CN113481275A - 一种酶催化半合成制备罗汉果赛门苷的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种酶催化半合成制备罗汉果赛门苷的方法，其特征在于，包括以下步骤：将包括罗汉果苷V和含有β‑1，6糖苷键的葡聚糖或多糖的底物溶液中加入β‑葡萄糖苷酶进行酶解得到罗汉果甜苷IIIE和β‑葡萄糖残基的混合物，之后加入葡萄糖基转移酶进行反应，即得赛门苷。本发明高效的利用了β‑葡萄糖苷酶；酶解罗汉果苷V和含有β‑1，6糖苷键的葡聚糖或多糖，再在葡萄糖基转移酶作用下反应制备目标产品赛门苷，副反应少，转化率高。按照本发明方法，罗汉果甜苷V转化为罗汉果赛门苷的产率在90％以上。本发明方法工艺简单，可操作性强，设备要求低，反应条件温和，生产成本低，适宜于工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及罗汉果赛门苷的制备方法，具体涉及一种酶催化半合成制备罗汉果赛门苷的方法。
背景技术
罗汉果是我国特有的一种植物，主要产于桂林市的临桂县和永福县，被人们誉为神仙果，是卫生部首批公布的药食两用名贵的中药材。罗汉果甜苷属低热量、高甜度、非营养、非发酵型的甜味剂，是罗汉果中的主要的甜味成分。罗汉果甜苷作为甜味剂是安全无毒的，不影响血糖、不诱发龋齿，在国家强制标准《GB2760食品添加剂使用标准》中规定，罗汉果甜苷可不限量用于各类食品。在当前全球倡导的无糖、低糖健康饮食的大背景下，罗汉果甜苷已经成为各大食品和饮料生产企业重点关注的热点天然甜味剂。
罗汉果甜苷包括罗汉果甜苷IIIE、罗汉果甜苷IV、赛门苷、罗汉果甜苷V、罗汉果甜苷VI等，在成熟的罗汉果果实中，罗汉果甜苷V是最主要的甜苷，但罗汉果甜苷V并不是甜度最高的，其甜度是蔗糖的256-344倍。所有罗汉果甜苷中，甜度最高的甜苷是赛门苷，赛门苷也是目前已发现的葫芦烷三萜皂苷中最甜的天然成分，其甜度是蔗糖的563倍。但是赛门苷在总罗汉果甜苷中的占比极小(小于5％)。目前基于罗汉果的天然高倍甜味剂中仍以罗汉果甜苷V作为最主要的成分。可见，赛门苷的稀有严重地阻碍了其广泛的应用。目前亟需一种能高效的将罗汉果甜苷V转化为赛门苷的产业化技术。
罗汉果甜苷V结构式如下：
赛门苷结构式如下：
赛门苷的化学结构比罗汉果甜苷V少一个β-D-葡萄糖，因此切去该葡萄糖单元是得到赛门苷的一种可行方法。
CN201811284733.7公开了《一种提高罗汉果苷甜度的方法》，该发明采用发酵方法，对罗汉果甜苷主要成分罗汉果甜苷V进行修饰，通过切断R1键上的β-D葡萄糖基，使之转化为甜度更高的赛门苷，以提高整体的甜度，通过发酵法控制转化率，进一步以色谱层析收集目标产物，最后浓缩冻干得到产品。该方法并未明确的记载罗汉果甜苷V酶解转化为赛门苷的转化率。
CN201911054996.3公开了《一种基于提高赛门苷含量而提高罗汉果甜苷整体甜度的方法》，该方法将罗汉果甜苷产品溶于同浓度的发酵培养液中，灭菌处理后，再将原液接种筛选出的特异性清酒酵母菌CN01，自然发酵72h后，离心过滤，收集除去菌体的含高含量赛门苷的发酵液，将发酵液经离子型色谱树脂分步纯化，收集赛门苷富集段，并经浓缩，干燥制得成品。。但该专利有诸多存疑之处，首先该专利利用了编号为Sc001，VSc01，CN01，CN01-A，T-CN00的菌株，并筛选出特异性清酒酵母菌CN01，利用其发酵液进行制备，但这些菌株未披露微生物保藏编号，无法证实该菌株在申请日之前已经获得。此外，该专利中各种甜苷的质量百分比含量均为10的整数倍，这在本领域技术人员看来是完全不可能的。
CN201410208095.6公开了《一种甜味剂赛门苷I的制备方法》，该方法以罗汉果鲜果、干果水提取液，或者商品罗汉果皂苷V成品水溶液为原料，加入催化酶，30-70℃反应4-12小时后加热至沸腾灭活3-5分钟，得到反应液，利用填料吸附反应液中的皂苷，30％-50％乙醇淋洗3-5个柱体积或80％乙醇淋洗2个柱体积，得到洗脱液，洗脱液经浓缩干燥，得赛门苷I。该专利披露了，当采用50万U/Lβ-葡聚糖酶作为催化酶时，赛门苷I的含量从5％提高至40％。
CN201210526355.5公开了一种制备高纯度赛门苷I的方法，但是该专利方法实际上是赛门苷的提纯，并没有把罗汉果甜苷V转化为赛门苷。
发明内容
现有技术中通过罗汉果甜苷V制备赛门苷，对于酶解的特异性提出了很高的要求，因为在罗汉果甜苷V的分子结构中，可供断裂的β-D-葡萄糖有很多，要高收率得到赛门苷，就需要提高β-D-葡萄糖断裂的选择性，但是一般通过微生物酶筛选的方式，一方面成本较高，一方面稳定性不够好，微生物菌株繁殖数代后的选择性可能发生下降。因此并不是一种适合工业化大规模将罗汉果甘V转化为赛门苷的方法。本发明克服现有技术不足，提供一种先通过罗汉果甜苷V转化为罗汉果甜苷IIIE，再和β-葡聚糖酶解产生的活性β-葡萄糖残基在β-葡萄糖转移酶的存在下反应，最终高收率，高纯度地获得赛门苷，本发明制备工艺简单、成本低廉、适宜于工业化生产的一种罗汉果赛门苷的合成方法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案如下：一种酶催化半合成制备罗汉果赛门苷的方法，包括以下步骤：将包括罗汉果甜苷V和含有β-1，6糖苷键的葡聚糖或多糖的底物溶液中加入β-葡萄糖苷酶进行酶解，酶解后加入葡萄糖基转移酶进行反应，即得赛门苷。
进一步地，所述酶催化半合成制备罗汉果赛门苷的方法，包括以下步骤：
(1)底物溶液的配制：将富含罗汉果甜苷V的底物和辅助底物投入pH为5.8-6.5的缓冲溶液中，加热，搅拌至全溶，得底物溶液；所述辅助底物是含有β-1，6糖苷键的葡聚糖或多糖；
(2)罗汉果甜苷IIIE的合成：将β-葡萄糖苷酶投入上述底物溶液中，保温搅拌反应得反应液I；将反应液I加热灭酶，降温至5-10℃，离心，过滤，得含有罗汉果甜苷IIIE和活性β-葡萄糖残基的滤液A；
(3)罗汉果赛门苷的合成方法：往步骤(2)中滤液A中加入葡萄糖基转移酶，保温搅拌，直至反应完全，得反应液II；将反应液II加热灭酶，降温至室温，离心，过滤，得含有罗汉果赛门苷的滤液B；
(4)后处理：将滤液B通过大孔吸附树脂层析柱，先水洗，再醇洗，将醇洗脱液浓缩干燥，得罗汉果赛门苷成品。
本发明通过罗汉果苷V制备赛门苷的一大优势是，所采用的酶均为常规的可商购的β-葡萄糖苷酶和葡萄糖基转移酶，工艺条件简单，原料价廉易得，是一种适合大规模工业化生产赛门苷的方法。
优选的，步骤(1)中所述的底物含有罗汉果甜苷V，可以是来源于天然植物罗汉果，也可以是来源于半合成或全合成。进一步优选地，所述底物中罗汉果甘V的含量在50％以上，优选在70％以上，更优选在90％以上。
优选的，步骤(1)中所述的辅助底物选自石耳素、昆布多糖、酵母葡聚糖中的至少一种。辅助底物的用量为底物中罗汉果甜苷V重量的10-20％。加入辅助底物的目的是在β-葡萄糖苷酶的作用下，β-1，6糖苷键断裂，使辅助底物酶解为活性β-葡萄糖残基。
优选的，步骤(1)中所述的缓冲溶液为磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲溶液，其浓度为0.01-0.05mol/L，缓冲溶液的pH范围为5.8-6.5，缓冲溶液的用量没有特别的限定，能够充分混合底物和辅助底物即可。选用磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲溶液的目的之一，是溶解底物及辅助底物、并提供最佳的酶解pH值；目的之二是K+对β-葡萄糖苷酶和葡萄糖基转移酶都有激活作用。
优选的，步骤(2)中所述的β-葡萄糖苷酶浓度为30-50u/mg，用量是底物中罗汉果苷V重量的0.5％-3％。使用β-葡萄糖苷酶的目的之一是将罗汉果甜苷V分子的两条糖基侧链分别分解一分子葡萄糖基(都是通过β-1，6糖苷键连接)，使其酶解为罗汉果甜苷IIIE；目的之二是将辅助底物(含有β-1，6糖苷键的葡聚糖或多糖)酶解为活性β-葡萄糖残基，为步骤(3)提供重要的酶促反应原料。
优选的，步骤(2)中所述的保温反应的温度为55-65℃。若反应的温度过低，将导致β-葡萄糖苷酶的催化效果降低，造成催化反应的速度变慢或反应不完全；若反应的温度过高，将导致β-葡萄糖苷酶变性、失活，同样不利于反应的进行；保温反应时间为8-15h；保温反应的搅拌速度为60-100rpm。若搅拌的速度过慢，将β-葡萄糖苷酶跟底物接触的几率降低，造成催化反应的速度变慢或反应不完全；若搅拌的速度过快，搅拌器过强的剪切力将破坏酶的空间结构，从而降低酶活，同样会造成催化反应的速度变慢或反应不完全。
优选的，步骤(2)中所述加热灭酶的温度为100-105℃，灭酶后的反应液降温至5-10℃。离心的目的是使变性失活的β-葡萄糖苷酶和有可能过量的辅助底物低温析出、沉淀从而除去。
优选的，步骤(3)中所述的葡萄糖基转移酶浓度为3-10u/μL，用量是底物中罗汉果苷V重量的1％-4％。使用葡萄糖基转移酶的目的是将滤液A中的罗汉果甜苷IIIE和活性β-葡萄糖残基在缓冲溶液中合成为罗汉果赛门苷。
优选的，步骤(3)中所述的保温反应的温度为35-55℃。若反应的温度过低，将导致葡萄糖基转移酶的催化效果降低，造成催化反应的速度变慢或反应不完全；若反应的温度过高，将导致葡萄糖基转移酶变性、失活，同样不利于反应的进行。
优选的，步骤(3)中所述的搅拌的速度为60-100rpm。若搅拌的速度过慢，将葡萄糖基转移酶跟底物接触的几率降低，造成催化反应的速度变慢或反应不完全；若搅拌的速度过快，搅拌器过强的剪切力将破坏酶的空间结构，从而降低酶活，同样会造成催化反应的速度变慢或反应不完全。
优选的，步骤(3)中所述的反应时间为10-20小时。
步骤(3)中，离心、过滤的目的是除去已经失活、变性的酶，并防止大孔吸附树脂柱堵塞。
优选的，步骤(4)中所述的大孔吸附树脂的型号包括但不限于D101、AB-8、LX-T28、HP20。将离心、过滤后得到含有罗汉果赛门苷的滤液B通过大孔吸附树脂层析柱，是利用大孔树脂只会吸附滤液中的罗汉果甜苷(含赛门苷)、而不会吸附滤液中其它成分(过量的葡萄糖残基、盐等)的原理，从而达到分离纯化的目的。
优选的，步骤(4)中所述醇为甲醇，乙醇，丙醇中的至少一种。
本发明方法的合成反应式如下：
在步骤(2)中，β-葡萄糖苷酶同时酶解底物中的罗汉果苷V和辅助底物中的β-1，6糖苷键，对于反应条件不需要进行精细的控制。而以往现有技术中在对罗汉果甘V进行酶解时，需要对反应条件进行精细控制，配合采用特异选择性的酶或者微生物菌株，否则可能将罗汉果甜苷V糖基支链上过多的β-D-葡萄糖被切断，使产物中赛门苷的含量降低，赛门苷产率下降。本发明独树一帜，首先将底物中的罗汉果甜苷V中的两个的β-D-葡萄糖切断，得到罗汉果甜苷IIIE后；将辅助底物β-1，6糖苷键断裂产生活性β-葡萄糖残基，罗汉果甜苷IIIE和活性β-葡萄糖残基在葡萄糖基转移酶存在下高效率地合成赛门苷。
本发明方法的有益效果如下：
(1)本方法提供了一种全新的罗汉果赛门苷获得途径——酶催化半合成，可以大幅度的提高罗汉果甜苷的整体甜度；
(2)本发明高效的利用了β-葡萄糖苷酶；此外，一分子活性β-葡萄糖残基可与罗汉果甜苷IIIE的糖基侧链对接，生成目标产品赛门苷，副反应少，转化率高。按照本发明方法，罗汉果甜苷V转化为罗汉果赛门苷的产率在90％以上，并且不需要特别精细的反应条件的控制和特异性的酶或者微生物菌株，常规商购的β-葡萄糖苷酶和葡萄糖基转移酶即可。
(3)本发明方法工艺简单，可操作性强，设备要求低，反应条件温和，生产成本低，不使用易燃易爆、有毒有害的化工溶剂，安全、绿色、环保，适宜于工业化生产。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
本发明实施例所使用的罗汉果甜苷V或罗汉果提取物购于湖南华诚生物资源股份有限公司；本发明实施例所使用的大孔吸附树脂购于西安蓝晓科技新材料股份有限公司；本发明实施例所使用的β-葡萄糖苷酶购于源叶生物，型号S10047、规格40u/mg；葡萄糖基转移酶购于Thermo Scientific，货号EO0831，规格5u/μL；本发明实施例所使用的原料或化学试剂，如无特殊说明，均通过常规商业途径获得。
本发明实施例中，采用高效液相色谱(HPLC)外标法测定罗汉果甜苷V及罗汉果赛门苷的含量。
实施例1
(1)底物溶液的配制：将底物(罗汉果甜苷V纯品，10g；经HPLC外标法检测，罗汉果甜苷V含量98.16％，赛门苷含量无)和辅助底物(石耳素，0.5g)投入80ml磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲溶液(摩尔浓度0.05mol/L，pH值＝6.0)中，加热至50℃，搅拌至全溶，得底物溶液；
(2)罗汉果甜苷IIIE的合成方法：将0.15gβ-葡萄糖苷酶投入上述底物溶液中，60℃保温，以60rpm的速度搅拌，反应9小时，直至反应完全，得反应液I；将反应液I加热至105℃灭酶30分钟，降温至5℃，离心，过滤，得含有罗汉果甜苷IIIE和活性β-葡萄糖残基的滤液A；
(3)罗汉果赛门苷的合成方法：往滤液A加入0.4g葡萄糖基转移酶，40℃保温，以60rpm的速度搅拌，反应10小时，直至反应完全，得反应液II；将反应液II加热至105℃灭酶30分钟，降温至室温，离心，过滤，得含有罗汉果赛门苷的滤液B；
(4)后处理：将滤液B通过大孔吸附树脂层析柱(树脂型号：D101)，上柱毕，水洗，再用乙醇洗脱，将乙醇洗脱液浓缩、真空干燥，得罗汉果赛门苷成品8.85g。
经高效液相色谱(HPLC)外标法测定，本实施例所得成品中罗汉果赛门苷的含量为89.43％、罗汉果甜苷V的含量为8.60％，罗汉果甜苷V转化为罗汉果赛门苷的转化率为92.25％。
实施例2
(1)底物溶液的配制：将底物(罗汉果提取物，10g；经HPLC外标法检测，罗汉果甜苷V含量50.29％，赛门苷含量2.13％)和辅助底物(昆布多糖，0.8g)投入50ml磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲溶液(摩尔浓度0.05mol/L，pH值＝6.5)中，加热至50℃，搅拌至全溶，得底物溶液；
(2)罗汉果甜苷IIIE的合成方法：将0.2gβ-葡萄糖苷酶投入上述底物溶液中，57℃保温，以90rpm的速度搅拌，反应10小时，直至反应完全，得反应液I；将反应液I加热至100℃灭酶30分钟，降温至5℃，离心，过滤，得含有罗汉果甜苷IIIE和活性β-葡萄糖残基的滤液A；
(3)罗汉果赛门苷的合成方法：往滤液A加入0.15g葡萄糖基转移酶，45℃保温，以90rpm的速度搅拌，反应12小时，直至反应完全，得反应液II；将反应液II加热至100℃灭酶30分钟，降温至室温，离心，过滤，得含有罗汉果赛门苷的滤液B；
(4)后处理：将滤液B通过大孔吸附树脂层析柱(树脂型号：LX-T28)，上柱毕，水洗，再用甲醇洗脱，将甲醇洗脱液浓缩、真空干燥，得罗汉果赛门苷成品9.42g。
经高效液相色谱(HPLC)外标法测定，本实施例所得成品中罗汉果赛门苷的含量为44.34％、罗汉果甜苷V的含量为5.24％，罗汉果甜苷V转化为罗汉果赛门苷的转化率为90.19％。
实施例3
(1)底物溶液的配制：将底物(罗汉果提取物，10g；经HPLC外标法检测，罗汉果甜苷V含量65.07％，赛门苷含量0.24％)和辅助底物(酵母葡聚糖，1g)投入60ml磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲溶液(摩尔浓度0.05mol/L，pH值＝5.9)中，加热至50℃，搅拌至全溶，得底物溶液；
(2)罗汉果甜苷IIIE的合成方法：将0.3gβ-葡萄糖苷酶投入上述底物溶液中，65℃保温，以100rpm的速度搅拌，反应12小时，直至反应完全，得反应液I；将反应液I加热至105℃灭酶30分钟，降温至5℃，离心，过滤，得含有罗汉果甜苷IIIE和活性β-葡萄糖残基的滤液A；
(3)罗汉果赛门苷的合成方法：往滤液A加入0.2g葡萄糖基转移酶，37℃保温，以100rpm的速度搅拌，反应15小时，直至反应完全，得反应液II；将反应液II加热至100℃灭酶30分钟，降温至室温，离心，过滤，得含有罗汉果赛门苷的滤液B；
(4)后处理：将滤液B通过大孔吸附树脂层析柱(树脂型号：AB-8)，上柱毕，水洗，再用乙醇洗脱，将乙醇洗脱液浓缩、真空干燥，得罗汉果赛门苷成品9.24g。
经高效液相色谱(HPLC)外标法测定，本实施例所得成品中罗汉果赛门苷的含量为56.66％、罗汉果甜苷V的含量为5.89％，罗汉果甜苷V转化为罗汉果赛门苷的转化率为91.63％。
Claims (10)
1.一种酶催化半合成制备罗汉果赛门苷的方法，其特征在于，包括以下步骤：将包括罗汉果苷V和含有β-1，6糖苷键的葡聚糖或多糖的底物溶液中加入β-葡萄糖苷酶进行酶解得到罗汉果甜苷IIIE和β-葡萄糖残基的混合物，之后加入葡萄糖基转移酶进行反应，即得赛门苷。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)底物溶液的配制：将富含罗汉果甜苷V的底物和辅助底物投入pH为5.8-6.5的缓冲溶液中，加热，搅拌至全溶，得底物溶液；所述辅助底物是含有β-1，6糖苷键的葡聚糖或多糖；
(2)罗汉果甜苷IIIE的合成：将β-葡萄糖苷酶投入上述底物溶液中，保温搅拌反应得反应液I；将反应液I加热灭酶，降温至5-10℃，离心，过滤，得含有罗汉果甜苷IIIE和活性β-葡萄糖残基的滤液A；
(3)罗汉果赛门苷的合成方法：往步骤(2)中滤液A中加入葡萄糖基转移酶，保温搅拌，直至反应完全，得反应液II；将反应液II加热灭酶，降温至室温，离心，过滤，得含有罗汉果赛门苷的滤液B；
(4)后处理：将滤液B通过大孔吸附树脂层析柱，先水洗，再醇洗，将醇洗脱液浓缩干燥，得罗汉果赛门苷成品。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述底物罗汉果甘V的含量在50％以上，优选在70％以上，更优选在90％以上。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的辅助底物选自石耳素、昆布多糖、酵母葡聚糖中的至少一种，辅助底物的用量为底物中罗汉果甜苷V重量的10-20％。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的缓冲溶液为磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲溶液，其浓度为0.01-0.05mol/L，缓冲溶液的pH范围为5.8-6.5。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述β-葡萄糖苷酶的浓度为30-50u/mg，所述葡萄糖基转移酶浓度为3-10u/μL。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述β-葡萄糖苷酶用量是底物中罗汉果苷V重量的0.5％-3％，和/或所述葡萄糖基转移酶用量是底物中罗汉果苷V重量的1-4％。
8.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，酶解反应温度为55-65℃，反应间为8-15h；反应时搅拌的速度为60-100rpm。
9.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，加入葡萄糖基转移酶进行反应的条件是反应温度35-55℃，反应时间10-20h，反应时转速60-100rpm。
10.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(4)中所述的大孔吸附树脂的型号包括D101、AB-8、LX-T28或HP20。
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