KR102329000B1

KR102329000B1 - 금목서 추출물 및 이로부터 분리된 화합물을 포함하는 미백용 조성물

Info

Publication number: KR102329000B1
Application number: KR1020190088469A
Authority: KR
Inventors: 이민아; 이예은; 정다은
Original assignee: 순천대학교 산학협력단
Priority date: 2019-07-22
Filing date: 2019-07-22
Publication date: 2021-11-18
Also published as: KR20210011255A

Abstract

3알파,24-디하이드록시-우르스-12-덴-28-오익산(3α,24-dihydroxy-urs-12-en-28-oic acid), 포몰릭산(pomolic acid), 마스리닉산(maslinic acid), 코르소릭산(corsolic acid), 및 이들 화합물의 화장학적 허용 가능한 염으로 이루어진 군으로부터 1 또는 2이상 선택된 물질을 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물에 관한 것으로, 상기 조성물은 멜라닌 생성 억제 효능 및 티로시나제 저해 활성 효능이 우수하며 인체에 안전한 물질로서 피부 미백을 위한 용도로 유용하게 사용 가능하다.

Description

금목서 추출물 및 이로부터 분리된 화합물을 포함하는 미백용 조성물{Compostions for whitening comprising compounds or extracts of Osmanthus fragrans}

본 발명은 금목서 추출물, 이의 분획물 및/또는 이로부터 분리된 화합물들을 포함하는 피부 미백용 조성물에 관한 것이다.

사람의 피부색은 피부 내부의 멜라닌(melanin) 농도와 분포에 따라 결정되는데, 이러한 멜라닌 농도와 분포는 유전적인 요인 외에도 태양 자외선이나 피로, 스트레스 등의 환경적 또는 생리적 조건에 의해서도 영향을 받는다. 인체 피부의 멜라닌 세포에서 생성되는 멜라닌 색소는 검은 색소와 단백질의 복합형태를 갖는 페놀계 고분자 물질로서, 자외선으로 발생하는 피부손상을 차단하는 중요한 역할을 하고 있다. 멜라닌 생합성에는 멜라닌 세포에 존재하는 티로시나제의 작용이 가장 중요한 것으로 보고되어 있다. 티로시나제(tyrosinase)는 아미노산의 일종인 티로신(tyrosine)을 멜라닌 중합체 생성의 중간산물인 도파(DOPA), 도파퀴논(dopaquinone)으로 전환시킴으로써 피부 흑화과정에 핵심적 역할을 수행한다. 그러나, 멜라닌이 만들어지는 경로는 알려져 있지만, 티로시나제가 작용하는 이전 단계인 멜라닌 합성을 유도하는 메카니즘(mechanism)이 무엇인지에 대해서는 아직도 자세히 밝혀지지 않고 있다.

이와 같은 멜라닌의 합성이 피부 내에서 과도하게 일어나면, 피부 톤을 어둡게 하고, 기미, 주근깨 등을 발생시키기도 한다. 따라서, 피부 내의 멜라닌 색소의 합성을 저해시키면, 피부 톤을 밝게 하여 피부 미백을 실현할 수 있을 뿐만 아니라 자외선, 호르몬 및 유전적 원인에 기인하여 발생하는 기미, 주근깨 등의 피부 과색소 침착증을 개선시킬 수 있다.

따라서, 종래에는 하이드로퀴논(hydroquinone)이나 아스코르빈산(ascorbic acid), 코지산(kojic acid), 글루타티온(glutathione)과 같은 티로시나제에 대해 저해 활성을 갖는 물질이 사용하여 피부 미백이나 피부 과색소 침착증을 개선하였다. 그러나, 하이드로퀴논은 소정의 미백효과를 발휘하지만 피부자극성이 심하여 배합량을 극소량으로 제한해야 하는 문제점이 있고, 아스코르빈산은 산화되기 쉬워 이를 배합한 화장료는 변색, 변취되는 등의 문제가 발생하며, 코지산은 용액 내에서 불안전하여 화장료의 제조공정이 복잡해진다는 단점이 있다. 또한, 글루타티온, 시스테인 등의 티올계 화합물은 특유의 불쾌한 냄새를 가질 뿐만 아니라 경피흡수에도 문제점이 있고, 이들의 배당체 및 유도체들도 극성이 높으므로 화장료의 배합 성분으로 사용하기는 어렵다. 그 외에 비타민 C의 경우 수용액 상태에서 쉽게 산화되어 지속적인 효과를 내지 못하는 문제점이 있다. 이에 따라 최근에는 천연 생약 추출물들을 포함한 피부 미백용 조성물들이 개발되고 있지만, 대부분 색깔을 띄고 있어 배합상에서의 문제점이 있고, 유효성분이 동정되지 않았기 때문에 제품 제조시 동일 효과를 기대할 수 없는 문제점이 있다.

한편, 금목서(Osmanthus fragrans var. aurantiacus)는 쌍떡잎식물 용담목 물푸레나무과의 상록 소교목이다. 이러한 금목서는 자라면 높이가 3 ~ 4m이며, 잎은 마주나 긴 타원상의 넓은 피침 모양이며, 빽빽하게 붙어있고, 잎 가장자리에는 잔톱니가 있거나 밋밋하며, 표면은 짙은 녹색이고 뒷면은 연한 녹색이다. 또한, 금목서의 꽃은 9월말 ~ 10월초 개화되며, 황색으로 향기가 매우 좋다.

상기 금목서에 관하여 연구된 바를 살펴보면, 대한민국 특허공개 제10-2019-0058168호에 금목서 추출물을 포함하는 항산화 또는 항염증염 조성물에 관하여 개시하고 있으며, 대한민국 특허공개 제10-2016-0108685호는 금목서와 동속이종에 속하는 은목서의 향취를 재현한 향료 조성물에 관하여 개시하고 있다. 이와 같이 금목서에 관하여 많은 연구가 이루어지지 않은 실정이다.

이에 본 발명자들은 금목서에 관한 연구를 하던 중 금목서 추출물과 이의 분획물, 그리고 이로부터 분리된 화합물들이 특히 미백효과가 우수하면서도 안정성이 높고, 피부 부작용이 없음을 발견하였고, 그 결과 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 하나의 목적은 금목서 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 미백용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 3알파,24-디하이드록시-우르스-12-덴-28-오익산(3α,24-dihydroxy-urs-12-en-28-oic acid), 포몰릭산(pomolic acid), 마스리닉산(maslinic acid), 코르소릭산(corsolic acid), 및 이들 화합물의 화장학적 허용 가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택된 1 또는 2이상의 화합물을 포함하는 피부 미백용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 조성물을 피부 미백을 위한 화장료 조성물로 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 조성물을 피부 미백을 목적으로 하는 개체에 투여하여 개체 피부의 멜라닌 농도를 감소하는 방법을 제공하는 것이다.

하나의 양태로서, 본 발명은 금목서(Osmanthus fragrans var. aurantiacus) 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서 “금목서”는 물푸레나무과의 목서속 식물로 이의 천연, 잡종 또는 변종을 포함한 뿌리, 줄기, 잎 또는 열매 등이 포함된 것을 말한다.

본 발명에서 상기 추출물(extract) 및 분획물은 천연물로부터 분리된 티로시나제(tyrosinase) 활성 억제 및 멜라닌 생성을 억제하는 활성을 가지는 물질을 말한다. 또한 본 발명에서 추출물 및 이의 분획물은 식물의 용매에 의한 추출액 또는 분획액 뿐만 아니라 이의 정제물, 이들의 건조 분말 또는 이를 이용하여 제형화된 모든 형태를 포함하는 의미로 사용된다.

상기 정제물은 추출물 또는 분획물로부터 부유하는 고체 입자를 제거하는 과정으로, 면, 나일론 등을 이용하여 입자를 걸러 내거나 한외여과법, 냉동여과법, 원심분리법 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 다양한 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 크로마토그래피)에 의한 분리 과정을 추가로 포함할 수 있다.

상기 추출물, 분획물 또는 정제물은 액체 형태로 그대로 사용하거나 또는 이를 농축 및/또는 건조하여 사용할 수 있다. 상기 농축 및/또는 건조 방법은, 이로써 제한되는 것은 아니나, 동결건조, 진공건조, 열풍건조, 분무건조, 감압건조, 포말건조, 고주파건조, 적외선건조 등의 방법을 포함한다

상기 금목서 추출물은 물, 유기 용매 또는 이의 혼합 용매를 사용하여 추출할 수 있으며, 바람직하게는 유기 용매를 사용하여 추출할 수 있다. 추출한 액은 액체 형태로 사용하거나 또는 농축 및/또는 건조하여 사용할 수 있다.

유기용매를 사용하여 추출하는 경우, 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 부탄올, 에틸렌, 아세톤, 헥산, 에테르, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 디클로로메탄, N, N-디메틸포름아미드(DMF), 디메틸설폭사이드(DMSO), 1,3-부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 또는 이들의 혼합용매인 유기용매를 사용하며, 추출물의 유효 성분이 파괴되지 않거나 최소화된 조건에서 실온 또는 가온하여 추출할 수 있다. 추출하는 유기용매에 따라 추출물의 유효성분의 추출정도와 손실정도가 차이가 날 수 있으므로, 알맞은 유기용매를 선택하여 사용하도록 한다.

하나의 구체적 실시예에서, 본 발명의 금목서 추출물은, 금목서 잎을 조말로 하여 무게(㎏)의 3배 내지 20배, 바람직하게는 3배 내지 15배의 물, C1 내지 C4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매, 바람직하게는 에탄올 또는 메탄올 용매; 10 내지 40℃바람직하게는 15 내지 37℃추출 온도; 1시간 내지 15일, 바람직하게는 1시간 내지 1일의 시간; 1회 내지 5회, 바람직하게는 1회 내지 3회의 회수; 냉침, 초음파 추출, 환류 냉각 추출, 바람직하게는 냉침 추출 방법을 이용하여 수득한 추출액을 여과, 감압 농축함으로써 수득하였다.

상기 금목서 추출물의 분획물은 유기 용매 또는 이의 혼합 용매를 사용하여 추출물로부터 분획할 수 있으며, 그 분획물은 액체 형태로 사용하거나 또는 농축 및/또는 건조하여 사용할 수 있다.

상기 분획물을 위한 용매는 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 노르말 부탄올, 이소부탄올, 펜탄올, 헥산올, 에틸렌, 아세톤, 노르말 헥산, 이소헥산, 시클로헥산, 에테르, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 디클로로메탄, N, N-디메틸포름아미드(DMF), 디메틸설폭사이드(DMSO), 1,3-부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 및 물을 단독 혹은 2종 이상의 혼합물로서 이용할 수 있으나, 이로 제한되지는 않는다. 바람직하게는 노르말 헥산올, 에틸아세테이트, 노르말 부탄올 및 물이다.

하나의 구체적 실시에서, 금목서 잎에 에탄올을 가하여 금목서 잎 추출물을 제조한 다음, 노르말 헥산, 에틸아세테이트, 노르말 부탄올 및 물을 사용하여 순차적으로 분획하였다.

상기 제조방법에 의하여 얻어진 금목서 추출물 및 이의 분획물은 티로시나제의 활성을 억제하고 멜라닌 생성을 효과적으로 억제하므로 피부의 미백 효과가 우수하다.

또한, 상기 금목서 추출물 및 이의 분획물은 독성 및 부작용이 거의 없으므로 본 발명의 피부 미백용 조성물에 안심하고 사용할 수 있다.

상기 제조방법에 의하여 얻어진 금목서 추출물 및/또는 이의 분획물은 본 발명의 조성물의 전체 중량에 대하여 0.0001 내지 15 중량%, 바람직하게는 0.001 내지 15 중량%, 보다 바람직하게는 0.001 내지 5 중량%로 포함될 수 있다. 0.0001 중량% 미만인 경우에는 미백 효과가 너무 미약하고, 15 중량%를 초과하는 경우에는 함량의 증가에 따른 효과의 증가가 미비하고 제형상의 안정성이 확보되지 않는 문제점이 있다.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 3알파,24-디하이드록시-우르스-12-덴-28-오익산(3α,24-dihydroxy-urs-12-en-28-oic acid), 포몰릭산(pomolic acid), 마스리닉산(maslinic acid), 코르소릭산(corsolic acid), 및 이들 화합물의 약제학적 또는 화장학적 허용 가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택된 1 또는 2이상의 화합물을 포함하는 피부 미백용 조성물을 제공한다.

상기 3알파,24-디하이드록시-우르스-12-덴-28-오익산(3α,24-dihydroxy-urs-12-en-28-oic acid)는 하기 화학식 1의 구조를 갖는 화합물로서, 이하 “화합물 1”이라 한다.

[화학식 1]

상기 포몰릭산(pomolic acid)은 하기 화학식 2의 구조를 갖는 화합물로서, 이하 “화합물 2”라 한다.

[화학식 2]

상기 마스리닉산(maslinic acid)은 하기 화학식 3의 구조를 갖는 화합물로서, 이하 “화합물 3”이라 한다.

[화학식 3]

상기 코르소릭산(corsolic acid)은 하기 화학식 4의 구조를 갖는 화합물로서, 이하 “화합물 4”라 한다.

[화학식 4]

상기 화합물 1 내지 4는 이들에 대한 공지의 제조방법에 따라 제조, 예를 들어, 금목서(Osmanthus fragrans var. aurantiacus)에서 추출분리 정제되거나, 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)와 같은 미생물 배양을 통해 얻어지거나 화학적으로 합성 제조된 상품일 수 있다. 상기 화합물 1 내지 4는 각각 C₃₀H₄₈O₄의 분자식을 갖는 것일 수 있다.

본 발명의 상기 화합물 1 내지 4는 세포내 멜라닌 생성 억제 효능이 농도의존적으로 증가하였으며, 특히 화합물 1 및 3은 기존의 미백 화장품 원료로 사용되고 있는 알부틴(Arbutin)과 비교하여 현저히 높은 멜라닌 생성 억제 효능을 나타내었다. 따라서, 본 발명의 화합물 1 내지 4는 멜라닌 생성 억제로 인한 미백 효과가 우수하다.

본 발명의 상기 화합물 1 내지 4는 화장학적으로 허용되는 염의 형태로 사용될 수 있으며, 이러한 염으로는 화장학적으로 허용되는 유리산(free acid)에 의해 형성되는 산부가염 또는 염기에 의해 형성되는 금속염이 있다. 상기 유리산으로는 무기산과 유기산이 사용될 수 있으며, 무기산으로는 염산, 황산, 브롬산, 아황산 또는 인산 등이 사용될 수 있고 유기산으로는 구연산, 초산, 말레인산, 후마산, 글루콘산, 메탄술폰산 등이 사용될 수 있으나, 이에 의해 제한되는 것은 아니다. 상기 금속염으로는 알칼리 금속염 또는 알칼리 토금속염이 있으며, 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염이 유용하다.

본 발명의 피부 미백용 조성물에서, 상기 화합물 1 내지 4 또는 이들 화합물의 염은 전체 조성물에 대하여 0.0001 내지 15 중량%가 바람직하다. 0.0001 중량% 미만인 경우에는 미백 효과가 너무 미약하고, 15 중량%를 초과하는 경우에는 함량의 증가에 따른 효과의 증가가 미비하고 제형상의 안정성이 확보되지 않는 문제점이 있다. 보다 바람직하게는 상기 화합물 1 내지 4 또는 이들 화합물의 염은 전체 조성물에 대하여 0.001 내지 5 중량% 포함된다.

본 발명의 상기 조성물은 피부 미백용 화장료 조성물일 수 있다.

상기 화장료 조성물은 유효 성분으로서 금목서 추출물, 이의 분획물, 및 3알파,24-디하이드록시-우르스-12-덴-28-오익산(3α,24-dihydroxy-urs-12-en-28-oic acid), 포몰릭산(pomolic acid), 마스리닉산(maslinic acid), 코르소릭산(corsolic acid), 및 이들 화합물의 화장학적 허용 가능한 염으로부터 선택된 1 또는 2이상의 물질 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예를 들어 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제 및/또는 담체를 포함한다. 또한 상기 화장료 조성물은 피부 미백효과를 증진시키기 위하여 피부 흡수 촉진 물질을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 폼(foam), 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라가칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진제를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라기칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린싱인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물에서, 금목서 추출물, 이의 분획물, 및 3알파,24-디하이드록시-우르스-12-덴-28-오익산(3α,24-dihydroxy-urs-12-en-28-oic acid), 포몰릭산(pomolic acid), 마스리닉산(maslinic acid), 코르소릭산(corsolic acid), 및 이들 화합물의 화장학적 허용 가능한 염으로부터 선택된 1 또는 2이상의 물질의 양은 전체 조성물에 대하여 0.0001 내지 15 중량%, 바람직하게는 0.001 내지 15 중량%, 보다 바람직하게는 0.001 내지 5 중량% 포함할 수 있다.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 조성물을 피부 미백을 목적으로 하는 개체에 투여하여 개체 피부의 멜라닌 농도를 감소시켜 피부를 미백하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 개체는 본 발명의 상기 조성물의 투여에 의하여 피부 미백을 위한 목적을 달성할 수 있는 인간을 포함한 포유동물, 예를 들어, 원숭이, 소, 말, 돼지, 양, 개, 고양이, 래트, 마우스, 침팬지 등을 의미한다.

상기 투여는 어떠한 적절한 방법으로 개체에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 경구 또는 비경구 투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 활성 물질이 표적 대상, 예를 들어, 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.

본 발명의 조성물의 적합한 투여량은 개체의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 상기 조성물의 일일 투여량은 성인 기준으로 1.0 ㎖ 내지 3.0 ㎖이며, 필요에 따라 일일 1회 내지 5회 도포하여 투여할 수 있다.

한편, 본 발명의 구체적 실시예에서 금목서 추출물, 이의 분획물, 및 3알파,24-디하이드록시-우르스-12-덴-28-오익산(3α,24-dihydroxy-urs-12-en-28-oic acid), 포몰릭산(pomolic acid), 마스리닉산(maslinic acid), 코르소릭산(corsolic acid), 및 이들 화합물의 화장학적 허용 가능한 염에 대한 세포 독성 실험 결과 천연 물질로서 인체에 무해한 물질임이 밝혀졌다. 따라서, 본 발명의 금목서 추출물, 이의 분획물, 및 3알파,24-디하이드록시-우르스-12-덴-28-오익산(3α,24-dihydroxy-urs-12-en-28-oic acid), 포몰릭산(pomolic acid), 마스리닉산(maslinic acid), 코르소릭산(corsolic acid), 및 이들 화합물의 화장학적 허용 가능한 염은 독성 및 부작용이 거의 없으므로 장기간 사용 시에도 안심하고 사용할 수 있으며, 특히 상기한 바와 같은 화장료 조성물 등에 안전하게 적용할 수 있다.

본 발명에 의하면 금목서 추출물, 이의 분획물, 및 3알파,24-디하이드록시-우르스-12-덴-28-오익산(3α,24-dihydroxy-urs-12-en-28-oic acid), 포몰릭산(pomolic acid), 마스리닉산(maslinic acid), 코르소릭산(corsolic acid), 및 이들 화합물의 화장학적 허용 가능한 염은 멜라닌 생성 억제 효능을 가진다. 또한 인체 안전성 시험에서 어떠한 독성이나 자극도 발생하지 않아 인체사용에 있어 안전한 물질인 것으로 판명되었다. 따라서, 본 발명의 상기 물질은 피부 미백을 위한 화장료 및 의약 등에 유용하게 사용할 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 금목서 잎 추출물 및 분획물의 농도에 따른 세포 생존율(%)을 나타낸 그림이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 3알파,24-디하이드록시-우르스-12-덴-28-오익산(3α,24-dihydroxy-urs-12-en-28-oic acid), 포몰릭산(pomolic acid), 마스리닉산(maslinic acid), 및 코르소릭산(corsolic acid) 화합물의 농도에 따른 세포 생존율(%)을 나타낸 그림이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 금목서 잎 추출물 및 분획물의 농도에 따른 멜라닌 함량(%)을 나타낸 그림이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 3알파,24-디하이드록시-우르스-12-덴-28-오익산(3α,24-dihydroxy-urs-12-en-28-oic acid), 포몰릭산(pomolic acid), 마스리닉산(maslinic acid), 및 코르소릭산(corsolic acid) 화합물의 농도에 따른 멜라닌 함량(%)을 나타낸 그림이다.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 그러나 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 금목서 추출물의 제조

서울대학교 남부학술림 (전남 광양시 백운산에 위치)에서 금목서 잎을 채집하고 채집된 샘플 1 g에 100% 에탄올을 가하여 37℃수욕상에서 2시간 동안 초음파 추출한 후 감압 농축하고 실험 농도를 증류수로 희석하여 사용하였다. 그 희석한 샘플은 빛을 차단한 후 냉동보관하면서 이후 실험에 사용하였다.

실시예 2: 화합물의 분리 및 동정

실시예 1에서 제조한 금목서 잎 추출물을 n-Hexane, Etylacetate, n-Butanol, Water 순으로 순차적으로 분획한 뒤, 감압 농축하고 실험 농도를 증류수로 희석하여 사용하였다. 희석한 샘플은 빛을 차단한 후 냉동보관하면서 이후 실험에 사용하였다.

상기 분획물을 필터링한 후 semi-HPLC를 이용하여 화합물을 분리한 후 NMR을 이용하여 구조동정하였다. 그 결과 하기 화학식 1 내지 4의 화합물임을 밝혀 내었다.

화합물 1: 3알파,24-디하이드록시-우르스-12-덴-28-오익산(3α,24-dihydroxy-urs-12-en-28-oic acid)

화합물 1 구조동정을 위하여, ¹H-NMR 스펙트럼 및 ¹³C-NMR 스펙트럼을 측정하였다.

¹H-NMR 스펙트럼에서 7개의 methyl group proton signal (δ _H 1.16, 3H, s, H-27; 1.07, 3H, s, H-26; 1.04, 3H, s, H-23; 0.96, 3H, d, J=6.4Hz, H-29; 0.95, 3H, s, H-25; 0.92, 3H, d, J=6.4, H-30)을 확인하였다. H-29 및 H-30이 doublet methyl proton으로 나온 것으로 보아 ursane 계열의 triterpenoid로 예상되었다. H-24가 4.19 (1H, d, 10.0Hz, H-24α), 3.72 (1H, d, 10.4Hz, H-24β)로 고자장으로 이동(shift)되었으므로 OH기가 치환되었음을 예측하였다. ¹³C-NMR 스펙트럼에서 3α-OH일 때에는 약 37 ppm (C-1)인 것에 비해 3β-OH carbon일 경우 39 ppm (C-1)로 화합물 1에서 (δ _C 38.9, C-1) 로 3β-OH로 확인하였다. 또한 urs-12-ene carbon signal (δ _C 139.2, C-13), carbonyl carbon signal (δ _C179.9, C-28) 을 확인할 수 있었고, 6개의 methyl carbon signal (δ _C 23.9, C-27; 23.6, C-11; 21.4, C-30; 18.5, C-6; 17.5, C-26; 17.5, C-29; 16.1, C-25; 13.1, C-23), 12개의 methylene signal (δ _C 125.6, C-12; 73.4, C-3; 67.8, C-24; 38.9, C-1; 37.4, C-22; 33.2, C-7; 31.0, C-21; 28.7, C-15; 27.7, C-2; 24.9, C-16; 23.6, C-11; 18.5, C-6), 5개의 methine signal (δ _C53.5, C-18; 48.5, C-5; 48.0, C-9; 39.4, C-19; 39.4, C-20), 7개의 quaternary carbon signal (δ _C179.9, C-28; 139.2, C-13; 48.0, C-17; 42.9, C-4; 42.5, C-14; 39.9, C-8; 37.1, C-10) 을 확인하였다. 또한 C-24가 OH기가 치환되어 고자장 이동(shift)된 67.8 ppm에서 확인되었다. 2D NMR 스펙트럼을 통해 각 치환체의 위치를 확인하였다. 화합물 1의 분자식은 C₃₀H₄₈O₄인 것을 확인하였다.

[화학식 1]

화합물 2: 포몰릭산(pomolic acid)

화합물 2 구조동정을 위하여, ¹H-NMR 스펙트럼 및 ¹³C-NMR 스펙트럼을 측정하였다.

¹H-NMR 스펙트럼에서 7개의 methyl group proton signal (δ _H 1.73, 3H, s, H-29; 1.45, 3H, s, H-27; 1.23, 3H, s, H-25; 1.12, 3H, s, H-23; 1.11, 3H, d, J=6.4Hz, H-30; 1.02, 3H, s, H-24; 0.91, 3H, s, H-26)을 확인하였다. H-29가 singlet methyl proton으로 C-19에 OH기가 치환되어 있다는 것을 예상하였고, H-30이 doublet methyl proton으로 나온 것으로 보아 ursane 계열의 triterpenoid로 예상되었다. ¹³C-NMR 스펙트럼에서 3α-OH일 때에는 약 37 ppm (C-1), 약 76 ppm (C-3), 약 22 ppm (C-24)인 것에 비해 3β-OH carbon일 경우 39 ppm (C-1), 약 79 ppm (C-3), 약 16 ppm (C-24)으로 화합물2에서 (δ _C 39.0, C-1; 78.2 C-3; 16.8 C-24) 로 3β-OH로 확인하였다. 또한 urs-12-ene carbon signal (δ _C 140.0, C-13), carbonyl carbon signal (δ _C180.7, C-28) 을 확인할 수 있었고, 7개의 methyl carbon signal (δ _C 28.8, C-23; 26.9, C-29; 24.7, C-27; 17.2, C-26; 16.8, C-24; 16.5, C-30; 15.6, C-25), 9개의 methylene signal (δ _C 39.0, C-1; 38.6, C-22; 33.6, C-7; 29.3, C-15; 28.1, C-2; 27.1, C-21; 26.4, C-16; 24.0, C-11; 18.9, C-6), 6개의 methine signal (δ _C128.0, C-12; 78.2, C-3; 55.9, C-5; 54.6, C-18; 47.8, C-9; 42.4, C-20), 8개의 quaternary carbon signal (δ _C180.7, C-28; 140.0, C-13; 72.7, C-19; 48.3, C-17; 42.1, C-14; 40.4, C-8; 39.4, C-4; 37.4, C-10) 을 확인하였다. 또한 C-19가 OH기가 치환되어 고자장 이동(shift)된 72.7 ppm에서 확인되었다. 2D NMR 스펙트럼을 통해 각 치환체의 위치를 확인하였다. 화합물 2의 분자식은 C₃₀H₄₈O₄인 것을 확인하였다.

[화학식 2]

화합물 3: 마스리닉산(maslinic acid)

화합물3 구조동정을 위하여, ¹H-NMR 스펙트럼 및 ¹³C-NMR 스펙트럼을 측정하였다.

¹H-NMR 스펙트럼에서 C-2와 C-3에 존재하는 hydroxyl group은 (δ _H 4.10, 1H, td, J=10.0, 4,8 Hz, H-2; 3.39, 1H, d, J=9.6Hz, H-3)로 C₂-α-OH, 및 C₃-β-OH을 갖는 것을 알 수 있다. 그리고 7개의 methyl group proton signal (δ _H 1.27, 3H, s, H-23; 1.25, 3H, s, H-27; 1.07, 3H, s, H-24; 1.00, 3H, s, H-26; 0.98, 3H, s, H-30; 0.97, 3H, s, H-25; 0.93, 3H, s, H-29)을 확인하였다. H-29와 H-30이 singlet으로 나온 것으로 보아 oleanane 구조를 예측할 수 있었다. ¹³C-NMR 스펙트럼에서 C₂-α-OH, 및 C₃-α-OH일 때는 C-1과 C-2의 chemical shift가 각각 약 66.5 ppm과 약 78.9 ppm인 것에 비해서, C₂-α-OH, 및 C₃-β-OH일 경우에는 각각 약 68.8 ppm과 약 83.8 ppm으로, 약간씩 저자장 이동(shift)되므로 화합물3은 (δ _C 83.8, C-3; 68.6, C-2)으로 2-α-OH, 3-β-OH를 갖는 것임을 알 수 있다. 또한 olean-12-ene carbon signal (δ _C 144.8, C-13), carbonyl carbon signal (δ _C180.2, C-28) 을 확인할 수 있었고, 7개의 methyl carbon signal (δ _C 33.2, C-29; 29.3, C-23; 26.1, C-27; 23.7 , C-25; 17.7, C-26; 17.4, C-24; 16.8, C-30), 9개의 methylene signal (δ _C47.7, C-1; 42.0, C-19; 34.2, C-21; 33.2, C-22; 33.2, C-7; 28.3, C-15; 24.0, C-16; 23.9, C-11; 18.8, C-6), 6개의 methine signal (δ _C122.4, C-12; 83.8, C-3; 68.6, C-2; 55.9, C-5; 48.1, C-9; 42.0, C-18), 8개의 quaternary carbon signal (δ _C180.2, C-28; 144.8, C-13; 46.6, C-17; 42.2, C-14; 39.8, C-8; 39.8, C-4; 38.5, C-20; 30.9, C-10) 을 확인하였다. 2D NMR 스펙트럼을 통해 각 치환체의 위치를 확인하였다. 화합물 3의 분자식은 C₃₀H₄₈O₄인 것을 확인하였다.

[화학식 3]

화합물 4: 코르소릭산(corsolic acid)

화합물 4 구조동정을 위하여, ¹H-NMR 스펙트럼 및 ¹³C-NMR 스펙트럼을 측정하였다.

¹H-NMR 스펙트럼에서 7개의 methyl group proton signal (δ _H 1.27, 3H, s, H-23; 1.20, 3H, s, H-27; 1.07, 3H, s, H-24; 1.03, 3H, s, H-26; 0.97, 3H, d, J=6.0Hz, H-30; 0.97, 3H, s, H-25; 0.93, 3H, d, J=6.4, H-29) 을 확인하였다. H-29 및 H-30이 doublet methyl proton으로 나온 것으로 보아 ursane 계열의 triterpenoid로 예상되었다. ¹³C-NMR 스펙트럼에서 C₂-α-OH, 및 C₃-α-OH일 때는 C-1과 C-2의 chemical shift가 각각 약 66.5 ppm과 약 78.9 ppm인 것에 비해서, C₂-α-OH, 및 C₃-β-OH일 경우에는 각각 약 68.8 ppm과 약 83.8 ppm으로, 약간씩 저자장 이동(shift)되므로 화합물4는 (δ _C 83.8, C-3; 68.6, C-2)으로 2-α-OH, 3-β-OH를 갖는 것임을 알 수 있다. 또한 urs-12-ene carbon signal (δ _C 139.3, C-13), carbonyl carbon signal (δ _C179.9, C-28) 을 확인할 수 있었고, 7개의 methyl carbon signal (δ _C 29.4, C-23; 23.9, C-27; 21.4, C-29; 17.7, C-24; 17.5, C-26; 17.5, C-30; 17.0, C-25) methylene signal (δ _C48.0, C-1; 37.4, C-22; 33.5, C-7; 31.1, C-21; 28.6, C-16; 24.9, C-15; 23.7, C-11; 18.8, C-6), methine signal (δ _C 125.5, C-12; 83.8, C-3; 68.6, C-2; 55.9, C-5; 53.5, C-18; 48.1, C-9; 39.5, C-19; 39.4, C-20), quaternary carbon signal (δ _C179.9, C-28; 139.3, C-13; 48.0, C-17; 42.5, C-14; 40.0, C-4; 39.8, C-8; 38.4, C-10) 을 확인하였다. 2D NMR 스펙트럼을 통해 각 치환체의 위치를 확인하였다. 화합물 4의 분자식은 C₃₀H₄₈O₄인 것을 확인하였다.

[화학식 4]

실시예 3: 금목서 추출물 및 이로부터 분리된 화합물들의 세포독성에 대한 안전성 평가

96well plate에 2 x 10⁴cells/well의 마우스 유래 멜라노마 세포 B16F10 세포를 넣고 10% FBS를 포함하는 DMEM 배지를 첨가한 후 5% CO₂, 37℃incubator 조건에서 24 시간동안 안정화한 후 배지를 교체하고 시료를 농도 별로 첨가한 다음 72시간 동안 배양하였다.

MTT 용액을 처리하고 암실의 37℃환경에서 4시간 후 배지를 제거하고 DMSO를 이용해 formazan을 용해하였다. 540 nm에서의 흡광도를 측정하고 대조군과 비교하여 하기 수학식 1을 이용하여 세포 생존율을 %로 나타내었다. 이에 대한 결과를 도 1 내지 2에 나타내었다.

수학식 1

Cell viability % = 100 X (처리군 흡광도 / 대조군 흡광도)

도 1은 금목서의 잎 추출물 및 분획물을 250 ㎍/mL 농도로 희석하여 처리하여 세포 독성을 측정한 결과이다. 금목서 잎 추출물 및 분획물은 250 ㎍/mL 농도에서 세포 독성이 없는 것으로 확인되었다.

도 2는 금목서로부터 분리된 화합식 1 내지 4의 화합물을 1, 10 μM 농도로 희석하여 처리한 후의 세포 독성을 측정한 결과이다. 금목서로부터 분리된 화학식 1 내지 4의 화합물은 1, 10 μM 농도에서 세포 독성이 없는 것으로 확인되었다.

실시예 4: 금목서 추출물 및 이로부터 분리된 화합물들의 멜라닌 생성 저해 효과

쥐의 색소세포(B16 melanoma cells, ATCC)를 이용하여 금목서 추출물, 이의 분획물 및 이로부터 분리된 화합물에 의한 멜라닌 생성 억제효과를 측정하였으며, 이를 멜라닌 생성을 억제하는 것으로 알려진 알부틴에 의한 멜라닌 생성 억제효과와 비교하였다.

24well plate에 2 x 10⁵cells/well의 마우스 유래 멜라노마 세포 B16F10 세포를 넣고 10% FBS를 포함하는 DMEM 배지를 첨가한 후 5% CO₂, 37℃incubator 조건에서 24 시간 동안 안정화한 후 배지를 교체하고 시료를 농도 별로 첨가한 다음 72시간 동안 배양하였다. 72시간 배양 후 10% DMSO가 첨가된 1N NaOH를 첨가하고 80℃에서 1시간 방치하여 세포내의 멜라닌(melanin)을 회수하였다. 멜라닌은 단위세포에서 단위 멜라닌 생성량을 ELISA를 이용하여 490nm에서 흡광도를 측정하였고, 대조군에 대한 백분율로 나타내었다. 이에 대한 결과를 도 3 내지 4에 나타내었다.

도 3은 금목서의 잎 추출물 및 분획물을 250 ㎍/mL 농도로 희석하여 처리한 후 멜라닌 함량을 측정한 결과이다. 금목서 잎 추출물은 250 ㎍/mL 농도에서 86.3 %로 멜라닌 함량이 감소하였고 분획물 중 특히 에틸아세테이트 250 ㎍/mL 농도에서 73. 4 %로 멜라닌 함량이 감소하는 경향을 보였다. 이 결과로부터 금목서 잎의 추출물 및 에틸아세테이트 분획물은 양성대조군인 arbutin보다 더 높은 멜라닌 저해 활성을 보임을 알 수 있었다.

도 4는 금목서로부터 분리된 화학식 1 내지 4의 화합물을 1, 10 μM 농도로 희석하여 처리한 후 멜라닌 함량을 측정한 결과이다. 화학식 1의 화합물은 1, 10 μM 농도에서 68.0 %, 58.0 %로, 화학식 2의 화합물은 88.7 %, 86.7 %로, 화학식 3의 화합물은 78.5 %, 77.1 %로, 화학식 4의 화합물은 97.8 %, 93.7 %로 농도의존적으로 멜라닌 함량이 감소하는 경향을 보였다. 이 결과로부터 금목서로부터 분리된 화학식 1 및 3의 화합물은 양성대조군인 arbutin보다 더 높은 멜라닌 저해 활성이 있음을 알 수 있었다.

Claims

3알파,24-디하이드록시-우르스-12-덴-28-오익산(3α,24-dihydroxy-urs-12-en-28-oic acid) 및 이의 화장학적 허용 가능한 염으로 이루어진 군으로부터 1 이상 선택된 물질을 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물.
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삭제
제1항에 있어서, 상기 3알파,24-디하이드록시-우르스-12-덴-28-오익산(3α,24-dihydroxy-urs-12-en-28-oic acid) 화합물은 금목서로부터 분리된 화합물인 것을 특징으로 하는 피부 미백용 화장료 조성물.