CN107880084B

CN107880084B - 从凌霄属植物花中提取制备高纯度毛蕊花糖苷的方法

Info

Publication number: CN107880084B
Application number: CN201711065456.6A
Authority: CN
Inventors: 杨阳; 朱斌; 周忠海; 焦留宏; 赵勇
Original assignee: Hospital Of 71st Group Army Of Pla
Current assignee: Hospital Of 71st Group Army Of Pla
Priority date: 2017-11-02
Filing date: 2017-11-02
Publication date: 2021-07-09
Anticipated expiration: 2037-11-02
Also published as: CN107880084A

Abstract

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种从凌霄属植物花中提取制备高纯度毛蕊花糖苷的方法。提取制备过程包括“乙酸乙酯提取除去杂质、乙醇水溶液提取制备毛蕊花糖苷流浸膏、过大孔吸附树脂柱色谱制备毛蕊花糖苷粗提物、过反相硅胶柱色谱制备高纯度毛蕊花糖苷”的两步提取和两步过柱，最终得到纯度大于98%毛蕊花糖苷粉末。本发明充分利用凌霄属植物药材资源提取制备毛蕊花糖苷，拓展来源、药源丰富；首次采用两步提取和两步过柱法，优化并改进了毛蕊花糖苷的提取制备方法，操作简便、成本低廉；操作中仅使用乙醇、乙酸乙酯二种有机试剂，不采用甲醇、丙酮等毒性试剂，无毒无害、绿色环保；毛蕊花糖苷的得率和纯度均较高，易于推广、值得推荐。

Description

从凌霄属植物花中提取制备高纯度毛蕊花糖苷的方法

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种从凌霄属植物花中提取制备高纯度毛蕊花糖苷的方法。

背景技术

毛蕊花糖苷(毛蕊花苷，verbascoside)，又名麦角甾苷(acteoside)、阿克替苷，属苯丙素苷类(phenylpropanoid glycosides)化合物，是一类含有取代苯乙基和肉桂酰基的天然糖苷，其分子式C₂₉H₃₆O₁₅，分子量624.59，为白色针晶粉末，易溶于乙醇、甲醇、醋酸乙酯，化学结构式如下：

现代药理研究表明，毛蕊花糖苷具有神经保护、抗肿瘤及抗肿瘤转移、肝脏保护、抗凋亡、抗炎症、抗病毒、DNA氧化损伤修复、抑制前列腺增生、强抗氧化等多种活性，而抗氧化活性为其核心作用[杨金润，曾勇，贺震旦，等.天然植物中阿克苷抗氧化作用研究进展.医学综述，2011，17(18)：2721-2723.孙卫东，陈飞，孙云.阿克替苷对大鼠试验性前列腺增生模型的抑制作用.扬州大学学报(农业与生命科学版)，2008，29(3)：55-58.]。

随着国内外毛蕊花糖苷等苯丙素苷类化合物药学研究的逐渐深入，其药用价值日益得到重视，市场上毛蕊花糖苷及其相关产品广泛应用、供不应求。目前，毛蕊花糖苷主要来源还是对天然植物的分离［何良波，孙凤娟，姜丽娜，等．4种单糖苯丙素苷类化合物的体外抗氧化作用及抑菌活性的研究．时珍国医国药，2011，22(3)：615-616．］。由于毛蕊花糖苷为肉苁蓉属植物的主要活性成分，近年来的专利研究主要集中于从肉苁蓉属植物中提取分离毛蕊花糖苷［刘昕，季青，招淑燕，等．一种萃取富含松果菊苷及毛蕊花糖苷活性物质的方法．中国专利：CN200710032803.5．2008-06-11．刘昕，贾宝国，田晓玲，等．一种采用固定化酶生产毛蕊花糖苷的方法．中国专利：CN200910041643.X．2010-01-20．刘昕，贾宝国，田晓玲，等．一种利用新鲜肉苁蓉生产毛蕊花糖苷的方法．中国专利：CN200910041646.3．2010-01-20．招淑燕，刘昕，彭青云，等．一种生产毛蕊花糖苷单体化合物的方法．中国专利：CN200910041647.8．2010-02-24．］。也有从马先蒿、密蒙花、车前子、红花钓钟柳、阿拉伯婆婆纳等其它植物中提取分离毛蕊花糖苷的报道［贾忠建，郑荣梁．一种毛蕊花甙的提取方法．中国专利：CN99123015.9．2001-04-18．陈新，聂晗．一种天然麦角甾苷的分离纯化方法．中国专利：CN201010183281.0．2010-09-22．苏刘花．一种制备毛蕊花苷的工艺．中国专利：CN201010130275.9．2010-10-20．谢峻，白林山，周安娜．一种从红花钓钟柳中分离制备毛蕊花糖苷的方法．中国专利：CN201110300550.1．2012-02-15．李法庆，刘东锋．一种阿克替苷的分离制备方法．中国专利：CN201110210055.1．2012-03-28．］。然而，仅从这几种植物中提取制备毛蕊花糖苷很难满足实际需要，因此，急需拓展和开发毛蕊花糖苷提取制备的新资源和新方法。

凌霄属（Campsis）隶属于紫葳科（Bignoniaceae）硬骨凌霄族（Tecomeae），含两种植物，凌霄［Campsis grandiflora (Thunb.) K. Schum.］产自我国和日本，美洲凌霄［C. radicans (L.) Seem.］原产北美洲，我国引进栽培；该属植物花大而美丽，常作为庭院观赏和绿化植物在我国广泛载培［中国科学院中国植物志编辑委员会．中国植物志，第69卷．北京：科学出版社，1990：32-34．］。凌霄属植物的干燥花可作为中药凌霄花（Flos Campsis）入药，性味甘、酸、寒，归肝、心包经，有凉血，化瘀，祛风之功效，主要用于月经不调，经闭症瘕，产后乳肿，风疹发红，皮肤瘙痒，痤疮等［国家药典委员会．中华人民共和国药典．2015年版，一部．北京：中国医药科技出版社，2015：287-287．］。其主要化学成分为甾醇、五环三萜、酚酸、黄酮及花色素、环烯醚萜及苷、苯丙素苷、以及挥发油等，具有抑制人酰基辅酶A-胆固醇酰基转移酶-1活性，抑制未孕子宫收缩、增强孕子宫收缩，抗氧化、抗炎及镇痛止痒作用，改善血液循环、降低血流量、抑制血栓等多种药理活性［杨阳，绳慧峰，张慰．凌霄花的化学成分及药理作用综述．中国药师，2008，11(12)：1521-1522．杨阳，汪念，张慰，等．凌霄花及其复方制剂的临床应用．中国实用医药，2010，5(1)：132-133．］。

毛蕊花糖苷为凌霄花中主要的苯丙素苷类化合物［张桥，沈娟，柳于介，等．高效液相色谱法测定中药凌霄花中麦角甾苷、齐墩果酸和熊果酸含量．中国中药杂志，2011，36(8)：1043-1045．］，目前，由凌霄花中提取制备毛蕊花糖苷的方法，均存在着操作工艺繁琐复杂、大量消耗有机溶剂、毛蕊花糖苷收率较低、纯度不高、推广应用价值不大等诸多问题。因此，需要进一步加以研究及改进。

发明内容

为了克服上述现有技术的不足之处，本发明提供一种从凌霄属植物花中提取制备高纯度毛蕊花糖苷的方法。

本发明是通过如下技术方案实现的：一种从凌霄属植物花中提取制备高纯度毛蕊花糖苷的方法，包括如下步骤：

1）乙酸乙酯提取除去杂质：将凌霄属植物干燥花药材先用乙酸乙酯5倍体积浸泡，20倍体积渗漉或5倍体积加热回流提取1～3次，滤过，弃去乙酸乙酯提取液，药材残渣留用制备毛蕊花糖苷流浸膏；

2）乙醇水溶液提取制备毛蕊花糖苷流浸膏：将步骤1）所述的乙酸乙酯提取后的药材残渣用60%乙醇水溶液5倍体积浸泡，20倍体积渗漉或5倍体积加热回流提取1～3次后，滤过，提取液减压浓缩制得毛蕊花糖苷流浸膏，得率为40.0%～50.0%；

3）过柱制备毛蕊花糖苷粗提物：将步骤2）所述的毛蕊花糖苷流浸膏加2～3倍体积的纯水完全溶解后，进行大孔吸附树脂柱色谱，先用纯水20倍柱体积洗脱除去杂质，再用低浓度乙醇水溶液20倍柱体积洗脱，洗脱液减压浓缩蒸干后得橙黄色毛蕊花糖苷粗提物，得率为2.5%～3.0%；

4）过柱制备高纯度毛蕊花糖苷：将步骤3）所述的毛蕊花糖苷粗提物再进行反相硅胶柱色谱，采用低浓度乙醇水溶液进行洗脱，除去色素和其它杂质成分，收集富含毛蕊花糖苷的洗脱液，减压浓缩蒸干后得浅黄色纯度大于98%毛蕊花糖苷粉末，得率为1.2‰～1.5‰；

上述步骤1）至步骤4）所述的提取液或洗脱液在减压浓缩时，温度均不超过65℃。

进一步地，步骤1）所述的凌霄属植物干燥花药材为凌霄属植物凌霄或美洲凌霄的干燥花药材。

进一步地，步骤3）使用的大孔吸附树脂用量为上柱样品的8～10倍质量，使用的低浓度乙醇水溶液为30%乙醇水溶液。

进一步地，步骤4）使用的反相硅胶用量为上柱样品的80～100倍质量，使用的低浓度乙醇水溶液为20%乙醇水溶液。

采用上述技术方案制得的毛蕊花糖苷粉末，经高效液相色谱法（HPLC）进行纯度检测，测得其毛蕊花糖苷纯度均大于98%。进行质谱（MS）、核磁共振谱（¹H-NMR、¹³C-NMR）分析，根据所得的数据进行结构鉴定，确定该粉末为毛蕊花糖苷。

本发明的有益效果是：（1）充分利用紫葳科凌霄属植物凌霄和美洲凌霄的药材资源提取制备毛蕊花糖苷，拓展来源，药源丰富。

（2）首次采用两步提取和两步过柱法，优化并改进了高纯度毛蕊花糖苷的提取制备方法，操作简便、成本低廉。

（3）操作中仅使用乙醇、乙酸乙酯二种有机试剂，不采用甲醇、丙酮等毒性试剂，无毒无害、绿色环保。

（4）毛蕊花糖苷的得率和纯度均较高，易于推广、值得推荐。

附图说明

图1为本发明提取制备的高纯度毛蕊花糖苷的高效液相色谱图（HPLC）；

图2为本发明提取制备的高纯度毛蕊花糖苷的质谱图（MS）；

图3为本发明提取制备的高纯度毛蕊花糖苷的核磁共振氢谱图（¹H-NMR）；

图4为本发明提取制备的高纯度毛蕊花糖苷的核磁共振碳谱图（¹³C-NMR）。

具体实施方式

下面根据附图和实施例对本发明进一步说明。本实施例在以本发明技术方案的为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体操作过程，但本发明的保护范围不限于以下实施例。

实施例1：从凌霄花中提取制备高纯度的毛蕊花糖苷

凌霄干燥花药材500g，切段，先用乙酸乙酯5倍体积浸泡24h，20倍体积渗漉提取，提取液于65℃下减压浓缩至无酯味，得流浸膏18g，得率为3.6%，留用制备高纯度熊果酸。将提取后的药材残渣用60%乙醇水溶液5倍体积浸泡24h，20倍体积渗漉提取，提取液于65℃下减压浓缩至无醇味，得毛蕊花糖苷流浸膏210g，得率为42%。

将上述制得的毛蕊花糖苷流浸膏加3倍体积的纯水完全溶解后，进行大孔吸附树脂柱色谱，树脂用量2000g；先用纯水20倍柱体积洗脱，除去色素和其它杂质成分，再用30%乙醇水溶液20倍柱体积洗脱，洗脱液减压于65℃下浓缩蒸干后得橙黄色毛蕊花糖苷粗提物12.9g，得率为2.58%。

将上述制得的毛蕊花糖苷粗提物再进行反相硅胶柱色谱，反相硅胶用量1200g；采用20%乙醇水溶液进行洗脱，色素和其它杂质成分先被洗脱除去，收集含毛蕊花糖苷的洗脱液，减压浓缩蒸干后得浅黄色高纯度毛蕊花糖苷粉末6.4g，得率为1.28‰。

纯度检测：使用Agilent 1100高效液相色谱仪对该毛蕊花糖苷粉末进行纯度检测（峰面积归一化法），色谱分析条件为：色谱柱，迪马公司diamonsil C18柱（5μ，250mm×4.6mm）；流动相，乙腈-0.5%磷酸水溶液（17:83）；检测波长，332nm；柱温，35℃；流速，1.0ml/min。测得毛蕊花糖苷纯度为99.4%。高效液相色谱图见图1，图中，峰A为毛蕊花糖苷。

结构鉴定：使用Varian Mat-212质谱仪和Bruker-speckospin AC-600P核磁共振仪对该粉末进行结构鉴定。

ESI-MS：m/z 647.2[M+Na]⁺，623.2[M-H]^－。质谱图见图2。

¹H-NMR（600MHz，CD₃OD，δ ppm）：7.58（1H，d，J=24.0Hz，H-7′），7.05（1H，d，J=3.0Hz，H-2′），6.95（1H，dd，J=2.4，12.0Hz，H-6′），6.77（1H，d，J=12.0Hz，H-5′），6.69（1H，d，J=2.4Hz，H-2），6.67（1H，d，J=12.0Hz，H-5），6.56（1H，dd，J=3.0，12.0Hz，H-6），6.27（1H，d，J=24.0Hz，H-8′），5.18（1H，d，J=1.2Hz，H-1″′），4.60（1H，m，H-4″），4.37（1H，d，J=12.0Hz，H-1″），4.04（1H，q，J=12.0Hz，H-8），3.91（1H，m，H-5″），3.81（1H，m，H-2″′），3.71（1H，q，J=12.0Hz，H-8），3.60（1H，m，H-4″′），3.58（1H，m，H-5″′），3.55（1H，m，H-3″′），3.53（1H，m，H-2″），3.50（1H，m，H-3″），3.38（2H，m，H-6″），2.79（2H，t，J=9.6Hz，H-7），1.08（3H，d，J=9.0Hz，H-6″′）。核磁共振氢谱图见图3。

¹³C-NMR（150MHz，CD₃OD，δppm）：167.9（C-9′），149.4（C-4′），147.6（C-7′），146.4（C-3′），145.7（C-3），144.3（C-4），131.0（C-1），127.2（C-1′），122.8（C-6′），120.9（C-6），116.7（C-2），116.1（C-5），115.9（C-2′），114.8（C-8′），114.3（C-5′），103.8（C-1″），102.6（C-1″′），81.3（C-3″），75.8（C-5″），75.6（C-5″′），73.4（C-2″′），71.9（C-4″′），71.9（C-2″），71.6（C-8），70.2（C-3″′），70.0（C-4″），61.9（C-6″），36.1（C-7），18.0（C-6″′）。核磁共振碳谱图见图4。

综合以上MS、¹H-NMR、¹³C-NMR数据与文献［郑秀萍，石建功．短筒兔耳草化学成分的研究．中草药，2004，35(5)：503-504．］对照一致，确定为毛蕊花糖苷。

实施例2：从美洲凌霄花中提取制备高纯度的毛蕊花糖苷

美洲凌霄干燥花药材500g，切段，先用乙酸乙酯5倍体积浸泡24h，5倍体积加热回流提取3次，每次1h，提取液于65℃下减压浓缩至无酯味，得流浸膏21g，得率为4.2%，留用制备高纯度熊果酸。将提取后的药材残渣用60%乙醇水溶液5倍体积浸泡24h，加热回流提取3次，每次1h，提取液于65℃下减压浓缩至无醇味，得毛蕊花糖苷流浸膏240g，得率为48%。

将上述制得的毛蕊花糖苷流浸膏加3倍体积的纯水完全溶解后，进行大孔吸附树脂柱色谱，树脂用量2000g；先用纯水20倍柱体积洗脱除去杂质，再用30%乙醇水溶液20倍柱体积洗脱，洗脱液减压于65℃下浓缩蒸干后得浅黄色毛蕊花糖苷粗提物14.2g，得率为2.84%。

将上述制得的毛蕊花糖苷粗提物再进行反相硅胶柱色谱，反相硅胶用量1200g；采用20%乙醇水溶液进行洗脱，色素和其它杂质成分先被洗脱除去，收集含毛蕊花糖苷的洗脱液，减压浓缩蒸干后得白色高纯度毛蕊花糖苷粉末7.1g，得率为1.42‰。

纯度检测：采用实施例1中的高效液相色谱法对该粉末进行纯度检测（峰面积归一化法），测得毛蕊花糖苷纯度为98.5%。

理化鉴别和结构鉴定：方法、步骤及其结果同实施例1。

Claims

1.一种从凌霄属植物花中提取制备高纯度毛蕊花糖苷的方法，包括如下步骤：

2）乙醇水溶液提取制备毛蕊花糖苷流浸膏：将步骤1）乙酸乙酯提取后的药材残渣用60%乙醇水溶液5倍体积浸泡，20倍体积渗漉或5倍体积加热回流提取1～3次后，滤过，提取液减压浓缩制得毛蕊花糖苷流浸膏；

3）过柱制备毛蕊花糖苷粗提物：将步骤2）所述的毛蕊花糖苷流浸膏加2～3倍体积的纯水完全溶解后，进行大孔吸附树脂柱色谱，先用纯水20倍柱体积洗脱除去杂质，再用低浓度乙醇水溶液20倍柱体积洗脱，洗脱液减压浓缩蒸干后得橙黄色毛蕊花糖苷粗提物；其中，使用的大孔吸附树脂用量为上柱样品的8～10倍质量，使用的低浓度乙醇水溶液为30%乙醇水溶液；

4）过柱制备高纯度毛蕊花糖苷：将步骤3）所述的毛蕊花糖苷粗提物再进行反相硅胶柱色谱，采用低浓度乙醇水溶液进行洗脱，除去色素和其它杂质成分，收集富含毛蕊花糖苷的洗脱液，减压浓缩蒸干后得浅黄色纯度大于98%毛蕊花糖苷粉末；其中，使用的反相硅胶用量为上柱样品的80～100倍质量，使用的低浓度乙醇水溶液为20%乙醇水溶液；

2.根据权利要求1所述的从凌霄属植物花中提取制备高纯度毛蕊花糖苷的方法，其特征在于：步骤1）所述的凌霄属植物干燥花药材为凌霄属植物凌霄或美洲凌霄的干燥花药材。