CN102942611A

CN102942611A - 制备高纯度赛门苷ⅰ的方法

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Publication number: CN102942611A
Application number: CN2012105263555A
Authority: CN
Inventors: 李晓波; 王梦月; 邢世华; 黄文武; 沈潇男
Original assignee: Shanghai Jiaotong University
Current assignee: Shanghai Jiaotong University
Priority date: 2012-12-07
Filing date: 2012-12-07
Publication date: 2013-02-27

Abstract

一种生物医药技术领域的制备高纯度赛门苷Ⅰ的方法，通过将罗汉果水煮后的上清液通过大孔树脂吸附后经减压洗脱得到浸膏，将浸膏溶解，取上清液上ODS柱，洗去杂质后得到赛门苷Ⅰ粗品，再将粗品进行Sephadex LH-20柱层析，经乙醇梯度洗脱后进行HPLC检测并合并含赛门苷Ⅰ的流份，最后回收溶剂即得赛门苷Ⅰ精制品。本发明通过水提法，采用三种不同分离机制的柱层析进行分离，整个过程只使用乙醇、水，不使用有毒溶剂；具有纯度高、得率高、工艺简单、成本低等优点。

Description

制备高纯度赛门苷Ⅰ的方法

技术领域

本发明涉及的是一种生物医药技术领域的方法，具体是一种制备高纯度赛门苷Ⅰ的方法。

背景技术

罗汉果SiraitiaeFructus为我国特产药材，具有清热润肺、利咽开音、润肠通便之功效，常用于肺热燥咳、咽痛失音、肠燥便秘的治疗。罗汉果主要含有罗汉果甜苷等化学成分，罗汉果甜苷为一系列葫芦烷型三萜皂苷，常作为天然甜味剂在药品、食品、饮料中广泛应用。现代研究发现，罗汉果甜苷中赛门苷Ⅰ，即siamenoside I：

的甜度最大，为蔗糖的560倍，甜度纯正，起甜快，甜味绵长，无甜叶菊苷、甘草甜素等天然甜味剂之后苦涩味，极易溶于水，稳定性良好；同时，赛门苷Ⅰ几乎不产生热量，具有不升高血糖、不升高血脂等优点；具有降血糖、降血脂等活性，因此，赛门苷Ⅰ非常适合作为糖尿病人、肥胖人群的保健食品，是优良的天然甜味剂。另外，赛门苷Ⅰ也是罗汉果的活性成分和特征性成分，高纯度的赛门苷Ⅰ可以用于罗汉果的鉴别及质量评价。因此，制备高纯度的赛门苷Ⅰ具有重要意义。

然而，目前已在罗汉果中发现罗汉果苷ⅡE（mogroside ⅡE）、7-氧-罗汉果苷ⅡE(7-oxomogroside ⅡE)、罗汉果苷ⅢE（mogrosideⅢE）、罗汉果苷Ⅳ（mogrosideⅣ）、罗汉果苷Ⅴ（mogrosideⅤ）、罗汉果苷Ⅵ（mogrosideⅥ）、赛门苷Ⅰ（siamenoside Ⅰ）、11-氧-罗汉果苷Ⅴ（11-oxo-mogroside Ⅴ）、7-氧-罗汉果苷Ⅴ（7-oxomogroside Ⅴ）等20多种皂苷，这些皂苷结构类似，分离难度大。

经对现有技术文献进行检索，公开号102180930A公开日2011-09-14，记载了一种“纯化赛门苷Ⅰ的方法”：该技术将罗汉果粉碎，加入5-15倍量40-60%甲醇提取2-3次，提取液减压回收甲醇，母液加适量水分散滤过，加入大孔树脂柱吸附，4-6BV40-60%甲醇溶液洗脱，收集洗脱液减压浓缩，浓缩液加甲醇至醇浓度50-70%，加活性炭共沸，脱色液滤过，加氯仿搅拌均匀静置分层，收集氯仿层，回收氯仿，得粗品，选用乙酸乙酯-正丁醇-磷酸水(pH2-3)溶液系统，采用高速逆流色谱分离，减压干燥即得赛门苷I纯品。采用该方法操作繁琐，需使用氯仿、甲醇等有毒溶剂，且所采用的纯化设备高速逆流色谱仪价格昂贵。

李倩在《高纯罗汉果苷V的提取纯化技术研究》（《湖南农业大学》2011年）中公开了一种建立HPLC定量检测罗汉果苷Ⅴ的方法，其HPLC色谱条件为：色谱柱为Hypersil ODS(250mm×4.6mm，5μm)，柱温35℃，检测波长为203mn，流动相为乙腈：水(23：77，v/v)，进样量20μL，流速0.8mL/min。但该技术使用硅胶柱，样品损失大，在制备罗汉果苷V的过程中，赛门苷Ⅰ极易损失。同时，该技术使用氯仿、甲醇等有毒溶剂。

发明内容

本发明针对现有技术存在的上述不足，提出一种制备高纯度赛门苷Ⅰ的方法，通过水提法，采用三种不同分离机制的柱层析进行分离，整个过程只使用乙醇、水，不使用有毒溶剂；具有纯度高、得率高、工艺简单、成本低等优点。

本发明是通过以下技术方案实现的：本发明通过将罗汉果水煮后的上清液通过大孔树脂吸附后经减压洗脱得到浸膏，将浸膏溶解并取上清液上ODS柱并洗去杂质后得到赛门苷Ⅰ粗品，再将粗品进行Sephadex LH-20柱层析，经乙醇梯度洗脱后进行HPLC检测并合并含赛门苷Ⅰ的流份，最后回收溶剂即得赛门苷Ⅰ精制品，具体步骤包括：

1）将罗汉果粉碎成粗粉加水煎煮后离心处理并收集上清液；

2）将步骤1）得到的上清液通过大孔树脂吸附后，用40%（v/v）酒精洗去杂质，然后用60-80%（v/v）酒精洗脱，最后从洗脱液中回收乙醇并得到浸膏；

3）将浸膏用60%（v/v）酒精溶解、离心并取上清液上ODS柱，先用60%（v/v）酒精洗去杂质，然后采用70-90%（v/v）酒精洗脱；最后从洗脱液中回收乙醇并进行HPLC检测，合并含赛门苷Ⅰ的流份得到赛门苷Ⅰ粗品；

4）将赛门苷Ⅰ粗品进行Sephadex LH-20柱层析，经乙醇梯度洗脱后进行HPLC检测并合并含赛门苷Ⅰ的流份，最后回收溶剂即得赛门苷Ⅰ精制品。

所述的乙醇梯度洗脱是指：依次用70%、80%、90%（v/v）酒精（各300mL）梯度洗脱（流速3mL/min），每份30mL进行洗脱。

步骤2）和步骤3）中，洗脱液的用量均为大孔树脂的柱体积、ODS柱体积的1.5-2.5倍。

步骤3）和步骤4）中的HPLC检测是指：以ODS柱为色谱柱，设置检测波长为205nm，流动相为乙腈-水25：75（v/v），流速为1.0mL/min。

有益效果

通过上述方法制备赛门苷Ⅰ精制品，所得产品纯度高，均在95%以上。采用水提取药材，既提高了收率（收率可高达0.03%以上）；同时又去除了罗汉果中脂溶性成分（如脂肪酸、黄酮、植物甾醇）的干扰，简化了制备工艺。采用大孔树脂、ODS、Sephadex LH-20等层析介质分离，目标产物损失少，样品收率高；同时，综合运用这三种分离机制不同的层析介质，大大提高了分离效果。整个制备过程只使用乙醇和水两种溶剂，价廉易得，安全无毒。且所使用的溶剂乙醇、水，以及分离中用到的填料均可反复使用，生产成本低。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1

本实施例是在以下实施条件和技术要求条件下实施的：

1．将罗汉果干果250g，加入1.5L水煎煮0.5h，4800转/分钟离心20分钟，收集上清液。

2．将上清液缓慢流经HZ-801大孔树脂（柱体积500mL，流速5mL/min），然后用750mL40%（v/v）酒精洗脱（流速10mL/min），收集洗脱液，减压回收乙醇用于下次使用；继续采用750mL80%(v/v)的酒精洗脱（流速10mL/min），收集80%(v/v)的酒精洗脱液，减压回收乙醇用于下次使用，得浸膏4.7g。

3．将上述浸膏用60%（v/v）酒精溶解，4800转/分钟离心20分钟，上清液上ODS柱(柱体积600mL)，然后用900mL60%（v/v）酒精洗脱（流速10mL/min）后，采用900mL90%（v/v）酒精洗脱（流速5mL/min），收集90%（v/v）酒精洗脱液，每份60mL；最后进行HPLC检测（色谱柱：ODS柱，检测波长：205nm，流动相乙腈-水25：75，流速：1.0mL/min），合并含赛门苷Ⅰ的流份，回收乙醇用于下一次使用，得赛门苷Ⅰ粗品(317mg)。

4．将上述粗品进行Sephadex LH-20（柱体积200mL），依次用60%、75%、90%（v/v）酒精（各200mL）梯度洗脱（流速2mL/min），每份20mL；最后进行HPLC检测（色谱柱：ODS柱，检测波长：205nm，流动相乙腈-水25：75，流速：1.0mL/min），合并含赛门苷Ⅰ的流份，即得赛门苷Ⅰ精制品(80mg)。

实施例2

本实施例是在以下实施条件和技术要求条件下实施的：

1．将罗汉果干果500g，加入6L水煎煮1h，4800转/分钟离心20分钟，收集上清液并将残余物重复上述加水煎煮和离心处理后合并两次处理的上清液。

2．将步骤1最终得到的上清液流经HZ-801大孔树脂（柱体积1000mL，流速5mL/min），然后用2500mL40%（v/v）酒精洗脱（流速10mL/min），收集洗脱液回收乙醇用于下次使用；继续采用2500mL60%(v/v)的酒精洗脱（流速10mL/min），收集60%（v/v）酒精洗脱液，减压回收乙醇用于下次使用，得浸膏7.9g。

3．将上述浸膏用60%（v/v）酒精溶解，4800转/分钟离心20分钟，上清液上ODS柱(柱体积800mL)，用2000mL60%（v/v）酒精洗脱（流速10mL/min）后，采用2000mL70%（v/v）酒精洗脱（流速8mL/min），收集洗脱液(每份80mL)并回收乙醇用于下一次使用；最后进行HPLC检测（色谱柱：ODS柱，检测波长：205nm，流动相乙腈-水25：75，流速：1.0mL/min），合并含赛门苷Ⅰ的流份，得赛门苷Ⅰ粗品(470mg)。

4．将上述粗品进行Sephadex LH-20（柱体积300mL），依次用70%、80%、90%（v/v）酒精（各300mL）梯度洗脱（流速3mL/min），每份30mL；最后进行HPLC检测（色谱柱：ODS柱，检测波长：205nm，流动相乙腈-水25：75，流速：1.0mL/min），合并含赛门苷Ⅰ的流份，即得赛门苷Ⅰ精制品(133mg)。

实施例3

本实施例是在以下实施条件和技术要求条件下实施的：

1．将罗汉果干果400g，加入3.2L水提取煎煮0.7h，4800转/分钟离心20分钟，收集上清液并将残余物重复上述加水煎煮和离心处理后合并两次处理的上清液。

2．将步骤1最终得到的上清液上HZ-801大孔树脂（柱体积1000mL，流速5mL/min），然后用2000mL40%（v/v）酒精洗脱（流速10mL/min），收集洗脱液回收乙醇用于下次使用；继续采用2000mL75%(v/v)的酒精洗脱（流速10mL/min），75%(v/v)的酒精洗脱液减压回收乙醇用于下次使用，得浸膏7.1g。

3．将上述浸膏用60%（v/v）酒精溶解，4800转/分钟离心20分钟，上ODS柱(柱体积600mL)，然后用1200mL60%（v/v）酒精洗脱（流速10mL/min）后，采用1200mL80%（v/v）酒精洗脱（流速6mL/min），收集洗脱液(每份60mL)，回收乙醇用于下一次使用；最后进行HPLC检测（色谱柱：ODS柱，检测波长：205nm，流动相乙腈-水25：75，流速：1.0mL/min），合并含赛门苷Ⅰ的流份，得赛门苷Ⅰ粗品(427mg)。

4．将上述粗品进行Sephadex LH-20（柱体积300mL），依次用70%、80%、90%（v/v）酒精（各300mL）梯度洗脱（流速3mL/min），每份30mL。HPLC检测（色谱柱：ODS柱，检测波长：205nm，流动相乙腈-水25：75，流速：1.0mL/min），合并含赛门苷Ⅰ的流份，即得赛门苷Ⅰ精制品(126mg)。

Claims

1.一种制备高纯度赛门苷Ⅰ的方法，其特征在于，通过将罗汉果水煮后的上清液通过大孔树脂吸附后经减压洗脱得到浸膏，将浸膏溶解，取上清液上ODS柱，洗去杂质后得到赛门苷Ⅰ粗品，再将粗品进行Sephadex LH-20柱层析，经乙醇梯度洗脱后进行HPLC检测并合并含赛门苷Ⅰ的流份，最后回收溶剂即得赛门苷Ⅰ精制品。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征是，所述方法具体步骤包括：

1）将罗汉果粉碎成粗粉加水煎煮后离心处理并收集上清液；

3）将浸膏用60%（v/v）酒精溶解、离心，取上清液上ODS柱，先用60%（v/v）酒精洗去杂质，然后采用70-90%（v/v）酒精洗脱；最后从洗脱液中回收乙醇并进行HPLC检测，合并含赛门苷Ⅰ的流份得到赛门苷Ⅰ粗品；

3.根据权利要求2所述的方法，其特征是，所述的加水煎煮中，水的用量为粗粉重量的6-12倍；煎煮时间为0.5-1h。

4.根据权利要求1或2或3所述的方法，其特征是，所述的上清液为将第一次收集后的残余物重复上述加水煎煮和离心处理后合并两次处理的上清液。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征是，所述的酒精洗脱的流速为8-10mL/min。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征是，所述的乙醇梯度洗脱是指：依次用70%、80%、90%（v/v）酒精（各300mL）梯度洗脱（流速3mL/min），每份30mL进行洗脱。

7.根据权利要求2所述的方法，其特征是，步骤2）和步骤3）中，洗脱液的用量均为大孔树脂的柱体积、ODS柱的1.5-2.5倍。

8.根据权利要求2所述的方法，其特征是，步骤3）和步骤4）中的HPLC检测是指：以ODS柱为色谱柱，设置检测波长为205nm，流动相为乙腈-水25：75（v/v），流速为1.0mL/min。