CN113801084A - 一种橘醋发酵底泥提取的多甲氧基黄酮及提取方法和应用 - Google Patents
一种橘醋发酵底泥提取的多甲氧基黄酮及提取方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于制药技术领域，公开了一种橘醋发酵底泥提取的多甲氧基黄酮及提取方法和应用。本发明将橘醋发酵底泥利用有机溶剂浸提，离心，收集有机相，将固相重复浸提2～6次，合并有机相，减压浓缩得到多甲氧基黄酮。该方法成本低廉、工艺简单、经济环保，富集程度高，便于后续针对单体成分纯化，避免了橘醋陈酿过程中发酵底泥作为废弃物丢弃对环境造成的污染，也避免了以果实直接提取带来的工序繁杂、高成本、高有机溶剂使用等弊端。本发明的方法能从橘醋发酵底泥中有效剥离促肿瘤细胞生长的成分，而保留显著抑制肿瘤细胞生长的成分，即多甲氧基黄酮。
Description
技术领域
本发明涉及制药技术领域，尤其涉及一种橘醋发酵底泥提取的多甲氧基黄酮及提取方法和应用。
背景技术
芸香科柑橘属植物果实和果皮富含黄酮类物质，其中多甲氧基黄酮是该属植物所特有，这类物质具有黄酮母核结构，苯环上羟基多被甲基化，具有抗炎、抗病毒、保护急性肝损伤、神经保护、抑制血小板功能减少血栓形成、治疗糖尿病并发症、降低血脂血糖、抗动脉粥样硬等较显著的生理活性，如川陈皮素(Nobiletin)、桔皮素(Tangeretin)等。此类物质在植物中含量低、极性小且难溶于水，富集纯化工序复杂、处理成本高，目前开发应用受限。例如，现有技术CN108727324A公开了从柑橘皮中提取多甲氧基黄酮的方法，其利用有机溶剂进行提取后还需对粗提液通过层析柱进行富集、除杂以及解吸，才可得到多甲氧基黄酮的混合物，工序复杂，提高了处理成本。又如，现有技术CN102875509A公开了将柑橘果皮粉碎后在70～85℃下进行提取，后续还需调节pH、脱脂处理等步骤，多甲氧基黄酮的纯化工序复杂，不利于工业化应用。
橘醋是以芸香科柑橘属植物果实汁或果皮水提取物为基质，采用二次发酵，并经“夏复晒，冬捞冰”多年陈化精酿而成。在陈酿过程中，橘醋中的沉淀物质逐渐沉降而导致陈化罐堆积产生大量罐底泥，回收橘醋后罐底泥一般作丢弃处理，造成资源浪费和环境污染。而且，现有技术中对于橘醋发酵底泥的资源化利用研究较少。
因此，针对上述两类问题，如何对橘醋发酵底泥进行资源化利用，并发开出一种成本低廉、工艺简单、经济环保，适用于工业化生产的利用橘醋发酵底泥提取多甲氧基黄酮的方法，具有重要的研究价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一种橘醋发酵底泥提取的多甲氧基黄酮及提取方法和应用，解决现有技术对橘醋陈酿过程中的发酵底泥资源化利用程度低，芸香科柑橘属植物多甲氧基黄酮富集、纯化开发工艺繁杂，成本较高，开发应用前景受限等缺陷。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种橘醋发酵底泥提取多甲氧基黄酮的方法，包括以下步骤：
将橘醋发酵底泥利用有机溶剂浸提，离心，收集有机相，将固相重复浸提2～6次，合并有机相，减压浓缩，得到多甲氧基黄酮。
优选的，在上述一种橘醋发酵底泥提取多甲氧基黄酮的方法中，所述橘醋发酵底泥和有机溶剂的质量体积比为1g：1～5mL。
优选的，在上述一种橘醋发酵底泥提取多甲氧基黄酮的方法中，所述有机溶剂为醇溶剂、乙酸乙酯或丙酮。
优选的，在上述一种橘醋发酵底泥提取多甲氧基黄酮的方法中，所述浸提温度为20～70℃，时间为3～48h。
优选的，在上述一种橘醋发酵底泥提取多甲氧基黄酮的方法中，所述减压浓缩时间为3～4h，温度为50～60℃。
优选的，在上述一种橘醋发酵底泥提取多甲氧基黄酮的方法中，所述将橘醋发酵底泥利用有机溶剂浸提前还包括将橘醋发酵底泥水洗，离心。
本发明还提供了一种橘醋发酵底泥提取多甲氧基黄酮的方法制得的多甲氧基黄酮，所述多甲氧基黄酮包括5,7,4'-三羟基黄酮、5,7,3'-三羟基-4'-甲氧基黄酮、3,5,7,4'-四羟基-8,3'-二甲氧基黄酮、5,7,8,4'-四甲氧基黄酮、5,6,7,8,3',4'-六甲氧基黄酮、3,5,6,7,8,3',4'-七甲氧基黄酮和5,6,7,8,4'-五甲氧基黄酮中的一种或几种。
本发明还提供了上述多甲氧基黄酮中的一种或几种在制备食品、保健品或治疗肿瘤疾病的药物中的应用。
优选的，在上述应用中，所述肿瘤疾病包括乳腺癌、肺癌、结肠癌、前列腺癌、黑色素瘤或肝癌。在本发明中，多甲氧基黄酮或其化合物组合通过抑制肿瘤细胞微管蛋白聚合，从而诱导肿瘤细胞发生G2/M期阻滞，引起细胞周期失调，起到抑制肿瘤细胞生长的作用。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明提供了一种橘醋发酵底泥提取多甲氧基黄酮的方法，该方法成本低廉、工艺简单、经济环保，富集程度高，便于后续针对单体成分纯化，避免了橘醋陈酿过程中发酵底泥作为废弃物丢弃对环境造成的污染，也避免了传统多甲氧基黄酮从果实直接提取带来的工序繁杂、高成本、高有机溶剂使用等弊端。
(2)通过本发明的方法，能从橘醋发酵底泥中有效剥离促肿瘤细胞生长的成分，而保留显著抑制肿瘤细胞生长的成分，即多甲氧基黄酮。
(3)本方法制备的多甲氧基黄酮属于药食同源成分，可作为添加成分制备食品、保健品和药物，用于肿瘤相关疾病的防治，多甲氧基黄酮或其化合物组合通过抑制肿瘤细胞微管蛋白聚合，从而诱导肿瘤细胞发生G2/M期阻滞，引起细胞周期失调，起到抑制肿瘤细胞生长的作用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为实施例1的多甲氧基黄酮高效液相色谱仪全成分分析图谱；
图2为实施例1～3的多甲氧基黄酮高效液相色谱仪分析图谱；
图3为实施例1的多甲氧基黄酮与人乳腺癌MCF-7细胞共孵育后细胞染色结果；
图4为实施例1的多甲氧基黄酮与人乳腺癌MCF-7细胞共孵育后细胞镜检结果；
其中，a为JCCD-2处理后的细胞镜检结果；b为JCCD-EXT处理后的细胞镜检结果；
图5为实施例1的多甲氧基黄酮对人乳腺癌MCF-7细胞生长抑制曲线；
其中，a为JCCD-1对MCF-7细胞生长抑制曲线；b为JCCD-2对MCF-7细胞生长抑制曲线；c为JCCD-EXT对MCF-7细胞生长抑制曲线；
图6为实施例1的多甲氧基黄酮处理的人乳腺癌MCF-7细胞经碘化丙啶(PI染色)后的周期分析；
其中，a为JCCD-EXT处理下MCF-7细胞周期分析；b为JCCD-EXT处理下G1期、S期和G2/M期细胞比例分析；
图7为实施例1的多甲氧基黄酮对人乳腺癌细胞MCF-7细胞的微管蛋白和细胞核的影响。
具体实施方式
本发明提供一种橘醋发酵底泥提取多甲氧基黄酮的方法，包括以下步骤：
将橘醋发酵底泥利用有机溶剂浸提，离心，收集有机相，将固相重复浸提2～6次，合并有机相，减压浓缩，得到多甲氧基黄酮。
在本发明中，橘醋发酵底泥的制备方法为：将柑橘全果处理后发酵制醋，过滤，回收橘醋，得到橘醋发酵底泥。
在本发明中，橘醋发酵底泥和有机溶剂的质量体积比优选为1g：1～5mL；进一步优选为1g：1.5～4mL；更优选为1g：2.5mL。
在本发明中，有机溶剂优选为醇溶剂、乙酸乙酯或丙酮；进一步优选为醇溶剂；更优选为乙醇或甲醇。
在本发明中，浸提时间优选为3～48h，温度优选为20～70℃；进一步优选的，浸提时间为6～36h，温度为23～50℃；更优选的，浸提时间为12h，温度为25℃。
在本发明中，离心转速优选为1000～10000rpm，时间优选为10～120min；进一步优选的，转速为3500～7500rpm，时间为20～60min；更优选的，转速为5000rpm，时间为30min。
在本发明中，减压浓缩的时间优选为3～4h，温度优选为50～60℃；进一步优选的，时间为3.2～3.8h，温度为52～57℃；更优选的，时间为3.5h，温度为55℃。
在本发明中，在浸提前还包括将橘醋发酵底泥水洗，离心；优选的，离心转速为1000～10000rpm，时间为10～120min；进一步优选的，转速为3500～7500rpm，时间为20～60min；更优选的，转速为5000rpm，时间为30min。本发明水洗的目的是除掉部分有机酸。
本发明还提供一种橘醋发酵底泥提取多甲氧基黄酮的方法制得的多甲氧基黄酮。
在本发明中，多甲氧基黄酮优选为5,7,4'-三羟基黄酮、5,7,3'-三羟基-4'-甲氧基黄酮、3,5,7,4'-四羟基-8,3'-二甲氧基黄酮、5,7,8,4'-四甲氧基黄酮、5,6,7,8,3',4'-六甲氧基黄酮、3,5,6,7,8,3',4'-七甲氧基黄酮和5,6,7,8,4'-五甲氧基黄酮中的一种或几种；进一步优选为5,6,7,8,3',4'-六甲氧基黄酮、3,5,6,7,8,3',4'-七甲氧基黄酮和5,6,7,8,4'-五甲氧基黄酮中的一种或几种；更优选为5,6,7,8,3',4'-六甲氧基黄酮、3,5,6,7,8,3',4'-七甲氧基黄酮和5,6,7,8,4'-五甲氧基黄酮的混合。
本发明还提供上述多甲氧基黄酮在制备食品、保健品或治疗肿瘤疾病的药物中的应用。
在本发明中，优选为5,6,7,8,3',4'-六甲氧基黄酮、3,5,6,7,8,3',4'-七甲氧基黄酮和5,6,7,8,4'-五甲氧基黄酮的混合在制备食品、保健品或治疗肿瘤疾病的药物中的应用。
在本发明中，肿瘤疾病优选为乳腺癌、肺癌、结肠癌、前列腺癌、黑色素瘤或肝癌。多甲氧基黄酮或其化合物组合通过抑制肿瘤细胞微管蛋白聚合，从而诱导肿瘤细胞发生G2/M期阻滞，引起细胞周期失调，起到抑制肿瘤细胞生长的作用。
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施例提供一种橘醋发酵底泥提取多甲氧基黄酮的方法，包括以下步骤：
将55g橘醋发酵底泥利用150mL水洗涤后，于5000rpm离心30min，然后利用110mL分析纯的甲醇于25℃浸提3h，于6000rpm离心35min，收集有机相，将固相重复浸提3次，合并有机相，减压浓缩得到多甲氧基黄酮10g。
实施例2
本实施例提供一种橘醋发酵底泥提取多甲氧基黄酮的方法，包括以下步骤：
将55g橘醋发酵底泥利用200mL水洗涤后，于7000rpm离心60min，然后利用55mL分析纯的乙醇于50℃浸提4h，于8000rpm离心20min，收集有机相，将固相重复浸提6次，合并有机相，减压浓缩得到多甲氧基黄酮9.7g。
实施例3
本实施例提供一种橘醋发酵底泥提取多甲氧基黄酮的方法，包括以下步骤：
将55g橘醋发酵底泥利用200mL水洗涤后，于3000rpm离心80min，然后利用165mL分析纯乙酸乙酯于70℃浸提6h，于7000rpm离心100min，收集有机相，将固相重复浸提4次，合并有机相，减压浓缩得到多甲氧基黄酮10.2g。
实施例4
多甲氧基黄酮的成分分离与鉴定：
将实施例1中的多甲氧基黄酮采用反相硅胶柱层析进行初步分离纯化，以日本YMCODS-A反相C-18填料为固定相，水-甲醇为流动相，流速：6mL/min，依次用10％、20％、30％，40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％甲醇溶液，5倍柱体积，梯度洗脱。洗脱相经高效液相色谱分析，合并相同流分，减压浓缩得到4个组分(Fr.1、Fr.8、Fr.10和Fr.12)。组分Fr.8、Fr.10和Fr.12分别在Ultimate XB-C18(10μm，4.6×250mm)半制备色谱柱上分离纯化，进样量为100μL，流动相分别为60％、72％、80％甲醇水溶液，流速为2mL/min；检测波长：220、254nm。根据出峰时间收集流分，纯化获得化合物1(10.4mg)、2(3.5mg)、5(9.7mg)、6(8.9mg)和7(4.6mg)。其中Fr.8-3、Fr.10-2分别经二次制备得到化合物3(2.8mg)和4(2.0mg)。高效液相色谱仪全成分分析图谱如图1所示。
将上述分离纯化后的产物经高分辨质谱、核磁共振波谱等方法进行结构鉴定，结果为7种化合物。化合物核磁数据如下：
化合物1：
淡黄色粉末；分子式C15H12O5.1H NMR(400MHz,DMSO-d6,δppm):12.18(1H,dr,s,5-OH),10.31(1H,dr,s,7-OH),9.10(1H,dr,s,4'-OH),7.31(2H,d,J＝8.4Hz,2'-Hand6'-H),6.78(2H,d,J＝8.4Hz,3'-Hand5'-H),5.80(2H,s,6-Hand8-H),5.40(1H,dd,J＝3.2,12.8Hz,2-H),3.21(1H,dd,J＝12.8,17.2Hz,2-H),2.64(1H,dd,J＝3.2,17.2Hz,3-H).13C-NMR(100MHz,DMSO-d6,δppm):195.5(C-4),168.3(C-7),163.4(C-5),162.7(C-9),157.6(C-4'),128.9(C-1'),128.2(C-2'and C-6'),115.1(C-3'andC-6'),101.1(C-10),96.1(C-6),95.3(C-8),78.2(C-2),41.9(C-3).根据以上数据，化合物1鉴定为5,7,4'-三羟基黄酮，即柚皮素。
化合物2：
淡黄色粉末；分子式C16H14O6。1H NMR(400MHz,DMSO-d6,δppm):12.19(1H,s,5-OH),10.32(1H,dr,s,7-OH),9.43(1H,dr,s,3'-OH),6.87(3H,m,H-2',5',6'),5.75(2H,d,J＝6.8Hz,H-6and8),5.37(1H,dd,J＝2.3,12.4Hz,2-H),3.76(3H,s,4'-OCH3),3.12(1H,dd,J＝12.4,16.8Hz,3-H),2.64(1H,dd,J＝3.2,17.2Hz,3-H).13C-NMR(100MHz,DMSO-d6,δppm):192.7(C-4),163.4(C-7),162.5(C-5),161.8(C-9),147.7(C-4'),146.4(C-3'),131.3(C-1'),117.4(C-6'),113.9(C-2'),111.9(C-5'),100.8(C-10),96.2(C-6),95.5(C-8),77.8(C-2),55.6(7-OCH3),41.9(C-3).根据以上数据，化合物2鉴定为5,7,3'-三羟基-4'-甲氧基黄酮，即橙皮素。
化合物3：
淡黄色粉末；分子式C17H14O8.1H NMR(400MHz,DMSO-d6,δppm):12.14(1H,s,5-OH),10.68(1H,s,7-OH),9.82(1H,s,4'-OH),9.54(1H,s,3-OH),7.75(2H,m,2'-H and 6'-H),6.97(1H,d,J＝5'-H),6.27(1H,s,6-H),3.85(6H,3',8-OCH3).13C-NMR(100MHz,DMSO-d6,δppm):176.5(C-4),156.9(C-7),155.8(C-5),146.9(C-9),149.3(C-3'),148.8(C-4'),147.8(C-2),136.3(C-3),127.8(C-8),122.6(C-1'),122.1(C-6'),116.1(C-5'),111.6(C-2'),103.4(C-10),98.8(C-6),61.3(8-OCH3),56.0(3'-OCH3).根据核磁共振波数据，化合物3被鉴定为3,5,7,4'-四羟基-3',8-二甲氧基黄酮，即柠檬黄素。
化合物4：
淡黄色粉末；分子式C19H18O6。1H NMR(400MHz,DMSO-d6,δppm):7.98(2H,d,J＝9.2Hz,2'-Hand6'-H),7.13(2H,d,J＝8.8Hz,3'-Hand5'-H),6.68(2H,d,J＝1.6Hz,3-Hand6-H),3.98(3H,s,7-OCH3),3.88(3H,s,5-OCH3),3.85(3H,s,4'-OCH3),3.84(3H,s,8-OCH3).13C-NMR(100MHz,DMSO-d6,δppm):175.7(C-4),161.8(C-4'),159.5(C-2),156.2(C-7),155.6(C-5),150.0(C-9),129.9(C-8),27.5(C-2'andC-6'),123.1(C-1'),114.6(C-3'andC-5'),108.0(C-10),106.2(C-3),93.7(C-6),60.9(8-OCH3),56.3(5-OCH3),56.2(7-OCH3),55.4(4'-OCH3).根据以上数据，化合物4鉴定为5,7,8,4'-四甲氧基黄酮。
化合物5：
淡黄色粉末；分子式C21H22O8。1H NMR(400MHz,DMSO-d6,δppm):7.65(1H,dd,J＝2,8.4Hz,H-6'),7.54(1Hd,J＝2,H-2'),7.16(1H,d,J＝8.4,H-5'),6.86(1H,s,H-3),4.03(3H,s,7-OCH3),3.97(3H,s,5-OCH3),3.88(3H,s,3'-OCH3),3.85(3H,s,4'-OCH3),3.84(3H,s,6-OCH3),3.78(3H,s,8-OCH3).13C-NMR(100MHz,DMSO-d6,δppm):56.2(6-OCH3),56.23(8-OCH3),61.8(4'-OCH3),61.9(3'-OCH3),62.2(7'-OCH3),62.3(5-OCH3),106.8(C-3),109.5(C-2'),112.4(C-5'),114.7(C-10),119.8(C-6'),123.6(C-1'),138.1(C-6),144.0(C-5),147.6(C-9),148.0(C-8),149.5(C-3'),151.4(C-7),152.3(C-4'),160.7(C-2),175.2(C-4).结合核磁共振波谱数据，化合物5鉴定为5,6,7,8,3',4'-六甲氧基黄酮，即川陈皮素。
化合物6：
淡黄色粉末；分子式C22H24O9。1H NMR(400MHz,DMSO-d6,δppm):7.71(1H,dd,J＝2,8.4Hz,H-6'),7.65(1H,d,J＝2.4Hz,H-2'),7.19(1H,d,J＝8.8,H-5'),4.02(3H,s,7-OCH3),3.95(3H,s,5-OCH3),3.86(3H,s,3'-OCH3),3.85(3H,s,4'-OCH3),3.84(3H,s,6-OCH3),3.81(3H,s,3'-OCH3),3.79(3H,s,8-OCH3).13C-NMR(100MHz,DMSO-d6,δppm):55.4(4'-OCH3),55.6(3'-OCH3),59.2(6-OCH3),61.3(8-OCH3),61.4(3-OCH3),61.6(7-OCH3),61.8(5-OCH3),110.7(C-2'),111.7(C-5'),114.3(C-10),121.4(C-6'),122.5(C-1'),137.3(C-6),139.9(C-8),143.2(C-3),146.1(C-5),147.2(C-9),148.4(C-3'),150.7(C-2),150.8(C-7),152.3(C-4'),172.2(C-4).化合物6根据上述数据鉴定为3,5,6,7,8,3',4'-七甲氧基黄酮。
化合物7：
淡黄色粉末；分子式C20H20O7。1H NMR(400MHz,DMSO-d6,δppm):8.00(2H,d,J＝8.8Hz,H-2'andH-6'),7.14(2H,d,J＝8.8Hz,H-3'andH-5'),6.77(1H,s,H-3),4.02(3H,s,7-OCH3),3.99(3H,s,5-OCH3),3.96(3H,s,4'-OCH3),3.85(3H,s,6-OCH3),3.84(3H,s,8-OCH3).13C-NMR(100MHz,DMSO-d6,δppm):56.0(6-OCH3),61.8(8-OCH3),61.9(4'-OCH3),62.3(7-OCH3),62.4(5-OCH3),106.57(C-3),114.8(C-10),115.1(C-3',5'),123.5(C-1'),128.2(C-2',6'),138.2(C-8),144.0(C-6),147.6(C-9),148.0(C-5),151.4(C-4'),160.8(C-2),162.5(C-7),176.2(C-4).根据以上数据，化合物7被鉴定为5,6,7,8,4'-五甲氧基黄酮，即桔皮素。
将实施例1～3使用不同有机溶剂提取的多甲氧基黄酮进行高效液相色谱分析，分析条件为：流动相为甲醇/水，从10％甲醇40min梯度洗脱到100％甲醇，最后100％甲醇洗脱5min；检测波长220nm；流速1mL/min；进样量10μL；色谱柱为Welch Ultimate XB-C18，5μm，4.6×250mm；色谱仪为戴安Ultimate 3000。高效液相色谱仪分析图谱如图2所示。由图2可知，不同溶剂提取物成分有差异，在采用甲醇提取时，提取产物种类更加丰富。
实施例5
多甲氧基黄酮抑制肿瘤细胞生长评价：
本发明所用癌细胞株包括人乳腺癌MCF-7细胞、人肺癌A549细胞、人结肠癌HCT116细胞、人前列腺癌DU145细胞、人黑色素瘤SK-MEL-1细胞、人肝癌HepG2细胞，实施例1的多甲氧基黄酮对上述肿瘤细胞半数抑制浓度IC50值为0.03～0.48μg/μL。现以典型人乳腺癌MCF-7细胞抑制活性为例说明如下。
将实施例1的多甲氧基黄酮(JCCD-EXT)与人乳腺癌MCF-7细胞进行共孵育，具体方法为：将癌人乳腺癌MCF-7细胞接种在含有10％胎牛血清的DMEM培养基中，在培养基中加入100units/mL青霉素和100mg/mL链霉素，置于37℃、5％CO2培养箱中培养。以每孔5000个细胞接种到96孔板过夜，然后加入JCCD-EXT共孵育72h。以实施例1的橘醋发酵底泥(JCCD-1)和橘醋发酵底泥经甲醇浸提后的不溶部分(JCCD-2)分别作为对照组，将3组共孵育后的细胞染色，染色结果如图3所示。由图3可知，JCCD-EXT与人乳腺癌细胞MCF-7细胞共孵育，能显著抑制肿瘤细胞生长；JCCD-1和JCCD-2则不能抑制肿瘤细胞生长。
将上述JCCD-EXT、JCCD-2与人乳腺癌细胞MCF-7细胞共孵育后进行细胞镜检，结果如图4所示。由图4可知，JCCD-2处理后可观察大量存活的肿瘤细胞，JCCD-EXT处理后未观察到明显存活的肿瘤细胞。
将JCCD-EXT、JCCD-1和JCCD-2与人乳腺癌MCF-7细胞共孵育后，采用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法，检测人乳腺癌细胞MCF-7增殖曲线。具体方法为：取对数生长期的细胞，经0.25％胰蛋白酶消化，用含10％胎牛血清的RPMI 1640培养基配制细胞悬液，接种于96孔板，培养24h。将待测样品用DMSO溶解后，用培养基稀释成不同浓度梯度。阴性对照组为等体积的培养基，培养72h后，加10μL MTT溶液，37℃5％CO2培养4h。取出96孔板，吸掉培养基上清液。加入DMSO，振荡10min，使DMSO完全溶解MTT反应的产物。用酶标仪读取490nm波长下的OD值，结果重复三次，取平均值。细胞增殖抑制率＝(A空白-A实验)/A空白×100％，以各化合物浓度与其对应的系列细胞增殖抑制率为变量，分别进行回归分析，结果如图5所示。由图5可知，JCCD-EXT与人乳腺癌细胞MCF-7细胞共孵育，能显著抑制癌细胞生长，其半数抑制浓度IC50值为0.03μg/μL；JCCD-1则不能抑制癌细胞生长；JCCD-2则能促进癌细胞生长。
经碘化丙啶(PI染色)后JCCD-EXT处理的人乳腺癌细胞MCF-7进行周期分析以及G1期、S期和G2/M期细胞比例分析，结果如图6所示。由图6可知，随着样品浓度的增加，G2/M期的细胞所占比例明显上升，其余周期的比例下降，G2/M期的细胞所占比例明显高于未加JCCD-EXT处理的对照组。JCCD-EXT处理下G1期、S期和G2/M期细胞比例分析显示处理细胞24h，对照组G2/M期细胞占比11.14％，而在浓度为160g/mL的JCCD-EXT作用下，G2/M期细胞占比则增加到46.04％(p<0.01)。
将JCCD-EXT处理人乳腺癌细胞MCF-724h后，经tubulin Tracker Green试剂和Hoechst 33258染色，测定JCCD-EXT对MCF-7细胞的微管蛋白和细胞核的影响，结果如图7所示。由图7可知，未加JCCD-EXT处理的对照组细胞的细胞核完整并且染色质均匀，紫外光下呈现均匀的弱蓝色荧光，而JCCD-EXT(160μg/L)处理后部分细胞出现核固缩，核体积变小，蓝色荧光强度加强，染色质结构松散，呈典型的细胞凋亡形态。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种橘醋发酵底泥提取多甲氧基黄酮的方法，其特征在于，包括以下步骤：
将橘醋发酵底泥利用有机溶剂浸提、离心，收集有机相，将固相重复浸提2～6次，合并有机相，减压浓缩，得到多甲氧基黄酮。
2.根据权利要求1所述的一种橘醋发酵底泥提取多甲氧基黄酮的方法，其特征在于，所述橘醋发酵底泥和有机溶剂的质量体积比为1g：1～5mL。
3.根据权利要求1或2所述的一种橘醋发酵底泥提取多甲氧基黄酮的方法，其特征在于，所述有机溶剂为醇溶剂、乙酸乙酯或丙酮。
4.根据权利要求3所述的一种橘醋发酵底泥提取多甲氧基黄酮的方法，其特征在于，所述将橘醋发酵底泥利用有机溶剂浸提前还包括将橘醋发酵底泥水洗，离心。
5.根据权利要求1、2或4所述的一种橘醋发酵底泥提取多甲氧基黄酮的方法，其特征在于，所述浸提温度为20～70℃，时间为3～48h。
6.根据权利要求5所述的一种橘醋发酵底泥提取多甲氧基黄酮的方法，其特征在于，所述减压浓缩时间为3～4h，温度为50～60℃。
7.权利要求1～6任一项所述的一种橘醋发酵底泥提取多甲氧基黄酮的方法制得的多甲氧基黄酮，其特征在于，所述多甲氧基黄酮包括5,7,4'-三羟基黄酮、5,7,3'-三羟基-4'-甲氧基黄酮、3,5,7,4'-四羟基-8,3'-二甲氧基黄酮、5,7,8,4'-四甲氧基黄酮、5,6,7,8,3',4'-六甲氧基黄酮、3,5,6,7,8,3',4'-七甲氧基黄酮和5,6,7,8,4'-五甲氧基黄酮中的一种或几种。
8.权利要求7所述的多甲氧基黄酮的应用，其特征在于，权利要求7所述的多甲氧基黄酮中的一种或几种用于制备食品、保健品或治疗肿瘤疾病的药物。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述肿瘤疾病包括乳腺癌、肺癌、结肠癌、前列腺癌、黑色素瘤或肝癌。
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