CN111205302B - 一种大果木姜子果实提取物、提取方法及制备方法和应用 - Google Patents

一种大果木姜子果实提取物、提取方法及制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种大果木姜子果实提取物、提取方法及制备方法和应用，本发明对大果木姜子果实进行了系统深入的化学成分研究，从中分离得3个倍半萜类成分,均为倍半萜类新骨架化合物，并明确了提取物的提取方法、制备方法及在抗炎及抗菌活性方面的应用。本发明首次公开了大果木姜子果实提取物，大果木姜子倍半萜A，B，C；并提供了它们的提取分离方法和新骨架结构确证的过程，完善了樟科木姜子属大果木姜子植物化学成分研究，提供的倍半萜类化合物具有新颖骨架结构，丰富了倍半萜类化合物的多样性。

Description

一种大果木姜子果实提取物、提取方法及制备方法和应用
技术领域
本发明涉及天然药物发明领域，具体涉及一种大果木姜子果实提取物、提取方法及制备方法和应用。
背景技术
苗药大果木姜子是樟科(Lauraceae)樟属(Cinnamomum)植物米槁(Cinnamomummigao H.W.Li)的果实。樟科(Lauraceae)樟属植物约有200种，分布于亚洲热带和亚热带及美洲。为落叶或常绿乔木或灌木。我国约有72种18变种和3变型，是我国樟科中种类较多、分布较广的属之一，自广东海南岛北纬18°，至长江以北的河南省北纬34°均有分布，但主产南方和西南温暖地区，为该地区森林中习见的树木。(中国科学院中国植物志编辑委员会，中国植物志[M]，北京：科学出版社，1979)。国内外学者先后从该科植物中分离得到黄酮、生物碱、萜类、木质素类等结构类型的化合物(Agrawal N,Choudhary A.S,Sharma M.C,DobhalM.P.Chemical constituents of plants from the genus litsea.Chemistry&Biodiversity 2011；8:223-243)。本属植物的主要用途是提取芳香油(工业上的重要原料)和作为中草药。萜类是本属植物的特征性成分，也是活性成分之一。具有抗菌消炎、治疗心血管疾病、抗病毒、驱虫杀虫、免疫抑制、抗HIV等多种作用。其中倍半萜还因为其结构简单，并且具有多种母核结构类型，可作为研发药物的先导化合物。植物大果木姜子(Litsealancilimba Merr.)是樟科，樟属常绿乔木，分布于云南、贵州和广西等省。《中药大辞典》记载:“性温、味辛、无毒，功能散寒祛湿、行气止痛，治吐泻、胃寒腹痛、脚气、肿毒”。民间常用于治疗胸腹痛、胸闷腹胀、哮喘等。
目前，国内外尚无大果木姜子果实化学成分及其药理活性的文献报道，也未见与本发明中的大果木姜子果实提取物制备方法、用途有关的报道。
为了克服上述技术问题，本发明人对大果木姜子果实进行了系统深入的化学成分研究，从中分离得3个倍半萜类成分,均为倍半萜类新骨架化合物，并明确了提取物的提取方法、制备方法及在抗炎及抗菌活性方面的应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种大果木姜子果实提取物。
本发明另一个目的是提供一种大果木姜子果实提取方法。
本发明另一个目的是提供一种大果木姜子果实制备方法。
本发明另一个目的是提供一种大果木姜子果实在抗炎及抗菌活性方面的应用。
本发明所述的一种大果木姜子果实提取物为大果木姜子倍半萜A、B、C，它们的结构式和绝对构型分别如下：
1)大果木姜子倍半萜A：
Figure GDA0002813497950000021
2)大果木姜子倍半萜B：
Figure GDA0002813497950000022
3)大果木姜子倍半萜C：
Figure GDA0002813497950000023
本发明所述的一种大果木姜子果实提取物的提取方法包括以下步骤：
1)将大果木姜子果实干燥，粉碎，以5～15倍量95％乙醇在20～30℃下浸泡提取2～5次，每次12～24小时，合并得提取液，减压浓缩；
2)减压浓缩提取液至无醇味，得水混悬流浸膏，加2～6倍水稀释，依次用2～6倍的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇分别萃取2～4次，减压回收溶剂，分别得到石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位；
3)将上述乙酸乙酯部位上100-200目正相硅胶柱色谱，依次用石油醚：乙酸乙酯进行梯度洗脱，具体比例以体积比为：100％石油醚,100:1,50:1,20:1,10:1,5:1及100％乙酸乙酯，洗脱液经薄层色谱检测，分别收集含有大果木姜子倍半萜A，B，C的流分；
4)再经200-300目硅胶柱色谱，以体积比为10:1的石油醚:乙酸乙酯洗脱细分之后，得大果木姜子倍半萜A，B，C洗脱流分。
优选的，本发明所述的一种大果木姜子果实提取物的提取方法包括以下步骤：
1)将大果木姜子果实干燥，粉碎，以8～12倍量95％乙醇23～27℃浸泡提取3～4次，每次12～24小时，合并得提取液，减压浓缩；
2)减压浓缩提取液至无醇味，得水混悬流浸膏，加2～6倍水稀释，依次用2～6倍的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇分别萃取2～4次，减压回收溶剂，分别得到石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位；
3)将上述乙酸乙酯部位上100-200目正相硅胶柱色谱，依次用石油醚：乙酸乙酯进行梯度洗脱，具体比例以体积比为：100％石油醚,100:1,50:1,20:1,10:1,5:1及100％乙酸乙酯，洗脱液经薄层色谱检测，分别收集含有大果木姜子倍半萜A，B，C的流分；
4)再经200-300目硅胶柱色谱，以体积比为10:1的石油醚:乙酸乙酯洗脱细分之后，得大果木姜子倍半萜A，B，C洗脱流分。
进一步优选的，本发明所述的一种大果木姜子果实提取物的提取方法包括以下步骤：1)将大果木姜子果实干燥，粉碎，以10倍量95％乙醇25℃浸泡提取3～4次，每次12～24小时，合并得提取液，减压浓缩；
2)减压浓缩提取液至无醇味，得水混悬流浸膏，加3～5倍水稀释，依次用3～5倍的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇分别萃取3次，减压回收溶剂，分别得到石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位；
3)将上述乙酸乙酯部位上100-200目正相硅胶柱色谱，依次用石油醚：乙酸乙酯进行梯度洗脱，具体比例以体积比为：100％石油醚,100:1,50:1,20:1,10:1,5:1及100％乙酸乙酯，洗脱液经薄层色谱检测，分别收集含有大果木姜子倍半萜A，B，C的流分；
4)再经200-300目硅胶柱色谱，以体积比为10:1的石油醚:乙酸乙酯洗脱细分之后，得大果木姜子倍半萜A，B，C洗脱流分。
本发明所述的一种大果木姜子果实提取物的制备方法为：将权利要求2-4任一项所述提取方法中的步骤4)所得的大果木姜子倍半萜B，C洗脱流分经高效液相色谱制备，分别以55～70％甲醇5～15L洗脱大果木姜子倍半萜B，C流分，得到化合物大果木姜子倍半萜B、C；将大果木姜子倍半萜A洗脱流分经硅胶薄层色谱制备，在温度为20～30℃，以比例为10:1的石油醚：乙酸乙酯为展开剂，展开，用5％香草醛浓硫酸为显色剂，在温度200～300℃下加热20～40s，刮板制备得到单体化合物大果木姜子倍半萜A。
优选的，本发明所述的一种大果木姜子果实提取物的制备方法为：将权利要求2-4任一项所述提取方法中的步骤4)所得的大果木姜子倍半萜B，C洗脱流分经高效液相色谱制备，分别以60～65％甲醇8～12L洗脱大果木姜子倍半萜B，C流分，得到化合物大果木姜子倍半萜B、C；将大果木姜子倍半萜A洗脱流分经硅胶薄层色谱制备，在温度为23～27℃，以比例为10:1的石油醚：乙酸乙酯为展开剂，展开，用5％香草醛浓硫酸为显色剂，在温度200～300℃下加热20～40s，刮板制备得到单体化合物大果木姜子倍半萜A。
进一步优选的，本发明所述的一种大果木姜子果实提取物的制备方法为：将权利要求2-4任一项所述提取方法中的步骤4)所得的大果木姜子倍半萜B，C洗脱流分经高效液相色谱制备，分别以60～65％甲醇10L洗脱大果木姜子倍半萜B，C流分，得到化合物大果木姜子倍半萜B、C；将大果木姜子倍半萜A洗脱流分经硅胶薄层色谱制备，在温度为25℃，以比例为10:1的石油醚：乙酸乙酯为展开剂，展开，用5％香草醛浓硫酸为显色剂，在温度200～300℃下加热30s，刮板制备得到单体化合物大果木姜子倍半萜A。
本发明所述的一种大果木姜子果实不同极性萃取部位在抗炎活性方面的应用，具体为：大果木姜子果实总提取物、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、水萃取部位在抑制LPS诱导RAW264.7巨噬细胞的NO生成活性方面的应用；所述大果木姜子倍半萜A、B、C在对抗二甲苯致炎的活性方面的应用及在对抗弗氏完全佐剂性关节炎的活性方面的应用。
进一步的，本发明所述大果木姜子倍半萜A、B、C在抗炎制剂中的应用。
本发明所述制剂为加入药学上可接受的辅料制备成药学上可接受的制剂，所述制剂为颗粒剂、胶囊剂、散剂、片剂、丸剂、注射制剂、冻干粉针剂。
本发明所述的药学上可接受的辅料没有限定，可以是填充剂、崩解剂、抗氧化剂、粘合剂、润滑剂、表面活性剂或矫味剂等本领域常用辅料中的一种或几种。
现有技术的问题及本发明具有以下有益效果：
一、现有技术的问题
目前，国内外尚无大果木姜子果实化学成分及其药理活性的文献报道，也未见与本发明中的大果木姜子果实提取物制备方法、用途有关的报道。
二、本发明的有益效果
1、本发明首次公开了大果木姜子果实提取物，大果木姜子倍半萜A，B，C；并提供了它们的提取分离方法和新骨架结构确证的过程，完善了樟科木姜子属大果木姜子植物化学成分研究，提供的倍半萜类化合物具有新颖骨架结构，丰富了倍半萜类化合物的多样性。
2、本发明人对大果木姜子果实进行了系统深入的化学成分研究，从中分离得3个倍半萜类成分,均为倍半萜类新骨架化合物，并明确了提取物的提取方法、制备方法及在抗炎及抗菌活性方面的应用。
3、本发明通过实验结果表明大果木姜子果实总提取物(ZT)、石油醚(PE)、乙酸乙酯(EA)、正丁醇(Bu-OH)、水萃取(H2O)部位对LPS诱导RAW264.7巨噬细胞的NO生成有一定的抑制活性，说明其具有一定抗炎活性。
4、实验结果表明大果木姜子倍半萜A、B、C对LPS诱导RAW264.7巨噬细胞的NO生成有明显的抑制活性，说明其具有抗炎活性。
5、通过实验可知，阳性药(阿司匹林)，大果木姜子总提物，石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和大果木姜子倍半萜A、B、C的低、高剂量组，对二甲苯引起的耳肿胀有明显的抑制作用(P<0.05)，其中，以石油醚部位、乙酸乙酯部位及大果木姜子倍半萜A、B、C高剂量组效果最明显。该实验表明大果木姜子倍半萜A、B、C具有明显的抗炎活性。
6、通过实验可知，阳性药(吲哚美辛)，大果木姜子总提物、石油醚和乙酸乙酯部位的高剂量组，以及大果木姜子倍半萜A、B、C低、高剂量组均能明显抑制大鼠的足肿胀度，显示大果木姜子总提物、石油醚和乙酸乙酯部位及大果木姜子倍半萜A、B、C均具有一定的抗炎活性。
附图说明
图1大果木姜子倍半萜A的1H-NMR图谱。
图2大果木姜子倍半萜A的13C-NMR和DEPT图谱。
图3大果木姜子倍半萜A的1H-1H COSY图谱。
图4大果木姜子倍半萜A的HSQC图谱。
图5大果木姜子倍半萜A的HMBC图谱。
图6大果木姜子倍半萜A的NOESY图谱。
图7大果木姜子倍半萜A的HR-ESI-MS高分辨质谱图谱。
图8大果木姜子倍半萜A的X单晶射线衍射结构。
图9大果木姜子倍半萜B的1H-NMR图谱。
图10大果木姜子倍半萜B的13C-NMR和DEPT图谱。
图11大果木姜子倍半萜B的1H-1H COSY图谱。
图12大果木姜子倍半萜B的HSQC图谱。
图13大果木姜子倍半萜B的HMBC图谱。
图14大果木姜子倍半萜B的NOESY图谱。
图15大果木姜子倍半萜B的HR-ESI-MS高分辨质谱图谱。
图16大果木姜子倍半萜B的圆二色谱(CD)。
图17大果木姜子倍半萜B的计算圆二色谱(ECD)。
图18大果木姜子倍半萜C的1H-NMR图谱。
图19大果木姜子倍半萜C的13C-NMR和DEPT图谱。
图20大果木姜子倍半萜C的1H-1H COSY图谱。
图21大果木姜子倍半萜C的HSQC图谱。
图22大果木姜子倍半萜C的HMBC图谱。
图23大果木姜子倍半萜C的NOESY图谱。
图24大果木姜子倍半萜C的HR-ESI-MS高分辨质谱图谱。
图25大果木姜子倍半萜C的圆二色谱(CD)。
图26大果木姜子倍半萜C的计算圆二色谱(ECD)。
图27大果木姜子果实总提取物(ZT)、石油醚(PE)、乙酸乙酯(EA)、正丁醇(Bu-OH)、水萃取(H2O)部位抑制LPS诱导RAW264.7的NO生成活性
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1大果木姜子倍半萜A、B、C，它们的结构式和绝对构型分别如下：
1)大果木姜子倍半萜A：
Figure GDA0002813497950000051
2)大果木姜子倍半萜B：
Figure GDA0002813497950000052
3)大果木姜子倍半萜C：
Figure GDA0002813497950000061
实施例2大果木姜子倍半萜A、B、C的提取方法
1)将大果木姜子果实干燥，粉碎，以5倍量95％乙醇在20℃下浸泡提取2次，每次24小时，合并得提取液，减压浓缩；
2)减压浓缩提取液至无醇味，得水混悬流浸膏，加2～6倍水稀释，依次用2～6倍的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇分别萃取2次，减压回收溶剂，分别得到石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位；
3)将上述乙酸乙酯部位上100-200目正相硅胶柱色谱，依次用石油醚：乙酸乙酯进行梯度洗脱，具体比例以体积比为：100％石油醚,100:1,50:1,20:1,10:1,5:1及100％乙酸乙酯，洗脱液经薄层色谱检测，分别收集含有大果木姜子倍半萜A，B，C的流分；
4)再经200-300目硅胶柱色谱，以体积比为10:1的石油醚:乙酸乙酯洗脱细分之后，得大果木姜子倍半萜A，B，C洗脱流分。
实施例3大果木姜子倍半萜A、B、C的提取方法
1)将大果木姜子果实干燥，粉碎，以15倍量95％乙醇在30℃下浸泡提取5次，每次12小时，合并得提取液，减压浓缩；
2)减压浓缩提取液至无醇味，得水混悬流浸膏，加2～6倍水稀释，依次用2～6倍的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇分别萃取4次，减压回收溶剂，分别得到石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位；
3)将上述乙酸乙酯部位上100-200目正相硅胶柱色谱，依次用石油醚：乙酸乙酯进行梯度洗脱，具体比例以体积比为：100％石油醚,100:1,50:1,20:1,10:1,5:1及100％乙酸乙酯，洗脱液经薄层色谱检测，分别收集含有大果木姜子倍半萜A，B，C的流分；
4)再经200-300目硅胶柱色谱，以体积比为10:1的石油醚:乙酸乙酯洗脱细分之后，得大果木姜子倍半萜A，B，C洗脱流分。
实施例4大果木姜子倍半萜A、B、C的提取方法
1)将大果木姜子果实干燥，粉碎，以8倍量95％乙醇23℃浸泡提取3次，每次12小时，合并得提取液，减压浓缩；
2)减压浓缩提取液至无醇味，得水混悬流浸膏，加2～6倍水稀释，依次用2～6倍的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇分别萃取2次，减压回收溶剂，分别得到石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位；
3)将上述乙酸乙酯部位上100-200目正相硅胶柱色谱，依次用石油醚：乙酸乙酯进行梯度洗脱，具体比例以体积比为：100％石油醚,100:1,50:1,20:1,10:1,5:1及100％乙酸乙酯，洗脱液经薄层色谱检测，分别收集含有大果木姜子倍半萜A，B，C的流分；
4)再经200-300目硅胶柱色谱，以体积比为10:1的石油醚:乙酸乙酯洗脱细分之后，得大果木姜子倍半萜A，B，C洗脱流分。
实施例5大果木姜子倍半萜A、B、C的提取方法
1)将大果木姜子果实干燥，粉碎，以12倍量95％乙醇27℃浸泡提取4次，每次24小时，合并得提取液，减压浓缩；
2)减压浓缩提取液至无醇味，得水混悬流浸膏，加2～6倍水稀释，依次用2～6倍的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇分别萃取4次，减压回收溶剂，分别得到石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位；
3)将上述乙酸乙酯部位上100-200目正相硅胶柱色谱，依次用石油醚：乙酸乙酯进行梯度洗脱，具体比例以体积比为：100％石油醚,100:1,50:1,20:1,10:1,5:1及100％乙酸乙酯，洗脱液经薄层色谱检测，分别收集含有大果木姜子倍半萜A，B，C的流分；
4)再经200-300目硅胶柱色谱，以体积比为10:1的石油醚:乙酸乙酯洗脱细分之后，得大果木姜子倍半萜A，B，C洗脱流分。
实施例6大果木姜子倍半萜A、B、C的提取方法
1)将大果木姜子果实干燥，粉碎，以10倍量95％乙醇25℃浸泡提取3次，每次12小时，合并得提取液，减压浓缩；
2)减压浓缩提取液至无醇味，得水混悬流浸膏，加3～5倍水稀释，依次用3～5倍的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇分别萃取3次，减压回收溶剂，分别得到石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位；
3)将上述乙酸乙酯部位上100-200目正相硅胶柱色谱，依次用石油醚：乙酸乙酯进行梯度洗脱，具体比例以体积比为：100％石油醚,100:1,50:1,20:1,10:1,5:1及100％乙酸乙酯，洗脱液经薄层色谱检测，分别收集含有大果木姜子倍半萜A，B，C的流分；
4)再经200-300目硅胶柱色谱，以体积比为10:1的石油醚:乙酸乙酯洗脱细分之后，得大果木姜子倍半萜A，B，C洗脱流分。
实施例7大果木姜子倍半萜A、B、C的提取方法
1)将大果木姜子果实干燥，粉碎，以10倍量95％乙醇25℃浸泡提取4次，每次24小时，合并得提取液，减压浓缩；
2)减压浓缩提取液至无醇味，得水混悬流浸膏，加3～5倍水稀释，依次用3～5倍的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇分别萃取3次，减压回收溶剂，分别得到石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位；
3)将上述乙酸乙酯部位上100-200目正相硅胶柱色谱，依次用石油醚：乙酸乙酯进行梯度洗脱，具体比例以体积比为：100％石油醚,100:1,50:1,20:1,10:1,5:1及100％乙酸乙酯，洗脱液经薄层色谱检测，分别收集含有大果木姜子倍半萜A，B，C的流分；
4)再经200-300目硅胶柱色谱，以体积比为10:1的石油醚:乙酸乙酯洗脱细分之后，得大果木姜子倍半萜A，B，C洗脱流分。
实施例8大果木姜子倍半萜A、B、C的制备方法
将实施例2-7任一项提取方法中步骤4)所得的大果木姜子倍半萜B，C洗脱流分经高效液相色谱制备，分别以55％甲醇5L洗脱大果木姜子倍半萜B，C流分，得到化合物大果木姜子倍半萜B、C；将大果木姜子倍半萜A洗脱流分经硅胶薄层色谱制备，在温度为20℃，以比例为10:1的石油醚：乙酸乙酯为展开剂，展开，用5％香草醛浓硫酸为显色剂，在温度200～300℃下加热20s，刮板制备得到单体化合物大果木姜子倍半萜A。
实施例9大果木姜子倍半萜A、B、C的制备方法
将实施例2-7任一项提取方法中步骤4)所得的大果木姜子倍半萜B，C洗脱流分经高效液相色谱制备，分别以70％甲醇15L洗脱大果木姜子倍半萜B，C流分，得到化合物大果木姜子倍半萜B、C；将大果木姜子倍半萜A洗脱流分经硅胶薄层色谱制备，在温度为30℃，以比例为10:1的石油醚：乙酸乙酯为展开剂，展开，用5％香草醛浓硫酸为显色剂，在温度200～300℃下加热40s，刮板制备得到单体化合物大果木姜子倍半萜A。
实施例10大果木姜子倍半萜A、B、C的制备方法
将实施例2-7任一项所述提取方法中步骤4)所得的大果木姜子倍半萜B，C洗脱流分经高效液相色谱制备，分别以60％甲醇8L洗脱大果木姜子倍半萜B，C流分，得到化合物大果木姜子倍半萜B、C；将大果木姜子倍半萜A洗脱流分经硅胶薄层色谱制备，在温度为23℃，以比例为10:1的石油醚：乙酸乙酯为展开剂，展开，用5％香草醛浓硫酸为显色剂，在温度200～300℃下加热20s，刮板制备得到单体化合物大果木姜子倍半萜A。
实施例11大果木姜子倍半萜A、B、C的制备方法
将实施例2-7任一项所述提取方法中步骤4)所得的大果木姜子倍半萜B，C洗脱流分经高效液相色谱制备，分别以65％甲醇8～12L洗脱大果木姜子倍半萜B，C流分，得到化合物大果木姜子倍半萜B、C；将大果木姜子倍半萜A洗脱流分经硅胶薄层色谱制备，在温度为27℃，以比例为10:1的石油醚：乙酸乙酯为展开剂，展开，用5％香草醛浓硫酸为显色剂，在温度200～300℃下加热40s，刮板制备得到单体化合物大果木姜子倍半萜A。
实施例12大果木姜子倍半萜A、B、C的制备方法
将实施例2-7任一项所述提取方法中的步骤4)所得的大果木姜子倍半萜B，C洗脱流分经高效液相色谱制备，分别以60～65％甲醇10L洗脱大果木姜子倍半萜B，C流分，得到化合物大果木姜子倍半萜B、C；将大果木姜子倍半萜A洗脱流分经硅胶薄层色谱制备，在温度为25℃，以比例为10:1的石油醚：乙酸乙酯为展开剂，展开，用5％香草醛浓硫酸为显色剂，在温度200～300℃下加热30s，刮板制备得到单体化合物大果木姜子倍半萜A。
实施例13大果木姜子倍半萜A，B，C提取及制备方法
大果木姜子果实(30.0kg)干燥粉碎后，室温25℃下用95％乙醇(30L)冷浸提取4次(24,12,12,12h),回收溶剂，浓缩得大果木姜子果实浓缩液约(5000g)；总浓缩液浸膏混悬于10L水中依次用10L石油醚、乙酸乙酯、正丁醇分别萃取3次，减压回收溶剂，分别得到石油醚部位(3800g)、乙酸乙酯部位(600g)和正丁醇部位(400g)。
将大果木姜子的乙酸乙酯部位600g上正相硅胶柱(100-200目)，依次用石油醚-乙酸乙酯(100％石油醚,100:1,50:1,20:1,10:1,5:1及100％乙酸乙酯)梯度洗脱，洗脱液经薄层色谱检测，合并相似组成的洗脱液，减压回收溶剂得8个洗脱部分。
接下来继续细分，取其中第2个洗脱部分，用石油醚和乙酸乙酯溶解之后，加入约浸膏1.5倍质量的硅胶(200-300目)拌样。上硅胶柱色谱从石油醚-乙酸乙酯(10:1)开始洗脱，使用薄层色谱(TLC)实时监测，逐渐加大洗脱剂的极性，至石油醚-乙酸乙酯(2：1)的时候，检测发现化合物基本全部流出，停止过柱。经薄层色谱检测合并相似组成的洗脱液，减压回收溶剂得5个洗脱流分。
接下来是制备过程，第2个洗脱流分(300mg)用石油醚混合乙酸乙酯溶解，室温25℃下，用毛细管吸取少量样品溶液，进行薄层层析(TLC)分析，展开剂为石油醚：乙酸乙酯＝10：1，展开剂用量约为15ml，待展开剂在展缸里面饱和之后，将硅胶板放入展缸中展开，展板结束之后，喷洒5％香草醛浓硫酸，然后使用加热枪在温度为200-300℃下加热约30s使其显色，我们可以观察到在Rf值约为0.6的位置处有一亮黄色主斑点，且其上下无其他斑点干扰。根据以上薄层层析分析结果，我们确定了使用制备薄层色谱硅胶板(PTLC)的条件为：室温25-30℃，展开剂为石油醚：乙酸乙酯＝10：1，5％香草醛浓硫酸为显色剂，然后在温度200-300℃下加热30s，从而可以刮板制备得到单体化合物大果木姜子倍半萜A(10.0mg)。
第3个洗脱流分(200mg)使用色谱纯甲醇溶解，另取极少量溶解，稀释至约10mg/ml，使用高效液相色谱(HPLC)进样检测，方法为10％-100％MEOH-20min，可以观察到在19min有一较大的吸收峰(检测波长为210nm)，后经过制备高效液相色谱方法，以60％甲醇(10L)洗脱，得到化合物大果木姜子倍半萜B(30.0mg)。
第5个流分(2.6g)进一步上硅胶H柱色谱，以石油醚-乙酸乙酯(5:1)等度洗脱，控制洗脱液的流速，洗脱液经薄层色谱检测，合并相似组成的3个洗脱液，回收溶剂得3个洗脱流分，再将其中的第2个流分(200mg)使用色谱纯甲醇溶解，另外取极少量溶解，稀释至约10mg/ml，使用高效液相色谱(HPLC)进样检测，方法为10％-100％MEOH-20min，可以观察到在20min有一较大的吸收峰(检测波长为210nm)，上制备色谱柱，以65％甲醇(10L)洗脱，得到大果木姜子倍半萜C(50.0mg)。
大果木姜子倍半萜A、B、C的1H-NMR和13C-NMR数据分别见表1和表2。
表1大果木姜子倍半萜A、B、C的1H-NMR数据(CDCl3,500MHz)
Figure GDA0002813497950000091
Figure GDA0002813497950000101
化合物原子编号见化合物结构式图；核磁化学位移单位为ppm；括号内为偶合常数值，单位为Hz。
表2大果木姜子倍半萜A、B、C的13C-NMR数据(CDCl3,125MHz)
Figure GDA0002813497950000102
Figure GDA0002813497950000111
化合物原子编号见化合物结构式图；核磁化学位移单位为ppm。
大果木姜子倍半萜A：白色针状结晶，溶于二氯甲烷，先由ESI-MS:m/z 253[M+H]+，推测分子量为252，结合1H-NMR(见图1)，13C-NMR和DEPT谱(见图2)确定分子式为C15H24O3，再由HR-ESI-MS高分辨质谱(见图7)给出分子离子峰m/z 253.1801[M+H]+(calcd.for253.1804)确认，不饱和度为Ω＝4。
在一维和二维核磁谱图：从1H-NMR谱(见图1)和HSQC(见图4)中，5组亚甲基质子信号[δH 2.46(1H,dd,J＝13.3,6.3Hz),1.96(1H,d,J＝13.4Hz)]，[δH 1.90(1H,m),1.60(1H,m)]，[δH 1.82(1H,m),1.60(1H,m)]，[δH 1.72(1H,m),1.64(1H,m)]，[δH 1.46(1H,dd,J＝15.3,7.2Hz),1.24(1H,m)]；2组次甲基质子信号[δH 2.39(1H,m)]，[δH 2.03(1H,t,J＝7.6Hz)]；4组甲基信号[δH 1.64(3H,s)],[δH 1.32(3H,s)],[δH 1.28(3H,s)],[δH 0.99(3H,d,J＝7.0Hz)]；
13C-NMR和DEPT(见图2)显示该化合物，有4个连氧季碳信号[δC 113.7,109.4,92.9,81.8]，其中两个连氧季碳信号较高，推测可能同时连接了两个氧原子。2个次甲基信号[δC 43.4,29.8]，5个亚甲基信号[δC 36.1,31.3,28.7,25.1,21.9]，4个甲基碳信号[δC30.3,24.8,19.3,16.5]。
通过二维谱图，链接碎片片段，推出结构。由于化合物中存在较多的亚甲基和次甲基，我们首先通过1H-1H COSY图谱(见图3)可以观察到，H-2/H-1，H-1/H-7，H-7/H-6，H-6/H-5，H-5/H-13之间有H-H COSY信号；同时在HMBC图谱(见图5)中，我们观察到甲基(H-13)对季碳(C-4)和亚甲基(C-6)有响应信号，亚甲基(H-2)对季碳(C-4)和季碳(C-3)也有响应信号，因此我们可以推断出存在一个七元环状结构，-C(1)H-C(2)H2-C(3)-C(4)-C(5)H-C(6)H2-C(7)H2-C(1)H-片段首尾相连。在该环状结构中C(1)、C(3)、C(4)、C(5)位置有取代基取代，其中我们已经确定C(5)位是甲基取代。在HMBC图谱(见图5)中，我们还观察到，C(1)位置上质子(H-1)对于季碳(C-8)和两个甲基碳(C-14)和(C-15)有相应信号，所以我们判定C(1)位上的侧链是-OC(8)(CH3)2。由于该化合物不饱和度为Ω＝4，且没有双键和苯环。所以该化合物中存在四个环状结构。仍有三个环状结构待确证。接下来在1H-1H COSY图谱(见图3)中还可以观察到，H-9/H-10之间有1H-1H COSY信号；在HMBC图谱(见图5)中，我们观察到次甲基(H-5)对亚甲基(C-9)有响应信号，甲基(H-12)对于亚甲基(H-10)和季碳(C-11)有响应信号，所以我们推测C(4)位置上存在一条侧链为-C(9)H2-C(10)H2-C(11)-C(12)H3。至此为止我们已经确定了所有的碳信号，根据分子量和分子的不饱和度推断，还有三个环状结构，和三个氧原子的位置待定。由于杂原子隔断了1H-1H COSY信号和HMBC信号。所以给判断结构带来了难度，我们根据C(3)的化学位移值断定，C(3)位应该与两个氧原子相连。同理C(11)位也应该与两个氧原子相连。所以我们推测C(8)与C(3)共用一个氧原子，从而形成一个五元环。C(3)位与C(11)位共用一个氧原子，从而形成一个六元环。C(4)和C(11)共用一个氧原子，形成两个五元环。这一系列的信号确定该化合物的平面结构。
由于手性位置较多，在NOESY图谱(见图6)较难确定该化合物的相对构型。辛运的是，我们成功使用溶剂丙酮培养出了该化合物的结晶(见图8)。后通过Cu-KαX-单晶衍射分析法确定化合物的绝对构型为1R,3S,4S,5R,11R，此化合物为新化合物，并且是一个骨架新颖的倍半萜化合物，命名为大果木姜子倍半萜A。
大果木姜子倍半萜B：淡黄色油状，溶于二氯甲烷，先由ESI-MS:m/z 291[M+Na]+，推测分子量为268，结合1H-NMR(见图9)，13C-NMR和DEPT谱(见图10)确定分子式为C15H24O4，再由HR-ESI-MS高分辨质谱(见图15)给出分子离子峰m/z 291.1558[M+Na]+(calcd.for298.1572)确认，不饱和度为Ω＝4。
在一维和二维核磁谱图：从1H-NMR谱(见图9)和HSQC(见图12)中观察得到在低场区没有相关信号，在高场区存在2组次甲基质子信号[δH 2.60(1H,m)]，[δH 2.51(1H,m)]；5组亚甲基信号[δH 2.53(2H,m)]，[δH 2.51(1H,m),1.97(1H,m)]，[δH2.36(1H,m),2.19(1H,m)]，[δH 2.04(1H,m),1.75(1H,m)]，[δH 1.67(1H,m),1.29(1H,m)]；4组甲基信号[δH 2.15(3H,s)]，[δH 1.61(3H,s)]，[δH 1.26(3H,s)]，[δH 1.09(3H,d,J＝7.1Hz)]。
13C-NMR和DEPT(见图10)显示该化合物，有3个羰基信号，其中包括2个酮羰基[δC214.4,208.0]，1个酯羰基[δC 171.7]，1个连氧季碳信号[δC 85.1]，2个次甲基信号[δC46.5,46.0]，5个亚甲基信号[δC 42.0,39.5,33.5,29.7,24.0]，4个甲基碳信号[δC 30.1,26.1,20.8,17.7]。
通过核磁二维谱图，连接碎片片段，推出化合物结构。首先，我们可以观察到的3个羰基信号，根据羰基碳的化学位移值，我们可以判断该化合物有两个酮羰基，一个酯羰基。由于化合物中存在较多的亚甲基，我们首先通过1H-1H COSY图谱(见图11)可以观察到，H-2/H-8，H-8/H-9，H-9/H-10之间有1H-1H COSY信号；同时在HMBC图谱(见图13)中，我们观察到甲基(H-14)对羰基(C-11)和亚甲基(C-10)有响应信号，因此我们可以推断出存在-C(2)H-C(8)H2-C(9)H2-C(10)H2-C(11)O-C(14)H3结构片段。除此之外，在1H-1H COSY图谱(见图11)可以观察到，H-15/H-4，H-4/H-5，H-5/H-6之间有1H-1H COSY信号；同时在HMBC图谱(见图13)中，我们观察到亚甲基(H-6)对酯羰基(C-1)有响应信号，甲基(H-15)对羰基(C-3)有响应信号，因此我们可以推断出存在-C(3)O-C(4)H(C(13)H3)-C(5)H2-C(6)H2-C(7)O-O-结构片段。以上两个大的结构片段通过重要的HMBC信号，亚甲基(H-8)对于羰基碳(C-3)有明显的相关信号从而连接起来。接下来我们发现剩余的两个甲基质子信号(H-12)和(H-13)对于连氧季碳(C-1)有相关HMBC信号，且两个甲基质子峰形均为单峰，我们可以确定，这两个甲基与季碳(C-1)相连；同时，质子信号(H-12)和(H-13)对于次甲基(C-2)也有相关HMBC信号，因此我们可以确定季碳(C-1)与次甲基(C-2)相连。最后，我们根据(C-1)的化学位移判定(C-1)与酯羰基中的氧原子相连。这一系列的信号确定了该化合物的平面结构，该化合物是一个少见的柔性八元内酯倍半萜结构，鉴定为是一个新骨架化合物。
在NOESY谱(见图14)中观察到H-4与H-2没有相关信号，说明这两个取代基位于异侧。从而确定了该化合物的相对构型有两种，我们测定了该化合物的CD数据(见图16)，并且通过ECD(见图17)的手段确定了该化合物的绝对构为2R,4S。此化合物为新骨架化合物，命名为大果木姜子倍半萜B。
大果木姜子倍半萜C：淡黄色油状，溶于二氯甲烷，先由ESI-MS:m/z 259[M+Na]+，推测分子量为236，结合1H-NMR(见图18)，13C-NMR和DEPT谱(见图19)确定分子式为C15H24O2，再由HR-ESI-MS高分辨质谱(见图24)给出分子离子峰m/z 259.1670[M+Na]+(calcd.for260.1674)确认，不饱和度为Ω＝4。
在一维和二维核磁谱图：从1H-NMR谱(见图18)和HSQC(见图21)中观察得到在低场区没有相关信号，在高场区存在3组次甲基质子信号[δH 2.83(1H,m)]，[δH 2.25(1H,m)]，[δH 1.74(1H,m)]；4组亚甲基信号[δH 2.68(1H,m),2.49(1H,dd,J＝15.0,12.2Hz)]，[δH2.55(1H,m),2.35(1H,m)]，[δH 1.81(1H,m),1.45(1H,m)]，[δH 1.62(1H,m),1.43(1H,m)]；4组甲基信号[δH 1.74(3H,d,J＝15.0,1.3Hz)]，[δH 1.21(3H,s)]，[δH 1.19(3H,s)]，[δH0.96(3H,d,J＝7.0Hz)]。
13C-NMR和DEPT(见图19)显示该化合物，有1个羰基信号[δC 204.9]，2个双键季碳信号[δC 162.8,130.5]，1个连氧季碳信号[δC 73.3]，4个亚甲基信号[δC 43.3,32.8,31.5,26.7]，3个次甲基信号[δC 44.6,43.2,38.5]，4个甲基碳信号[δC 27.7,26.5,14.5,14.4]。
通过核磁二维谱图，连接碎片片段，推出化合物结构。首先，我们可以观察到的1个羰基信号，和两个与羰基相连的双键信号，说明该化合物中存在一个α-β不饱和羰基的结构。通过HMBC(见图22)可以观察到与吸电子基团相连的亚甲基(C-3)的质子(H2-3)对羰基(C-2),双键碳(C-1)和(C-5)，以及次甲基碳(C-4)有响应信号，说明该结构中存在一个五元α-β不饱和羰基环状结构；甲基质子(H-12)和(H-13)对次甲基(C-4)，季碳(C-11)有响应信号，说明甲基(C-12)和甲基(C-13)连接在连氧季碳(C-11)上，且连氧季碳(C-11)与次甲基(C-4)相连。五元环的基本结构确定。通过1H-1H COSY图谱(见图20)，H-6/H-7，H-7/H-8，H-8/H-9，H-9/H-10之间有1H-1H COSY信号，因此可以推断出存在-C(6)H2-C(7)H2-C(8)H-C(9)H-C(10)H2-结构片段；同时还可以观察到，H-8/H-14，H-9/H-15之间有1H-1H COSY信号，因此可以推断出次甲基C(8)与甲基C(14)相连，次甲基C(9)与甲基C(15)相连；同时在HMBC中(见图22)观察到，次甲基质子(H-4)对亚甲基(C-6)有响应信号，亚甲基质子(H-10)对羰基碳(C-2)有响应信号，因此可以推断出亚甲基(C-6)与双键碳(C-5)相连，而亚甲基(C-10)与双键碳(C-1)相连，从而形成一个七元环状结构。至此为止，我们推断出了两个环状结构并把他们连接了起来，这一系列的信号确定了该化合物的平面结构。
在NOESY谱(见图23)中观察到H-8与H-9有相关信号，定义为α朝向，另外H-9与H-12和H-13有相关信号，与H-4没有相关信号，故H-4定义为β朝向。从而确定了该化合物的相对构型有两种，测定了该化合物的CD数据(见图25)，之后通过ECD(见图26)的数据，我们确定了化合物的绝对构型为4S,8R,19R.此化合物为新化合物，命名为大果木姜子倍半萜C。
综上所述，可以确定实施例1制备得到的大果木姜子倍半萜A,B,C化合物结构式为：
Figure GDA0002813497950000141
实施例14
取大果木姜子倍半萜A或B或C作为原料药，加入1/8的淀粉，制粒，得颗粒剂。
实施例15取大果木姜子倍半萜A或B或C作为原料药，加入1/10的淀粉，混匀，装入胶囊，得胶囊剂。
实施例16取大果木姜子倍半萜A或B或C作为原料药，加入及1/10的糊精混合均匀，干燥，制成丸剂。
实施例17取大果木姜子倍半萜A或B或C作为原料药，加入1/8的淀粉，制粒，压片，制成片剂。
实施例18取大果木姜子倍半萜A或B或C作为原料药，加入10倍量的注射用水，浸泡3-5小时，过滤，灭菌，得注射剂。
实施例19取大果木姜子倍半萜A或B或C作为原料药，加入6倍量的注射用水，浸泡3-5小时，过滤，冻干，得冻干粉剂。
实施例20大果木姜子果实总提取物、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、水萃取部位抑制LPS诱导RAW264.7的NO生成活性
(1)样品配置
实施例1制得的大果木姜子果实总提取物、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、水萃取部位及阳性对照药小白菊内酯用DMSO(二甲亚砜)(Merck)溶解后，加入PBS(磷酸盐缓冲液)配成10mM的溶液，进一步稀释为不同梯度浓度的样品。以10μg/mL的LPS(Lipopolysaccharides,脂多糖，Sigma,Cat.L-2880)为诱导剂。
(2)实验方法
小鼠巨噬细胞RAW264.7(购于上海生科院细胞资源中心)在37℃,5％CO2培养箱中常规培养于DMEM培养液中。实验时将1μL/mL LPS(脂多糖)(溶于蒸馏水中)加入100mL浓度为2×106μg/mL的细胞悬液中，18h后以Griess法通过测定细胞上清液中亚硝酸盐的含量间接反映NO生成量：取100mL细胞培养液，加入等量Griess(格里斯)试剂，测定吸光值。
(3)评价标准及统计方法
于570nm波长处测吸收度，以NaNO2标准溶液绘制标准曲线，计算亚硝酸盐的浓度。各组实验结果以SPSS软件ONE WAY ANNOVA方法(美国芝加哥SPSS公司)进行统计分析。
(4)实验结果
实验结果表明大果木姜子果实总提取物(ZT)、石油醚(PE)、乙酸乙酯(EA)、正丁醇(Bu-OH)、水萃取(H2O)部位对LPS诱导RAW264.7巨噬细胞的NO生成有一定的抑制活性(结果见表3)，说明其具有一定抗炎活性。
大果木姜子果实总提取物(ZT)、石油醚(PE)、乙酸乙酯(EA)、正丁醇(Bu-OH)、水萃取(H2O)部位抑制LPS诱导RAW264.7的NO生成活性。见图27。
实施例21大果木姜子倍半萜A、B、C抑制LPS诱导RAW264.7的NO生成活性
(1)样品配置
实施例1制得的大果木姜子倍半萜A、B、C，及阳性对照药氨基胍(Sigma-Aldrich,纯度>98.0％))用DMSO(二甲亚砜)(Merck)溶解后，加入PBS(磷酸盐缓冲液)配成10mM的溶液，进一步稀释为0,0.1,0.5,5,20μM梯度浓度的样品。以10μg/mL的LPS(Lipopolysaccharides,脂多糖，sigma,Cat.L-2880)为诱导剂。
(2)实验方法
小鼠巨噬细胞RAW264.7(购于上海生科院细胞资源中心)在37℃,5％CO2培养箱中常规培养于DMEM培养液中。实验时将1μL/mL LPS(脂多糖)(溶于蒸馏水中)加入100mL浓度为2×106μg/mL的细胞悬液中，18h后以Griess法通过测定细胞上清液中亚硝酸盐的含量间接反映NO生成量：取100mL细胞培养液，加入等量Griess(格里斯)试剂，测定吸光值。
(3)评价标准及统计方法
于570nm波长处测吸收度，以NaNO2标准溶液绘制标准曲线，计算亚硝酸盐的浓度。各组实验结果以SPSS软件ONE WAY ANNOVA方法(美国芝加哥SPSS公司)进行统计分析。
(4)实验结果
实验结果表明大果木姜子倍半萜A、B、C对LPS诱导RAW264.7巨噬细胞的NO生成有明显的抑制活性(结果见表3)，说明其具有抗炎活性。
表3大果木姜子倍半萜A、B、C抑制LPS诱导RAW264.7的NO生成活性
Figure GDA0002813497950000151
实施例22大果木姜子倍半萜A、B、C对抗二甲苯致炎的活性
(1)样品配置
实施例1制得的大果木姜子总提物，石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和大果木姜子倍半萜A、B、C，均分别用0.5％Tween-80(吐温-80)溶液配制成所需浓度的混悬液，备用。临用前将阿司匹林片(Sigma-Aldrich公司)配制成200mg/kg的混悬液作为阳性对照。各组的给药体积均为20mL/kg，口服给药。
(2)实验方法
昆明种小鼠220只，雄性，18～22g，随机分为22组，每组10只。设一组模型对照、一组阳性对照和20组给药组。小鼠购入适应环境一周后，开始给药。给药方法为：阳性药阿司匹林连续给药5天，每天一次，0.5mL/次，剂量为200mg/kg；各治疗组连续给药5天，每天一次，0.5mL/次，大果木姜子总提物组剂量为400mg/kg、800mg/kg，石油醚、乙酸乙酯、正丁醇部位剂量为200mg/kg、400mg/kg，大果木姜子倍半萜A、B、C剂量为200mg/kg、100mg/kg。模型组连续给药5天，每天一次，0.5mL/次。小鼠末次给药后30min，右耳两面涂二甲苯0.05mL/只致炎，左耳不涂，60min后处死，用6mm打孔器取左右耳同一部位圆片，精密称量两耳重量。
(3)评价标准及统计方法
以右耳和左耳重量之差代表肿胀程度。各组实验结果以SPSS软件ONE WAY ANNOVA方法进行统计分析。
(4)实验结果
阳性药(阿司匹林)，大果木姜子总提物，石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和大果木姜子倍半萜A、B、C的低、高剂量组，对二甲苯引起的耳肿胀有明显的抑制作用(P<0.05)，其中，以石油醚部位、乙酸乙酯部位及大果木姜子倍半萜A、B、C高剂量组效果最明显。该实验表明大果木姜子倍半萜A、B、C具有明显的抗炎活性(见表4)。
表4.大果木姜子总提物、各提取部位及大果木姜子倍半萜A、B、C对小鼠耳肿胀试验的影响
Figure GDA0002813497950000161
实施例23大果木姜子倍半萜A、B、C对抗弗氏完全佐剂性关节炎的活性
(1)样品制备
实施例1制得的大果木姜子总提物，石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和大果木姜子倍半萜A、B、C，均分别用0.5％Tween-80溶液配制成所需浓度的混悬液，备用。临用前将吲哚美辛片配制成210mg/kg的混悬液作为阳性对照。各组的给药体积均为10mL/kg，口服给药。
(2)实验方法
雄性大鼠，190～200g，随机分作22组，每组10只。设1组模型、1组阳性对照和20组给药组。大鼠购入适应环境一周后，开始给药。给药方法为：阳性连续口服给药5天，每天一次，剂量为210mg/kg；受试组连续给药5天，每天一次，腹腔注射，大果木姜子总提物组剂量为500mg/kg、1000mg/kg，石油醚、乙酸乙酯部位、正丁醇部位及大果木姜子倍半萜A、B、C剂量为100mg/kg、200mg/kg。模型组连续给药5天，每天一次，口服注射空白溶剂。末次给药后致炎，测大鼠右爪溶剂，测定后每只大鼠右组注射弗氏完全佐剂0.05mL，24小时后再测右足容积，求得大鼠右足肿胀度。
(3)评价标准及统计方法
各组实验结果以SPSS软件ONE WAY ANNOVA方法进行统计分析。
(4)实验结果
阳性药(吲哚美辛)，大果木姜子总提物、石油醚和乙酸乙酯部位的高剂量组，以及大果木姜子倍半萜A、B、C低、高剂量组均能明显抑制大鼠的足肿胀度，显示大果木姜子总提物、石油醚和乙酸乙酯部位及大果木姜子倍半萜A、B、C均具有一定的抗炎活性(P<0.05，表5)。
表5.大果木姜子总提物、各提取部位及大果木姜子倍半萜A、B、C对抗弗氏完全佐剂性关节炎的活性
Figure GDA0002813497950000171
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作出一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (9)

1.一种大果木姜子果实提取物，其特征在于，所述提取物为大果木姜子倍半萜A、B、C，它们的结构式如下：
1)大果木姜子倍半萜A：
Figure FDA0002843772310000011
2)大果木姜子倍半萜B：
Figure FDA0002843772310000012
3)大果木姜子倍半萜C：
Figure FDA0002843772310000013
2.一种提取权利要求1所述的大果木姜子果实提取物的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
1)将大果木姜子果实干燥，粉碎，以5～15倍量95％乙醇在20～30℃下浸泡提取2～5次，每次12～24小时，合并得提取液，减压浓缩；
2)减压浓缩提取液至无醇味，得水混悬流浸膏，加2～6倍水稀释，依次用2～6倍的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇分别萃取2～4次，减压回收溶剂，分别得到石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位；
3)将上述乙酸乙酯部位上100-200目正相硅胶柱色谱，依次用石油醚：乙酸乙酯进行梯度洗脱，具体比例以体积比为：100％石油醚,100:1,50:1,20:1,10:1,5:1及100％乙酸乙酯，洗脱液经薄层色谱检测，分别收集含有大果木姜子倍半萜A，B，C的流分；
4)再经200-300目硅胶柱色谱，以体积比为10:1的石油醚:乙酸乙酯洗脱细分之后，得大果木姜子倍半萜A，B，C洗脱流分。
3.根据权利要求2所述的大果木姜子果实提取物的提取方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
1)将大果木姜子果实干燥，粉碎，以8～12倍量95％乙醇23～27℃浸泡提取3～4次，每次12～24小时，合并得提取液，减压浓缩；
2)减压浓缩提取液至无醇味，得水混悬流浸膏，加2～6倍水稀释，依次用2～6倍的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇分别萃取2～4次，减压回收溶剂，分别得到石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位；
3)将上述乙酸乙酯部位上100-200目正相硅胶柱色谱，依次用石油醚：乙酸乙酯进行梯度洗脱，具体比例以体积比为：100％石油醚,100:1,50:1,20:1,10:1,5:1及100％乙酸乙酯，洗脱液经薄层色谱检测，分别收集含有大果木姜子倍半萜A，B，C的流分；
4)再经200-300目硅胶柱色谱，以体积比为10:1的石油醚:乙酸乙酯洗脱细分之后，得大果木姜子倍半萜A，B，C洗脱流分。
4.根据权利要求2所述的大果木姜子果实提取物的提取方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
1)将大果木姜子果实干燥，粉碎，以10倍量95％乙醇25℃浸泡提取3～4次，每次12～24小时，合并得提取液，减压浓缩；
2)减压浓缩提取液至无醇味，得水混悬流浸膏，加3～5倍水稀释，依次用3～5倍的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇分别萃取3次，减压回收溶剂，分别得到石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位；
3)将上述乙酸乙酯部位上100-200目正相硅胶柱色谱，依次用石油醚：乙酸乙酯进行梯度洗脱，具体比例以体积比为：100％石油醚,100:1,50:1,20:1,10:1,5:1及100％乙酸乙酯，洗脱液经薄层色谱检测，分别收集含有大果木姜子倍半萜A，B，C的流分；
4)再经200-300目硅胶柱色谱，以体积比为10:1的石油醚:乙酸乙酯洗脱细分之后，得大果木姜子倍半萜A，B，C洗脱流分。
5.一种制备权利要求1所述提取物的方法，其特征在于，将权利要求2-4任一项所述提取方法中的步骤4)所得的大果木姜子倍半萜B，C洗脱流分经高效液相色谱制备，分别以55～70％甲醇5～15L洗脱大果木姜子倍半萜B，C流分，得到化合物大果木姜子倍半萜B、C；将大果木姜子倍半萜A洗脱流分经硅胶薄层色谱制备，在温度为20～30℃，以比例为10:1的石油醚：乙酸乙酯为展开剂，展开，用5％香草醛浓硫酸为显色剂，在温度200～300℃下加热20～40s，刮板制备得到单体化合物大果木姜子倍半萜A。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，将权利要求2-4任一项所述提取方法中的步骤4)所得的大果木姜子倍半萜B，C洗脱流分经高效液相色谱制备，分别以60～65％甲醇8～12L洗脱大果木姜子倍半萜B，C流分，得到化合物大果木姜子倍半萜B、C；将大果木姜子倍半萜A洗脱流分经硅胶薄层色谱制备，在温度为23～27℃，以比例为10:1的石油醚：乙酸乙酯为展开剂，展开，用5％香草醛浓硫酸为显色剂，在温度200～300℃下加热20～40s，刮板制备得到单体化合物大果木姜子倍半萜A。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，将权利要求2-4任一项所述提取方法中的步骤4)所得的大果木姜子倍半萜B，C洗脱流分经高效液相色谱制备，分别以60～65％甲醇10L洗脱大果木姜子倍半萜B，C流分，得到化合物大果木姜子倍半萜B、C；将大果木姜子倍半萜A洗脱流分经硅胶薄层色谱制备，在温度为25℃，以比例为10:1的石油醚：乙酸乙酯为展开剂，展开，用5％香草醛浓硫酸为显色剂，在温度200～300℃下加热30s，刮板制备得到单体化合物大果木姜子倍半萜A。
8.根据权利要求1所述的大果木姜子果实提取物的应用，其特征在于，所述大果木姜子倍半萜A、B、C在制备抗炎制剂中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述制剂为加入药学上可接受的辅料制备成药学上可接受的制剂，所述制剂为颗粒剂、胶囊剂、散剂、片剂、丸剂、注射制剂、冻干粉针剂。
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