KR101542176B1 - 와송 추출물 또는 와송 캘러스 배양 추출물을 유효성분으로 포함하는 고기능성 화장료 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 와송 추출물; 또는 와송 캘러스 배양 추출물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 와송 추출물; 또는 와송 종자를 배양하여 캘러스 유도 및 이를 증식시켜 수득한 와송 캘러스 배양물을 열수 추출함으로서 제조되는 와송 캘러스 배양 추출물을 유효성분으로 포함하는 고기능성 화장료 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 와송 추출물; 또는 와송 캘러스 배양 추출물은 천연물 유래의 소재로서 피부에 안정하면서도 주름개선 효과, 피부염 개선 효과, 피부노화 방지 효과, 피부 보습 효과, 모공수축 효과, 피지 억제 효과 및 여드름 개선 효과를 동시에 나타낼 수 있으므로, 이를 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 고기능성 화장료 조성물로서 유용하게 사용될 수 있다.

Description

와송 추출물 또는 와송 캘러스 배양 추출물을 유효성분으로 포함하는 고기능성 화장료 조성물{The high functional cosmetic composition comprising orostachys japonicus extract or orostachys japonicus callus culture extracts}
본 발명은 와송 추출물; 또는 와송 캘러스 배양 추출물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 와송 추출물; 또는 와송 종자를 배양하여 캘러스 유도 및 이를 증식시켜 수득한 와송 캘러스 배양물을 열수 추출함으로서 제조되는 와송 캘러스 배양 추출물을 유효성분으로 포함하는 고기능성 화장료 조성물에 관한 것이다.
피부는 외부환경과 직접 접해 있으면서 온도, 습도, 항원 및 자외선 등으로부터 보호해 주는 기능을 가지고 있다. 하지만, 외부 오염물질, 자외선, 스트레스 등의 물리적, 화학적 자극으로 인하여 피부 기능이 저하되어 나이가 들어감에 따라 세포 증식 및 면역 활성이 약해져 피부 세포의 손상을 신속히 복구하지 못하고 피부 구성 성분의 전체적인 악화를 일으켜 피부주름, 탄력 손실 및 각질화 등이 일어나게 된다.
피부의 노화는 크게 내인적 노화와 외인적 노화로 나뉜다. 내인적 노화는 자연적으로 나타나는 노화 현상으로, 임상학적으로 탄력이 감소하고 피부의 결이 거칠어지며 깊은 주름이 생기고 색소가 침착되는 특징이 있다. 외인적 노화는 자외선, 활성 산소종(Reactive oxygen species) 및 스트레스 등의 외부 환경적인 요인에 의해 발생하는 노화 현상으로 최근에는 급속한 산업화와 이에 의한 공기오염과 오존층의 파괴로 UV 양이 증가되고 이는 활성산소종과 같은 강력한 산화 물질들을 발생시켜서 피부 콜라겐 등의 결합조직형성 파괴, 세포막 기능저해, DNA 변이촉진, 단백질 작용 변형, 세포내 신호전달 물질들의 변형 등을 유발하여 인간에게 피부주름 생성, 색소 침착 등을 유발시켜 피부노화를 야기 시키게 된다. 이러한 피부 손상을 방지하기 위하여 레티놀, 레티노이드, 비타민 C, 플라보노이드 및 토코페롤, 코엔자임 Q10 등의 여러 가지 피부 보호 성분이 함유된 화장료 또는 피부 보호제가 개발되고 있다.
최근에는 독성이 상대적으로 적고 자연친화적인 화장품을 개발하기 위해 천연물을 이용 추출공정과 발효기술을 통해 미백, 항노화, 항주름, 항산화, 하염과 같은 생리 활성 물질을 탐색한 후, 이들을 화장품 소재로서 사용하고 있다.
한편, 와송(瓦松)은 바위솔(Orostachys japonicus A. Berger)이라하며 일명 암송(岩松), 옥송(屋松), 작엽하초(昨葉何草) 등으로 불리는 돌나물과(Crassulaceae)의 다년생 초본 식물로서 한방에서 해열, 소종, 지혈, 이습 등에 사용되며[金在佶,1984, 原色天然藥物大事典(上卷), 南山堂, 서울, p.447], 민간요법으로 암치료에도 많이 이용되고 있다[배성식, 1990, 한방과 건강, 1, 26]. 이 식물은 바위 곁에 붙어서 자라는 육질의 다년생 초본이지만 꽃이 피고 열매를 맺으면 고사하는 특징이 있다. 근생엽은 로제트형으로 퍼지며 끝이 굳어져서 가시처럼 되고 원줄기에 잎이 달리며 엽병이 없고 여름철에 나오는 근생엽과 더불어 끝이 굳어지지 않고 다만 뾰족해질 뿐이며 피침형으로서 녹색이지만 자주색 또는 분을 칠한 듯한 백색인 것도 있다. 꽃은 9월에 피고 백색이며 총상화서는 길이 6-15 cm로서 화병이 없는 꽃이 밀착하고 포는 피침형이며 끝이 뾰족하다. 꽃받침은 5개로서 피침형이고 녹색이며 꽃잎도 5개로서 피침형 예두이고 길이가 6 mm 정도이다. 수술은 10개이며 꽃잎보다 길고 자방은 5개이며 화분은 적색이지만 점차 흑색으로 된다[이창복, 1979, 大韓植物圖鑑, 鄕文社서울, p.402]. 와송은 여름부터 가을에 걸쳐 채취하며 뿌리를 제거한 전초(全草)를 햇볕에 말려 약용으로 한다[金在佶, 1984, 原色天然藥物大事典(上卷), 南山堂, 서울, p.447].
와송을 본초학적으로 문헌을 통하여 고찰하여 보면 당본초(唐本草)에는 구중의 건조(乾燥)와 통증에 사용한다고 하며, 본초강목에는 대장하혈에 물로 추출하여 복용하고, 모든 상처에 도포하면 수렴 효과가 있다고하며 본초재신에는 백독(百毒)을 치료하고 종(腫)을 소실시키며 분류초약성에는 치질의 종통출혈을 다스리는데는 약초를 전액(煎液)으로하여 세척한다고 하며 본초재신에는 창(瘡)과 유(癒)에 효과가 있다고 한다.
지금까지 분리·보고된 와송의 성분으로는 프리에데린(friedelin), 에피-프리에드라놀(epi-friedlanol), 글루티논(glutinone), 글루티놀(glutinol)과 같은 트리터페노이드(triterpenoid)류와 β-시토스테롤(β-sitosterol), 캄페스테롤(campesterol) 등의 스테롤(sterol) 계열 물질, 지방산 에스테르(fatty acid ester)류 및 카엠프페롤(kaempferol), 쿠에르세틴(quercetin)과 같은 플라보노이드(flavonoid), 4-히드록시벤조산(4-hydroxybenzoic acid), 3,4-디히드록시벤조산(3,4-dihydroxybenzoic acid), 갈릭산(gallic acid) 등의 방향족 산(aromaticacid) 등이 있다. 또한, 중국산 와송(自瓦松, O. fimbriatus Berger)에는 당성분으로서 세도헵툴로산(sedoheptulosan)과 이소프로필리덴 세도헵툴로즈(isopropylidene sedoheptulose), 플라보노이드(flavonoid) 성분으로서 카엠프페롤-3-글루코실-7-람노사이드(kaempferol-3-glucosyl-7-rhamnoside)가 알려져 있다. 이런 와송의 피부 생리 활성에 대한 연구는 미흡한 실정이다.
이에 본 발명자들은 생체에 부작용이 없으면서 피부 개선 작용이 우수한 천연물질을 찾고자 모색하던 중, 와송(Orostachys japonicus)에 주목하여 이의 약리학적 효과를 실험한 결과, 주름개선 효과, 피부염 개선 효과, 피부노화 방지 효과, 피부 보습 효과, 모공수축 효과, 피지 억제 효과 및 여드름 개선 효과를 모두 가지는 것으로 나타났으며, 이를 통해 화장품 소재로서의 충분한 가치가 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
한국공개특허 제10-2011-0132209호
따라서 본 발명의 목적은 피부에 안정하면서도 고기능성을 가지는 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 와송 추출물을 유효성분으로 포함하는 기능성 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 화장료 조성물은 주름개선 효과, 피부염 개선 효과, 피부노화 방지 효과, 피부 보습 효과, 모공수축 효과, 피지 억제 효과 및 여드름 개선 효과로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 기능성을 가질 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 주름개선 효과는 콜라겐 생합성 증대 및 MMP-1의 생합성 억제를 통해 이루어질 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 피부염 개선 효과는 세포 내 산화질소(NO) 생성 억제를 통해 이루어질 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 피부노화 방지 효과는 항산화 활성 증대를 통해 이루어질 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 유효성분은 전체 조성물 중량 대비 0.001 내지 20%로 포함될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 화장료 조성물은 유연 화장수, 젤, 수용성 리퀴드, 밀크로션, 영양크림, 마사지 크림, 에센스, 수중유 형 에멀젼, 유중수 형 에멀젼, 페이스크성 무수 생성물, 고체 무수 생성물, 소구체를 사용한 수성 상에서의 오일 분산물, 이온성 지질 소포체, 비이온성 지질 소포체, 연고, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 보디오일, 수중유 형 메이크업베이스, 유중수 형 메이크업베이스, 파운데이션, 스킨커버, 립스틱, 립그로스, 페이스파우더, 투웨이케익, 아이섀도우, 마스카라, 치크칼라 및 아이브로우펜슬류로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종의 제형일 수 있다.
또한 본 발명은 와송 캘러스 배양 추출물을 유효성분으로 포함하는 기능성 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 와송 캘러스 배양 추출물은 a) 와송 종자를 배지에 치상하여 20~27℃의 온도 및 65~75% 습도의 조건에서 암실 배양하여 발아를 유도하는 단계; b) 발아된 와송 잎을 절단하여 IAA(indole-3-acetic acid), 제아틴(Zeatin), 수크로오스(Sucrose) 및 겔라이트(Gelite)를 함유한 MS 기본배지에 접종한 후 23~27℃에서 배양하여 캘러스를 유도하는 단계; c) 배양된 와송 캘러스를 계대 배양을 통해 증식시키는 단계; d) 증식된 와송 캘러스 배양물을 수확하여 수분을 제거한 후 55~65℃의 온도 조건에서 건조하는 단계; 및 e) 건조된 와송 캘러스 배양물에 정제수를 가하여 열수추출하는 단계를 포함하는 과정을 통해 제조될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 화장료 조성물은 주름개선 효과, 피부염 개선 효과, 피부노화 방지 효과, 피부 보습 효과, 모공수축 효과, 피지 억제 효과 및 여드름 개선 효과로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 기능성을 가질 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 주름개선 효과는 콜라겐 생합성 증대 및 MMP-1의 생합성 억제를 통해 이루어질 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 피부염 개선 효과는 세포 내 산화질소(NO) 생성 억제를 통해 이루어질 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 피부노화 방지 효과는 항산화 활성 증대를 통해 이루어질 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 유효성분은 전체 조성물 중량 대비 0.001 내지 20%로 포함될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 화장료 조성물은 유연 화장수, 젤, 수용성 리퀴드, 밀크로션, 영양크림, 마사지 크림, 에센스, 수중유 형 에멀젼, 유중수 형 에멀젼, 페이스크성 무수 생성물, 고체 무수 생성물, 소구체를 사용한 수성 상에서의 오일 분산물, 이온성 지질 소포체, 비이온성 지질 소포체, 연고, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 보디오일, 수중유 형 메이크업베이스, 유중수 형 메이크업베이스, 파운데이션, 스킨커버, 립스틱, 립그로스, 페이스파우더, 투웨이케익, 아이섀도우, 마스카라, 치크칼라 및 아이브로우펜슬류로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종의 제형일 수 있다.
본 발명의 와송 추출물 또는 와송 캘러스 배양 추출물은 천연물 유래의 소재로서 피부에 안정하면서도 주름개선 효과, 피부염 개선 효과, 피부노화 방지 효과, 피부 보습 효과, 모공수축 효과, 피지 억제 효과 및 여드름 개선 효과를 동시에 나타낼 수 있으므로, 이를 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 고기능성 화장료 조성물로서 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명은 와송 추출물; 또는 와송 캘러스 배양 추출물을 유효성분으로 포함하는 기능성 화장료 조성물을 제공함에 그 특징이 있다.
본 발명에서 ‘와송(瓦松, Orostachys japonicus)’은 일명 바위솔로 불리는 쌍떡잎식물 장미목 돌나물과의 다년생 초본식물로, 한방고서에 해열, 지열, 간염, 습진, 화상 등에 특효가 있다고 기록되어 있다. 특히, 당뇨병, 중풍, 관절염, 위장병, 팔 다리 아프고, 손발 저림, 변비, 구토, 각종 성인병 등에 특효가 있다고 알려져 있다.
본 발명자들은 상기와 같은 특징으로 갖는 와송의 추출물; 또는 와송 캘러스 배양 추출물이 콜라겐 생합성 증대 및 MMP-1의 생합성 억제를 통한 주름 개선 효과를 가지며(실험예 2 참조), 세포 내 산화질소(NO) 생성 억제를 통한 피부염 개선 효과를 가지고(실험예 3 참조), 항산화 활성 증대를 통한 피부노화 방지 효과(실험예 4 참조)와 더불어 피부 보습 효과(실험예 5 참조), 모공수축 효과(실험예 6 참조), 피지 억제 효과(실험예 7 참조) 및 여드름 개선 효과(실험예 8 참조)를 모두 갖는 것을 실험을 통해 입증하였다.
본 발명에 따른 ‘와송 추출물’은 당업계에 공지된 추출 및 분리하는 방법을 사용하여 천연으로부터 추출 및 분리하여 수득한 것을 사용할 수 있으며, 본 발명에서 정의된 추출물은 적절한 용매를 이용하여 와송의 다양한 기관 또는 부분 (예: 잎, 꽃, 뿌리, 줄기, 가지, 껍질 및 종자 등)으로부터 추출하여 얻은 것을 의미하고, 바람직하게는 잎, 줄기, 가지, 껍질 또는 뿌리, 보다 바람직하게는 잎, 가지 또는 뿌리, 가장 바람직하게는 잎으로부터 얻은 추출물을 의미한다. 예를 들어, 와송의 조추출물, 극성용매 가용 추출물, 비극성용매 가용 추출물 또는 조추출물의 용매 분획물을 모두 포함하는 개념이다.
상기 와송으로부터 추출물을 추출하기 위한 적절한 용매로는 약제학적으로 허용되는 유기용매라면 어느 것을 사용해도 무방하며, 물 또는 유기용매를 사용할 수 있으며, 이에 제한되지는 않으나, 예를 들어, 정제수, 메탄올(methanol), 에탄올(ethanol), 프로판올(propanol), 이소프로판올(isopropanol), 부탄올(butanol) 등을 포함하는 탄소수 1 내지 4의 알코올, 아세톤(acetone), 에테르(ether), 벤젠(benzene), 클로로포름(chloroform), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 메틸렌클로라이드(methylene chloride), 헥산(hexane) 및 시클로헥산(cyclohexane) 등의 각종 용매를 단독으로 혹은 혼합하여 사용할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 본 발명의 와송 추출물이 와송 조추출물인 경우 물, 에탄올, 메탄올, 부탄올 또는 이들의 혼합용매를 이용하여 추출할 수 있 있으며, 초임계 유체를 이용하여 추출할 수도 있다.
추출 방법으로는 열수추출법, 냉침추출법, 환류냉각추출법, 용매추출법, 수증기증류법, 초임계추출법, 초음파추출법, 용출법, 압착법 등의 방법 중 어느 하나를 선택하여 사용할 수 있다. 또한, 목적하는 추출물은 추가로 통상의 분획 공정을 수행할 수도 있으며, 통상의 정제 방법을 이용하여 정제될 수도 있다. 본 발명의 와송 추출물의 제조방법에는 제한이 없으며, 공지되어 있는 어떠한 방법도 이용될 수 있다.
예를 들면, 본 발명의 조성물에 포함되는 와송 추출물은 상기한 열수 추출법, 용매 추출법 또는 초임계 추출법으로 추출된 1차 추출물을, 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조할 수 있다. 또한 상기 1차 추출물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography), 박층 크로마토그래피(thin layer chromatography), 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography) 등과 같은 다양한 크로마토그래피를 이용하여 추가로 정제된 분획을 얻을 수도 있다.
따라서 본 발명에 있어서 와송 추출물은 추출, 분획 또는 정제의 각 단계에서 얻어지는 모든 추출액, 분획 및 정제물, 그들의 희석액, 농축액 또는 건조물을 모두 포함하는 개념이다.
본 발명에 따른 ‘와송 캘러스 배양 추출물’은 와송 종자를 배양하여 캘러스 유도 및 이를 증식시켜 수득한 와송 캘러스 배양물의 추출물을 의미한다.
본 발명의 와송 캘러스 배양 추출물은 와송 종자를 배양하여 발아를 유도한 후, 발아된 와송 잎을 이용 캘러스를 유도 및 계대 배양을 통해 캘러스를 증식시킨 다음, 증식된 와송 캘러스 배양물을 건조하고 여기에 정제수를 가하여 열수 추출하는 과정을 통해 제조될 수 있으나, 특별히 그 과정을 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 일 구체예에서, 본 발명의 와송 캘러스 배양 추출물은 a) 와송 종자를 배지에 치상하여 20~27℃의 온도 및 65~75% 습도의 조건에서 암실 배양하여 발아를 유도하는 단계; b) 발아된 와송 잎을 절단하여 IAA(indole-3-acetic acid), 제아틴(Zeatin), 수크로오스(Sucrose) 및 겔라이트(Gelite)를 함유한 MS 기본배지에 접종한 후 23~27℃에서 배양하여 캘러스를 유도하는 단계; c) 배양된 와송 캘러스를 계대 배양을 통해 증식시키는 단계; d) 증식된 와송 캘러스 배양물을 수확하여 수분을 제거한 후 55~65℃의 온도 조건에서 건조하는 단계; 및 e) 건조된 와송 캘러스 배양물에 정제수를 가하여 열수추출하는 단계를 포함하는 과정을 통해 제조될 수 있다.
본 발명의 조성물이 화장료 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 조성물은 와송 추출물; 또는 와송 캘러스 배양 추출물뿐만 아니라, 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 상술한 유효성분(와송 추출물; 또는 와송 캘러스 배양 추출물) 이외에, 유효성분과 반응하여 피부보호 효과를 손상시키지 않는 한도에서 종래부터 사용되어오던 피부보호제를 혼합하여 사용할 수도 있다.
본 발명의 화장료 조성물을 첨가할 수 있는 제품으로는, 예를 들어, 수렴화장수, 유연화장수, 영양화장수, 각종크림, 에센스, 팩, 파운데이션 등과 같은 화장품류와 클렌징, 세안제, 비누, 트리트먼트, 미용액 등이 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 구체적인 제형으로서는 유연 화장수, 젤, 수용성 리퀴드, 밀크로션, 영양크림, 마사지 크림, 에센스, 수중유 형 에멀젼, 유중수 형 에멀젼, 페이스크성 무수 생성물, 고체 무수 생성물, 소구체를 사용한 수성 상에서의 오일 분산물, 이온성 지질 소포체, 비이온성 지질 소포체, 연고, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 보디오일, 수중유 형 메이크업베이스, 유중수 형 메이크업베이스, 파운데이션, 스킨커버, 립스틱, 립그로스, 페이스파우더, 투웨이케익, 아이섀도우, 마스카라, 치크칼라 및 아이브로우펜슬류로 이루어진 군 중에서 선택되는 1종의 제형을 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 유효성분(와송 추출물; 또는 와송 캘러스 배양 추출물)의 함량은 조성물 총 중량에 대하여 0.0001-20중량%이며, 바람직하게는 0.5-20%이며, 보다 바람직하게는 1.0-20중량%이다. 상기 유효성분(와송 추출물; 또는 와송 캘러스 배양 추출물)의 함량이 0.0001중량% 미만이면 기능성(주름개선 효과, 피부염 개선 효과, 피부노화 방지 효과, 피부 보습 효과, 모공수축 효과, 피지 억제 효과 및 여드름 개선 효과)이 크게 감소되고, 20중량%를 초과하는 경우에는 피부 자극을 초래할 수 있으며, 제형상의 문제점이 발생할 수 있다.
한편, 본 발명에 따른 상기 화장료 조성물은 유효성분(와송 추출물; 또는 와송 캘러스 배양 추출물)을 나노리포좀 내부에 함유시켜 안정화하여 제형화할 수도 있다. 상기 유효성분(와송 추출물; 또는 와송 캘러스 배양 추출물)을 나노리포좀 내부에 함유시키면, 유효성분(와송 추출물; 또는 와송 캘러스 배양 추출물)의 성분이 안정화되어 제형화시 침전형성, 변색, 변취 등의 문제점을 해결할 수 있으며, 성분의 용해도 및 경피흡수율을 높일 수 있어 상기 추출물로부터 기대되는 효능을 최대로 발현시킬 수 있다.
본 발명에서 나노리포좀은 통상적인 리포좀의 형태를 갖는 것으로서 평균 입자 지름이 10~500nm인 리포좀을 의미한다. 본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 나노리포좀의 평균 입자 지름은 50~300nm이다. 나노리포좀의 평균 입자 지름이 300nm를 초과하는 경우에는 본 발명에서 달성하고자 하는 기술적 효과 중 피부침투의 개선 및 제형 안정성의 개선이 매우 미약하다.
본 발명에 따라 상기 추출물을 안정화하는데 사용되는 나노리포좀은 폴리올, 유성성분, 계면활성제, 인지질, 지방산 및 물을 포함하는 혼합물에 의해 제조될 수 있다.
본 발명의 나노리포좀에 이용되는 폴리올은 특히 제한되지 않으며, 바람직하게는 프로필렌글리콜, 디프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 글리세린, 메틸프로판디올, 이소프로필렌글리콜, 펜틸렌글리콜, 에리스리톨, 자일리톨, 솔비톨 및 이의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상이다. 그 사용량은 나노리포좀 총 중량에 대하여 10~80중량%, 바람직하게는 30~70중량%이다.
본 발명의 나노리포좀의 제조에 이용되는 유성(oil) 성분은 당업계에 공지된 다양한 오일이 이용될 수 있으며, 바람직하게는 헥사데칸 및 파라핀 오일과 같은 하이드로카본계 오일, 에스테르계의 합성오일, 디메치콘 및 사이크로메치콘계와 같은 실리콘 오일, 해바라기유, 옥수수유, 대두유, 아보카도유, 참깨유 및 어유와 같은 동식물성 오일, 에톡시레이티드 알킬에테르계오일, 프로폭시레이티드 알킬에테르계오일, 피토스핑고신, 스핑고신 및 스핑가닌과 같은 스핑고노이드 지질, 세레브로사이드 콜레스테롤, 시토스테롤 콜레스테릴설페이트, 시토스테릴설페이트, C10-40 지방알콜 및 이의 혼합물이다. 그 사용량은 나노리포좀 총 중량에 대하여1.0~30.0중량%일 수 있으며, 바람직하게는 3.0~20.0중량%이다.
본 발명의 나노리포좀의 제조에 이용되는 계면활성제는 당업계에 공지된 어떠한 것도 사용할 수 있다. 예를 들어, 음이온성 계면활성제, 양이온성 계면활성제, 양성 계면활성제 및 비이온성 계면활성제가 사용될 수 있다. 바람직하게는 음이온성 계면활성제 및 비이온성 계면활성제이다. 음이온성 계면활성제의 구체적인 예는 알킬아실글루타메이트, 알킬포스페이트, 알킬락틸레이트, 디알킬포스페이트 및 트리알킬포스페이트를 포함한다. 비이온성 계면활성제의 구체적인 예는 알콕시레이티드 알킬에테르, 알콕시레이티드 알킬에스테르, 알킬폴리글리코사이드, 폴리글리세릴에스테르 및 슈가에스테르를 포함한다. 특히 바람직한 계면활성제는 비이온성 계면활성제에 속하는 폴리솔베이트류이다. 그 사용량은 나노리포좀 총 중량에 대하여 0.1~10중량%일 수 있으며, 바람직하게는 0.5~5.0중량%이다.
본 발명의 나노리포좀의 제조에 이용되는 또 다른 성분인 인지질은 양쪽친화성 지질이 이용되며, 천연 인지질(예를 들어, 난황 레시틴 또는 대두 레시틴, 스핑고마이엘린) 및 합성 인지질(예를 들어, 디팔미토일포스파티딜콜린 또는 수첨 레시틴)을 포함하며, 바람직하게는 레시틴이다. 특히, 대두 또는 난황에서 추출한 천연 유래의 불포화 레시틴 또는 포화 레시틴이 바람직하다. 통상적으로 천연 유래의 레시틴은 포스파티딜콜린의 양이 23~95%, 그리고 포스파디딜에탄올아민의 양이 20% 이하이다. 본 발명의 나노리포좀의 제조에 있어서, 인지질의 사용량은 나노리포좀 총 중량에 대하여 0.5~20.0중량%이며, 바람직하게는 2.0~8.0중량%이다.
본 발명의 나노리포좀 제조에 이용되는 지방산은 고급 지방산으로서, 바람직하게는 C12-22 알킬 체인의 포화 또는 불포화 지방산으로서, 예컨대, 라우린산, 미리스트산, 팔미트산, 스테아린산, 올레산 및 리놀레산을 포함한다. 그 사용량은 나노리포좀 총 중량에 대하여 0.05~3.0중량%일 수 있으며, 바람직하게는 0.1~1.0중량%이다.
본 발명의 나노리포좀의 제조에 이용되는 물은 일반적으로 탈이온화된 증류수이며, 그 사용량은 나노리포좀 총 중량에 대하여 5.0~40중량%일 수 있다.
나노리포좀의 제조는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 이루어질 수 있으나, 가장 바람직하게는 상기 성분들을 포함하는 혼합물을 고압 호모게나이저에 적용하여 제조된다. 고압 호모게나이저에 의한 나노리포좀의 제조는 소망하는 입자 크기에 따라 다양한 조건(예: 압력, 횟수 등)으로 실시할 수 있으며, 바람직하게는 600~1200bar의 압력 하에서 1~5회 고압 호모게나아저를 통과하도록 하여 나노리포좀을 제조할 수 있다.
본 발명에 따른 고기능성 화장료 조성물은 상기 유효성분(와송 추출물; 또는 와송 캘러스 배양 추출물)을 나노리포좀 충 중량 기준으로 0.1~20.0중량%로 함유할 수 있다.
본 발명은 또한, a) 와송 종자를 배지에 치상하여 20~27℃의 온도 및 65~75% 습도의 조건에서 암실 배양하여 발아를 유도하는 단계; b) 발아된 와송 잎을 절단하여 IAA(indole-3-acetic acid), 제아틴(Zeatin), 수크로오스(Sucrose) 및 겔라이트(Gelite)를 함유한 MS 기본배지에 접종한 후 23~27℃에서 배양하여 캘러스를 유도하는 단계; c) 배양된 와송 캘러스를 계대 배양을 통해 증식시키는 단계; d) 증식된 와송 캘러스 배양물을 수확하여 수분을 제거한 후 55~65℃의 온도 조건에서 건조하는 단계; 및 e) 건조된 와송 캘러스 배양물에 정제수를 가하여 열수추출하는 단계를 포함하는 와송 캘러스 배양 추출물의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 a)단계 전 와송 종자의 표면을 살균하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 구체예에서, 상기 e)단계 후 열수추출한 와송 캘러스 배양물을 여과한 후 동결·건조하는 단계를 추가로 더 포함할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1>
본 발명에 따른 와송 캘러스 배양 추출물 제조
<1-1> 와송 종자로부터 캘러스와 부정근 유도
먼저 와송 종자의 표면을 살균하기 위하여, 와송 종자(경남 함양군 마천면 추성리(지리산 자락))를 70% 에탄올에 30초간 침지시키고, 2% 치아염소산나트륨(Sodium hypochlorite)에 5분 진탕하여 살균 후, 멸균수로 세척하였다.
살균된 와송 종자를 1/2MS(Murashinge and Skoog, 1962)배지에 치상하고, 25℃, 습도 70%의 생장상에서 7일간 암실 배양하며 발아를 유도하였다. 발아된 와송 잎을 날카로운 칼로 단번에 잘라서 IAA(indole-3-acetic acid) 0.5㎎/L, 제아틴(Zeatin) 0.2㎎/L의 생장조절물질과 수크로오스(Sucrose) 30g/L, 겔라이트(Gelite) 2.0g/L를 함유한 MS 기본배지에 접종한 후 23~27℃의 배양실에서 8주간 배양하여 캘러스를 유도하였다. 유도된 캘러스는 4주 간격으로 계대 배양하여 증식하였다.
상기 과정을 통해 수득한 캘러스로부터 부정근을 유도하기 위하여 수크로오스(Sucrose) 30g/L, 겔라이트(Gelite) 2.0g/L를 함유한 MS 기본배지에 NAA(1-naphthaleneacetic acid) 0.5 mg/L 의 생장조절물질을 첨가하여 22±1℃의 암조건 배양실에서 8주간 배양하였다. 각각의 배지는 1N 수산화칼륨(KOH)을 이용하여 pH 5.8로 조정한 후, 121 ℃에서 20분간 고압멸균기를 이용하여 살균한 다음, 페트리디쉬에 분주하여 사용하였다.
유도한 부정근의 정단부를 약 1cm 정도 절단하여 수크로오스(Sucrose) 30g/L, 겔라이트(Gelite) 2.0g/L를 함유한 1/2 MS 기본배지에 생장조절물질 IBA(indole-3-butyric acid) 1mg/L를 첨가한 배지에 접종하여, 22±1℃의 암조건 배양실에서 4 주간 배양하였다.
<1-2> 와송 캘러스 배양 및 대량생산
무균적으로 채취된 와송 캘러스를 3% Sucrose 및 agar 8g/L가 포함된 MS 기본배지에서 2~3주의 일정기간 간격으로 계대 배양하였다. 이후, 풍선형 생물반응기((기기종 및 구입처 기재요망)를 이용하여 agar를 제외한 동일한 조성의 액체 배지에서 온도 25℃, 습도 70%, 공기공급량 0.1 vvm으로 일정하게 조절하며 14일 간격으로 배양함으로써, 캘러스를 배양 및 증식하여 대량생산하였다.
<1-3> 와송 캘러스 배양 추출물 제조
증식된 와송 캘러스 배양물을 수확하여 깨끗한 티슈로 충분히 수분을 제거한 후 60℃로 2일 동안 건조기에서 건조하였다. 건조된 와송 캘러스 배양물 분말 50g을 용기에 담고, 1L의 정제수를 넣고 열수추출하였다. 열수추출은 8~48시간 정도, 80 ∼ 100 ℃로 가열하여 열수 추출하였다. 추출 후, mesh로 여과하여 고형분을 제거하고, 여과하여 나온 와송 캘러스 배양 추출물을 동결·건조하여 정제수에 녹여 하기 실험의 시료로 사용하였다.
< 비교예 1>
와송 추출물 제조
경남 함양군 마천면 추성리(지리산 자락)에서 채취한 와송을 정제수로 여러 번 세척하고, 깨끗한 티슈로 충분히 수분을 제거한 후 60℃로 2일 동안 건조기에서 건조하였다. 건조된 와송 50g을 용기에 담고, 1L의 정제수를 넣고 열수 추출하였다. 열수추출은 8~48시간 정도, 80 ∼ 100 ℃로 가열하여 열수 추출하였다. 추출 후, mesh로 여과하여 고형분을 제거하고, 여과하여 나온 와송 추출물을 동결·건조하여 정제수에 녹여 하기 실험의 시료로 사용하였다.
< 실험예 1>
본 발명에 따른 와송 캘러스 배양 추출물의 피부세포생존율(Cell Viability)에 미치는 영향
본 실험에서는 상기 실시예 1을 통해 제조된 와송 캘러스 배양 추출물에 대한 피부 세포의 증식 활성을 알아보았다.
이를 위해, 먼저 인간각질형성 세포(human keratinocyte cell, HaCaT)는 ATCC(American Type Culture Collection)에서 분주 받아서 배양하였다. 각 세포를 1×104cells/ml의 농도로 하여 24 웰 배양판에 접종하였다. 배지는 10% FBS를 함유한 DMEM(Dubelcco'S Modified Eagle Medium, BRL,USA)을 사용하였다. 10% FBS를 함유하는 DMEM에서 48시간 배양하여 배양용기 표면적의 25 ~ 30%만큼 배양되면, 상기 실시예 1에서 제조된 와송 캘러스 배양 추출물과 비교예 1에서 제조된 와송 추출물이 농도별(0.5중량%, 1.0중량%, 2.0중량%, 5.0중량%, 10.0중량%)로 각각 함유된 FBS-free DMEM으로 교체하여 24시간 추가로 배양하였다.
배양 후 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐 테트라졸리움 브롬화물 (MTT, Sigma M5655, USA) 용액 (2.5 mg/ml)을 50㎕ 첨가하고 3시간동안 추가로 배양한 후 상등액을 제거하고, 각 well 당 200 ㎕의 디메틸설폭사이드(DMSO, Sigma D2650, USA)용액을 가한 후 20분간 교반하여 형성된 포르마잔(formazan) 결정을 녹인 다음, 100㎕ 씩을 96 웰 로 취하여 Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)로 570 nm 에서 흡광도를 측정하였다. 피부 세포의 증식 활성 정도는 순수한 물을 사용한 대조군의 흡광 강도를 기준으로 하기 수학식에 따라 계산하여 백분율로 표시하였다.
[수학식 1]
세포생존율(Cell Viability)효과 (%) = [(실험군 흡광도 - 대조군 흡광도)/대조군의 흡광도]×100
본 발명의 와송 캘러스 배양 추출물의 농도별 처리에 따른 세포생존율
시 료 Cell viability
( % of control)
0.1 % 0.5 % 1.0 % 2 % 5% 10%
와송 추출물
(비교예 1)		 98 99 100 101 102 102
와송 캘러스 배양 추출물
(실시예 1)		 100 101 100 101 105 105
그 결과 상기 표 1에서 나타낸 바와 같이, 본 발명의 와송 캘러스 배양 추출물은 처리 농도에 상관없이 모든 실험군에서 세포생존율에 영향을 미치지 않는 것을 확인할 수 있었다. 즉, 상기 실시예 1을 통해 제조된 본 발명의 와송 캘러스 배양 추출물은 세포독성이 없는 것으로 나타났다.
< 실험예 2>
본 발명에 따른 와송 캘러스 배양 추출물의 피부 주름 개선 효과
본 실험에서는 상기 실시예 1을 통해 제조된 와송 캘러스 배양 추출물에 대한 피부 주름 개선 효과를 살파보기 위하여, 프로콜라겐 생합성량 측정과 더불어 콜라겐 분해 관련 효소인 MMP-1의 발현 억제 효과를 조사하였다.
<2-1> 프로콜라겐 합성 증진 실험
인간섬유아세포(Human Skin Fibroblast)를 37℃, 5% CO2배양기에서 일정한 습도를 유지하는 세포 배양기내에서 10% FBS, Penicillin(50U/ml), Streptomycin(50/ml)를 함유하는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium, Gibco, USA)으로 배양하여, 1×105개/ml로 24 웰 플레이트에 500㎕ 씩 분주한 다음 24시간 배양하였다. 이후 상기 실시예 1을 통해 준비한 본 발명의 와송 캘러스 배양 추출물 및 상기 비교예 1을 통해 준비한 와송 추출물이 농도별(0.1, 0.5, 1, 2, 5, 10중량%)로 각각 포함된 DMEM 배지를 넣고 48시간 동안 37℃, 5% CO2배양기에서 추가로 배양하였다. 이때 대조군은 DMEM 배지를 사용하였다. 상기 과정을 통해 배양한 배지의 상층액을 각각 20㎕ 을 취해 Procollagen Type I C-Peptide EIA Kit(PICP, Takara, Cat No. MK101)를 이용하여 측정함으로써 새로 합성된 콜라겐 양을 측정하였다. PICP양은 ng/1×105세포로 환산하였으며, 하기 수학식에 따라 계산하여 계산하였다.
[수학식 2]
Figure 112013097569880-pat00001

본 발명의 와송 캘러스 배양 추출물의 농도별 처리에 따른 프로콜라겐 생합성량
시 료 Procollagen 생합성량
( % of control)
0.1 % 0.5 % 1.0 % 2 % 5% 10%
와송 추출물
(비교예 1)		 99 102 105 108 111 113
와송 캘러스 배양 추출물
(실시예 1)		 103 116 129 133 145 141
그 결과 상기 표 2에서 나타낸 바와 같이, 본 발명의 와송 캘러스 배양 추출물의 처리 농도에 의존적으로 프로콜라겐 생합성량이 증대되는 것을 확인할 수 있었으며, 특히 비교예로서 와송 추출물 대비 프로콜라겐 생합성 효과가 두드러지게 높은 것을 알 수 있었다. 이러한 결과를 통해, 본 발명의 와송 캘러스 배양 추출물의 경우 와송 자체의 추출물에 비해 콜라겐 합성을 증대시키는 효과가 탁월한 것을 확인할 수 있었다.
<2-2> MMP -1 발현 억제 효과
피부의 주름은 콜라겐의 합성과 분해의 불균형에 기안하는데 보통 피부에서 type I 콜라겐의 합성과 그 분해 효소인 MMP-1이 균형을 이루고 있다. 그러나 광노화된 피부에서는 type I, III 콜라겐의 합성이 저하되고, MMP-1의 활성이 증가된다. 이러한 MMPs(matrix metalloproteinases)는 단백분해효소로 세포외 기질(extracellular matrix)을 분해하는 기능을 나타내며 정상적인 상태에서는 상처치유나 조직재생과정에 관여하는 것으로 알려져 있다.
따라서 본 발명자들은 상기 실시예 1을 통해 제조된 본 발명의 와송 캘러스 배양 추출물이 피부 주름 개선에 효과가 있음을 입증하기 위하여, 콜라겐의 분해 효소로 널리 알려진 MMP-1(matrix metalloproteinase-1)의 발현 억제 정도를 아래와 같은 실험으로 평가하였다.
인간섬유아세포(Human Skin Fibroblast)를 37℃, 5% CO2 배양기에서 일정한 습도를 유지하는 세포 배양기내에서 10% FBS, Penicillin(50U/ml), Streptomycin(50/ml)를 함유하는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium, Gibco, USA)으로 배양하여, 1×106개/ml로 48 웰 플레이트에 분주한 다음 24시간 배양한 후, UVB를 조사하였다. 이후 상기 실시예 1을 통해 준비한 본 발명의 와송 캘러스 배양 추출물 및 상기 비교예 1을 통해 준비한 와송 추출물이 농도별(0.1, 0.5, 1, 2, 5, 10중량%)로 각각 포함된 DMEM 배지를 넣고 48시간 동안 37℃, 5% CO2배양기에서 추가로 배양하였다. 이때 대조군은 DMEM 배지를 사용하였다. 48시간 후, 배지의 상층액을 각각 20㎕을 취해 Matrix Metalloproteinase-1, Biotrack Activity(Amersham, Cat No. RPN2629)를 이용하여 측정함으로써 새로 합성된 MMP-1의 양을 측정한 뒤 mg/ml 환산하여, 하기 수학식 3에 따라 계산하였다.
[수학식 3]
Figure 112013097569880-pat00002

본 발명의 와송 캘러스 배양 추출물의 농도별 처리에 따른 MMP-1 생합성 억제율(%)
UVB
처리유무		 시료 농도(중량%) MMP-1 생합성 억제율(%)
- 음성 대조군 - 0
+ 와송 추출물
(비교예 1)		 0.1 0
0.5 3
1.0 5
5.0 19
10 25
와송 캘러스 배양 추출물
(실시예 1)		 0.1 5
0.5 12
1.0 20
5.0 32
10 40
양성 대조군(비타민 C) 1% 30
그 결과 상기 표 3에서 나타낸 바와 같이, 본 발명의 와송 캘러스 배양 추출물의 처리 농도에 의존적으로 MMP-1 생합성 억제 효과가 증대되는 것을 확인할 수 있었으며, 특히 비교예로서 와송 추출물 대비 MMP-1 생합성 억제 효과가 더욱 뛰어난 것을 보여주었다.
< 실험예 3>
본 발명에 따른 와송 캘러스 배양 추출물의 항염 효과
iNOS는 inducible nitric oxide synthase의 약어로서 유도성 NOS라고 불리며, 병원균의 세포막 성분인 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide: LPS), IL-1, TNF-α와 같은 사이토카인, 방사선 등의 면역 자극제에 의해 세포가 활성화될 때에만 여러 세포에서 많은 양이 발현되어 산화질소(NO) 생성을 유도하고, 이렇게 생성되는 산화질소는 염증발현이나 숙주방어기전 등에 작용하는 것으로 알려져 있다.
따라서 본 발명자들은 상기 실시예 1을 통해 제조된 와송 캘러스 배양 추출물의 항염 효과를 조사하기 위하여, iNOS 활성 저해 정도를 산화질소(NO) 생성량 측정을 통해 살펴보았다. Raw 264.7 세포주로부터 생성된 nitric oxide(NO)의 양은 세포 배양액 중에 존재하는 NO2 -형태로서 Griess시약을 이용하여 측정하였다.
자세하게는 1μg LPS로 활성화된 Raw 264.7 세포에서 NO 생성 억제를 측정하기 위해, 상기 실시예 1을 통해 준비한 본 발명의 와송 캘러스 배양 추출물 및 상기 비교예 1을 통해 준비한 와송 추출물이 농도별(0.1, 0.5, 1, 2, 5, 10중량%)로 각각 포함된 DMEM 배지에서 Raw 264.7 세포를 24시간 동안 배양한 후, Griess reagent를 세포배양 상층액 100 μl와 Griess시약 (1% sulfanilamide in 5% phosphoric acid, 1% α-naphthylamide in H2O)100μl를 혼합하여 96 웰 플레이트에서 10분 동안 반응시킨 후 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. NO2-의 농도는 소듐 니트레이트(sodium nitrate)를 희석하여 흡광도를 측정하여 표준 곡선을 얻었다.
본 발명의 와송 캘러스 배양 추출물의 농도별 처리에 따른 세포 내 NO 생성량
LPS
처리유뮤		 시료 농도(중량%) 세포생존율 NO 생성(μM)
- 음성 대조군 - 100 1.3
+ 음성 대조군 - 60 3.6
와송 추출물
(비교예 1)		 0.1 98 3.5
0.5 99 3.4
1.0 100 3.3
5.0 101 3.2
10 102 3.2
와송 캘러스 배양 추출물
(실시예 1)		 0.1 100 3.2
0.5 101 3.0
1.0 100 2.8
5.0 101 2.5
10 105 2.2
양성 대조군(인도메타신) 10μM 95.8 3.1
그 결과 상기 표 4에서 나타낸 바와 같이, 본 발명의 와송 캘러스 배양 추출물의 처리 농도에 의존적으로 세포 내 산화질소(NO)의 생성량이 저해/억제되는 것을 확인할 수 있었으며, 특히 비교예로서 와송 추출물뿐만 아니라 양성 대조군으로서 항염증제로 널리 알려진 인도메타신과 비교하여 산화질소(NO) 생성 저해 활성이 더욱 효과적인 것으로 나타났다. 이러한 결과를 통해, 본 발명자들은 와송 캘러스 배양 추출물이 산화질소(NO) 생성 저해 활성을 통해 항염증 작용이 뛰어남을 실험을 통해 입증하였다.
< 실험예 4>
본 발명에 따른 와송 캘러스 배양 추출물의 항산화 효과
본 발명자들은 상기 실시예 1을 통해 제조된 와송 캘러스 배양 추출물의 항산화 효과를 조사하기 위하여, ABTS 라디칼 소거능 측정을 통해 항산화 정도를 살펴보았다.
ABTS 라디칼을 이용한 항산화 활성 측정은 과황산칼륨(potassium persulfate)과의 반응에 의해 생성된 ABTS 자유 라디칼이 추출물 내의 항산화 물질에 의해 제거되어 라디칼 특유의 색인 청록색이 탈색되는 것을 이용한 방법으로 Van den Berg 등의 방법을 변형하여 측정하였다. 자세하게는, 1.0 mM의 AAPH(2,2'-azo-bis 2-amidinopropanedeihydrochloride)는 100 mM PBS 버퍼에 녹인 2.5 mM ABTS(2,2'-azino-bis 3-ethylbenzenothiazolin-6-sulfonic acid)와 혼합한 후 68℃ 의 항온조에서 12분 동안 반응시켜 ABTS 양이온(ABTS+)을 형성시켰다. 그 후, 앞서 만든 ABTS+ 용액 980㎕에 실시예 1을 통해 준비한 본 발명의 와송 캘러스 배양 추출물 및 상기 비교예 1을 통해 준비한 와송 추출물을 농도별(0.1, 0.5, 1, 2, 5, 10중량%)로 각각 20㎕씩 가하여 37℃ water bath에서 10분간 반응시키면서 734 nm에서 감소하는 흡광도의 정도를 측정하였으며 이때 양성대조군은 Trolox 0.1 % 을 사용하였다. ABTS 라디칼 소거능은 다음의 수학식 3에 따라 계산하였다.
[수학식 4]
Figure 112013097569880-pat00003

본 발명의 와송 캘러스 배양 추출물의 농도별 ABTS 라디칼 소거 활성
시료 농도(중량%) ABTS 라디칼 소거 활성
음성 대조군 - 0
와송 추출물
(비교예 1)		 0.1 5
0.5 5
1.0 10
5.0 20
10 45
와송 캘러스 배양 추출물
(실시예 1)		 0.1 4
0.5 11
1.0 20
5.0 34
10 70
양성 대조군(비타민 C) 0.1 72
그 결과 상기 표 5에서 나타낸 바와 같이, 본 발명의 와송 캘러스 배양 추출물의 처리 농도에 의존적으로 항산화 활성이 증대되는 것을 확인할 수 있었으며, 특히 비교예로서 와송 추출물로 대비 항산화 효과가 더욱 뛰어난 것을 보여주었다. 또한 양성 대조군인 비타민 C와 유사한 수준 정도로 항산화 활성이 우수한 것을 알 수 있었다.
< 실험예 5>
본 발명에 따른 와송 캘러스 배양 추출물의 피부 보습 효능
본 실험에서는 1회 도포 시 피부 보습지속력을 알아보기 위하여, 건조를 호소하거나, 건성 피부라고 생각되는 30~40대 성인 남·여 50명에게 하기 표 6의 조성으로 제조된 화장료 조성물을 얼굴 및 전박 내측에 도포하도록 한 후, 24시간 동안 코니오미터(corneometer; CM820 courage Khazaka electronic GmbH, Germany)를 이용하여 피부 수분량을 측정하였다. 코니오미터는 피부의 표피 내에 존재하는 수분의 양을 센서를 이용하여 수분의 이온 정도를 측정하고 이를 수치화하여 수분의 양을 계산함으로써 보습력을 측정하는 것이며, 측정방법은 하기와 같다.
1)측정하고자 하는 피부 부위에 코니오미터 프로브를 올려놓았다.
2)프로브를 피부에 누르면 센서를 통하여 피부의 전기 전도도(capacitance)를 수치화하여 화면에 표시되었다.
3)측정부위를 달리하여, 측정을 반복하였다.
4)한번 측정 후, 킴와이프 같은 휴지로 센서를 닦은 후, 다시 측정하였다.
본 발명의 와송 캘러스 배양 추출물을 포함하는 화장료 조성물
구성성분 중량 %(w/w)
비교제조예 1 제조예 1 제조예 2
세토스테아릴알코올 1.0 1.0 1.0
자기유화형모노스테아린산 1.0 1.0 1.0
밀납 0.5 0.5 0.5
스쿠알란 5.0 5.0 5.0
이소세틸옥타노에이트 3.0 3.0 3.0
디메틸실록산 0.3 0.3 0.3
모노스테아린산소르비탄 0.5 0.5 0.5
모노스테아린산폴리에틸렌글리콜 8.0 8.0 8.0
글리세린 4.0 4.0 4.0
프로필렌글리콜 0.2 0.2 0.2
카르복시폴리머 0.22 0.22 0.22
트리에탄올아민 0.25 0.25 0.25
방부제 0.1 0.1 0.1
향료 0.01 0.01 0.01
착색료 0.01 0.01 0.01
와송 추출물 - 2 -
와송 캘러스 배양 추출물 - - 2
정제수 to 100 to 100 to 100
상기 방법으로 미리 도포 시작 전 항온, 항습 조건(24℃, 습도 40%)에서 코니오미터를 이용하여 피부 수분량을 측정하여 기본 값으로 삼고, 12시간, 24시간 경과 후의 변화를 측정하였다. 그 결과는 하기 표 7에 나타내었다.
조성물별 피부 수분량 (%)
시료 피부 수분량(%)
도포 전 12시간 후 24시간 후
비교제조예 1 30.7 38.3 31.2
제조예 1 30.3 41.2 34.4
제조예 2 30.1 45.9 39.1
상기의 표 7의 결과에서, 비교제조예 1을 도포한 경우는 도포 후 12시간 경과 후에는 피부 수분량이 어느 정도 증가하였지만, 24시간 경과 후에는 도포 전의 상태로 되돌아감을 알 수 있었다. 반면에, 와송 추출물 및 와송 캘러스 배양 추추물을 2중량%로 함유하는 화장료 조성물인 제조예1 및 제조예2를 각각 피부에 도포할 경우, 그 보습력이 24시간 이상 지속되고 피부 수분 함량 증가 효과가 높음을 확인할 수 있었다. 또한, 와송 추출물(제조예 1) 대비 와송 캘러스 배양 추출물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물(제조예 2)의 수분 지속성이 더욱 뛰어난 것을 보여주었다.
< 실험예 6>
본 발명에 따른 와송 캘러스 배양 추출물의 모공수축 효과
본 발명의 조성물의 모공 수축 효과를 측정하기 위해 상기 실시예 1을 통해 제조된 와송 캘러스 배양 추출물을 대상으로 피부를 대신할 단백질로 헤모글로빈을 사용하여 모공수축효과를 시험하였다.
자세하게는, 0.9％ Phosphate Buffer Saline (0.1mM, pH 7.4)으로 헤모글로빈 용액(0.05g/50ml)을 제조하여 헤모글로빈 용액 2 ml에, 상기 실시예에서 획득한 조성물 2 ml을 가한 후, 30초 동안 진탕 혼합한 다음 3,500 rpm에서 10분 동안 원심분리하고, 그 상등액 1 ml에 정제수 2 ml을 가하여 407 nm에서 UV-Visible spectrum으로 측정하였다. 대조군으로 상기 실시예의 조성물 대신 PBS(Phosphate Buffer Saline) 2 ml을 가하였다. 다양한 농도의 조성물을 함유한 실험군의 경우에, 헤모글로빈의 침전량을 측정하여 수축효과를 평가하였고, 헤모글로빈의 침전(％)가 높을수록 모공수축효과가 우수한 것으로 판별하였다.
본 발명의 와송 캘러스 배양 추출물의 농도별 헤모글로빈의 침전량
시료 헤모글로빈의 침전 (% of control)
0.5 % 1.0 % 2 % 5 %
와송 추출물
(비교예 1)		 4.8 10.1 19.4 22.1
와송 캘러스 배양 추출물
(실시예 1)		 8.1 15.3 32.3 52.1
그 결과 상기 표 8에서 나타낸 바와 같이, 본 발명의 와송 캘러스 배양 추출물의 처리 농도에 의존적으로 헤모글로빈의 침전량이 증대되는 것을 확인할 수 있었으며, 특히 비교예로서 와송 추출물로 헤모글로빈의 침전량 증대가 더욱 뛰어난 것을 보여주었다. 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 와송 캘러스 배양 추출물의 모공수축효과가 우수하다고 판단하였다.
< 실험예 7>
본 발명에 따른 와송 캘러스 배양 추출물의 피지 억제효과
본 실험에서는 피시험자 10명의 4주 후에 피부 유분 측정기(Sebum meter SM810)를 이용하여 피부의 피지분비량을 측정하였다. 실험은 22±2℃, 40±5％ humidity에서 이루어졌다. 지성 피부인 경우 측정값이 220㎍/cm2이상이고, 정상 피부인 경우 100∼220 ㎍/cm2이다. 대조군으로 정제수를 사용하였다.
본 발명의 와송 캘러스 배양 추출물의 피지 억제효과
시료 피지 억제효과
0 일 (사용 전) 28 일 (사용 후)
대조군 230 225
1% 와송 추출물 231 175
1% 와송 캘러스 배양 추출물 230 179
그 결과 상기 표 9에서 나타낸 바와 같이, 본 발명의 와송 캘러스 배양 추출물을 처리한 실험군에서 시간 경과에 따른 피지 억제효과가 우수한 것을 확인할 수 있었다.
< 실험예 8>
본 발명에 따른 와송 캘러스 배양 추출물의 여드름 개선 효과
본 실험에서는 여드름이 발생한 남녀 10명으로 대상으로 화장수를 아침, 저녁으로 4주간 얼굴 전체에 실시예 1에서 제조한 와송 캘러스 배양 추출물 1% 농도로 고루 바르도록 하였다. 여드름 개선 효과의 판정은 실험에 참가한 본인이 느끼는 정도에 따라 하기 판정기준을 참고로 1-3점으로 시험 전 상태를 평가한 뒤 여드름 치유 효과를 평가하도록 하여 그 결과를 표에 나타내었다.
<시험전 상태의 평가>
1 = 여드름 조금 있음 2 = 여드름 약간 있음 3 = 여드름 심함
<여드름 효과 판정>
- : 효과 거의 없음, + : 약간의 효과 있음, ++ : 많이 완화, +++: 완전히 치유됨
여드름 개선 효과 판정
피험자 시험전 상태 2주 경과후 효과 4주 경과 후 효과
피험자1 2 + +
피험자2 1 + ++
피험자3 1 - +
피험자4 2 - -
피험자5 2 + ++
피험자6 2 + +
피험자7 3 ++ +++
피험자8 2 - ++
피험자9 3 + +
피험자10 2 + ++
그 결과 상기 표 10에서 나타낸 바와 같이, 1% 와송 캘러스 배양 추출물이 함유된 유연 화장수를 4주간 사용한 후 대다수 피험자들에서 여드름의 개선 효과를 확인할 수 있었다.
< 제조예 1>
본 발명의 기능성 화장료 조성물 제조
상기 실시예 1을 통해 제조된 본 발명의 와송 캘러스 배양 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장품으로 영양화장수, 크림, 에센스 등의 유화 제형의 화장품 및 유연화장수 등의 가용화 제형의 화장품을 제조하였다.
<1-1> 화장수( skin )
본 발명의 와송 캘러스 배양 추출물을 함유한 화장수를 아래의 성분비로 통상적인 방법으로 제조하였다.
본 발명의 유연화장수 제형예
성분 중량 %(w/w)
글리세린 5.0
디프로필렌글리콜 3.0
히아루론산 0.5
폴리옥시에틸렌 경화피마자유 0.1
폴리에틸렌 올레일에틸 0.1
에탄올 5.0
방부제 0.15
항료 0.01
착색료 0.01
와송 캘러스 배양 추출물 1.0
정제수 to 100
<1-2> 에센스
본 발명의 와송 캘러스 배양 추출물을 함유한 에센스를 아래의 성분비로 통상적인 방법으로 제조하였다.
본 발명의 에센스 제형예
성분 중량 %(w/w)
세토스테아릴알코올 1.0
자기유화형모노스테아린산 1.0
밀납 0.5
스쿠알란 5.0
이소세틸옥타노에이트 3.0
디메틸실록산 0.3
모노스테아린산소르비탄 0.5
모노스테아린산폴리에틸렌글리콜 8.0
글리세린 4.0
프로필렌글리콜 0.2
카르복시폴리머 0.22
트리에탄올아민 0.25
방부제 0.2
향료 0.01
착색료 0.01
와송 캘러스 배양 추출물 7.0
정제수 to 100
<1-3> 로션
본 발명의 와송 캘러스 배양 추출물을 함유한 로션을 아래의 성분비로 통상적인 방법으로 제조하였다.
본 발명의 로션 제형예
성분 중량 %(w/w)
세토스테아릴알코올 0.8
자기유화형모노스테아린산 1.0
밀납 0.5
스테아린산 0.5
유동파라핀 7.0
스쿠알란 5.0
마카데미아오일 3.0
이소세틸옥타노에이트 2.0
디메틸실록산 0.3
모노스테아린산소르비탄 0.5
모노스테아린산폴리에틸렌글리콜 1.2
글리세린 4.0
프로필렌글리콜 4.0
베타인 4.0
카르복시폴리머 0.12
트리에탄올아민 0.15
방부제 0.25
향료 0.01
착색료 0.01
와송 캘러스 배양 추출물 5.0
정제수 to 100
<1-4> 크림
본 발명의 와송 캘러스 배양 추출물을 함유한 로션을 아래의 성분비로 통상적인 방법으로 제조하였다.
본 발명의 크림 제형예
성분 중량 %(w/w)
세토스테아릴알코올 3.0
자기유화형모노스테아린산 1.5
친유형모노스테아린산 1.5
밀납 0.5
유동파라핀 8.0
스쿠알란 7.0
이소세틸옥타노에이트 4.0
정제호호바유 4.0
디메틸실록산 0.3
모노스테아린산소르비탄 1.0
모노스테아린산폴리에틸렌글리콜 1.2
글리세린 6.0
프로필렌글리콜 4.0
베타인 4.0
산탄검 0.06
트리에탄올아민 0.10
방부제 0.25
향료 0.01
착색료 0.01
와송 캘러스 배양 추출물 7.0
정제수 to 100
<1-5> 젤
본 발명의 와송 캘러스 배양 추출물을 함유한 젤을 아래의 성분비로 통상적인 방법으로 제조하였다.
본 발명의 젤 제형예
성분 중량 %(w/w)
글리세린 4.0
프로필렌글리콜 4.0
에탄올 10
폴리옥시에틸렌경화피마자유 0.1
카르복시폴리머 0.30
트리에탄올아민 0.30
방부제 0.2
향료 0.01
착색료 0.01
와송 캘러스 배양 추출물 1.0
정제수 to 100
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (15)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 와송 캘러스 배양 추출물을 유효성분으로 포함하는 주름개선 효과, 피부염 개선 효과, 피부노화 방지 효과, 피부 보습 효과, 모공수축 효과, 피지 억제 효과 및 여드름 개선 효과를 가지는 화장료 조성물.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 와송 캘러스 배양 추출물은 a) 와송 종자를 배지에 치상하여 20~27℃의 온도 및 65~75% 습도의 조건에서 암실 배양하여 발아를 유도하는 단계; b) 발아된 와송 잎을 절단하여 IAA(indole-3-acetic acid), 제아틴(Zeatin), 수크로오스(Sucrose) 및 겔라이트(Gelite)를 함유한 MS 기본배지에 접종한 후 23~27℃에서 배양하여 캘러스를 유도하는 단계; c) 배양된 와송 캘러스를 계대 배양을 통해 증식시키는 단계; d) 증식된 와송 캘러스 배양물을 수확하여 수분을 제거한 후 55~65℃의 온도 조건에서 건조하는 단계; 및 e) 건조된 와송 캘러스 배양물에 정제수를 가하여 열수추출하는 단계를 포함하는 과정을 통해 제조되는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
  10. 삭제
  11. 제8항에 있어서,
    상기 주름개선 효과는 콜라겐 생합성 증대 및 MMP-1의 생합성 억제를 통해 이루어지는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
  12. 제8항에 있어서,
    상기 피부염 개선 효과는 세포 내 산화질소(NO) 생성 억제를 통해 이루어지는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
  13. 제8항에 있어서,
    상기 피부노화 방지 효과는 항산화 활성 증대를 통해 이루어지는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
  14. 제8항에 있어서,
    상기 유효성분은 전체 조성물 중량 대비 0.001 내지 20%로 포함되는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
  15. 제8항 내지 제9항 및 제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 화장료 조성물은 유연 화장수, 젤, 수용성 리퀴드, 밀크로션, 영양크림, 마사지 크림, 에센스, 수중유 형 에멀젼, 유중수 형 에멀젼, 페이스크성 무수 생성물, 고체 무수 생성물, 소구체를 사용한 수성 상에서의 오일 분산물, 이온성 지질 소포체, 비이온성 지질 소포체, 연고, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 보디오일, 수중유 형 메이크업베이스, 유중수 형 메이크업베이스, 파운데이션, 스킨커버, 립스틱, 립그로스, 페이스파우더, 투웨이케익, 아이섀도우, 마스카라, 치크칼라 및 아이브로우펜슬류로 이루어진 군 중에서 선택되는 1종의 제형인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
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