CN103450296A - 一种快速从连翘叶中制备连翘苷的方法 - Google Patents

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杜杰
李飞鹤
栗亚云
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Abstract

本发明针对从连翘叶中制备连翘苷的现有技术中存在的连翘苷易分解、步骤繁琐、耗时长等问题，提供了一种快速从连翘叶中制备连翘苷的方法。该方法步骤包括：取连翘叶粉末，先用无水乙醇回馏提取2-3次，滤液浓缩至糊状，再用蒸馏水溶解过滤，所得滤液浓缩、冷藏、过滤得沉淀，沉淀用乙醇溶液溶解，加入石油醚萃取，下层溶液经浓缩、干燥、重结晶2-4次即可。用HPLC测其纯度，纯度达98%以上。本方法可大大减少杂质，给后续纯化工作带来极大便利；使用石油醚萃取，排除了叶绿素干扰，大大提高了连翘苷的纯度；分离时不使用柱层析，从而耗时大大减少，可为生产节省大量人力和时间。

Description

一种快速从连翘叶中制备连翘苷的方法
技术领域
本发明涉及从连翘叶中提取连翘苷的方法，具体是一种快速从连翘叶中制备连翘苷的方法。
背景技术
连翘（Forsythia suspensa(Thunb.)Vahl）为木犀科连翘属植物，是临床常用传统中药之一。《中国药典2010》第一部第159页描述：连翘具有清热解毒，消肿散结，疏散风热。用于痈疽，瘰疬，乳痈，丹毒，风热感冒，温病初起，温热入营，高热烦渴，神昏发斑，热淋涩痛等作用。现代药理研究表明：连翘具有抗菌（李仲兴等.天津中医药.2007，24（4）：328–331；刘世旺等.安徽农业科学.2007,35（24）:7383–7384+7387；牛新华等.时珍国医国药.2002，13（6）：342–343）、抗炎（J.Y.Hu,et al.Pharmacol.Clin.Chin.Mater.Med.2007.23:51–52；S.J.Dai,et al.Planta Medica，2009，75:375–377）、抗病毒、抗氧化、抗内毒素、抑制弹性蛋白酶活力、抑制磷酸二酯酶、强心利尿、解热、抗肝损伤及治疗肝炎等作用（T.Lu,et al.Food Chem.Toxicol.2010，48:764–770；X.L.Piao,et al.Phytother.Res.2009，23:938–942；Y.Z.Wang,et al.Chin.Chem.Lett.2008，19:1234-1236；T.Iizuka,et al.J.Pharm.Soc.Jpn.2005,125:219–224；杨建雄等.营养学报.2004，26(1)：65-67）。
连翘化学成分较多，据目前报道，主要含有木脂素类、萜类、挥发油类、黄酮类、香豆精、苯乙醇及其甙类等（郭素华.中国药学杂志.2003，38(4)：295-297）。其中：连翘苷是其最主要的质量控制指标，连翘药材中连翘苷含量不少于0.15％（《中国药典2010》第一部第159页）。连翘苷为木脂素苷类化合物，其化学式为C27H34O11，分子量为534，熔点为18l℃，难溶于水，易溶于乙醇、甲醇等有机溶剂(姚新生主编，天然药物化学，第三版，北京，人民卫生出版社，2003)。
大量的研究结果证明，连翘叶中的化学成分与连翘果实中的化学成分有非常好的一致性(丁冈等.中药材.1994，17(10):42-44)，而且连翘叶中有许多化学成分的含量远远高于连翘果实，如：连翘叶中连翘苷约占5％，连翘果实中连翘苷约占0.2％，含量差别超过20倍(杨建雄等.营养学报.2004，26(1)：65—67)。由于连翘叶中有许多化学成分的含量远远高于连翘果实，所以，连翘叶虽不能入药，但在制备单体化合物如连翘苷等方面具有较大的优势，同时也大大节省了连翘果实在制备单体化合物中的浪费现象，充分利用了秋季连翘叶落叶的价值。
目前关于从连翘叶中提取连翘苷的方法有多种，主要有：水煎法、渗漉法、水煮-醇沉提取法等。这些方法具有耗时长、耗能大、产率低、生产成本高等缺陷。
中国专利（申请号200610027331.X）“一种连翘提取物的制备方法”，该发明不足之处一是水提杂质较多，后续纯化困难，二是只得到了浸膏，未进一步说明分离提纯过程。
中国专利（申请号200810176773.X），“从连翘叶中提取连翘苷的新方法”，该发明不足在于乙醇溶液提取连翘苷，会使杂质含量大大增多，对后续分离纯化连翘苷带来较大困难，同时加入表面活性剂，也增加了连翘苷的纯化步骤。
中国专利（申请号201010235729.9）,“一种从连翘叶中提取连翘苷的方法”，缺陷在于使用碱性溶液，使得连翘苷容易分解，同时进行大孔树脂、氧化铝柱层析，耗时大大增加。
中国专利（申请号201110058486.0），“用连翘叶制备连翘苷提取物的方法”，不足之处在于用85%乙醇提取，杂质会大大提高，给后续纯化带来较大困难，同时需离心，不利于大量生产，还有就是具体产率不明确，未进一步说明纯化过程。
王娅丽等（王娅丽等.西北药学杂志，2006，21（1）：9-10），该方法不足之处是得到仅是粗提物，且由于用乙醇浓度85％提取，杂质较多，虽初始得率为5.781％，但最终纯化后会较低。
胡光等(胡光等.黑龙江医药.2005，18（2）：41-42)，该方法不足之处同样在于80％乙醇提取，杂质较多，给后续纯化工作带来较大困难，且最终纯化后反而得率降低。
于春波等（于春波等.黑龙江医药.2004，17(2)：104-106），该方法不足之处在于70％乙醇提取，杂质较多，给后续纯化工作带来较大困难，同时需要大孔树脂层析，耗时较长。
张杲2006年硕士学位论文，“连翘(Forsythia suspense)叶药用价值及其药用活性组分的初步研究”，是用无水乙醇提取，但未能去除叶绿素。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的耗时长、方法繁琐、纯度低等问题，提供一种方法简单、纯度高、快速从连翘叶中制备连翘苷的方法。
本发明提供的一种快速从连翘叶中制备连翘苷的方法，包括步骤：
1）取连翘叶，粉碎，过10-20目筛，得粉末；
2）称连翘叶粉末，加无水乙醇回馏提取，料液比1∶5-20，提取2-4次，三层纱布过滤，得滤液；
3）滤液浓缩至糊状，加入5-10倍体积的蒸馏水，滤纸减压抽滤，得滤液；
4）将步骤3）所得滤液浓缩为原体积60%-20%，4℃冷藏2-12小时，滤纸减压抽滤，得沉淀；
5）沉淀加乙醇溶液溶解，加入石油醚，石油醚与乙醇体积比为0.5-2∶1，混匀，静置萃取2-12小时，得上、下两层溶液；
6）将下层溶液浓缩，真空冷冻干燥，得粗提物；
7）将粗提物中加入4-10倍体积的无水乙醇，溶解，4℃冷藏2－12小时，减压抽滤，得晶体，真空冷冻干燥，重结晶2-4次即可。用HPLC测其纯度，纯度达98%以上。
所述步骤2）中加无水乙醇回馏提取，料液比1∶8-15，提取2-3次。
所述步骤5）中石油醚与乙醇体积比为0.5-1.5∶1。
我们通过连翘叶－无水乙醇提取－石油醚萃取－重结晶、连翘叶－无水乙醇提取－大孔树脂柱层析－重结晶、连翘叶－85%乙醇提取－石油醚萃取－重结晶以及连翘叶－85%乙醇提取－大孔树脂柱层析－重结晶四种方法进行连翘苷的制备和比较，结果表明：连翘叶－无水乙醇提取－石油醚萃取－重结晶所得连翘苷含量和纯度最高，效果最好。分析其原因：一是无水乙醇回流提取可大大减少杂质，给后续纯化工作带来极大便利，虽提取时连翘苷提取率较低，但由于纯度较高，经后续纯化后连翘苷最终含量和纯度反而比乙醇水溶液提取得到的要高。二是用石油醚萃取，排除了叶绿素干扰，大大提高了连翘苷的纯度。三是分离时并未使用柱层析，从而耗时大大减少，为科研与企业生产节省了大量人力和时间。
附图说明
图1：连翘叶无水乙醇粗提物的HPLC图
图2：连翘叶无水乙醇提取物石油醚萃取后的上层溶液紫外可见光扫描图
图3：连翘叶无水乙醇提取物石油醚萃取后的下层溶液紫外可见光扫描图
图4：连翘叶无水乙醇粗提物石油醚萃取后的下层溶液第3次结晶后HPLC图
具体实施方式
实施例1
1）取连翘叶，粉碎，过10-20目筛，得粉末；
2）称连翘叶粉末200g，加入2000mL无水乙醇回馏提取，提取2次，三层纱布过滤，得滤液；
3）滤液浓缩至糊状。部分糊状物干燥，HPLC检测如图1所示。其余糊状物加入8倍体积的蒸馏水，滤纸减压抽滤，得滤液；
4）将步骤3）所得滤液浓缩为原体积40%，4℃冷藏8小时，滤纸减压抽滤，得沉淀；
5）沉淀加乙醇溶液溶解，加入石油醚，石油醚与乙醇体积比为1：1，混匀，静置萃取8小时，得上、下两层溶液；图2为萃取溶液上层吸光度曲线，说明石油醚已把叶绿素A和叶绿素B萃取干净；图3为萃取溶液下层吸光度曲线，波长200nm到800nm之间，说明下层乙醇溶液中已没有叶绿素A和叶绿素B杂质。
6）将下层溶液浓缩，真空冷冻干燥，得粗提物；
7）将粗提物中加入8倍体积的无水乙醇，溶解，4℃冷藏8小时，减压抽滤，得晶体，真空冷冻干燥，得到连翘苷重结晶粗品2.88g，纯度为66.93%；再重结晶2次，得连翘苷1.94g，纯度98.7%，如图4所示。
实施例2
步骤2）中，无水乙醇回馏提取3次，其它同实施例1。得连翘苷2.01g，用HPLC测其纯度，纯度达98.4%。
实施例3
步骤5）中，加入石油醚进行萃取，石油醚与乙醇体积比为0.5：1，其它同实施例1。得连翘苷1.97g，用HPLC测其纯度，纯度达98.2%。
实施例4
步骤7）中，重结晶共2次，其它步骤同实施例1。得连翘苷1.98g，纯度达96.8%。

Claims (3)

1.一种快速从连翘叶中制备连翘苷的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）取连翘叶，粉碎，过10-20目筛，得粉末；
2）称连翘叶粉末，加无水乙醇回馏提取，料液比1∶5-20，提取2-4次，三层纱布过滤，得滤液；
3）滤液浓缩至糊状，加入5-10倍体积的蒸馏水，滤纸减压抽滤，得滤液；
4）将步骤3）所得滤液浓缩为原体积60%-20%，4℃冷藏2-12小时，滤纸减压抽滤，得沉淀；
5）沉淀加乙醇溶液溶解，加入石油醚，石油醚与乙醇体积比为0.5-2∶1，混匀，静置萃取2-12小时，得上、下两层溶液；
6）将下层溶液浓缩，真空冷冻干燥，得粗提物；
7）将粗提物中加入4-10倍体积的无水乙醇，溶解，4℃冷藏2－12小时，减压抽滤，得晶体，真空冷冻干燥，重结晶2-4次即可。用HPLC测其纯度，纯度达98%以上。
2.如权利要求1所述的一种快速从连翘叶中制备连翘苷的方法，其特征在于，所述步骤2）中加无水乙醇回馏提取，料液比1∶8-15，提取2-3次。
3.如权利要求1所述的一种快速从连翘叶中制备连翘苷的方法，其特征在于，所述步骤5）中石油醚与乙醇体积比为0.5-1.5∶1。
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