CN111072738B

CN111072738B - 一种从林檎中同时分离纯化得到白杨素-5-葡萄糖苷和白杨素的方法

Info

Publication number: CN111072738B
Application number: CN201911411443.9A
Authority: CN
Inventors: 蔡爱华; 霍华珍; 谢运昌; 孙博; 李典鹏
Original assignee: Guangxi Institute of Botany of CAS
Current assignee: Guangxi Institute of Botany of CAS
Priority date: 2019-12-31
Filing date: 2019-12-31
Publication date: 2021-09-28
Anticipated expiration: 2039-12-31
Also published as: CN111072738A

Abstract

本发明公开了一种从林檎中同时分离纯化得到白杨素‑5‑葡萄糖苷和白杨素的方法，该方法具体是以林檎的枝和/或叶为原料，获取其提取液；提取液浓缩至浸膏，所得浸膏用5‑30v/v％低碳醇或pH≥8的碱液溶解，取上清液上大孔吸附树脂柱分离纯化，以低碳醇‑水体系进行梯度洗脱，分段收集流份，分别合并富含白杨素‑5‑葡萄糖苷和白杨素的流份并回收溶剂，分别得到白杨素‑5‑葡萄糖苷和白杨素。本申请所述方法首次以林檎枝和/或叶为原料时，仅通过简单的大孔吸附树脂柱纯化同时分离得到了白杨素‑5‑葡萄糖苷和白杨素，而且纯度较高；本发明所述方法简单易操作，处理量大，回收率高，工艺周期短，生产成本低，易于实现工业化生产。

Description

一种从林檎中同时分离纯化得到白杨素-5-葡萄糖苷和白杨素的方法

技术领域

本发明涉及从植物中提取分离活性成分的方法，具体涉及一种从林檎中同时分离纯化得到白杨素-5-葡萄糖苷和白杨素的方法。

背景技术

林檎，属于蔷薇科苹果属植物，有中国台湾林檎(Malus doumeri(Boi s)Chevalier)、尖嘴林檎(Malus melliana(Hand.-Mazz.)Rehder)和光萼林檎(Malusleiocalyca S.Z.Huang)三个近缘种，主要分布于我国江西、湖南、福建、广西、云南、贵州及中国台湾等地区。广西俗称的“大果山楂”、“广山楂”，湖南俗称的“冬梨子”、“花红”均属中国台湾林檎。

林檎中富含多酚、黄酮、三萜等生物活性成分，具有防癌、降压、降脂、抗氧化、保肝、抑菌、提高免疫力等广泛的药理活性，在我国广西、广东、湖南等地作为山楂习用已有多年的历史。目前林檎中活性成分的研究主要集中在以粗提物总黄酮、总酚或总三萜等指标进行各种工艺优化及粗提物抗氧化、降血脂、保肝、抑菌等相关活性的研究，或者仅着重于化学成分的分离，对提取物中具体的活性成分及含量研究不够。分析林檎中的有效活性物质，并将其多种主要活性成分安全、高效、环境友好的同时充分提取出来，得到纯度较高的产品，对于林檎资源的高效利用具有重要意义。

白杨素(chrysin)即5，7-二羟基黄酮，又称白杨黄素，是一种黄酮类化合物，其分子式为C₁₅H₁₀O₄，分子量为254，具有抗氧化、抗肿瘤、抗癌、抗病毒、抗高血压、抗糖尿病、抗菌、抗过敏等广泛的药理活性，是合成抗癌、降血脂、抗菌、消炎等新药开发研究中一个非常重要的资源。白杨素糖苷为白杨素苷元上的活性氢和糖(或糖的衍生物)的半缩醛(或半缩酮羟基)脱水形成的另一类黄酮类化合物，苷元和该种苷元形成的一种或多种糖苷在植物体内基本上是同时存在并能相互转化，白杨素糖苷类化合物通过酸、酶等水解很容易转化成白杨素苷元。白杨素-5-葡萄糖苷(Chrysin-5-glucopyranoside)即三叶海棠素(Toringin)，为白杨素糖苷类化合物中的一种，其分子式为C₂₁H₂₀O₉，分子量为416，具有抗癌、降低细胞毒性、保护PC12神经细胞等药理活性，即可以单独开发作为一个产品在医药领域中发挥重要作用，也可以将其水解成白杨素加以利用。

已有的报道中，从植物中提取分离白杨素糖苷或白杨素的方法很多，如公开号为CN104926771A(以木蝴蝶、山白松、芒松、三叶海棠等为原料提取白杨素)、CN102329356A(以三叶海棠为原料提取白杨素)、CN102344430A(以三叶海棠为原料提取白杨素)、CN102464687A(以三叶海棠为原料提取白杨素-5-葡萄糖苷)等。这些方法中，主要有醇提聚酰胺柱纯化法、醇提大孔吸附树脂富集溶剂萃取法、水提大孔吸附树脂纯化法、水提醇沉法等，但现有技术要么仅着重于从一种原料中直接提取白杨素或者直接提取白杨素糖苷，对于原料中同时存在白杨素或白杨素糖苷时，提取液中白杨素或白杨素糖苷中的另外一种就不能充分获得；要么直接将原料中的白杨素糖苷通过酸、酶水解成白杨素再进行提取分离，如此虽可充分获取原料中的白杨素糖苷苷元，但提取前的酸、酶水解过程也会导致原料中其它组分的分解而产生大量的副产物，提取液中白杨素的后续分离难度提高，目标产物的最终回收率偏低或者分离纯化成本增加。综上可知，现有的方法从植物中通过简单的大孔吸附树脂柱纯化都只能单一地分离得到白杨素糖苷或白杨素，还未见从一种原料中同时分离纯化得到白杨素和白杨素糖苷的相关报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种简便、高效的从林檎中同时分离纯化得到白杨素-5-葡萄糖苷和白杨素的方法。

本发明所述的一种从林檎中同时分离纯化得到白杨素-5-葡萄糖苷和白杨素的方法，包括：以林檎的枝和/或叶为原料，获取其提取液；提取液浓缩至浸膏，所得浸膏用5-30v/v％低碳醇或pH≥8.0的碱液溶解，取上清液上大孔吸附树脂柱分离纯化，以低碳醇-水体系进行梯度洗脱，分段收集流份，分别合并富含白杨素-5-葡萄糖苷和白杨素的流份并回收溶剂，分别得到白杨素-5-葡萄糖苷和白杨素。

本发明所述方法以林檎的枝和/或叶为原料，所得浸膏先用5-30v/v％低碳醇或pH≥8的碱液溶解，所得上清液仅通过简单的大孔吸附树脂进行处理即可一步实现两种目标产物的同时富集和分离纯化，而且所得目标产物的纯度较高(白杨素-5-葡萄糖苷纯度为83.5％以上，白杨素纯度为87.5％以上，均采用HPLC法检测，下同)。

上述方法中，所述的林檎具体可以是选自中国台湾林檎(Malus doume ri(Bois)Chevalier)、尖嘴林檎(Malus melliana(Hand.-Mazz.)Rehder)和光萼林檎(Malusleiocalyca S.Z.Huang)中的一种或两种以上的组合。用作原料的林檎枝和/或叶可以是新鲜的也可以是干燥的，为了使原料中的白杨素-5-葡萄糖苷和白杨素更充分的提取出来，优选是在提取之前对所述枝和/或叶作砍段、切片、粉碎等处理，更优选是将原料粉碎至20-40目再进行提取。

上述方法中，申请人发现，所得浸膏的溶解程度及后续用低碳醇-水体系梯度洗脱之前采用树脂柱的平衡处理对能够一步实现两种目标产物的同时富集和分离纯化起着极为重要的作用。申请人的试验结果表明，当以5-30v/v％低碳醇溶解浸膏时，优选是控制溶解的程度为饱和，更优选是采用10-25v/v％低碳醇溶解浸膏至饱和；当以pH≥8.0的碱液溶解浸膏时，优选是控制溶解的程度为所得料液的pH＝7.1-9.0，更优选是采用pH＝8.5-11.0的碱液溶解浸膏并控制溶解的程度为所得料液的pH＝7.5-8.5。当以5-30v/v％低碳醇溶解浸膏时，所得上清液上完柱后，先用5-30v/v％低碳醇洗柱(用量优选为柱体积的2-4倍)，再以低碳醇-水体系进行梯度洗脱；而当以pH≥8.0的碱液溶解浸膏时，所得上清液上完柱后，先用pH＝7.1-9.0的碱液洗柱(用量优选为柱体积的2-4倍)，再以低碳醇-水体系进行梯度洗脱。

上述方法中，所述的低碳醇-水体系为甲醇-水体系或乙醇-水体系，在对大孔吸附树脂柱进行梯度洗脱的过程中，通常是以低碳醇和水按5：95至95：5的体积比进行梯度洗脱。当前序是以5-30v/v％低碳醇溶解浸膏时，收集低碳醇-水体系按50：50至70：30的体积比的洗脱部位，即为富含白杨素-5-葡萄糖苷的流份；收集低碳醇-水体系按80：20至95：5的体积比的洗脱部位，即为富含白杨素的流份。当以pH≥8的碱液溶解浸膏时，收集低碳醇-水体系按30：70至70：30的体积比的洗脱部位，即为富含白杨素-5-葡萄糖苷的流份；收集低碳醇-水体系按80：20至95：5的体积比的洗脱部位，即为富含白杨素的流份。在收集洗脱液时，采用现有常规TLC或HPLC等方法分段收集含目标成分的流份。

上述方法中，为防止目标成分在上样过程中析出，优选是在上样之前先用5-30v/v％低碳醇或者是与用pH≥8.0的碱液溶解浸膏所得料液的pH值对应的碱液平衡大孔吸附树脂，此时，5-30v/v％低碳醇或用pH≥8.0的碱液溶解浸膏所得料液的pH值对应的碱液的用量优选为柱体积的2-4倍。

上述方法中，所述的大孔树脂为能吸附分离白杨素-5-葡萄糖苷和白杨素的药用级大孔吸附树脂，优选的型号为Amberlite XAD16、X-5、AB-8或DA101等。

上述方法得到的白杨素-5-葡萄糖苷和白杨素虽然纯度较高(纯度分别为83.5％以上和87.5％以上)，但不符合特殊场合的使用，为了进一步提高所得白杨素-5-葡萄糖苷和白杨素的纯度，本发明所述方法优选还包括对所得白杨素-5-葡萄糖苷和白杨素分别进行纯化的步骤。所述纯化的方法与现有技术相同，具体可以是对所得白杨素-5-葡萄糖苷和白杨素分别用甲醇和/或乙醇进行重结晶，以得到纯化后的白杨素-5-葡萄糖苷和白杨素。经检测(HPLC法，下同)，经重结晶1次后的白杨素-5-葡萄糖苷的纯度为99.0％以上，白杨素的纯度为99.0％以上。

本申请中，所述的低碳醇优选为甲醇和/或乙醇；所述的碱液为碱性物质的水溶液，所述的碱性物质可以是现有常规的有机碱或无机碱，优选为氨水、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾、碳酸氢钾、碳酸铵、碳酸氢铵、氢氧化钠和氢氧化钾等中的一种或两种以上的组合。

本申请中，可以采用现有常规的溶媒及提取方法对林檎的枝和/或叶进行提取以获得其提取液，具体可以是以低碳醇和/或碱液为溶媒进行提取，得到林檎的提取液。其中的低碳醇为浓度5-100v/v％甲醇和/或乙醇，优选的浓度为50-80v/v％；碱液为pH≥8的碱性物质的水溶液，碱性物质的选择同前述；优选采用pH＝8.5-10的碱液为溶媒进行提取。在提取时的操作(如提取的方式、提取的时间等)均与现有相同，优选采用超声提取、加热提取或回流提取。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

1、本申请拓展了获得白杨素-5-葡萄糖苷和白杨素的原料来源。

2、本发明以林檎枝和/或叶为原料，仅通过简单的大孔吸附树脂柱纯化即可以同时分离得到纯度较高的白杨素-5-葡萄糖苷和白杨素(两者的纯度分别为83.5％以上和87.5％以上)，方法简单易操作，而且处理量大，回收率高(白杨素-5-葡萄糖苷84.0％以上，HPLC法，下同；白杨素85.0％以上，HPLC法，下同)，工艺周期短，生产成本低，易于实现工业化生产。

3、将白杨素-5-葡萄糖苷和白杨素分别作为不同产品分离纯化出来，即可在医药领域中各自发挥重要作用，也可将纯化后的白杨素-5-葡萄糖苷水解成白杨素后再加以利用，可以避免在纯化前酸、酶水解产生的大量副产物而存在的白杨素后续分离难度提高、目标产物的最终回收率偏低或者分离纯化成本增加等问题。

附图说明

图1为本发明实施例1中步骤5)所得白杨素-5-葡萄糖苷的高效液相色谱图。

图2为本发明实施例1中步骤5)所得白杨素的高效液相色谱图。

图3为本发明实施例1中步骤6)所得白杨素-5-葡萄糖苷的高效液相色谱图。

图4为本发明实施例1中步骤6)所得白杨素的高效液相色谱图。

在图1-4中，I：白杨素-5-葡萄糖苷；II：白杨素。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的详述，以更好地理解本发明的内容，但本发明并不限于以下实施例。

实施例1

1)取中国台湾林檎(Malus doumeri(Bois)Chevalier)的树枝，晒干，粉碎，过20目筛，收集筛下物作为提取原料；对提取原料中白杨素-5-葡萄糖苷和白杨素的含量进行检测(HLPC法，下同)，分别为3.87％和1.05％；

2)将5Kg提取原料置于提取容器中，加入相当于原料8倍重量的60v/v％乙醇，升温至70℃超声提取(超声功率为200W)1.0h，过滤，滤渣再重复上述条件提取2次，合并滤液，得到提取液；

3)所得提取液真空浓缩至浸膏，所得浸膏用15v/v％乙醇溶解至饱和溶液，静置过夜，取上清液备用；

4)先用3倍柱体积、15v/v％乙醇平衡大孔吸附树脂柱(树脂型号为AmberliteXAD16)，然后将步骤3)所得上清液上大孔吸附树脂柱，上样完成后，先用3倍柱体积、15v/v％乙醇洗柱，用乙醇-水体系进行梯度洗脱(乙醇和水的体积比为15：85至95：5)，先收集乙醇和水按50：50至70：30的体积比的洗脱部位，即为富含白杨素-5-葡萄糖苷的流份，记为样品1；再收集乙醇和水按80：20至95：5的体积比的洗脱部位，即为富含白杨素的流份，记为样品2；

5)将样品1浓缩至干，得到白杨素-5-葡萄糖苷193.7g，经检测，纯度为85.0％，高效液相色谱图如图1所示；将样品2浓缩至干，得到白杨素51.9g，经检测，纯度为90.0％，高效液相色谱图如图2所示；经计算，白杨素-5-葡萄糖苷的回收率为85.1％，白杨素的回收率为89.0％；

6)将步骤5)所得的白杨素-5-葡萄糖苷和白杨素分别用乙醇重结晶1次，分别得到浅棕色产物(白杨素-5-葡萄糖苷纯品)155.0g(经检测，纯度为99.1％)和浅黄色产物(白杨素纯品)44.1g(经检测，纯度为99.2％)。

对本实施例步骤6)所得的浅棕色产物进行紫外光谱、质谱、核磁共振氢谱和碳谱表征，数据如下：

UV/VIS(甲醇，λnm)266,310。

HRESIMS[M-H]^-415.1018，计算值415.1029，分子式为C₂₁H₂₀O₉。

¹H-NMR、¹³C-NMR数据见表1。

表1

将所得浅棕色产物在2mol/L的盐酸甲醇溶液中，于80℃水解2小时，水解产物与本实施例步骤6)所得淡黄色产物完全一致。其¹H-NMRδ:4.75(d,J＝7.4Hz,1H)、3.36(t,J＝8.0Hz,1H)、3.31(t,J＝8.0Hz,1H)、3.22(t,J＝8.0Hz,1H)、3.35(dd,J＝5.5,8.0Hz,1H)、3.55(dd,J＝5.5,12.0Hz,1H)、3.75(d,J＝12.0Hz,1H)以及¹³C-NMRδ:105.1、72.9、75.6、70.0、76.8、61.8为β-D-葡萄吡喃糖的特征；¹H-NMRδ:8.02(d,J＝8.4Hz,2H)、7.58(t,J＝7.55Hz,1H)、(dd,J＝8.0,8.4Hz,2H)以及¹³C-NMR130.7、125.5、128.4、130.9为黄酮B环1′位取代苯的特征,¹H-NMRδ:6.80(s,1H)为黄酮C环3位H未被取代的特征，¹H-NMRδ:6.79(d,J＝2.1Hz,1H)、6.75(d,J＝2.1Hz,1H)为黄酮A环间位被取代的特征，A、C环¹³C-NMR化学位移与芹菜素-5-葡萄糖苷以及木犀草素-5-葡萄糖苷接近，而与白杨素-7-葡萄糖苷、芹菜素-7-葡萄糖苷以及木犀草素-7-葡萄糖苷有较大的差别，表明产物极可能与芹菜素-5-葡萄糖苷以及木犀草素-5-葡萄糖苷具有相同A、C环,，即葡萄糖成苷位置为黄酮的5-位。加AlCl₃样品UV吸收峰无明显变化，表明化合物不能与铝离子形成稳定的络合物，进一步证实了浅棕色化合物的5-羟基被取代。

因此，本实施例步骤6)所得的浅棕色产物可以确定为白杨素-5-葡萄糖苷，化学结构如下述式(I)所示：

对本实施例步骤6)所得的淡黄色产物进行紫外光谱、质谱、核磁共振氢谱和碳谱表征，数据如下：

UV/VIS(甲醇，λnm)260,310。

HRESIMS[M-H]^-253.0508，计算值253.0501，分子式C₁₅H₁₀O₄。

¹H-NMR(500MHz,DMSO-d₆)δ12.83(1H,s,OH-5),10.96(1H,s,OH-7),7.99(2H,d,J＝7.6Hz,H-2',6'),7.52(2H,dd,J＝7.6,7.2Hz,H-3',5'),7.56(1H,t,J＝7.2Hz,H-4'),6.87(1H,s,H-3),6.48(1H,d,J＝1.9Hz,H-8),6.21(1H,d,J＝1.9Hz,H-6).

¹³C-NMR(125MHz,DMSO-d₆)δ181.9(C-4),164.5(C-7),163.2(C-2),161.6(C-5),157.5(C-9),132.0(C-4'),130.8(C-1'),129.1(C-3',5'),126.4(C-2',6'),105.2(C-3),104.0(C-10),99.1(C-6),94.2(C-8).

上述数据与文献报道相同，因此，本实施例步骤6)所得的浅黄色产物可以确定为白杨素。化学结构如下述式(Ⅱ)所示：

对比例1

取中国台湾林檎Malus doumeri(Bois)Chevalier的果实，晒干，粉碎，过20目筛，收集筛下物作为提取原料；对提取原料中白杨素-5-葡萄糖苷和白杨素的含量进行检测(HLPC法，下同)，分别为0.23％和0.03％；由于提取原料中目标物含量太低而不再继续提取分离步骤。

实施例2

1)取中国台湾林檎Malus doumeri(Bois)Chevalier)的树叶，晒干，粉碎，过20目筛，收集筛下物作为提取原料；对提取原料中白杨素-5-葡萄糖苷和白杨素的含量进行检测(HLPC法，下同)，分别为4.43％和1.07％；

2)将5Kg提取原料置于提取容器中，加入相当于原料6倍重量的80v/v％甲醇，升温至60℃回流提取2.0h，过滤，滤渣再重复上述条件提取2次，合并滤液，得到提取液；

3)所得提取液真空浓缩至浸膏，所得浸膏用10v/v％甲醇溶解至饱和溶液，静置过夜，取上清液备用；

4)先用2倍柱体积、10v/v％甲醇平衡大孔吸附树脂柱(树脂型号为X-5)，然后将步骤3)所得上清液上大孔吸附树脂柱，上样完成后，先用2倍柱体积、10v/v％甲醇洗柱，用甲醇-水体系进行梯度洗脱(甲醇和水的体积比为10：90至95：5)，先收集甲醇和水按50：50至70：30的体积比的洗脱部位，即为富含白杨素-5-葡萄糖苷的流份，记为样品1；再收集甲醇和水按80：20至95：5的体积比的洗脱部位，即为富含白杨素的流份，记为样品2；

5)将样品1浓缩至干，得到白杨素-5-葡萄糖苷222.0g，经检测，纯度为84.1％；将样品2浓缩至干，得到白杨素52.5g，经检测，纯度为88.6％；经计算，白杨素-5-葡萄糖苷的回收率为84.3％，白杨素的回收率为85.4％；

6)将步骤5)所得的白杨素-5-葡萄糖苷和白杨素分别用甲醇重结晶1次，分别得到浅棕色产物(白杨素-5-葡萄糖苷纯品)176.1g(经检测，纯度为99.0％)和浅黄色产物(白杨素纯品)44.1g(经检测，纯度为99.1％)。

实施例3

1)取尖嘴林檎(Malus melliana(Hand.-Mazz.)Rehder)的树枝，晒干，粉碎，过40目筛，收集筛下物作为提取原料；对提取原料中白杨素-5-葡萄糖苷和白杨素的含量进行检测，分别为3.34％和1.21％；

2)将5Kg提取原料置于提取容器中，加入相当于原料5倍重量的80v/v％乙醇，回流提取2.0h，过滤，滤渣再重复上述条件提取1次，合并滤液，得到提取液；

3)所得提取液真空浓缩至浸膏，所得浸膏用25v/v％乙醇溶解至饱和溶液，静置过夜，取上清液备用；

4)先用3倍柱体积、25v/v％乙醇平衡大孔吸附树脂柱(树脂型号为AB-8)，然后将步骤3)所得上清液上大孔吸附树脂柱，上样完成后，先用3倍柱体积、25v/v％乙醇洗柱，用乙醇-水体系进行梯度洗脱(乙醇和水的体积比为25：75至95：5)，先收集乙醇和水按50：50至70：30的体积比的洗脱部位，即为富含白杨素-5-葡萄糖苷的流份，记为样品1；再收集乙醇和水按80：20至95：5的体积比的洗脱部位，即为富含白杨素的流份，记为样品2；

5)将样品1浓缩至干，得到白杨素-5-葡萄糖苷165.4g，经检测，纯度为85.3％；将样品2浓缩至干，得到白杨素61.0g，经检测，纯度为88.6％；经计算，白杨素-5-葡萄糖苷的回收率为84.5％，白杨素的回收率为89.4％；

6)将步骤5)所得的白杨素-5-葡萄糖苷和白杨素分别用乙醇重结晶1次，分别得到浅棕色产物(白杨素-5-葡萄糖苷纯品)133.3g(经检测，纯度为99.0％)和浅黄色产物(白杨素纯品)51.1g(经检测，纯度为99.0％)。

实施例4

1)、2)同实施例3；

3)所得提取液真空浓缩至浸膏，所得浸膏用pH＝8.0的碳酸钠水溶液溶解至所得料液的pH＝7.5，静置过夜，取上清液备用；

4)先用4倍柱体积、pH＝7.5的碳酸钠水溶液平衡大孔吸附树脂柱(树脂型号为AB-8)，然后将步骤3)所得上清液上大孔吸附树脂柱，上样完成后，先用3倍柱体积、pH＝7.5的碳酸钠水溶液洗柱，再用乙醇-水体系进行梯度洗脱(乙醇和水的体积比为5：95至95：5)，先收集乙醇和水按30：70至70：30的体积比的洗脱部位，即为富含白杨素-5-葡萄糖苷的流份，记为样品1；再收集乙醇和水按80：20至95：5的体积比的洗脱部位，即为富含白杨素的流份，记为样品2；

5)将样品1浓缩至干，得到白杨素-5-葡萄糖苷165.2g，经检测，纯度为85.1％；将样品2浓缩至干，得到白杨素60.5g，经检测，纯度为88.4％；经计算，白杨素-5-葡萄糖苷的回收率为84.2％，白杨素的回收率为88.4％；

6)将步骤5)所得的白杨素-5-葡萄糖苷和白杨素分别用甲醇重结晶1次，分别得到浅棕色产物(白杨素-5-葡萄糖苷纯品)133.2g(经检测，纯度为99.1％)和浅黄色产物(白杨素纯品)50.7g(经检测，纯度为99.2％)。

实施例5

1)取光萼林檎(Malus leiocalyca S.Z.Huang)的树枝，晒干，粉碎，过40目筛，收集筛下物作为提取原料；对提取原料中白杨素-5-葡萄糖苷和白杨素的含量进行检测，分别为3.80％和1.12％；

2)将5Kg提取原料置于提取容器中，加入相当于原料8倍重量的50v/v％乙醇，升温至90℃回流提取3.0h，过滤，滤渣再重复上述条件提取2次，合并滤液，得到提取液；

3)所得提取液真空浓缩成浸膏，所得浸膏用pH＝11.0的氢氧化钾水溶液溶解至所得料液的pH＝9.0，静置过夜，取上清液备用；

4)先用3倍柱体积、pH＝9.0的氢氧化钾水溶液平衡大孔吸附树脂柱(树脂型号为DA101)，然后将步骤3)所得上清液上大孔吸附树脂柱，上样完成后，先用3倍柱体积、pH＝9.0的氢氧化钾水溶液洗柱，再用乙醇-水体系进行梯度洗脱(乙醇和水的体积比为5：95至95：5)，先收集乙醇和水按30：70至70：30的体积比的洗脱部位，即为富含白杨素-5-葡萄糖苷的流份，记为样品1；再收集乙醇和水按80：20至95：5的体积比的洗脱部位，即为富含白杨素的流份，记为样品2；

5)将样品1浓缩至干，得到白杨素-5-葡萄糖苷192.9g，经检测，纯度为84.9％；将样品2浓缩至干，得到白杨素54.9g，经检测，纯度为89.9％；经计算，白杨素-5-葡萄糖苷的回收率为86.2％，白杨素的回收率为88.2％；

6)将步骤5)所得的白杨素-5-葡萄糖苷和白杨素分别用甲醇重结晶1次，分别得到浅棕色产物(白杨素-5-葡萄糖苷纯品)154.3g(经检测，纯度为99.0％)和浅黄色产物(白杨素纯品)46.5g(经检测，纯度为99.1％)。

实施例6

1)取光萼林檎(Malus leiocalyca S.Z.Huang)的树叶，晒干粉碎，过40目筛，收集筛下物作为提取原料；对提取原料中白杨素-5-葡萄糖苷和白杨素的含量进行检测，分别为4.31％和1.02％；

2)将5Kg提取原料置于提取容器中，加入相当于原料7倍重量的pH＝9.0的碳酸钠水溶液，升温至70℃回流提取3.0h，过滤，滤渣再重复上述条件提取1次，合并滤液，得到提取液；

3)所得提取液真空浓缩成浸膏，所得浸膏用pH＝10.0的氨水溶解至所得料液的pH＝8.5，静置过夜，取上清液备用；

4)先用2倍柱体积、pH＝8.5的氨水平衡大孔吸附树脂柱(树脂型号为HPD-400)，然后将步骤3)所得上清液上大孔吸附树脂柱，上样完成后，先用3倍柱体积、pH＝8.5的氨水洗柱，再用乙醇-水体系进行梯度洗脱(乙醇和水的体积比为5：95至95：5)，先收集乙醇和水按30：70至70：30的体积比的洗脱部位，即为富含白杨素-5-葡萄糖苷的流份，记为样品1；再收集乙醇和水按80：20至95：5的体积比的洗脱部位，即为富含白杨素的流份，记为样品2；

5)将样品1浓缩至干，得到白杨素-5-葡萄糖苷218.8g，经检测，纯度为83.9％；将样品2浓缩至干，得到白杨素51.1g，经检测，纯度为87.9％；经计算，白杨素-5-葡萄糖苷的回收率为85.2％，白杨素的回收率为88.1％；

6)将步骤5)所得的白杨素-5-葡萄糖苷和白杨素分别用乙醇重结晶1次，分别得到浅棕色产物(白杨素-5-葡萄糖苷纯品)172.9g(经检测，纯度为99.1％)和浅黄色产物(白杨素纯品)42.3g(经检测，纯度为99.2％)。

Claims

1.一种从林檎中同时分离纯化得到白杨素-5-葡萄糖苷和白杨素的方法，其特征在于：以林檎的枝和/或叶为原料，获取其提取液；提取液浓缩至浸膏，所得浸膏用5-30v/v％低碳醇或pH≥8.0的碱液溶解，取上清液上大孔吸附树脂柱分离纯化，以低碳醇-水体系进行梯度洗脱，分段收集流份，分别合并富含白杨素-5-葡萄糖苷和白杨素的流份并回收溶剂，分别得到白杨素-5-葡萄糖苷和白杨素；其中，

当以5-30v/v％低碳醇溶解浸膏时，控制溶解的程度为饱和；当以5-30v/v％低碳醇溶解浸膏时，所得上清液上完柱后，先用5-30v/v％低碳醇洗柱，再以低碳醇-水体系进行梯度洗脱；收集低碳醇-水体系按50：50至70：30的体积比的洗脱部位，即为富含白杨素-5-葡萄糖苷的流份；收集低碳醇-水体系按80：20至95：5的体积比的洗脱部位，即为富含白杨素的流份；

当以pH≥8.0的碱液溶解浸膏时，控制溶解的程度为所得料液的pH＝7.1-9.0；当以pH≥8.0的碱液溶解浸膏时，所得上清液上完柱后，先用pH＝7.1-9.0的碱液洗柱，再以低碳醇-水体系进行梯度洗脱；收集低碳醇-水体系按30：70至70：30的体积比的洗脱部位，即为富含白杨素-5-葡萄糖苷的流份；收集低碳醇-水体系按80：20至95：5的体积比的洗脱部位，即为富含白杨素的流份。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的林檎为选自中国台湾林檎Malusdoumeri(Bois)Chevalier、尖嘴林檎Malus melliana(Han d.-Mazz.)Rehder和光萼林檎Malus leiocalyca S.Z.Huang中的一种或两种以上的组合。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述的低碳醇为甲醇和/或乙醇。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述的碱液为碱性物质的水溶液。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：以林檎的枝和/或叶为原料，以低碳醇或碱液为溶媒进行提取，得到林檎的提取液。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述的低碳醇为甲醇和/或乙醇，所述的碱液为碱性物质的水溶液。

7.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：还包括对得到白杨素-5-葡萄糖苷和白杨素分别进行纯化的步骤。