KR101945859B1

KR101945859B1 - 신규한 진세노사이드를 유효성분으로 포함하는 미백용 조성물

Info

Publication number: KR101945859B1
Application number: KR1020160023497A
Authority: KR
Inventors: 이대영; 김금숙; 이승은; 안영섭; 이재원; 지승헌
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2016-02-26
Filing date: 2016-02-26
Publication date: 2019-02-11
Also published as: KR20170100957A

Abstract

본 발명은 신규한 진세노사이드를 유효성분으로 포함하는 미백용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 미백용 조성물은 멜라닌의 생합성을 효과적으로 억제할 뿐만 아니라, 종래 합성 약학적 조성물보다 인체에 무해하며 부작용이 거의 없으므로, 미백용 화장료 조성물 및 멜라닌 색소 과다 침착으로 인한 질환의 예방 또는 치료제로 활용될 수 있다.

Description

신규한 진세노사이드를 유효성분으로 포함하는 미백용 조성물{Composition for skin whitening comprising novel ginsenoside}

본 발명은 신규한 진세노사이드를 유효성분으로 포함하는 미백용 조성물에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 멜라닌 세포에서 멜라닌의 생합성을 억제하여 미백 활성을 가지는 인삼 잎 추출물 유래 화합물을 유효성분으로 포함하는 미백용 조성물에 관한 것이다. 또한, 상기 화합물은 천연물로부터 추출 분리된 것으로 인체 부작용이 거의 없으므로, 피부 미백용 화장료 조성물 또는 멜라닌 색소 과다 침착으로 인한 질환의 예방 또는 치료제로 활용될 수 있다.

멜라닌 색소는 멜라닌형성(melanogenesis)이라고 불리는 과정을 통해 멜라닌세포(melanocyte)의 멜라노좀(melanosome)에서 합성되고 상피의 각질형성세포(keratinocyte)로 분산됨으로써, 피부색을 형성하고 피부를 태양의 자외선광으로부터 보호하는 역할을 수행한다. 멜라닌 생합성에 대한 생화학적 경로는 티로시나아제(tyrosinase)가 촉매하는 2개의 특징적 반응인, L-티로신의 수산화반응과 3,4-디히드록시페닐알라닌(3,4-dihydroxyphenylalanine, dopa)의 산화반응을 통해 시작되며, 생성된 도파퀴논(dopaquinone)은 멜라노좀에서 시스테인(cysteine) 또는 글루타티온(glutathione)과 같은 티올 물질과 쉽게 반응하여 황색/적색 피오멜라닌(pheomelanin)을 생성한다. 티올 물질이 고갈되면, 과량의 도파퀴논은 자발적으로 도파크롬(dopachcrome)으로 변환되고 종국적으로 흑색/갈색 유멜라닌(eumelanin)을 형성한다. 피부색이 멜라닌색소의 혼합에 의해 결정이 되지만, 티로시나아제는 피오멜라닌과 유멜라닌 모두의 생합성에 반드시 필요하다 (Slominski A, et al., Physiol Rev., 84:1155, 2004; Hearing VJ and Tsukamoto K., FASEB J., 5:2902, 1991; Le Pape E el al., Pigment Cell Melanoma Res., 21:477, 2008).

피부의 각질형성세포와 섬유아세포로부터 분비되는 파라크린 인자(paracrine factor)는 멜라노사이트에서 멜라닌의 생성에 영향을 미칠 수 있다. 이들 인자들 중에서 α-MSH(α-melanocyte stimulating hormone)은 멜라노사이트상의 MC1R (melanocortin type 1 receptor)에 특이적으로 결합하여 아데닐레이트 사이클라아제(adenylate cyclase)를 활성화시킴으로써 cAMP의 세포내 농도를 증가시키고, 이로 인해 곧 티로시나아제(tyrosinase) 발현이 유도된다. 따라서, 파라크린 인자들 간의 균형은 멜라노사이트 활성화의 세밀한 조절을 통해 피부의 색소화를 조정하는데 있어서 매우 중요한 역할을 한다. 그러나, 멜라닌 색소가 비정상적으로 축적되면, 기미(melasma), 주근깨(freckle), 노인성흑자(senile lentigen)과 같은 색소과다침작 질환이 발생하게 된다(Busca R and Ballotti R., Pigment Cell Res., 13:60, 2000).

상기와 같이 멜라닌 색소 침착으로 인해 발생하는 질환을 예방할 뿐만 아니라 미용적 요구에 의해 미백성분에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있으며, 현재 코지산(Kojic acid), 알부틴(Arbutin) 등과 같은 티로시나제 효소활성을 억제하는 물질, 하이드로퀴논(Hydroquinone), 비타민-C(L-Ascorbic acid) 및 이들의 유도체와 각종 식물 추출물 등이 미백 성분으로 알려져 있다. 이들은 멜라닌 색소의 합성을 저해함으로써, 피부 톤을 밝게 하여 피부 미백을 실현할 수 있을 뿐만 아니라, 자외선, 호르몬 또는 유전에 기인한 기미나 주근깨 등의 피부 과색소 침착증의 개선이 가능한 효과가 있다.

하지만, 상기 성분들은 피부 적용 시, 자극과 발적 등의 안전성의 문제로 사용량의 제한이 있거나, 효과가 미미하여 실질적인 효과를 기대할 수 없는 문제점이 있어, 생체에 안전하고, 유효성분이 안정하며, 무엇보다도 기존의 피부 미백 효과가 있는 물질보다 효과가 우수한 피부 미백 활성을 지닌 성분의 개발이 절실히 요망되고 있다.

한편, 인삼(Panax ginseng C.A. Meyer)은 오가피과 인삼 속에 속하는 식물로서 한국, 중국 및 일본 등지에서 2,000 여년 전부터 사용되어 온 생약이며, 경험적으로 질병을 예방하고 수명을 연장시킬 목적으로 사용되어 왔다. 지금까지 알려진 인삼의 효능 및 효과는 중추신경계에 대한 작용, 항발암 작용, 항암활성, 면역기능 조절작용, 항당뇨 작용, 간기능 항진효능, 심혈관 장해개선, 항동맥경화 작용, 혈압조절 작용, 갱년기 장애 개선, 골다공증에 미치는 효과, 항스트레스 및 항피로 작용, 항산화 활성 및 노화억제 효능 등이 있다(최신고려인삼 '성분 및 효능편', 한국인삼연초연구원, 56-112, 1996).

인삼의 대표적 생리활성 성분인 진세노사이드(Ginsenoside)는 인삼의 지상 및 지하부에 고르게 분포되어 있으며, 특히 인삼 근(뿌리), 인삼엽 및 인삼 열매 등 부위에 따라 진세노사이드 함량뿐만 아니라 조성도 다른 것으로 알려져 있다(Attele AS et al, Biochem. Pharmacol., 58; 1685-1693, 1999).

종래의 기술에서는 인삼 유래 다양한 진세노사이드가 항산화, 항염증, 미백 및 보습 등의 효과를 가진다고 보고되었으나(대한민국 공개특허 제2014-0006418호; 대한민국 공개특허 제2013-0031988호), 인삼 잎 유래 물질의 미백효과에 대한 연구는 미미한 실정이다.

이에, 본 발명자들은 생체에 안전하고 미백효과가 우수한 물질을 선별하기 위해 예의 노력한 결과, 인삼 잎에서 신규한 진세노사이드 화합물을 추출, 분리하였으며, 상기 분리된 화합물은 세포 독성이 없으며, 멜라닌 생합성 저해활성이 우수하다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은, 멜라닌 생합성 억제효능을 가진 신규한 진세노사이드 화합물을 유효성분으로 포함하는 미백용 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명은 또한, 상기 조성물을 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물 및 멜라닌 색소 과다 침착 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명은 또한, 상기 조성물을 포함하는 멜라닌 색소 과다 침착 질환의 예방 또는 치료용 피부 외용제를 제공하는데 있다.

상술한 본 발명의 과제를 해결하기 위하여 본 발명은 하기 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물을 제공한다.

[화학식 1]

[화학식 2]

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 화합물은 인삼 유래일 수 있으며, 특히 인삼 잎 유래일 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 인삼은 다단재배, 수경재배 또는 유기농 재배로 수득된 인삼일 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 조성물은 멜라닌 생합성을 억제할 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 화합물은 총 조성물에 20 내지 100 μM 농도로 포함될 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 조성물을 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 조성물을 포함하는 멜라닌 색소 과다 침착 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 멜라닌 색소 과다 침착 질환은 기미, 주근깨, 노인성 색소반, 또는 일광흑색증(solar lentigines)일 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 약학적 조성물은 파우더, 젤, 연고, 크림, 로션, 액제 또는 에어로졸 제형의 피부외용 제형을 가질 수 있다.

따라서 본 발명은 신규한 진세노사이드를 유효성분으로 포함하는 미백용 조성물을 제공한다. 본 발명의 미백용 조성물은 멜라닌의 생합성을 효과적으로 억제할 뿐만 아니라, 종래 합성 약학적 조성물보다 인체에 무해하며 부작용이 거의 없으므로, 미백용 화장료 조성물 및 멜라닌 색소 과다 침착으로 인한 질환의 예방 또는 치료제로 활용될 수 있다.

도 1은 인삼잎 유래 화합물 1(진세노사이드 Rh21)과 화합물 2(20-O-β-D-glucopyranosyl-3β,6α,12β,20β,25-pentahydroxydammar-23-ene)의 화학 구조를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 화합물 1(진세노사이드 Rh21) 및 화합물 2(20-O-β-D-glucopyranosyl-3β,6α,12β,20β,25-pentahydroxydammar-23-ene)의 처리 농도에 따른 세포내 멜라닌 생합성 저해 활성을 확인한 데이터이다.
도 3은 제브라피시(zebrafish) 모델을 이용한 멜라닌 저해활성 측정방법을 나타낸 그림이다.
도 4는 본 발명의 화합물 1(진세노사이드 Rh21)의 처리 농도에 따른 제브라피쉬(zebrafish) 모델에서 멜라닌 저해 활성을 확인한 데이터이다(A: 무처리 음성 대조군, B: PTU(phenyl-2-thiourea) 100 μM처리 양성 대조군, C: 진세노사이드 Rh21 40μM 처리군, D: 진세노사이드 Rh21 80μM 처리군).

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

상술한 바와 같이, 멜라닌 색소 침착으로 인해 발생하는 질환을 예방할 뿐만 아니라 미용적 요구에 의해 미백성분에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있으나, 미백효과가 있는 것으로 알려진 성분은 자극과 발적 등의 안전성의 문제로 사용량의 제한이 있거나, 효과가 미미하여 실질적인 효과를 기대할 수 없는 문제점이 있다.

따라서, 본 발명은 하기 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물을 제공한다.

[화학식 1]

[화학식 2]

상기 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 화합물; 또는 이의 염;은 화학 합성에 의해 수득되거나, 천연물로부터 분리되거나, 또는 판매되는 것을 구입하여 사용할 수 있으며, 바람직하게는 천연물로부터 분리된 것을 사용할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 인삼에서 유래한 것을 사용할 수 있다.

또한, 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 화합물의 염은 약학적으로 허용가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염일 수 있으며, 상기 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 브롬산, 황산, 아황산, 인산 등을 사용할 수 있고, 유기산으로는 구연산, 초산, 말레산, 퓨마르산, 글루코산, 메탈설폰산, 아세트산, 글리콜산, 석신산, 타타르산, 4-톨루엔 설폰산, 갈락투론산, 엠본산, 글루탐산, 시트르산, 아스파르탄산 등을 사용할 수 있다.

본 발명에 의한 부가염은 통상의 방법, 즉, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 수혼화성 유기용매, 예를 들면 아세톤, 메탄올, 에탄올 또는 아세토니트릴 등에 녹이고 당량 또는 과량의 유기산을 가하거나 무기산의 산 수용액을 가한 후 침전시키거나 결정화시켜서 제조하거나, 또는 용매나 과량의 산을 증발시킨 후 건조하거나 석출된 염을 흡인 여과시켜 제조할 수 있다.

본 발명의 상기 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 화합물을 인삼에서 추출하여 사용하는 경우, 바람직하게 인삼 잎 추출물에서 정제할 수 있다. 상기 인삼은 품종 및 재배 방법에 상관없이 모든 인삼을 제한 없이 사용할 수 있으나, 바람직하게는 다단 재배, 수경재배 또는 유기농 재배로 수득된 인삼으로, 더 바람직하게는 수경 재배된 인삼을 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서, 인삼 유래 상기 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 화합물의 분리 정제 방법은, 인삼 잎으로부터 추출물을 수득한 후 감압 농축하는 단계;

감압 농축한 추출물을 유기 용매를 사용하여 액체 분배추출물을 수득하는 단계; 및

상기 액체 분배추출물을 분리 정제하여 상기 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 화합물을 수득하는 단계; 를 포함한다.

먼저, 인삼 잎으로부터 추출물을 수득한 후 감압 농축하는 단계를 설명한다.

상기 추출은 추출용매를 사용하여 수행할 수 있으며, 추출용매는 통상적으로 천연물 추출에 사용되는 것이라면 특별히 제한은 없으나, 바람직하게는 C₁ ~ C₅ 알코올 중에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 메탄올 또는 에탄올일 수 있다.

나아가, 상기 추출물을 수득하는 방법으로는 통상적으로 천연물에서 추출물을 수득하는 방법이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 초음파 추출법, 여과법 및 환류 추출법으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 사용할 수 있으며, 상기 감압농축은 진공감압농축기 또는 진공회전증발기를 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.

다음으로, 감압 농축한 추출물을 유기 용매를 사용하여 액체 분배추출물을 수득하는 단계를 설명한다.

상기 유기 용매는 통상적으로 추출에 사용되는 유기 용매라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 C₁ ~ C₅ 알코올, 물, 헥산, 메틸렌클로라이드 및 에틸 아세테이트로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 물, 부탄올 및/또는 에틸 아세테이트를 포함할 수 있으며, 가장 바람직하게는 부탄올 또는 에틸 아세테이트를 사용할 수 있다.

상기 액체 분배추출물은 통상적인 액체 분배추출법을 이용하여 제조된 것이라면 특별히 제한하지 않는다. 상기 액체 분배추출법은 추출물 중에 포함되어 있는 극성 물질부터 비극성 물질까지 다량의 불순물을 제거하여 다음 단계인 크로마토그래피(chromatography)를 이용한 정제를 보다 효과적으로 수행하기 위해 수행하는 것으로서, 상기 다량의 불순물은 용매에 대한 용해도 및 용매와 용매의 혼합성을 이용하여 제거할 수 있다.

마지막으로, 상기 액체 분배추출물을 크로마토그래피를 통해 분획물을 수득하는 단계를 설명한다.

상기 크로마토그래피는 통상적으로 성분 분리에 사용되는 크로마토그래피법이라면 특별히 제한하지 않는다. 예를 들면, C₁₈ 컬럼 크로마토그래피(C₁₈ column chromatography), 이산화규소 컬럼 크로마토그래피(SiO₂ column chromatography), 얇은막 크로마토그래피(thin-layer chromatography) 또는 고속 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography) 등 일 수 있다.

상기 크로마토그래피는 통상적으로 성분들을 각각 분리하는데 사용되는 조건이라면 특별히 제한하지 않는다. 크로마토그래피는 1회 내지 수회 수행할 수 있으며, 바람직하게는 2회 이상, 더욱 바람직하게는 3회 이상 수행할 수 있다.

상기와 같이 수회 크로마토그래피를 수행할 경우, 수득하는 분획물의 순도를 증가시켜 순도 높은 분획물을 수득할 수 있다.

본 발명의 일실시 양태에서는 바람직하게, 동결 건조된 인삼 잎을 메탄올에 침지시켜 추출한 다음, 감압 농축하여 추출물을 수득하는 단계; 상기 인삼 잎 메탄올 추출물을 에틸아세테이트(EtOAc)/물(H2O)을 이용하여 분배 추출한 다음, 물 층을 수득하여 부탄올(n-buOH)로 분배 추출하는 단계; 상기 물 층 및 부탄올 층을 각각 감압 농축하여 에틸아세테이트, 부탄올 및 물 분획을 수득하는 단계; 및 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 및 역상 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 분리 정제하는 단계; 를 포함하는 방법으로 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 화합물을 수득할 수 있다.

본 발명의 화합물은 미백효과를 가지는 것을 특징으로 하며, 구체적으로 멜라닌 생합성을 억제하는 효과가 있다.

본 발명의 일실시 양태에서는, 본 발명에서 수득한 화합물에 의해 세포내 멜라닌 생합성이 저해되는지 확인하기 위해 멜란-a(melan-a) 세포에 하기 화학식1로 표시되는 화합물 1을 농도별로 처리하였으며, 그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 80 μM 농도에서 37 %로 높은 멜라닌 합성 저해활성을 보이는 것을 확인하였다.

또한, 생체내(in vivo) 환경에서 미백활성을 검증하기 위해 제브라피쉬(zebrafish) 모델에서 멜라닌 저해 활성을 도 3에 나타난 그림과 같이 수행한 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 제브라피쉬 배아(embryo)의 요크(yolk)부분의 색소 침착이 대조구에 비해 현저하게 감소하는 것을 확인하였으며, 제브라피쉬 요크의 변형이나 부풀어 오름 같은 기형은 발견되지 않았으므로, 본 발명의 화합물의 독성이 없거나 미미한 것을 확인하였다.

본 발명의 미백용 조성물은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 총 조성물에 대하여 5 내지 100 μM 농도로, 바람직하게는 20 내지 100 μM 농도로 포함될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 20 내지 80 μM 농도로 포함될 수 있다. 상기 조성물의 용매로는 화합물의 미백 효과를 방해하지 않는 것이라면 특별히 제한되지 않으나, 보다 바람직하게는 물, 에탄올, 프로필알코올, DMSO 등일 수 있다. 상기 화합물의 농도가 20 μM 미만일 경우 미백효과가 미흡할 수 있다. 또한, 100 μM 보다 높은 양의 화합물이 포함되면 농도 증가로 인한 효능의 향상이 적어 효율이 떨어지는 문제점이 있을 수 있다.

세포 독성의 경우, 화합물 1 및 화합물 2는 80 μM 농도 이하에서 세포 독성이 관찰되지 않았으며, 화합물 1 및 2는 100 μM 농도에서 약간의 독성이 관찰되었다.

하지만, 상기 화합물의 IC₅₀ 값은 모두 세포독성을 보이지 않는 농도 범위로, 유효한 범위 내에서는 독성 없이 사용 가능함을 확인하였다.

본 발명은, 상기 미백용 조성물을 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물을 포함한다.

상기 화장료 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 또는 스프레이 형태의 제형을 가질 수 있다.

상기 화장료 조성물에 있어서, 본 발명의 화합물을 함유하는 미백용 조성물은 화장료 조성물 전체 중량부에 대하여 0.0005 내지 10 중량부로 포함될 수 있으며, 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분 1종 이상을 함유할 수 있다.

상기 화장료 조성물은 일반적인 유화 제형 및 가용화 제형의 형태로 제조할 수 있다. 상기 유화 제형으로는 영양화장수, 크림, 에센스 등이 있으며, 상기 가용화 제형으로는 유연화장수 등이 있다. 적합한 제형은 이에 제한되지는 않으나, 예를 들어 용액, 겔, 고체 또는 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는 이온형(리포좀), 바이온형의 소낭 분산제의 형태, 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이 또는 콘실 스틱의 형태일 수 있다. 또한, 포말(foam)의 형태 또는 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 조성물의 형태일 수 있다.

나아가, 상기 화장료 조성물은 통상적으로 화장품에 첨가되는 것이라면 특별히 제한하지 않는다. 예를 들면, 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제, 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제, 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 등을 첨가할 수 있다.

본 발명은, 하기 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 화합물; 및 약학적으로 허용되는 이의 염을 포함하는 멜라닌 색소 과다 침착 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

[화학식 1]

[화학식 2]

본 발명의 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 화합물은 인삼에서 추출하여 사용하는 경우, 바람직하게 인삼 잎 추출물에서 정제할 수 있다. 상기 인삼은 품종 및 재배 방법에 상관없이 모든 인삼을 제한 없이 사용할 수 있으나, 바람직하게는 다단 재배, 수경재배 또는 유기농 재배로 수득된 인삼으로, 더 바람직하게는 수경 재배된 인삼을 사용할 수 있다.

상기 멜라닌 색소 과다 침착 질환은 기미, 주근깨, 노인성 색소반 및 일광흑색증(solar lentigines)으로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있으며, 약학적 조성물은 파우더, 젤, 연고, 크림, 로션, 액제 또는 에어로졸 제형의 피부외용 제형을 가질 수 있다.

본 발명은 상기 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 화합물 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염뿐만 아니라 이로부터 제조될 수 있는 동일한 효능을 나타내는 용매화물, 수화물 및 입체 이성질체도 모두 발명의 범주 내로 포함한다.

나아가, 상기 약제학적으로 허용 가능한 그의 염은 동결 건조되어 있고, 정맥 내, 근육 내 또는 피하 주사에 의해서와 같이 투여를 위한 약제학상 허용되는 제제를 형성하도록 재구성될 수 있는 그러한 약제 또는 그의 염이 포함될 수 있다.

더불어, 본 발명에서 기술된 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 화합물 또는 약학적으로 허용되는 이의 염은 고체로서 경구로 또는 흡입을 통해 투여될 수 있거나, 용액, 현탁액 또는 에멀젼으로서 근육 내 또는 정맥 내로 투여될 수 있다. 바람직하게는 리포좀 현탁액으로서 흡액, 정맥 내 또는 근육 내로 투여될 수 있으며, 에어로졸로서 흡입에 의해 투여하기 적당한 약제학적 제제가 제공될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 상기 약학적 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

상세하게는, 제제화 할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다.

경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 약제학적으로 허용 가능한 그의 염에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose), 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용될 수 있다.

경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.

좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween)61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 멜라닌 색소 과다 침착 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 상기 "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정 될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 또한, 상기 약학적 조성물은 멜라닌 색소 과다 침착 질환의 예방 또는 치료를 위하여 단독으로, 수술, 호르몬 치료, 약물 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

본 발명은 하기 화학식 1 또는 화학식2로 표시되는 화합물을 포함하는 멜라닌 색소 과다 침착 질환의 예방 또는 치료용 피부 외용제 조성물을 제공한다.

[화학식 1]

[화학식 2]

상기 피부 외용제의 제형은 특별히 제한하지 않는다. 예를 들면, 파우더(power), 젤(gel), 연고(ointment), 크림(cream), 액체(liquid), 에어로졸(aerosol) 등의 제형을 가질 수 있다.

또한, 본 발명의 피부 외용제의 적용 가능한 다른 하나의 형태는 의약 국소제제이다. 본 발명의 피부 외용제는 멜라닌 색소 과다 침착 질환 개선 효과를 갖기 위하여, 유효성분인 화학식 1로 표시되는 화합물 이외에 추가로 약학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 의약 국소제제로 제조할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 통상적인 방법에 따라 연고, 크림, 젤, 피부 유화액, 피부 현탁액, 패치 또는 분무제 등의 국소제제로 제형화하여 사용할 수 있다. 더 나아가 당분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제형화할 수 있다.

나아가, 본 발명에 따른 피부 외용제의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 상기 화학식 1로 표시되는 화합물의 일일 투여량은 0.01 내지 300 ㎎/㎠ 일 수 있으며, 하루 1 내지 5회 도포하여 1개월 이상 계속 투여할 수 있다.

ROS(reactive oxidative species)는 멜라닌 세포 증식 및 멜라닌 형성에 주요한 역할을 하고 있는 것으로 알려져 있지만, ROS 소거능과 ROS 발생의 억제는 색소 침착을 억제하는 것으로 생각된다(Lin, J.W et al., Natural products with skin-whitening effects. JFoodDrugAnal, 2008, 2, 1-10.).

UV 방사선은 피부에 멜라닌 형성을 자극한다. UV 방사선을 피부에 조사하면, 멜라닌 세포는 세포내 산화 질소(NO)의 생산을 증가시키고, 이는 멜라닌 형성을 개지하는 신호전달 캐스케이드(cascade)를 유발한다. 멜라닌 형성 생합성 경로에 있어서, 타이로시나아제는 L-타이로신을 o-디페놀(3,4-dihydroxylphenylalaninem L-DOPA)로, 또 L-DOPA를 o-퀴논으로 변환하는 두가지 산화 반응을 촉매한다. 타이로시나아제-연관 단백질 1(TRP1)과 DOPA 크롬 토토머라아제(TRP2)는 계속해서 도파퀴논을 유멜라닌으로 대사한다.

최근 연구에 따르면, 인삼 뿌리, 열매 그리고 잎으로부터 정제한 진세노사이드 또는 추출물은 항산화 특성을 가지고 있으며, 인삼의 물, 메탄올 그리고 에탄올 추출물은 DPPH, 슈퍼옥사이드 및 하이드록실 라디칼에 대한 소거능을 가진다. 따라서, 본원 발명에 기재된 인삼 지상부로부터 추출된 새로운 진세노사이드는 항산화 효과로 인해 타이로시나아제를 억제할 것으로 생각된다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업자에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실험 준비

1-1 : 실험 장비

Kieselgel 60과 LiChroprep RP-18 레진은 컬럼 크로마토그래피(Merck, Darmstadt, Germany)에 사용되었다. Kieselgel 60 F₂₅₄(Merck)와 RP-18 F_254S(Merck)는 TLC 실험을 위한 고체상으로 이용하였다. TLC 플레이트 상에서의 스팟 검출은 UV 램프(Spectroline, model ENF-240 C/F, Spectronics Corp., New York, NY, USA)로 확인하거나, 현상된 플레이트에 10% 수성 H₂SO₄를 분무한 후에 가열하여 확인하였다. 광학 회전은 JASCO P-1010 디지털 편광계(Tokyo, Japan)를 사용하여 측정하였다. 녹는점은 Fisher-Johns 녹는점 측정장치를 이용하여 측정하였다. 자외선 스펙트럼은 시마즈 모델(Shimadzu model) UV-1601 분광 광도계로 측정하였다. 고속원자충격질량분석(FAB-MS) 스펙트럼은 JEOL JMS-700(Tokyo, Japan)를 통해 측정하였다. IR 스펙트럼은 Perkin Elmer Spectrum One FT-IR 분광계(Buckinghamshire, England)에서 얻었다. NMR 스펙트럼은 Varian Inova AS 400 분광계(400 MHz, Varian, Palo Alto, CA, USA)에 기록되었다.

1-2 : 인삼 준비

4개월 동안 수경 재배 시스템(aeroponic system)으로 재배한 인삼(P. ginseng)을 한국 원예원으로부터 수득하였다.

1-3 : 세포 배양

멜란-a 멜라닌세포는 C57BL/6 마우스 유래의 정상 뮤린 멜라닌세포주로, 착색이 되어 있으며, 죽지 않는 불멸화 세포주인 것을 특징으로 한다. 본 발명에서 사용한 멜란-a 세포는 도로시 베넷 박사 (St. George’Hospital, London, UK)로부터 수득하였다.

세포는 95% 공기, 10% 이산화탄소, 37℃의 온도조건에서 배양하였으며, 배양액은 RPMI 1640 배지를 사용하였다. 배지에는 10% 열-불활성화 소태아 혈청, 1% 페니실린/스트렙토마이신 그리고 200nM PMA가 추가적으로 첨가되었다. 또한, 세포 배양 후, 세포 생존율은 세포 계수 키트-8(Dojindo Lab., Japan)로 측정하였다.

1-4 : 제브라피쉬 준비

성체 제브라피쉬는 상업적으로 제브라피쉬 전문 판매자로부터 구입하였으며, 10 내지 15 마리의 제브라피쉬는 5L의 아크릴 탱크에 28.5℃, 14/10시간 빛/어둠 사이클 조건으로 보관하였다. 제브라피쉬는 하루 3회, 일주일에 6회 먹이를 주었으며, 먹이로는 테트라민 플레이크 사료와 살아있는 새우(Atremia salina)를 주었다.

제브라피쉬의 배아는 빛을 밝혀, 자연 산란을 유도하여 수득하였으며, 배아 수득은 30분 이내에 완료하였다.

화합물 분리

2-1 : 인삼잎 추출물 제조

수경 재배한 인삼을 건조하여, 인삼의 지상부를 분말화 하였다. 인삼 분말 6.27 kg을 24시간동안 실온에서 80% 메탄올(30L ×3)로 추출하였다. 추출물을 여과지로 여과하고, 추출물 1.4 kg을 수득한 후 45 ℃ 조건에서 감압하에 추출 용매를 증발시켰다. 그 후 추출물을 물 3L에 처리하고, EtOAc(3L ×3) 및 n-BuOH(2.6L ×3)로 연속 추출하였다. 각 층은 EtOAc(75g), n-BuOH(470g) 및 물(855g) 분획을 얻기 위하여 감압하에 농축시켰다.

2-2 : 인삼잎 추출물 분획

(1) EtOAc 분획(75g)은 실리카겔 컬럼(φ 14 ×16 cm)으로 거른 후 CHCl₃-MeOH (30:1, 60 L)과 CHCl₃-MeOH-H₂O (15:3:1, 136 L)로 용출시켰다. 그 결과 24개의 분획물(HPE1 내지 HPE24)을 수득하였다.

상기 24개 분획물 중 15번째 분획물(HPE 15, 5.49 g; Ve/Vt = 0.34-0.36)에 대하여 옥타데실실레인화된 실리카 컬럼 크로마토그래피 (Octadecylsilanized Silicas column chromatography; ODS c.c., Waters사 제품; Φ 4㎝, MeOH-H₂O = 3:2, 1.0ℓ → 2:1, 2.5ℓ → 3:1, 5.2ℓ → 5:1, 2.0ℓ)를 실시하여 총 25개의 분획물(HPE 15-1 내지 HPE 15-25)를 수득하였다.

(2) n-BuOH 분획(130g)은 실리카겔 컬럼(φ 13 ×17 cm)으로 거른 후 CHCl₃-MeOH-H₂O (8:3:1, 90 L → 6:4:1, 110 L)로 용출시켰다. 그 결과 20개의 분획물(HPB1 내지 HPB20)을 수득하였다.

상기 20개 분획물 중 3번째 및 4번째 분획물을 혼합하고(18.9 g, Ve/Vt = 0.05-0.12), 실리카겔 컬럼(φ 8 ×15 cm, CHCl₃-MeOH-H₂O = 12:3:1, 14 L)으로 추가 분획을 실시하여 14개의 분획물(HPB3-1 to HPB3-14)을 수득하였다.

그 후, 분획물 HPB3-4와 HPB3-5를 혼합하였다(1.27 g, Ve/Vt = 0.09-0.16). 그리고 옥타데실실레인화된 실리카 컬럼(φ 4 ×7 cm, MeOH-H₂O = 2:1, 2.6 L)으로 분획하였다. 그리하여 9개의 분획물(HPB3-4-1 내지 HPB3-4-9)를 수득하였다.

분획물 HPB3-4-3(119.4 mg, Ve/Vt = 0.14-0.26)를 ODS 컬럼(φ 2.5 ×7 cm, MeOH-H2O = 1:1, 1 L)으로 분획하여 9개의 분획물(HPB3-4-3-1 내지 HPB3-4-3-9)을 수득하였으며, HPB3-4-3-7분획물에는 본원 발명의 화학식 1로 나타나는 화합물이 포함되어 있었다[HPB3-4-3-7, 10.5 mg, Ve/Vt = 0.42-0.55, TLC R_f = 0.40 (RP-18 F_254S, MeOH-H₂O = 2:1), Rf = 0.50 (Kieselgel 60 F₂₅₄, CHCl₃-MeOH-H₂O = 7:3:1)].

HPB5 내지 HPB7 분획물을 혼합한 후(24.0 g, Ve/Vt = 0.12-0.22), 실리카겔 컬럼(φ 7 ×12 cm, CHCl₃-MeOH-H₂O = 10:3:1, 10 L → 6:4:1, 9 L)으로 분획하여 16개의 분획물을 수득하였다(HPB5-1 to HPB5-16).

[화학식 1]

HPB5-6 분획물(323.1 mg, Ve/Vt = 0.28-0.31)을 ODS 컬럼 (φ 3 ×14 cm, MeOH-H₂O = 3:2, 1.2 L → 3:1, 1.5 L)으로 분획하여 10개의 분획물을 수득하였다(HPB5-6-1 to HPB5-6-10). HPB5-6-5 분획물에는 본원 발명에 기재된 화학식 2로 나타나는 화합물이 포함되어 있었다 [HPB5-6-5, 10.1 mg, Ve/Vt = 0.21-0.23, TLC R_f = 0.50 (RP-18 F_254S, MeOH-H₂O = 2:1), Rf = 0.45 (Kieselgel 60 F₂₅₄, CHCl₃-MeOH-H₂O = 7:3:1)].

[화학식 2]

화합물 구조 및 성질 분석

상기 실시예 1-1에 기재된 분석 실험 장비를 이용하여, 실시예 2-2에서 분리한 분획물들의 화합물 구조를 동정하고, 성질을 분석하였다. 본원 발명의 화학식 1로 표시되는 화합물(화합물1)은 HPB3-4-3-7 분획물로부터 동정되었으며, 분원 발명의 화학식 2로 표시되는 화합물(화합물2)은 HPB5-6-5 분획물로부터 동정되었다. 하기는 각 화합물의 특성을 나타낸다.

* 화합물 1 : 백색 분말; 녹는점 : 138 내지 140 ℃; [α]²⁵ _D + 17.4°(c = 0.39, MeOH); IR (CaF₂ window): 3377, 2932, 1382 cm^-1; Positive-FAM-MS m/z: 691.3 [M+Na]⁺; HR-Positive-FAB-MS m/z: 691.4390 [M+Na]⁺ (calcd. for C₃₇H₆₄O₁₀ Na, 691.4399); ¹H- and ¹³C-NMR 데이터는 하기 표1 참조

* 화합물 2 : 백색 분말, 녹는점: 138 내지 142℃; [α]²⁵ _D + 20.2°(c = 0.50, MeOH); IR (CaF₂ window): 3359, 2929, 1384 cm^-1; Positive-FAM-MS m/z: 676.6 [M+Na]⁺; HR-Positive-FAB-MS m/z: 677.4252 [M+Na]⁺ (calcd. for C₃₆H₆₂O₁₀ Na, 677.4242); ¹H- and ¹³C-NMR 데이터는 하기 표1 참조

화합물 1 및 2의 ¹H-(400MHz)and¹³C-NMR(100MHz)스펙트럼 (in pyridine-d ₅)

	compound 1		compound 2
No.	δ_Hinppm,JinHz	δ_C	δ_Hinppm,JinHz	δ_C
1	1.73, 1.02	39.4	1.70, 1.00	39.5
2	1.84, 1.83	28.1	1.83, 1.81	28.1
3	3.49 (1H, dd, J=11.6,4.8Hz)	78.5	3.50 (1H, dd, J=11.2,5.2Hz)	78.5
4	-	40.3	-	40.3
5	1.21 (1H, d, J=10.4Hz)	61.8	1.20 (1H, d, J=10.4Hz)	61.8
6	4.38 (1H, m)	67.7	4.37 (1H, m)	67.7
7	1.92, 1.87	47.4	1.91, 1.86	47.4
8	-	41.2	-	41.2
9	1.54	49.3	1.53	49.8
10	-	39.4	-	39.3
11	2.11, 1.58	31.0	2.08, 1.53	31.0
12	4.03 (1H, m)	70.3	4.03 (1H, m)	70.4
13	1.97 (1H, m)	49.3	1.97 (1H, m)	49.2
14	-	51.4	-	51.4
15	1.61, 0.99	30.7	1.57, 0.99	30.6
16	1.74, 1.40	26.4	1.72, 1.41	26.4
17	2.45 (1H, m)	52.1	2.40 (1H, m)	52.4
18	1.14 (3H, s)	17.6	1.13 (3H, s)	17.6
19	1.04 (3H, s)	17.4	1.03 (3H, s)	17.4
20	-	83.0	-	83.2
21	1.55 (3H, s)	23.0	1.55 (3H, s)	22.9
22	3.07 (1H, dd, J=14.0,5.6Hz) 2.64 (1H, dd, J=14.0,8.8Hz)	39.6	3.01 (1H, dd, J=14.0,6.0Hz) 2.71, (1H, dd, J=14.0,8.8Hz)	39.3
23	6.02 (1H, ddd, J=15.6,8.8,5.6Hz)	126.8	6.26 (1H, ddd, J=15.6,8.8,6.0Hz)	122.8
24	5.64 (1H, d, J=15.6Hz)	138.5	5.96 (1H, d, J=15.6Hz)	142.0
25	-	74.9	-	69.0
26	1.31 (3H, s)	26.1	1.51 (3H, s)	30.6
27	1.33 (3H, s)	26.3	1.50 (3H, s)	30.8
28	1.94 (3H, s)	31.9	1.95 (3H, s)	31.9
29	1.43 (3H, s)	16.4	1.42 (3H, s)	16.4
30	0.92 (3H, s)	17.3	0.89 (3H, s)	17.2
OCH₃	3.18 (3H, s)	50.2	-	-
1'	5.15 (1H, d, J=7.6Hz)	98.3	5.15 (1H, d, J=7.6Hz)	98.4
2'	3.95 (1H, dd, J=8.8,7.6Hz)	75.2	3.94 (1H, dd,J=8.4,7.6Hz)	75.2
3'	4.18 (1H, dd, J=8.8,8.8Hz)	78.9	4.14 (1H, dd,J=8.8,8.4Hz)	78.9
4'	4.09 (1H, dd, J=9.6,8.8Hz)	71.6	4.07 (1H, dd, J=9.6,8.8Hz)	71.7
5'	3.90 (1H, ddd, J=9.6,5.6,2.4Hz)	78.2	3.90 (1H, ddd, J=9.6,5.6,2.4Hz)	78.2
6'	4.45 (1H, dd, J=11.6,2.4Hz) 4.27 (1H, dd, J=11.6,5.6Hz)	63.0	4.46 (1H, dd,J=11.6,2.4Hz) 4.23 (1H, dd,J=11.6,5.6Hz)	62.9

* Assignments were confirmed by DEPT, ¹H-¹H COSY, HSQC, and HMBC.

백색 분말의 화합물 1에 10% H₂SO₄를 분무하고 열을 가하면, TLC에 보라색을 나타낸다. 또한, 양성 HR-FAB-MS에서 분자량 691.4390 [M+Na]⁺ 피크를 보여(계산값 C₃₇H₆₄O₁₀Na, 691.4399), 분자식은 C₃₇H₆₄O₁₀으로 결정되었다. IR 스펙트럼의 결과를 통해서 하이드록시기(3377 cm^-1)와 이중결합(1647 cm^-1)을 가진다는 것을 확인하였다.

¹H-NMR 스펙트럼은 두개의 올레핀 메틴 양성자 신호 [δH 6.02 (¹H, ddd, J = 15.6, 8.8, 5.6 Hz, H-23), 5.64 (¹H, d, J = 15.6 Hz, H-24)], 세개의 산소화 메틴 양성자 신호 [δH 4.38 (¹H, m, H-6), 4.03 (¹H, overlapped, H-12), 3.49 (1H, dd, J = 11.6, 4.8 Hz, H-3)], 하나의 메톡시 양성자 신호[δH 3.18 (³H, s, OCH₃)] 그리고 여덟개의 메틸 양성자 신호[δH 1.94 (³H, H-28), 1.55 (³H, H-21), 1.43 (³H, H-29), 1.33 (³H, H-27), 1.31 (³H, H-26), 1.14 (³H, H-18), 1.04 (³H, H-19), 0.92 (³H, H-30)]를 나타냈다. 그리고 ¹H-NMR 스펙트럼을 통해 트랜스 형태의 이중결합 하나와 테트라사이클릭 트리테르펜 잔기를 가지고 있으며, 세개의 하이드록시기를 가지고 있다는 것을 알아내었다.

또한, 화합물 1은 δH 1.94 (H-28)p 메틸 양성자 신호의 화학적 시프트(shift)가 확인되어 프로토파낙사트리올(PPT)-타입인 것으로 확인되었다. 일반적으로 ca δH 1.30에서 프로토파낙사디올(PPD)-타입의 H-28 화학적 시프트가 관찰된다. 그리고, 헤미아세탈 양성자 신호 [δH 5.15 (¹H, d, J=7.6 Hz)]와 δH 4.45-3.95에서의 몇몇의 산소화 메틴 그리고 메틸렌 양성자 신호가 당 잔기의 신호로서 관찰되었다. 아노머 양성자 신호(J=7.6 Hz)의 결합 상수로부터 헤미아세탈 양성자와 당 잔기의 H-2는 축 배열(axial arragnement)로 결정되었다. 상기 언급된 데이터의 조합으로 화합물 1은 프로토파낙사트리올 모노글라이코사이드(protopanaxatiriol monoglycoside)인 것으로 결론지었다.

¹³C-NMR 스펙트럼은 트리테르펜(triterpene), 메톡시 및 육탄당 잔기로 인하여 37개의 탄소 신호를 나타내었다. 두개의 올레핀 메틴 탄소 [δC 138.5 (C-24), 126.8 (C-23)], 하나의 산소화 4차 탄소[δC 74.9 (C-25)], 세개의 산소화 메틴 탄소[δC 78.5 (C-3), 70.3 (C-12), 67.7 (C-6)], 하나의 메톡시 탄소[δC 50.2 (25-OCH3)] 그리고 여덟개의 메틸 탄소[δC 31.9 (C-28), 26.3 (C-27), 26.1 (C-26), 23.0 (C-21), 17.6 (C-18), 17.4 (C-19), 17.3 (C-30), 16.4 (C-29)] 신호가 아글리콘 잔기에 대하여 관찰되었다. NMR 자료는 C-25와 같은 산소화 4차 탄소의 화학적 시프트를 제외하고는 화합물 1과 화합물 2가 유사하였다. 그리고, 당은 헤미아세탈[δC 98.3, (C-1')], 네개의 산소화 메틴[δC 78.9 (C-3'), 78.2 (C-5'), 75.2 (C-2'), 71.6 (C-4')] 그리고 하나의 산소화 메틸렌[δC 63.0 (C-6')] 탄소 신호로부터 β-글루코피라노오스(β-glucopyranose)로 확인되었다.

gHMBC 스펙트럼에서는 화합물 1과 화합물 2가 아노머 양성자 신호 [δH 5.15 (H-1')]와 아글리콘의 산소화 4차 탄소 신호[δC 83.0 (C-20)] 사이의 넓은 범위에서 일치하는 것이 관찰되었다. 이는 β-글루코피라노오스가 C-20의 하이드록시기와 연결되었다는 것을 의미한다. 또한, 메톡시 양성자 신호[δH 3.18 (25-OCH₃)]와 산소화 4차 탄소 신호[δc 74.9 (C-25)] 사이의 상관관계는 C-25에 메톡시기가 연결되었다는 것을 나타낸다(도 1 참조).

상기 데이터에 기초하여, 화합물 1의 구조는 β-D-glucopyranosyl-3β,6α,12β,20β-tetrahydroxy-25-methoxydammar-23-ene’로 규명되었으며, 이는 기존에 알려지지 않은 신규한 화합물로 확인되어, 본원에서는 이를 진세노사이드 Rh21로 명명하였다. 또한, 화합물 2는 β-D-glucopyranosyl-3β,6α,12β,20β,25-pentahydroxydammar-23-ene’로 확인되었으며, 각각 NMR 데이터와 MS 데이터에 의하면 몇몇 문헌에 보고된 것과 구조가 일치하였다. 본원 발명의 화합물 1 및 2가 수경재배 인삼의 지상부로부터 분리된 것을 처음이다.

화합물의 세포독성 평가

실시예 3에서 수득한 화합물 1 및 2의 세포독성 여부를 측정하기 위하여, 세포 생존률을 측정하였다. 먼저, 밀란-a 세포(한국 세포주 은행, 한국)는 10% FBS(fetal bovine serum), 2mM 글루탐산(glutamate), 100 units/㎖ 페니실린(penicillin) 및 100 mg/㎖ 스트렙토마이신(streptomycin)이 포함된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium; WelGENE Inc., 한국)에서 5% CO₂ 조건으로 배양하여 준비하였다.

실시예 3에서 수득한 화합물 1 및 2를 각각 상기의 FBS가 첨가 되지 않은 DMEM 배지에 첨가하여 시료용액을 제조하였으며, 화합물 1 및 2는 각각 2, 5, 10, 20, 50, 80, 100 μM이 되도록 준비하였다.

그 다음, 상기 밀란-a 세포를 1×10⁴ 개/웰(cell/well)이 되도록 96-웰 플레이트(96-well plate)에 분주한 다음, 12 내지 18 시간 동안 상기와 동일한 배지에서 배양하였으며, 그 후 배지를 제거하고 상기에서 준비한 4종류의 화합물에 대한 시료용액을 각각 처리한 후, 20시간 동안 배양하였다.

그 후, 각 웰당 10 ㎍/㎖의 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide; Sigma-Aldrich, 미국) 시약을 10㎕씩 넣고 4시간 동안 방치한 후 상등액을 제거하여 침전물을 수득하였다 (아무것도 처리하지 않은 웰 (blank well)에는 처리하지 않음). 이후 상기 침전물에 디메틸 설폭사이드(DMSO; Dimethyl sulfoxide) 100 ㎕를 첨가하여 상기 침전물에 형성된 포르마잔(formazan)을 녹여 용액을 제조하였다. 상기 DMSO 첨가 30 내지 60분 후 상기 용액을 550 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.

세포의 생존률은 하기 수학식 1에 따라 화합물 1 및 2를 각각 처리한 그룹과 아무것도 처리하지 않은 대조군 그룹 내에 있는 생존세포의 비율로써 측정하였다.

[수학식 1]

세포 생존률(%) =[(화합물 처리 세포수 OD 값- blank 웰 OD 값)/(대조군 OD 값 - blank 웰 OD 값)] ×100

그 결과, 밀란-a 세포에 화합물 1 또는 2를 80 μM에서 처리하였을 때, 생존율이 각각 98.1%와 97.8% 이상 나타내었다(결과 미도시). 이러한 결과는, 화합물 1과 화합물 2가 비독성 물질임을 의미한다.

화합물의 미백활성 측정

5-1 : 세포내 멜라닌 생합성 저해활성 확인

본 발명 화합물 1 및 2(도 1 참조)의 멜라닌 형성 억제능을 평가하였다. 멜란-a세포는 상기 실시예 1-3에 기재된 바와 같이 준비하였으며, 준비된 멜란-a 세포에 72시간동안 화합물 1 및 2를 0 내지 80 μM 범위의 농도로 처리하였다.

그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 화합물 1의 멜라닌 합성 억제능은 화합물1의 20, 40 및 80μM 농도에서 각각 8.4, 15.6 및 37.0%를 보였다. 또한, 화합물 2의 멜라닌 합성 억제능은 화합물 1보다 약간 낮게 나타났으며, 화합물2의 20, 40 및 80μM 농도에서 각각 7.6, 12.8 및 17.8%를 보였다. 화합물 1 및 2은 모두 투여량 의존적으로 멜라닌 합성을 억제하였다.

특히, 화합물 1은 80 μM 농도에서 37.0%로 가장 높은 멜라닌 저해 활성을 나타내었다. 보고에 따르면 인삼 뿌리 추출물 0 내지 1000 μg/ml에서 어떠한 멜라닌 억제 효과를 나타내지 않았으며(Im, S.J et al.,; Effect of radix ginseng and radix trichosanthis on the melanogenesis. BiolPharmBull 2003, 26, 849-853.), 인삼에 주로 발견되는 미백 성분인 쿠마린산은 765 μM에서 멜라닌을 29% 억제하는 것으로 나타났다(Kong, Y.H. et al.; Inhibitory effects of cjiiamic acid on melanin biosynthesis in skin. BiolPharmBull 2008, 31, 946-948.). 쿠마린산을 본원 발명의 화합물과 비교해볼 때, 화합물 1은 8 배 낮은 농도범위에서 1.2배 높은 멜라닌 합성 저해 활성을 보였다.

5-2 : 제브라피쉬 모델에서 멜라닌 저해 활성 확인

생체내(in vivo) 환경에서 본 발명의 화합물의 미백활성을 검증하기 위해 제브라피쉬(zebrafish) 모델을 이용한 멜라닌 저해 활성을 확인하였다.

먼저, 성숙한 제브라피쉬(zebrafish; Zebrafish Resource Bank, 한국)는 5ℓ수조에 10 ~ 15 마리가 되도록 한 다음, 낮과 밤의 주기를 14시간 : 10시간으로 하여 28.5℃의 수온이 유지된 폐쇄 순환 여과 시스템을 갖춘 수조에서 사육하였으며, 살아있는 브라인 쉬림프(brine shrimp; San Francisco BayBrand, Inc., 미국)를 하루에 3번 식이하여 사육하였다 (Kimmel et al., 1995; Westerfield,1993).

그 다음, 제브라피쉬의 멜라닌 저해 실험을 수행하기 위해 상기에서 사육된 제브라피쉬 암수를 알 채취 전날, 알 채취용 수조에 넣고 다음날 광주기 시기 1 ~ 2 시간 이후에 알을 채취하였다. 채취된 알은 제브라피쉬 엠브리오 배지(zebrafish embryo medium)가 1㎖ 포함된 24웰 플레이트에 웰당 7 내지 9 알씩 넣었고 24시간 동안 발생시켰다. 그 후, 실시예 3에서 분석한 화합물 1 또는 2를 0.1% DMSO에 용해한 후, 9 내지 72 시간 후-수정(post-ferilization) 상태에 배아에 처리하였다. 처리 농도는 각각 20, 40 및 80 μM 이 되도록 처리하였다. 화합물 처리 48 시간 이후에 대조구 대비 샘플 처리구의 색소 발생 정도를 실체현미경으로 관찰하였다. 몸에 나타난 색소침착을 평가하기 위하여 집게로 융모막을 제거하고, 트리카인 메탄설포네이트 용액으로 마취시킨 후, 35mm 접시에 놓고 3% 메틸셀룰로오스를 처리하여 관찰하였다. 상기 방법은 도 3의 모식도에 간략하게 나타내었다.

아무것도 처리하지 않은 군을 음성대조군(control)으로 하였으며, 양성대조군은 미백제로 사용되는 PTU (1-phenyl-2-thiourea)를 0.2 mM 농도로 첨가하였다.

그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 제브라피쉬 배아(embryo)의 요크(yolk)부분의 색소 침착이 대조구(도 4A)에 비해 현저하게 감소하는 것을 확인하였다. 화합물 1은 80 μM 농도에서 멜라닌 형성 억제능이 27.2%인 것으로 나타났다. 또한, 제브라피쉬 요크의 변형이나 부풀어오름 같은 기형은 발견되지 않았으므로, 본 발명의 화합물의 독성이 없거나 미미한 것을 확인하였다.

제조예 1: 약학적 조성물의 제조

본 발명의 상기 화학식 1로 표현되는 화합물(하기, "화합물"로 기재함)을 포함하는 약학적 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제조예 1-1. 산제의 제조

화합물 2 g

유당 1 g

상기의 성분을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.

제조예 1-2. 정제의 제조

화합물 100 ㎎

옥수수전분 100 ㎎

유 당 100 ㎎

스테아린산 마그네 2 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

제조예 1-3. 캡슐제의 제조

화합물 100 ㎎

옥수수전분 100 ㎎

유 당 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 2 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

제조예 1-4. 환의 제조

화합물 1 g

유당 1.5 g

글리세린 1 g

자일리톨 0.5 g

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 방법에 따라 1환 당 4 g이 되도록 제조하였다.

제조예 1-5. 과립의 제조

화합물 150 ㎎

대두추출물 50 ㎎

포도당 200 ㎎

전분 600 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 30% 에탄올 100 ㎎을 첨가하여 섭씨 60℃에서 건조하여 과립을 형성한 후 포에 충진하였다.

제조예 2: 화합물을 포함하는 크림의 제조

상기 실시예 1-3에서 제조한 상기 화학식 1로 표시되는 화합물(하기 "화합물"로 기재함)을 포함하는 피부 미백용 크림의 제조는 하기의 함량으로 혼합하여 제조하였다.

화합물 3㎖

모노스테아린산글리세린 4㎖

세테아릴알콜 4.5㎖

스테아린산 3㎖

밀납 1.5㎖

글리세린 3㎖

스쿠알란 8㎖

베타인 6㎖

소듐히아루로네이트 0.5㎖

경화식물유 2㎖

폴리솔베이트60 3㎖

증류수 총 100㎖가 되도록 첨가

상기 조성비는 화장료 제형에 적합한 성분을 바람직한 제조예로 혼합 조성하였지만 수요계층이나, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

정리하면, 본 발명에서는 인삼 잎 추출물로부터 화학식1로 표시되는 신규한 화합물 진세노사이드 Rh21을 분리해 내었으며, 이 신규한 화합물은 80 μM이하의 농도에서 세포독성이 없으며, 우수한 멜라닌 색소 억제능을 가진다. 따라서, 본원 발명의 신규한 화합물은 미백 효과의 기능성을 가질 수 있어, 잠재적으로 유용한 피부 미백제로 사용될 수 있다.

이상으로, 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

하기 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물.
[화학식 1]

[화학식 2]
제1항에 있어서, 상기 화합물은 인삼 잎 추출물의 n-BuOH 분획물에 포함된 것을 특징으로 하는 피부 미백용 화장료 조성물.
삭제
제1항에 있어서, 상기 조성물은 멜라닌 생합성 억제능을 가지는 것을 특징으로 하는 피부 미백용 화장료 조성물.
하기 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 화합물; 및 약학적으로 허용되는 이의 염을 포함하는 멜라닌 색소 과다 침착 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
[화학식 1]

[화학식 2]
제5항에 있어서, 상기 화합물은 인삼 잎 추출물의 n-BuOH 분획물에 포함된 것을 특징으로 하는 멜라닌 색소 과다 침착 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
삭제
제5항에 있어서, 상기 조성물은 멜라닌 생합성 억제능을 가지는 것을 특징으로 하는 멜라닌 색소 과다 침착 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제5항에 있어서, 상기 멜라닌 색소 과다 침착 질환은 기미, 주근깨, 노인성 색소반 및 일광흑색증(solar lentigines)으로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 멜라닌 색소 과다 침착 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제5항의 조성물을 포함하는 멜라닌 색소 과다 침착 질환의 예방 또는 치료용 피부 외용제 조성물.
제10항에 있어서, 상기 멜라닌 색소 과다 침착 질환은 기미, 주근깨, 노인성 색소반 및 일광흑색증(solar lentigines)으로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 멜라닌 색소 과다 침착 질환의 예방 또는 치료용 피부 외용제 조성물.