CN110251552B - 一种龙脷叶总黄酮的制备方法 - Google Patents

一种龙脷叶总黄酮的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种龙脷叶总黄酮的制备方法，选取龙脷叶药材的干燥叶，用95％乙醇加热回流提取，获得龙脷叶的提取液；将龙脷叶的提取液减压回收，浓缩至无醇味，获得龙脷叶醇提浸膏；将龙脷叶醇提浸膏与去离子水搅拌均匀，混悬过滤，获得龙脷叶醇提上清液，将龙脷叶醇提上清液用石油醚萃取，获得龙脷叶萃取水层；龙脷叶萃取水层经ODS减压柱层析，以甲醇‑水系统梯度洗脱，获得龙脷叶总黄酮。本发明方法其方法简单、对实验材料要求低，易操作；龙脷叶总黄酮具有α‑葡萄糖苷酶的抑制活性，总黄中的六个黄酮化合物具有α‑葡萄糖苷酶的抑制活性，并且对正常肺泡细胞安全，可以用于抗糖尿病药物的制备，用于糖尿病患者的辅食。

Description

一种龙脷叶总黄酮的制备方法
技术领域
本发明具体涉及一种龙脷叶总黄酮的制备方法。
背景技术
龙脷叶(Sauropus spatulifolius Beille)系大戟科守宫木属植物，又名龙舌叶、龙耳叶，原产于越南北部，马来半岛有栽培，在我国多分布于福建、广东、广西等地。民间地区常将龙脷叶作为食疗药材使用，其味甘、淡，性平，有清肺除热、化痰止咳的功效，用于治疗肺燥咳嗽、气管炎、支气管炎及便秘等疾病，龙脷叶中含有丰富的有效物质，但是目前市场上对此块研究不多，一些研究者通过化学反应鉴别龙脷叶可能含有糖、皂苷、鞣质、有机酸，生物碱、香豆素等化学成分，另一些研究学者从龙脷叶的乙醇提取物中分离得到β-谷甾醇油酸酯、β-谷甾醇、1，3-十四烷酸甘油二酯、月桂酸、邻苯二甲酸二丁酯、豆甾醇、槲皮素、山柰酚、己糖衍生物等化合物。还有一些研究学者药理研究表明，龙脷叶对化学刺激引起的疼痛有明显抑制作用，对二甲苯致小鼠耳廓肿胀、角叉菜胶致大鼠足肿胀和棉球致小鼠肉芽肿等炎症模型具有抗炎活性，以及抗急性肺损伤活性，DPPH自由基清除活性，抗菌等作用，并且，龙脷叶安全、无毒，广东广西等民间地区常将其作为食疗药材使用。但是龙脷叶的化学成分及其药效物质不明确，仍有待进一步深入研究。
发明内容
本发明目的是提供一种龙脷叶总黄酮的制备方法，解决上述问题。
本发明的技术方案是：
一种龙脷叶总黄酮的制备方法，其特征在于，包括步骤：
(1)选取龙脷叶药材的干燥叶，用95％乙醇加热回流提取，获得提取液，所述提取次数为两次，每次提取2小时，将两次获得的所述提取液冷却至室温，过滤合并，获得龙脷叶的提取液；
(2)将所述龙脷叶的提取液减压回收，浓缩至无醇味，获得龙脷叶醇提浸膏；
(3)将所述龙脷叶醇提浸膏与去离子水搅拌均匀，混悬过滤，获得龙脷叶醇提上清液，将所述龙脷叶醇提上清液用石油醚萃取，保留萃取得到的水层，经减压浓缩，获得龙脷叶萃取水层；
(4)所述龙脷叶萃取水层经ODS减压柱层析，以甲醇-水系统梯度洗脱，30％甲醇洗脱去除杂质，收集50％甲醇洗脱液，回收溶剂，获得龙脷叶总黄酮。
进一步的，步骤(1)中所述干燥叶与95％乙醇的质量比为1：10。
进一步的，步骤(3)中所述龙脷叶醇提浸膏与去离子水的质量比为1：1.5。
进一步的，步骤(3)中所述龙脷叶醇提浸膏与去离子水的质量比为1：1.5。
进一步的，还包括步骤(5)：所述龙脷叶总黄酮经ODS减压柱层析，分别以35％甲醇，50％甲醇洗脱，得到35％甲醇洗脱物和50％甲醇洗脱物，将所述35％甲醇洗脱物用75％乙醇溶解，经凝胶Sephadex LH-20柱、75％乙醇洗脱，获得山柰酚-3-O-β-D-龙胆二糖苷、槲皮素-3-O-β-D-龙胆二糖苷、山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷，将所述50％甲醇洗脱物用高效液相色谱柱检测，流速为10ml/min，检测波长为254nm，45％甲醇洗脱，获得山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖(1-6)-β-D-(2-去氧)葡萄糖苷，再用50％甲醇洗脱，获得化合物山柰酚-3-O-β-D-(2-去氧)葡萄糖苷。
进一步的，所述山柰酚-3-O-β-D-(2-去氧)葡萄糖苷的结构为：
Figure BDA0002099698850000021
进一步的，所述山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖(1-6)-β-D-(2-去氧)葡萄糖苷的结构为：
Figure BDA0002099698850000031
本发明提供了一种龙脷叶总黄酮的制备方法，优点为：
(1)制备方法简单、对实验材料要求低，易操作；
(2)龙脷叶总黄酮具有α-葡萄糖苷酶的抑制活性，总黄中的六个黄酮化合物具有α-葡萄糖苷酶的抑制活性，并且对正常肺泡细胞安全，可以用于抗糖尿病药物的制备，用于糖尿病患者的辅食。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术方案。但是本发明不限于所列出的实施例，还应包括在本发明所要求的权利范围内其他任何公知的改变。
此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
实施例1
1、龙脷叶总黄酮的制备
取龙脷叶药材的干燥叶5kg，以10倍量的95％乙醇加热回流提取两次，每次提取2小时，冷却至室温，过滤合并可得到龙脷叶的提取液，减压回收浓缩至无醇味可得龙脷叶醇提浸膏。将龙脷叶浸膏与其1.5倍量的去离子水搅拌均匀混悬过滤得龙脷叶醇提上清液，然后与石油醚萃取4次(龙脷叶醇提上清液﹕石油醚＝2:3)，用以去除大量的脂溶性叶绿素，保留萃取得到的水层经减压浓缩即可得龙脷叶萃取后水层(约1500ml)。
龙脷叶萃取水层，经ODS(50μm)减压柱层析，以甲醇-水系统梯度洗脱，30％甲醇洗脱去除杂质，收集50％甲醇洗脱液，回收溶剂，制备得到龙脷叶总黄酮(12.5g)。
龙脷叶总黄酮再经ODS(50μm)减压柱层析，分别以35％甲醇，50％甲醇洗脱，得到35％甲醇洗脱物和50％甲醇洗脱物。35％甲醇洗脱物用75％乙醇溶解，经凝胶SephadexLH-20柱，75％乙醇洗脱，先后得到山柰酚-3-O-β-D-龙胆二糖苷(1.8g)，槲皮素-3-O-β-D-龙胆二糖苷(1.2g)，山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖苷(34mg)，槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷(19mg)。50％甲醇洗脱物制备型高效液相，色谱柱(8C18-100AA,20mm*250mm)，流速为10ml/min，检测波长254nm，45％甲醇洗脱，得到山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖(1-6)-β-D-(2-去氧)葡萄糖苷(16mg)；50％甲醇洗脱，得到化合物山柰酚-3-O-β-D-(2-去氧)葡萄糖苷(15mg)。
龙脷叶总黄酮含有槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷，槲皮素-3-O-β-D-龙胆二糖苷，山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖苷，山柰酚-3-O-β-D-龙胆二糖苷，山柰酚-3-O-β-D-(2-去氧)葡萄糖苷，山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖(1-6)-β-D-(2-去氧)葡萄糖苷。
2、龙脷叶总黄酮及各化合物降α-葡萄糖苷酶活性
在具塞试管中加入0.45mL pH为6.8的磷酸盐缓冲液和100μL的α-葡萄糖苷酶(0.36U/mL)，37℃的水浴锅中保温5min后，加入150μL PNPG(2mmoL/L)和100μL样品，在37℃水浴锅反应10min，以1mL Na2CO3(0.5moL/L)终止反应，在400nm处测定吸光值。每一个样品测量三次，计算平均值。以阿卡波糖为阳性对照，并设置空白组消除样品紫外吸收，按照下列公式计算抑制率：
Y＝A空白-(A样品-A背景)/A空白
A空白＝加酶不加样品时的吸光度
A样品＝加酶和样品时的吸光度
A背景＝加样品不加酶时的吸光度
Y＝α-葡萄糖苷酶的抑制率(％)
实验数据通过spss软件进行分析，得出IC50。
龙脷叶总黄酮2.303mM，槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷1.043mM，槲皮素-3-O-β-D-龙胆二糖苷0.9305mM，山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖苷3.082mM，山柰酚-3-O-β-D-龙胆二糖苷1.189mM，山柰酚-3-O-β-D-(2-去氧)葡萄糖苷4.013mM，山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖(1-6)-β-D-(2-去氧)葡萄糖苷1.024mM，阿卡波糖1.601μM。
3、化合物的性状、物理性质及核磁数据如下：
槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷：黄色粉末，mp 225.0-227.0℃，易溶于甲醇，TLC紫外254nm下观察有暗斑，三氯化铝显黄色。1H-NMR(600MHz,DMSO-d6)δ:12.61(s,5-OH),7.59(1H,br.s,H-2’),7.57(1H,br.s,d,J＝8.1Hz,H-6’),6.85(1H,d,J＝8.3Hz,H-5’),6.41(1H,J＝2.0Hz,H-8),6.20(1H,J＝2.0Hz,H-8),5.44(1H,d,J＝7.1Hz,H-1”).13C-NMR(150MHz,DMSO-d6)δ:177.4(C-4),164.1(C-7),161.2(C-5),156.3(C-9),156.1(C-2),148.4(C-4’),144.7(C-3’),133.3(C-3),121.5(C-6’),121.1(C-1’),116.2(C-2’),115.2(C-5’),103.9(C-10),101.0(C-1”),98.6(C-6),93.4(C-4),77.4(C-5”),76.5(C-3”),74.1(C-2”),69.9(C-4”),61.0(C-6”)。
槲皮素-3-O-β-D-龙胆二糖苷：黄色粉末，微溶于甲醇，mp 210.0-213.0℃，TLC紫外254nm下观察有暗斑，三氯化铝显黄色。1H-NMR(600MHz,DMSO-d6)δ:12.55(s,5-OH),7.57(1H,br.s,H-2’),7.56(1H,br.s,d,J＝8.1Hz,H-6’),6.83(1H,d,J＝8.1Hz,H-5’),6.35(1H,br.s,H-8),6.15(1H,br.s,H-6),5.39(1H,d,J＝7.1Hz,H-1”),4.06(1H,d,J＝7.7Hz,H-1”’).13C NMR(150MHz,DMSO-d6)δ:177.2(C-4),165.1(C-7),161.2(C-5),156.4(C-9),156.1(C-2),148.6(C-4’),144.8(C-3’),133.3(C-3),121.7(C-6’),121.0(C-1’),116.12(C-5’),115.3(C-2’),103.7(C-1”’),103.1(C-10),101.0(C-1”),98.9(C-6),93.7(C-8),76.5(C-5”’,5”),76.4(C-3”’),76.3(C-3”),74.0(C-2”),73.4(C-2”’),69.7(C-4”),69.7(C-4”’),68.1(C-6”),60.7(C-6”’)。
山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖苷：黄色粉末,mp 212.0-215.0℃，易溶于甲醇,TLC紫外254nm下观察有暗斑，三氯化铝显黄色。1H-NMR(600MHz,DMSO-d6)δ:12.61(s,5-OH),8.04(2H,d,J＝8.9Hz,H-2’,6’),6.88(2H,d,J＝8.9Hz,H-3’,5’),6.43(1H,br.s,H-8),6.20(1H,br.s,H-6),5.46(1H,d,J＝7.5Hz,glc H-1”),3.08-3.2(4H,m).13C-NMR(150MHz,DMSO-d6)δ:177.5(C-4),164.5(C-7),161.3(C-5),160.0(C-4’),156.5(C-9),156.3(C-2),133.2(C-3),131.0(C-2’,6’),121.0(C-1’),115.2(C-3’,5’),104.0(C-10),101.0(C-1”),98.8(C-6),93.8(C-8),77.6(C-5”),76.5(C-3”),74.3(C-2”),70.0(C-4”),60.9(C-6”)。
山柰酚-3-O-β-D-龙胆二糖苷：黄色粉末，微溶于甲醇，mp 208.0-210.0℃，TLC紫外254nm下观察有暗斑，三氯化铝显黄色。1H-NMR(600MHz,DMSO-d6)δ:12.57(s,5-OH),8.02(2H,d,J＝8.7Hz,H-2’,6’),6.88(2H,d,J＝8.7Hz,H-3’,5’),6.37(1H,br.s,H-8),6.16(1H,br.s,H-6),5.36(1H,d,J＝7.5Hz,H-1”),4.04(1H,d,J＝7.7Hz,H-1”’).13C-NMR(150MHz,DMSO-d6)δ:177.2(C-4),165.1(C-7),161.2(C-5),160.0(C-4’),156.5(C-9),156.4(C-2),133.2(C-3),130.9(C-2’,6’),120.9(C-1’),115.1(C-3’,5’),103.7(C-1”’),103.2(C-10),101.1(C-1”),99.0(C-6),93.9(C-8),76.6(C-5”’,5”),76.3(C-3”’,5”),74.1(C-2”),73.4(C-2”’),69.8(C-4”),69.7(C-4”’),68.0(C-6”),60.8(C-6”’)。
山柰酚-3-O-β-D-(2-脱氧)葡萄糖苷：黄色粉末，易溶于甲醇，TLC紫外254nm下观察有暗斑，三氯化铝显色为黄色。HR-MS(ESI,m/z):[M-H]+Calcd:431.0978,Found:421.1035.1H-NMR(600MHz,CD4O)δ:8.05(2H,d,J＝8.7Hz,H-2’,6’),6.92(2H,d,J＝8.7Hz,H-3’,5’),6.42(1H,br.s,H-8),6.22(1H,br.s,H-6),5.39(1H,d,J＝9.5Hz,H-1”),3.75(1H,d,J＝12.0Hz,Ha-6”),3.58(2H,dd,J＝12.0,5.28Hz,Ha-6”,H-3”),3.21(1H,t,J＝9.3Hz,H-4”),3.16(1H,m,H-5”),2.45(1H,dd,J＝4.86,12.1Hz,Ha-2”),1.68(1H,d,J＝10.3Hz,Hb-2”).13C-NMR(150MHz,CD4O)δ:179.6(C-4),166.0(C-7),163.1(C-5),161.6(C-4’),159.0(C-9),158.5(C-2),135.7(C-3),130.8(C-2’,6’),122.9(C-1’),116.2(C-3’,5’),105.9(C-10),101.2(C-1”),99.8(C-6),94.7(C-8),78.5(C-5”),72.2(C-3”),40.2(C-2”),72.8(C-4”),62.8(C-6”)。
山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖(1-6)-β-D-(2-脱氧)葡萄糖苷：黄色粉末，易溶于甲醇，TLC紫外254nm下观察有暗斑,三氯化铝显色为黄色。HR-MS(ESI,m/z):[M-H]+Calcd:593.1506,Found:593.1510.1H-NMR(600MHz,DMSO-d6)δ:12.58(s,5-OH),8.05(2H,d,J＝8.8Hz,H-2’,6’),6.89(2H,d,J＝8.8Hz,H-3’,5’),6.41(1H,br.s,J＝2.0Hz,H-8),6.19(1H,br.s,J＝2.0Hz,H-6),5.38(1H,d,J＝9.7Hz,DeoxyglcH-1”),4.07(1H,d,J＝7.8Hz,glcH-1”’).13C-NMR(150MHz,DMSO-d6)δ:177.5(C-4),164.4(C-7),161.2(C-5),160.0(C-4’),156.7(C-9),156.5(C-2),133.8(C-3),131.0(C-2’,6’),120.7(C-1’),115.2(C-3’,5’),104.1(C-10),98.8(C-6),93.8(C-8),103.22(glcC-1”’),99.21(Deoxyglc C-1”),39.3(glc C-2”),76.6(glc C-3”’),76.5(Deoxyglc C-5”),73.5(Deoxyglc C-3”),71.1(glc C-2”’),70.2(Deoxyglc C-4”),69.8(glcC-4”’),68.5(Deoxyglc C-6”),60.9(glcC-6”’)。
4、化合物结构如下：
4.1槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷
Figure BDA0002099698850000071
4.2槲皮素-3-O-龙胆二糖苷
Figure BDA0002099698850000072
4.3山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖苷
Figure BDA0002099698850000073
4.4山柰酚-3-O-龙胆二糖苷
Figure BDA0002099698850000074
5、龙脷叶总黄酮及各化合物的细胞毒性考察
取对数生长期RLE-6TN细胞(正常肺泡上皮细胞)，按细胞浓度为6×10^4，在96孔板中每孔接种100μL细胞(6,000cells/well)，F12培养基，10％胎牛血清，在37度，5％CO2条件下培养24h后，给不同浓度的药物(100,10,1μM)。给药后的72h，移除原先的培养基，每孔加入CCK8培养基(CCK8:培养基＝1:9)100μL。继续置于二氧化碳培养箱中孵育1h，用酶标仪测每孔的吸光度。
实验数据通过spss软件进行分析，得出IC50。
龙脷叶总黄酮、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-β-D-龙胆二糖苷、山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖苷、山柰酚-3-O-β-D-龙胆二糖苷、山柰酚-3-O-β-D-(2-去氧)葡萄糖苷和山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖(1-6)-β-D-(2-去氧)葡萄糖苷IC50均大于100μM。
综上所述，本发明所述的一种龙脷叶总黄酮的制备方法，其方法简单、对实验材料要求低，易操作；龙脷叶总黄酮具有α-葡萄糖苷酶的抑制活性，总黄中的六个黄酮化合物具有α-葡萄糖苷酶的抑制活性，并且对正常肺泡细胞安全，可以用于抗糖尿病药物的制备，用于糖尿病患者的辅食。
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (6)

1.一种龙脷叶总黄酮的制备方法，其特征在于，包括步骤：
(1)选取龙脷叶药材的干燥叶，用95％乙醇加热回流提取，获得提取液，所述提取次数为两次，每次提取2小时，将两次获得的所述提取液冷却至室温，过滤合并，获得龙脷叶的提取液；
(2)将所述龙脷叶的提取液减压回收，浓缩至无醇味，获得龙脷叶醇提浸膏；
(3)将所述龙脷叶醇提浸膏与去离子水搅拌均匀，混悬过滤，获得龙脷叶醇提上清液，将所述龙脷叶醇提上清液用石油醚萃取，保留萃取得到的水层，经减压浓缩，获得龙脷叶萃取水层；
(4)所述龙脷叶萃取水层经ODS减压柱层析，以甲醇-水系统梯度洗脱，30％甲醇洗脱去除杂质，收集50％甲醇洗脱液，回收溶剂，获得龙脷叶总黄酮；
(5)所述龙脷叶总黄酮经ODS减压柱层析，分别以35％甲醇，50％甲醇洗脱，得到35％甲醇洗脱物和50％甲醇洗脱物，将所述35％甲醇洗脱物用75％乙醇溶解，经凝胶SephadexLH-20柱、75％乙醇洗脱，获得山柰酚-3-O-β-D-龙胆二糖苷、槲皮素-3-O-β-D-龙胆二糖苷、山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷，将所述50％甲醇洗脱物用高效液相色谱柱检测，流速为10ml/min，检测波长为254nm，45％甲醇洗脱，获得山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖(1-6)-β-D-(2-去氧)葡萄糖苷，再用50％甲醇洗脱，获得化合物山柰酚-3-O-β-D-(2-去氧)葡萄糖苷。
2.根据权利要求1所述的一种龙脷叶总黄酮的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述干燥叶与95％乙醇的质量比为1：10。
3.根据权利要求1所述的一种龙脷叶总黄酮的制备方法，其特征在于：步骤(3)中所述龙脷叶醇提浸膏与去离子水的质量比为1：1.5。
4.根据权利要求1所述的一种龙脷叶总黄酮的制备方法，其特征在于：步骤(3)中所述龙脷叶醇提上清液与石油醚萃的质量比为2：3。
5.根据权利要求1所述的一种龙脷叶总黄酮的制备方法，其特征在于：所述山柰酚-3-O-β-D-(2-去氧)葡萄糖苷的结构为：
Figure FDA0002977500300000021
6.根据权利要求1所述的一种龙脷叶总黄酮的制备方法，其特征在于：所述山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖(1-6)-β-D-(2-去氧)葡萄糖苷的结构为：
Figure FDA0002977500300000022
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