렴성이며, 씨는 가늘고 긴 타원형이며 날개가 있다(한대석, 생약학, p 285-287, 1998; 생약학교재 편찬위원회, 생약학, p 310-311, 1998).
연교의 생리활성성분으로서 악틴(arctiin), 악티게닌(arctigenin), 필리린(phillyrin), 마타이레시놀(matairesinol), 마타이레시노사이드(matairesinoside) 및 피노레시놀 글루코시드(pinoresinol glucoside) 등의 여러 리그난 성분과 포시티아사이드(forsythiaside), 서스펜소사이드(suspensoside), 악테오사이드(acteoside) 및 비리디시마사이드(viridissimaside) 등의 카페인산(caffeic acid) 배당체 성분, 그리고 트리테르페노이드(triterpenoids) 성분으로 베튜린산(betulinic acid), 올레아놀산(oleanolic acid) 및 우르솔산(ursolic acid) 등이 있으며, 또한 플라보노이드(flavonoid) 성분으로 루틴(rutin) 등을 함유하고 있다(Nishibe S et al., Yakugaku Zasshi 97: 1134-1137, 1977; Chiba et al., Shoyakugaku Zasshi 32: 194-198, 1978; Nishibe S. et al., Chem Pharm Bull 30: 1048-1050, 1982; Nishibe S. et al., Chem Pharm Bull 30: 4548-4552, 1982; Kitagawa S, et al., Phytochemistry 23: 1635-1642, 1984; Kitagawa S. et al., Chem Pharm Bull 32: 1209-1213, 1984; Kitagawa S. et al., Chem Pharm Bull 36: 3667-3672, 1988; Rahman MMA. et al., Phytochemistry 29: 1971-1980, 1990).
지금까지 국내외적으로 수행된 연교추출물 및 활성성분들의 약리 및 생리적작용에 관한 보고로서 항산화 및 항고지혈증작용(이정민 외, 한국영양학회지, 36: 990-996, 2003; Cho et al., Biofactors 15: 1-3, 2004)과 더불어 주된 생리활성물질인 리그난계의 피노레시놀(pinoresinol), 마타이레시놀(matairesinol) 등의 cyclic AMP phosphodiesterase 저해작용(Kitagawa S. et al., Chem Pharm Bull 32: 1209-1213, 1984) 및 항암작용(Nishibe S. et al., The 2nd International Conference on Food Factors: Physiologic functions and disease risk reduction, ICoFF-2, Abstract p124, 2001), 카페인산(caffeic acid) 배당체인 포시티아사이드(forsythiaside) 및 서스펜소사이드(suspensoside)의 황색포도상구균에 대한 항균작용(Nishibe S. et al., Chem Pharm Bull 30: 4548-4552, 1982; Nishibe S. et al., Chem Pharm Bull 30: 1048-1050, 1982), 그리고 알레아노산(aleanoic acid)의 이뇨작용과 연교 알코올엑기스의 항알레르기작용이 보고되었으며, 그 외 항균작용, 진토작용, 혈압강하작용, 보간작용 및 이뇨작용이 현저한 것으로 보고되고 있다(생약학교재 편찬위원회, 생약학, p 310-311, 1998). 따라서 연교의 이러한 여러 가지 생리적작용을 근거로하여 항암, 항고혈압 및 항균 효능을 지닌 기능성 식품, 화장품 및 의약품의 개발이 요구되고 있다.
한편, 최근 여러 과채류, 곡류 및 두류 등의 식물에 함유되어 있는 식물화학물질(phytochemicals)은 비타민을 능가할 차세대 요법의 약으로서 암, 심장병, 고혈압 및 골다공증 등 여러 가지 퇴행성 만성질환의 예방에 우수한 효과가 있는 것으로 밝혀지고 있다(Block G, Patterson B, Subar A, Nutr. Cancer, 18: 1-29, 1992;Clare MH, Food Technol., 52(11): 63-70, 1998). 특히 이들 식물화학물질 중 최근 가장 주목을 받고 있는 것이 바로 콩의 이소플라본(제니스테인 및 다이드제인)과 아마종자(flax seed)의 리그난(마타이레시놀, 세코이소라리시레시놀)과 같은 식물성 여성호르몬 즉 피토에스트로겐(phytoestrogen) 물질이다(Adlercreutz H, Baillieres Clin Endocrinol Metab., 24: 605-623, 1998; Hutchins AM, Slavin JL, Lampe JW, J. Am. Diet Assoc., 95: 545-551, 1995). 이들 피토에스트로겐은 디페놀화합물로서 그 구조와 분자량이 스테로이드 여성호르몬 에스트로겐(estrogen)과 유사하여 호르몬 의존성의 여러 암(유방암, 전립선암 및 대장암)의 발병을 감소시켜 줄 뿐만 아니라 폐경기 여성에게 가장 흔하게 발병하는 심장병 및 골다공증의 발병을 억제하며, 아울러 그 외 항산화, 항용혈, 항균 및 항바이러스작용을 지니고 있다(Adlercreutz H, Natural Antioxidants and Food Quality in Atherosclerosis and Cancer Prevention. Lignans and isoflavonoids: Epidemiology and a possible role in prevention of cancer. Kumpulainen, J.T. and Salonen, J.T.(ed.), p. 349-355. The Royal Soc. of Chemistry, UK, 1996;Anderson JJB, Garner SC, Nutr. Res., 17: 1617-1632, 1997). 따라서 현재 국내외적으로 천연물 유래의 새로운 식물성 여성호르몬(피토에스트로겐) 물질을 찾으려는 연구가 활발히 수행되고 있다.
식물 중에 존재하는 리그난화합물은 디벤질부탄(dibenzylbutane) 골격을 지닌 디페놀화합물로써 주로 아마종자(linseed) 및 참깨종자(sesame seed)를 비롯한 여러 식물종자에 많이 함유되어 있다. 이들 리그난화합물은 사람이 섭취하면 장의 세균에 의해 여성호르몬 17β-에스트라디올(17β-estradiol)과 분자구조가 아주 유사한 포유류 리그난화합물로 전환되며[그 예로서 세코이소라리시레시놀 디글리코사이드(secoisolarici-resinol diglycoside)는 세균에의해 엔테로디올(enterodiol)로, 그리고 마타이레시놀(matairesinol)은 엔테로락톤(enterolacton)으로 각각 전환], 일단 체내에 생성된 포유류 리그난 성분은 혈액과 간을 순환하여 최종적으로 뇨로 배설되기에 식물에 함유된 리그난 전구체의 량과 뇨 배설량은 직접 상관관계를 갖고 있다. 따라서 이들 리그난화합물은 호르몬 의존성 전립선암, 유방암 및 대장암을 억제할 뿐만 아니라 심장병 및 골다공증을 예방하며, 그 이외 항균 및 항바이러스 성질을 갖고 있다(Adlercreutz H, Setchell KDR, J. Steroid Biochem., 13: 11-15, 1979; Adlercreutz H, Gastroenterology 86: 761-767, 1984; Watanabe S, Koessel S, J. Epidemiol., 3: 47-53, 1993; Yuan JM, Wang QS, Ross RK, Henderson BE, Yu MC, Br. J. Cancer 71: 1353-1358, 1995). 따라서 세코이소라리시레시놀 및 마타이레시놀을 다량 함유하고 있는 아마종자(flax seed)는 현재 미국이나 유럽에서 암 예방 식이성건강보조식품 소재로서 널리 이용되고 있으며, 아울러 그들을 함유하고 있는 새로운 식물 자원을 찾으려는 연구가 활발히 수행되고 있다.
한편, 여성호르몬 에스트로겐(estrogen)은 진피에 있는 섬유아세포를 자극하 여 콜라겐의 합성과 신진대사를 촉진시키며 또한 피부의 수분유지에 매우 중요한 히아루론산의 합성을 촉진시킴으로서 피부에 탄력성, 부드러움, 유연성 및 보습성을 부여하는 생리활성물질이다(Shaher MG, Maibach HI, J. Clin. Dermatol., 2: 143-148, 2001: Thornton MJ, Exp. Dermatol., 11: 487-492, 2002). 또한, 에스트로겐은 표피에 있는 기저세포의 증식을 촉진시켜 표피를 좀 더 두텁게 함으로서 피부의 세포조직을 강화시키며, 피지선을 조절하여 피지선의 성장을 억제함으로서 피지의 생성을 감소시킬 뿐만 아니라 털의 성장속도를 늦추어 털을 가늘고 짧게 유지시킨다(Thornton MJ, Exp. Dermatol., 11: 487-492, 2002). 그러나 여성이 갱년기에 접어들면 에스트로겐의 분비 결핍으로 섬유아세포는 콜라겐과 탄력섬유 등의 생성이 억제되어, 피부가 얇아지고 피부의 탄력이 감소한다. 따라서 에스트로겐 결핍으로 인한 피부노화 현상을 억제하기 위한 수단으로 현재 가장 주목을 받고 있는 것이 바로 에스트로겐(estrogen) 호르몬 대체요법이다(Brincat MP, Maturitas 29: 107-112, 2000). 그러나 피부 화장료에서는 여성호르몬을 직접적으로 사용하지 못하기 때문에 현재 이를 대체할 수 있는 천연물 유래의 새로운 식물성 여성호르몬(피토에스트로겐)의 개발이 절실히 요구되고 있다.
개나리 열매(연교)에 함유되어 있는 마타이레시놀(matairesinol) 및 악티게닌(arctigenin) 성분은 거의 배당체(matairesinoside 및 arctiin)로 존재하고 있으며, 그 함량은 식물성 여성호르몬의 보고로 알려진 아마종자의 마타이레시놀 함량보다 높다(Thompson LU, Baillieres Clin. Endocrinol Metab., 12: 691-705, 1998; Hutchins AM et al., Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 9: 1113-1118, 2000; Nishibe S. et al., Cancer Preventive p 124, 2001; Sicilia T et al., J. Agric. Food Chem., 26: 1181-1188, 2003). 그리고 개나리의 품종 및 성장 시기에 따라 마타이레시놀 및 악티게닌의 함량은 상당히 차이가 있으며(Rahman MMA et al., Phytochemistry 29: 1971-1980, 1990), 또한 개나리 열매(연교) 뿐만 아니라 개나리 잎 및 줄기에도 다량 존재하고 있는 것으로 보고되고 있다 (Nishibe S. et al., The 2nd International Conference on Food Factors: Physiologic functions and disease risk reduction, ICoFF-2, Abstract p124, 2001). 이와같이 지금까지 개나리 열매(연교)로부터 마타이레시놀 및 악티게닌 그리고 그들의 배당체(마타이레시노사이드 및 악틴)의 분리 및 동정 그리고 그들의 생리작용에 관한 다수의 연구가 보고되어 왔으나 아직까지 연교에 다량 존재하는 비활성형의 리그난성분(마타이레시노사이드 및 악틴)을 활성형(마타이레시놀 및 악티케닌)으로 전환하는 기술 개발과 더불어 그를 대량 순수 분리 및 정제에 관한 연구는 거의 없는 실정이다.
따라서, 본 발명의 목적은 건조 개나리 열매(연교)로부터 항암, 항고혈압, 항골다공증 및 항노화활성을 지니고 있는 식물성 여성호르몬 성분인 활성형 리그난화합물 마타이레시놀 및 악티게닌의 전환기술을 개발하고, 그들을 효과적으로 분리 및 정제하기 위한 개선된 방법을 제공하고자 한다.
본 발명의 목적은 개나리 열매(연교)의 메탄올추출물을 노르말-헥산으로 탈지하고 얻어진 탈지 메탄올추출물을 열수로 용해하고 여기에 펙틴나제 및 셀룰라제를 혼합처리하여 비활성형 리그난성분을 활성형 리그난성분으로 전환시킴과 동시에 그들 성분을 다이아이온 HP-20 이온수지 칼럼 크로마토그래피 또는 에틸아세테이트로 용매분획한 후 실리카겔 칼럼 크로마토그래피와 세파덱스 LH-20 칼럼 크로마토그래피를 실시하여 활성형 리그난화합물 마타이레시놀 및 악티게닌을 순수 분리 및 정제함으로서 달성하였다.
이하, 본 발명의 구체적인 구성을 설명한다.
본 발명은 건조 연교의 메탄올 추출단계; 상기 메탄올추출물의 탈지 단계; 효소의 처리단계; Diaion HP-20 이온수지 칼럼 크로마토그래피 혹은 에틸아세테이트 용매분획 후 실리카겔 칼럼 크로마토그래피 단계; 세파덱스 LH-20 칼럼 크로마토그래피에 의한 리그난화합물 마타이레시놀 및 악티게닌의 분리 및 정제단계로 구성된다.
본 발명은 다음의 단계를 포함하는 건조 연교로부터 식물성 여성호르몬 성분인 리그난화합물인 마타이레시놀 및 악티게닌의 분리 및 정제방법을 제공한다:
건조 연교에 50∼100% 메탄올수용액을 1톤/100 kg 로 가하여 70∼90℃에서 12시간 가열하여 추출한 다음 감압 농축하고,
상기의 농축물에 50∼100% 메탄올수용액로 가용시킨 다음, 동량의 100% 노르말-헥산을 첨가하여 탈지하고,
상기에서 얻은 연교 탈지 메탄올추출물에 10% 메탄올수용액을 33.3 kg/kg 중량%로 첨가하여 현탁시킨 후 상기 탈지 메탄올추출물에 대해 10% 펙틴나제 및 10% 셀룰라제를 혼합처리하여 50∼60℃에서 12시간동안 가수분해시키고,
상기로부터 얻은 가수분해물을 다이아이온 HP-20 수지에 통과시킨 후 80% 메탄올수용액으로 용출시키고 농축 후 다시 세파덱스 LH-20 칼럼 크로마토그래피를 실시하여 리그난화합물인 마타이레시놀 및 악티게닌을 분리 및 정제함.
또한, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 건조 연교로부터 활성형 리그난화합물인 마타이레시놀 및 악티게닌의 분리 및 정제방법을 제공한다:
효소처리한 탈지 메탄올추출물에 2배 부피의 에틸아세테이트를 가하여 용매분획한 후 상층의 에틸아세테이트층을 감압농축하여 얻은 에틸아세테이트추출물을 다시 실리카겔 및 세파덱스 LH-20 칼럼 크로마토그래피를 연이어 실시하여 리그난화합물인 마타이레시놀 및 악티게닌을 분리 및 정제함.
본 발명의 건조 연교로부터 리그난 성분인 마타이레시놀 및 악티게닌의 분리 및 정제방법에서 메탄올수용액의 바람직한 농도는 50% 내지 100%이며, 가장 바람직하게는 80% 내지 90% 수용액이다. 이 때 추출용매로써 메탄올 대신 에탄올을 사용할 수도 있다.
본 발명의 건조 연교에서 리그난 성분의 분리 및 정제방법에서 가열추출의 바람직한 온도는 70℃ 내지 90℃ 이며, 가장 바람직하게는 80℃ 이다.
이하, 본 발명의 구체적인 방법을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하지만 본 발명의 권리범위는 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1 : 효소처리, 이온수지 및 세파덱스 LH-20 칼럼 크로마토그래피에 의한 연교로부터 리그난화합물 마타이레시놀 및 악티게닌의 분리 및 정제
연교로부터 활성형 리그난화합물인 마타이레시놀과 악티게닌을 분리 정제하기 위해, 효소처리, Diaion HP-20 이온수지 및 세파덱스 칼럼 크로마토그래피를 실시하였다. 우선, 건조 개나리 열매(Forsythia viridissima Lindley) 100 kg에 80% 메탄올수용액 1.0톤을 가하여 80℃에서 12시간 가열추출한 후 여과하였다. 상기 추출과정을 2회 반복 실시하여 얻은 혼합 메탄올추출액을 부분 감압ㆍ농축하여 연교 메탄올추출액(300 kg)을 얻었다. 다음, 메탄올추출액을 80% 메탄올수용액(500 kg)으로 교반하면서 가용화한 후 1∼2일간 상온에서 방치한 다음 얻어진 상등액에 노르말-헥산(300 kg)를 가하고 분획하여 상층액의 지방과 색소를 제거하고 하층을 농축하여 연교 탈지 메탄올추출물(18 kg)을 얻었다. 이것을 다시 90% 메탄올수용액(100 kg)으로 용해하여 하룻밤 정치시킨 후 여과 및 농축하여 연교추출물(15 kg)을 얻고 이 중 3 kg을 10% 메탄올수용액(100 kg)으로 용해한 후 여기에 펙틴나제(pectinex, Novozymes, Denmark)와 셀룰라제(celluclast, Novozymes, Denmark) 각각 300 g을 가하여 50~60℃에서 12시간 교반하면서 가수분해시킨 후 방냉하고 미리 40% 메탄올수용액으로 평형화시켜 놓은 Diaion HP-20 이온수지(Mistubishi Chem. Co., Japan) 칼럼(25 cm × 280 cm)에 충진시킨 후 순차적으로 40% 메탄올수용액(500 kg), 60% 메탄올수용액(1.5 톤), 80% 메탄올수용액(500 kg), 및 100% 메탄올(300 kg)로 각각 용출하였다. 이때, 80% 메탄올수용액(120 kg)으로 먼저 용출되는 분획 I과 다음 용출액(50 kg)을 통과시킨 후 최종 80% 메탄올수용액(130 kg)으로 용출되는 분획 II를 회전식 증발건조기(rotary evaporator)로 50℃ 이하에서 감압농축시켜 분획 I(132 g, 정제분말 I)과 분획 II(119 g, 정제분말 II)을 각각 얻었 다. 다음 이들 분획을 다시 메탄올로 각각 용해시킨 후 연속적으로 세파덱스 LH-20(파마시아, 스웨덴) 100 g으로 충진시킨 칼럼(직경 4 cm × 길이 80 cm)에 옮기고 메탄올 1 L으로 튜브당 5 mL씩 200개 분획으로 나누어 용출하여 마타이레시놀(matairesinol) 55.2 g (수율 276 mg%)과 악티게닌(arctigenin) 48.5 g (수율 243 mg%)을 각각 얻었다.
실시예 2 : 에틸아세테이트 분획, 실리카겔 및 세파덱스 칼럼 크로마토그래피에 의한 연교로부터 리그난화합물 마타이레시놀 및 악티게닌의 분리 및 정제
연교로부터 리그난화합물 마타이레시놀과 악티게닌을 분리 정제하기 위해, 에틸아세테이트 분획, 실리카겔 및 세파덱스 칼럼 크로마토그래피를 실시하였다. 우선, 상기 실시예 1에서와 같은 방법으로 얻은 탈지 메탄올추출물(15 kg) 중 3 kg을 효소처리한 후 얻어진 효소추출액에 에틸아세테이트(100 kg)을 가하여 2회 연속 분획한 다음 얻어진 상층액을 무수 망초로(10 kg)로 탈수한 후 감압농축하여 에틸아세테이트추출물(175 g)을 얻었다. 다음, 이 추출물을 클로로포름:메탄올(5:1, v/v) 혼합용액 2 kg으로 용해한 후 미리 같은 용매로 평형화시켜 놓은 실리카겔(Merck, Damstadt, Germany) 칼럼(25 cm×280 cm)에 충진시킨 후 연속적으로 용출하여 4가지 분획을 얻었다: 분획 I (100 kg), 분획 II(150 kg), 분획 III(100 kg), 및 분획 IV(50 kg). 다음, 이들 분획 중 분획 II(정제분말 II)와 분획 IV(정제분말 IV)를 각각 감압농축하여 얻어진 추출물을 다시 메탄올로 용해시킨 후 연속적으로 세파덱스 LH-20(파마시아, 스웨덴) 100 g으로 충진시킨 칼럼(직경 4 cm×길이 80 cm)에 옮기고 메탄올 1 L으로 튜브당 5 mL씩 200개 분획으로 나누어 용출하여 분획 II로부터 악티게닌(arctigenin) 41.0 g (수율 205 mg%)과 분획 IV로부터 마타이레시놀(matairesinol) 44.8 g (수율 224 mg%)을 각각 얻었다.
실시예 3 : 본 발명의 방법에 따라 생산된 연교 정제분말 중의 리그난화합물 마타이레시놀 및 악티게닌의 정량분석
상기 실시예 1과 2에서 서술된 방법에 따라 연교로부터 최종적으로 세파덱스 LH-20 칼럼 크로마토그래피를 실시하기 전에 얻어진 연교 정제분말 중 리그난화합물 마타이레시놀 및 악티게닌의 정량분석은 고속액체크로마토그래피(HPLC)를 이용하여 다음과 같이 실시하였다. 우선, 연교 정제분말 0.1 g을 100% 메탄올 10 mL로 용해한 후 같은 용액으로 100 mL로 정용하였다. 상기 용액을 같은 용매로 10배 희석한 후 이 중 1 mL을 취하여 0.45 ㎛ membrane filter(gelman Sci, USA)를 통과시킨 후 20 ㎕를 HPLC에 주입시켜 정량분석하였으며, 이때 HPLC 분석조건은 다음과 같다: 길슨 506B 고속액체크로마토그래피, 칼럼; YMC pack C18(5 ㎛, 4.6 mm × 250 mm, YMC Inc., USA), 이동상(용매 A --> 용매 B로 60분간 농도구배 용출); 용매 A(0.03% 인산 함유 20% 메탄올수용액) & 용매 B(80% 메탄올수용액), 자외선 검출기; UV280 nm, 유속; 1.0 mL/min.
이때, 상기 실시예 1과 2에 따라 연교로부터 분리된 리그난 아글리콘성분 마타이레시놀 및 악티게닌과 그들의 배당체성분(마타이레시노사이드 및 악틴)의 고속 액체크로마토그램 및 화학구조는 도 1과 도 2에 각각 나타내었다.
그리고 연교로부터 분리된 리그난화합물 마타이레시놀 및 악티게닌의 UV, IR, NMR 및 MS 스펙트럼 데이터를 나타낸 결과는 표 1과 같다.
연교로부터 분리된 리그난화합물 마타이레시놀 및 악티게닌의 UV, IR, NMR 및 MS 스펙트럼 데이터
Instrumental analysis |
마타이레시놀 |
악티게닌 |
UV(λmax)nm in MeOH(logε) |
230(3.91) 280(3.79) |
230(3.90), 280(3.77) |
IR(vmax)cm-1 |
3410, 1760, 1610, 1520 |
3400, 1770, 1520 |
1H-NMR |
|
|
H-2 |
6.60(d, J=2.0 Hz) |
6.65(d, J=2.0 Hz) |
H-5 |
6.66(d, J=8.0 Hz) |
6.70(d, J=8.0 Hz) |
H-6 |
6.48(dd, J=8.0, 2.0 Hz) |
6.58(dd, J=8.0, 2.0 Hz) |
H-7 |
2.43(m) |
2.43(m) |
H-8 |
2.68(m) |
2.68(m) |
H-9 |
3.85(dd, J=8.3, 7.5 Hz) 4.08(dd, J=8.8, 7.5 Hz) |
3.85(dd, J=8.3, 7.5 Hz) 4.08(dd, J=8.8, 7.5 Hz) |
H-2' |
6.74(d, J=2.0 Hz) |
6.82(d, J=2.0 Hz) |
H-5' |
6.69(d, J=8.0 Hz) |
6.74(d, J=8.0 Hz) |
H-6' |
6.58(dd, J=8.0, 2.0 Hz) |
6.66(dd, J=8.0, 2.0 Hz) |
H-7' |
2.81(dd, J=14.0, 7.0 Hz) 2.88(dd, J=14.0, 5.5 Hz) |
2.85(dd, J=14.0, 7.0 Hz) 2.92(dd, J=14.0, 5.5 Hz) |
H-8' |
2.68(m) |
2.68(m) |
OCH3 |
3.73, 3.71 |
3.73, 3.71, 3.70 |
13C-NMR |
|
|
C-1 |
129.62 |
131.27 |
C-2 |
112.68 |
111.82 |
C-3 |
147.49 |
148.68 |
Instrumental analysis |
마타이레시놀 |
악티게닌 |
C-4 |
145.10 |
147.33 |
C-5 |
115.39 |
113.43 |
C-6 |
120.71 |
120.38 |
C-7 |
36.90 |
36.92 |
C-8 |
40.91 |
40.84 |
C-9 |
70.72 |
70.71 |
C-1' |
128.93 |
128.91 |
C-2' |
113.47 |
112.37 |
C-3' |
147.42 |
147.44 |
C-4' |
144.94 |
145.14 |
C-5' |
115.39 |
115.31 |
C-6' |
121.60 |
121.59 |
C-7' |
33.71 |
33.75 |
C-8' |
45.66 |
45.68 |
C-9' |
178.51 |
178.48 |
OCH3 |
55.55, 55.48 |
55.54, 55.45, 55.34 |
FAB-MS[m/z] |
359[M+H]+ |
373[M+H]+ |
NMR 스펙트럼은 AMX-500 spectrometer (Varian Unityplus, USA)상에서 DMSO에서 얻음.
화학물질의 이동(Chemical shifts)은 δ 값으로 나타냈으며, coupling constants(J in parentheses)는 Hz로 제공됨. d:doublet; dd: double doublet; m: multiplet.
상기 실시예 1과 2에서 서술된 방법에 따라 연교로부터 제조된 두 가지 정제분말 중의 두 가지 리그난화합물(마타이레시놀 및 악티게닌)의 함량을 측정한 결과를 표 2 및 표 3에 각각 나타내었다.
효소처리 및 다이아이온 칼럼 크로마토그래피에 의해 연교로부터 제조된 정제분말 I 및 II 중의 마타이레시놀 및 악티게닌의 함량
정제분말 |
리그난 |
함량(%, 정제분말 100g) |
1차 분석 |
2차 분석 |
3차 분석 |
평균 |
I |
마타이레시놀 |
24.78 |
25.08 |
24.73 |
24.86±0.19 |
II |
악티게닌 |
23.01 |
22.49 |
22.91 |
22.80±0.28 |
모든 측정은 3회 반복하여 측정한 후 평균± 표준편차로 나타냄.
각 시험구간의 유의성 있음(p<0.05).
표 2에서 보는 바와 같이, 효소처리 및 다이아이온 칼럼 크로마토그래피에 의해 연교로부터 제조된 정제분말 I 및 II 중의 마타이레시놀 및 악티게닌의 함량은 각각 24.86% 및 22.80% 로서 두 분말 모두 20% 이상의 수율을 얻을 수 있었다.
에틸아세테이트 분획 및 실리카겔 칼럼 크로마토그래피에 의해 연교로부터 제조된 정제분말 II 및 IV 중의 마타이레시놀 및 악티게닌의 함량
정제분말 |
리그난 |
함량(%, 정제분말 100g) |
1차 분석 |
2차 분석 |
3차 분석 |
평균 |
II |
마타이레시놀 |
31.13 |
30.45 |
32.76 |
31.45±1.19 |
IV |
악티게닌 |
29.65 |
30.76 |
31.54 |
30.65±0.95 |
모든 측정은 3회 반복하여 측정한 후 평균± 표준편차로 나타냄.
각 시험구간의 유의성이 없음(p<0.05).
표 3에서 보는 바와 같이, 에틸아세테이트 분획 및 실리카겔 칼럼 크로마토그래피에 의해 연교로부터 제조된 정제분말 II 및 IV 중의 마타이레시놀 및 악티게닌의 함량은 각각 31.45% 및 30.65% 로서 두 가지 분말 모두 약 30% 이상의 수율을 얻었다. 이는 앞의 효소처리 및 다이아이온 칼럼 크로마토그래피에 의해 연교로부터 제조된 정제분말 I 및 II 중의 마타이레시놀 및 악티게닌의 함량 보다 높았으나 수율면에서는 앞의 것보다 낮았다.
실시예 4 : 효소처리 유무에 따른 연교추출물에 함유된 리그난화합물의 정량분석
효소처리 유무에 따른 연교추출물에 함유된 리그난배당체 마타이레시노사이드와 악틴 및 그들의 아글리콘 성분 마타이레시놀 및 악티게닌을 정량하기 위해 미리 연교로부터 순수하게 분리된 4가지 리그난화합물을 이용하여 작성된 표준검량곡선[마타이레시노사이드: y=76.85x + 0.193 (r2=0.996); 악틴: y=107.30x + 0.111 (r2=0.997); 마타이레시놀: y=72.04x + 0.081 (r2=0.992); 악티게닌: y=111.12x - 0.047 (r2=0.994)]을 토대로 효소처리 유무에 따른 연교 메탄올추출 중의 4가지 리그난화합물의 함량을 측정한 결과는 표 4와 같다.
효소처리에 따른 연교추출물 중의 리그난 배당체 및 아글리콘의 함량 비교
처리구 |
함량(%, 연교추출물) |
마타이레시노사이드 |
악틴 |
마타이레시놀 |
악티게닌 |
무처리구(대조구) |
3723±23.4 |
3416.4±2.5 |
513.2±12.4 |
725.4±10.4 |
효소처리구 |
Tr* |
Tr |
2766.2±16.4 |
1624.5±12.4 |
모든 측정은 3회 반복하여 측정한 후 평균± 표준편차로 나타냄.
각 시험구간의 유의성 있음(p<0.05). *Trace: 1 mg% 이하
표 4에서 보는 바와 같이, 무처리구에서는 연교 메탄올추출물의 4가지 리그난화합물의 함량을 보면 마타이레시노사이드 3723.5 mg%, 악틴 3416.4 mg%, 마타이레시놀 513.2 mg% 및 악티게닌 725.4 mg%으로서 대부분 리그난배당체 화합물(마타이레시노사이드 & 악틴)이 존재하는 반면, 그들의 아글리콘 화합물인 마타이레시놀 및 악틴게닌 함량은 낮았다. 반면, 효소처리구에서는 마타이레시놀 2766.2 mg% 및 악티게닌 1624.5 mg%으로서 리그난 배당체성분은 거의 존재하지 않고 두 가지 리그난 아글리콘성분만이 대부분 존재하였다. 이와같이 효소처리에 의해 연교 메탄올추출물에 존재하는 리그난 배당체 성분은 거의 아글리콘 성분으로 전환되었음을 알 수 있었다.
상기 실시예를 통하여 설명한 바와 같이, 본 발명은 개나리 열매로부터 마타이레시놀 및 악티게닌의 분리 및 정제방법에 관한 것으로, 개나리 열매(연교)로부터 식물성 여성호르몬 리그난화합물 마타이레시놀 및 악티게닌을 효과적으로 분리 및 정제하는 방법을 제공하는 데 뛰어난 효과가 있다. 또한, 본 발명은 연교 탈지 메탄올추출물에 효소를 처리하여 비활성형 리그난배당체 성분을 활성형 리그난 아글리콘 성분으로 전환시킨 후 다이아이온 HP-20 이온수지 또는 실리카겔 칼럼 크로마토그래피와 최종적으로 세파덱스 LH-20 칼럼 크로마토그래피를 연이어 실시하여 활성형 리그난화합물을 효과적으로 분리 및 정제하도록 하는데 뛰어난 효과가 있다. 따라서, 본 발명의 분리 및 정제방법은 연교로부터 리그난 아글리콘 성분을 대량생산할 수 있고 작업의 효율을 높이는 효과가 있으므로 생리활성물질 분리산업상 유용할 뿐만 아니라 상기 리그난화합물은 항암, 항고혈압, 항골다공증 및 항노화성 식물성에스트로겐 성분으로서 기능성 식품, 화장품 및 의약품의 신소재로써 사용할 수 있어 식품, 화장품 및 약학산업상 매우 유용한 발명인 것이다.