CN109517864A - 一种罗汉果苷的制备方法 - Google Patents

一种罗汉果苷的制备方法 Download PDF

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CN109517864A CN201811466406.3A CN201811466406A CN109517864A CN 109517864 A CN109517864 A CN 109517864A CN 201811466406 A CN201811466406 A CN 201811466406A CN 109517864 A CN109517864 A CN 109517864A
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grosvenori aglycone
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吴旭日
卞柳云
花私齐
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    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
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    • C12P19/56—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen atom of the saccharide radical directly bound to a condensed ring system having three or more carbocyclic rings, e.g. daunomycin, adriamycin
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Abstract

罗汉果苷IIIE甜度高、口味较好，但在罗汉果中含量极低，无法大量提取制备。本发明公开发明了一种采用糖基水解酶定点水解罗汉果苷V生物合成罗汉果苷IIIE的方法，可用于罗汉果苷IIIE的大量绿色化制备，亦可为罗汉果苷IIIE的结构改造提供了物质基础。

Description

一种罗汉果苷的制备方法
技术领域
本发明属于天然产物生物合成和食品化工技术领域，具体涉及利用异源表达的糖苷水解酶水解罗汉果苷V制备天然非糖类甜味剂罗汉果苷ⅢE。
背景技术
近些年来，由于高能量饮食的过多摄入，糖尿病、肥胖症等患者逐年增多，且由此产生的并发症对人类健康产生了严重危害。因此，寻找并开发低热量、健康的新型非营养型甜味剂逐渐成为行业的需求。由于口味纯正、甜度高、绿色健康等特点，罗汉果苷已逐渐成为新型天然非营养型甜味剂开发的一类热点化合物。自1983年Takemoto等从罗汉果S.grosvenorii果实中分离出甜味化合物罗汉果苷(Mogroside,MG)IV、V和VI后，已有超过30种同系列化合物被陆续分离鉴定，它们均为罗汉果苷元([10α-cucurbit-5-ene-3β,11α,24(R),25-tetraol])连接2至6个葡萄糖单元的四环三萜皂苷(Li C,etal.Chin.J.Nat.Med.,2014,12:89-102)。罗汉果苷初步甜味构效关系研究发现，含3个葡萄糖单元是罗汉果苷具有甜味的结构基础(Wang L,et al.Molecules,2014,19:12676-12689.)，例如，罗汉果苷IIIE、IV、V和赛门苷I的甜度分别是5％蔗糖的300倍、350倍、425倍和560倍，但口味有所差异。因此，采用糖基化酶对具有3个葡萄糖基的罗汉果苷如罗汉果苷IIIE进行定点糖基化修饰，可获得一系列口味独特的非营养型甜味剂。
罗汉果苷仅占罗汉果干燥果实的3.82％，结构中含3个糖的罗汉果苷IIIE含量甚微(LI C,et al.J.Natural Medicines.,2014,12:89-102)，已成为了基于罗汉果苷IIIE的糖基化修饰开发不同口味的新型罗汉果苷类甜味剂的瓶颈。由于化学合成方法难度极大且成本高，市场接受度低，所以立体选择性和部位选择性强且绿色环保的生物催化剂成为罗汉果苷IIIE制备的首选策略。鉴于罗汉果苷V是罗汉果提取物中含量最高的甜味化合物，也是目前唯一可产业化提取制备的罗汉果苷类化合物。在结构分析后发现，罗汉果苷V只需选择性水解3位和24位以β-1,6-糖苷键连接的葡萄糖单元即可获得罗汉果苷IIIE。因此采用专一性强的糖苷水解酶建立绿色化罗汉果苷IIIE酶法合成工艺成为最佳选择。
基于上述分析，本发明采用来源自酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae的糖苷水解酶EXG1及其突变体EXG19对罗汉果苷V进行选择性水解，以绿色化制备罗汉果苷IIIE。与现有的天然提取方法相比，本发明提供了一种解决了罗汉果苷IIIE大量获得的方法，使基于IIIE糖基化修饰获得不同口味的罗汉果苷类甜味剂提供了物质基础。
发明内容
本发明的目的在于采用专一性强的糖苷水解酶EXG1及其突变体EXG19水解罗汉果苷V建立一种绿色、高效、经济的罗汉果苷ⅢE生物合成新方法。为基于罗汉果苷ⅢE的糖基化修饰开发新型优质非营养型甜味剂、药品和药用辅料奠定基础。为实现上述目的，本发明所采用的技术方案具体如下：
1)糖苷水解酶的基因来源
糖苷水解酶EXG1来源自酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae，基因序列如SEQ IDNO:1所示；糖苷水解酶EXG19为EXG1的突变体，基因序列如SEQ ID NO:2所示。
2)糖苷水解酶异源表达工程菌构建
利用Nde I和Xho I将EXG1和EXG19的编码基因插入大肠杆菌表达载体pET-22b(+)，构建获得重组质粒pET-22b-exg1和pET-22b-exg19，然后分别转化至大肠杆菌BL21分别获得表达菌株E.coli(pET-22b-exg1)和E.coli(pET-22b-exg19)。
3)糖苷水解酶的诱导表达
将E.coli(pET-22b-exg1)和E.coli(pET-22b-exg19)培养至OD600至0.9±0.1时，采用IPTG诱导表达糖苷水解酶。诱导表达条件为温度15℃、诱导剂IPTG 0.4mM和诱导时间12小时。
4)催化反应系统的构建
粗酶液反应体系：由含EXG1或EXG19的大肠杆菌细胞提取液，罗汉果苷V以及缓冲液组成。原位反应体系：向E.coli(pET-22b-exg1)或E.coli(pET-22b-exg19)菌液种加入罗汉果苷V和葡萄糖。静息细胞反应体系：将离心收集的表达EXG1或EXG19的大肠杆菌细胞用缓冲液重悬后加入罗汉果苷V和葡萄糖。
5)反应条件的优化
由于粗酶液反应效率更高更可控，因此本发明优选粗酶液反应体系生物合成罗汉果苷IIIE，并优化其反应条件：pH为3.0-8.0，优选6.0；反应的温度为25-65℃，优选45℃；底物罗汉果苷V的浓度为1-10mg/mL，优选5mg/mL；反应时间为4-24小时，优选20小时。
6)罗汉果苷IIIE的纯化
反应完成后，加热离心去除蛋白或菌体，上清液浓缩后用C18层析柱分离纯化获得高纯度罗汉果苷ⅢE。
本发明具有如下优点：
1)与从罗汉果中提取制备罗汉果苷IIIE的方法相比，本发明采用糖苷水解酶催化罗汉果苷V水解制备罗汉果苷IIIE可实现IIIE的大量可获得性；
2)与化学合成方法相比，本发明制备罗汉果苷IIIE的方法效率更高，更加绿色化，产品更易被市场接受；
3)与糖基转移酶相比，采用糖苷水解酶制备罗汉果苷IIIE产物更加单一，且不需要成本高昂的糖基供体。
综上所述，本发明建立了罗汉果苷IIIE生物合成方法，为罗汉果苷IIIE及其糖基化衍生物的制备和新型非营养型甜味剂开发提供了基础。
附图说明
图1为糖基水解酶催化罗汉果苷V水解的HPLC色谱图。
图2为罗汉果苷IIIE的氢谱。
图3为罗汉果苷IIIE的碳谱
具体实施方式
以下进一步提供实施实例，这些实施实例有助于理解本发明，仅用作说明而不限制本发明的应用范围。
实施例1糖苷水解酶的表达菌株构建
将来源自Saccharomyces cerevisiae的糖苷水解酶EXG1的基因(SEQ ID NO:1)委托苏州金唯智生物科技有限公司合成并利用Nde I和Xho I将其插入pET-22b的多克隆位点，获得重组质粒pET-22b-exg1。在此基础上，将质粒转化至大肠杆菌BL 21，获得重组表达菌株E.coli(pET-22b-exg1)。EXG19为EXG1的L63S，E414D的双点突变体(SEQ ID NO:2)，该突变的重组表达菌株E.coli(pET-22b-exg19)的构建同EXG1。
实施例2糖苷水解酶EXG1的诱导表达
将工程菌株E.coli(pET-22b-exg1)接种至50mL LB培养基(含100μg/mL氨苄青霉素)，37℃、220rpm振摇过夜培养获得种子液，按5％接种量转接至LB培养基(含100μg/mL氨苄青霉素)中，37℃振摇培养至OD600＝0.8±0.1时，然后考察不同诱导温度、诱导剂浓度和诱导时间对。诱导表达完成后，离心收集菌体，并用0.1M磷酸钾缓冲液重悬，高压细胞破碎(25Kpsi)后离心收集上清，SDS-PAGE分析EXG1的可溶性表达情况，确定最佳的诱导条件。经检测，EXG1在15℃、20℃、25℃、30℃时的可溶性表达量分别为：16.5％、15.1％、14.3％和13.8％；IPTG浓度为0.2mM、0.4mM、0.6mM、0.8mM、1.0mM时的可溶性表达量分别为16.5％、22.1％、21.4％、20.6％、18.9％；表达时间为4h、8h、12h、16h、20h和24h的可溶性表达量分别为：17.1％、20.2％、22.8％、21.3％、20.5％和19.4％。根据上述数据，EXG1可溶性表达的最佳条件最终确定为：0.4mM IPTG、15℃和12小时。
实施例3糖苷水解酶EXG19的诱导表达
糖苷水解酶EXG19诱导表达条件的考察参数同EXG1，结果为在15℃、20℃、25℃、30℃时的可溶性表达量分别为：14.8％、14.2％、12.7％和10.8％；IPTG浓度为0.2mM、0.4mM、0.6mM、0.8mM、1.0mM时的可溶性表达量分别为14.8％、18.5％、17.8％、15.3％、14.1％；表达时间为4h、8h、12h、16h、20h和24h的可溶性表达量分别为：14.1％、16.5％、18.9％、18.5％、18.1％和17.9％。根据上述数据，EXG19可溶性表达的最佳条件同样为：0.4mMIPTG、15℃和12小时。
实施例4罗汉果苷的HPLC检测方法
罗汉果苷对照品和罗汉果苷V水解产物的HPLC色谱分析条件如下：
色谱柱：Agilent C18,5μm,250×4.6mm
流动相A：超纯水(含0.1％甲酸)流动相B：乙腈(含0.1％甲酸)
洗脱梯度：10％B～90％B梯度洗脱20min
进样量：10μL；柱温：30℃；流速：1ml/min；检测波长：210nm
在该色谱条件下，罗汉果V和IIIE的保留时间分别为10.0min和11.7min，见图1。
实施例5罗汉果苷IIIE的原位生物合成
采用最优表达条件诱导表达EXG1和EXG19，诱导完成后直接向培养液中加入罗汉果苷V至2.5mg/ml，然后于35℃振摇反应8小时。反应完成后取1ml反应液加入1ml甲醇停止反应，12000rpm离心15min去除菌体，上清液进行HPLC分析。结果显示，表达EXG1和EXG19的大肠杆菌催化罗汉果苷V水解合成罗汉果苷IIIE的转化率分别是55.8％和51.7％。
实施例6静息细胞催化合成罗汉果苷IIIE
采用最优条件诱导表达EXG1和EXG19，诱导表达完成后离心收集菌体，然后按照1g菌体：10ml 0.1M NaOAc-HAc缓冲液(pH＝6.0)分别重悬菌体，加入罗汉果苷V至2.5mg/ml，于35℃振摇反应8小时。反应完成后取1ml反应液加入1ml甲醇停止反应，12000rpm离心15min去除菌体，上清液进行HPLC分析。结果显示，EXG1和EXG19催化合成罗汉果苷IIIE的转化率分别是61.7％和60.6％。
实施例7粗酶液催化合成罗汉果苷IIIE
按照1g菌体：10ml 0.1M NaOAc-HAc缓冲液(pH＝6.0)分别重悬表达EXG1和EXG19的菌体，然后高压破细胞后离心获得含EXG1和EXG19的粗酶液。10ml的反应体系中，粗酶液为8ml，罗汉果苷V浓度为2.5mg/ml，0.1M NaOAc-HAc缓冲液(pH＝6.0)为2ml。于35℃振摇反应8小时后，取1ml反应液加入1ml甲醇停止反应，12000rpm离心15min去除蛋白，上清液进行HPLC分析。结果显示，EXG1和EXG19催化合成罗汉果苷IIIE的转化率分别是66.6％和64.9％。
实施例8粗酶液催化合成罗汉果苷IIIE的最佳反应温度
鉴于粗酶液催化罗汉果苷IIIE的效率高于静息细胞反应和原位转化反应，本发明优选选择含EXG1的粗酶液作为生物催化剂合成罗汉果苷IIIE并进行后续反应考察。
按照1g菌体：10ml 0.1M NaOAc-HAc缓冲液(pH＝6.0)重悬表达EXG1菌体，破细胞离心获得粗酶液用于构建反应体系。在10ml反应体系中，粗酶液为8ml，罗汉果苷V浓度为2.5mg/ml，0.1M NaOAc-HAc缓冲液(pH＝6.0)为2ml。反应液于不同温度条件下振摇反应8小时后，取样进行HPLC分析。结果显示，25℃、35℃、45℃、55℃和65℃条件下罗汉果苷IIIE的生成率分别为25.5％、66.4％、69.7％、60.2％、0。因此，选择45℃作为最佳反应温度。
实施例9最佳反应pH值
按照1g菌体：10ml不同pH缓冲液重悬表达EXG1菌体，破细胞离心获得粗酶液，用于构建反应体系。在10ml反应体系中，粗酶液为8ml，罗汉果苷V浓度为2.5mg/ml，不同pH值的缓冲液为2ml。反应液于45℃振摇反应8小时后，取样进行HPLC分析。反应中所用不同pH的缓冲液分别0.05M Tris-HCl(pH＝7.5-8.0)、0.05Na2HPO4-柠檬酸(pH＝3.0-4.0,6.5-7.0)和0.1M NaOAc-HAc(pH＝4.5-6.0)。检测结果显示，反应pH为3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、和8.0条件下的罗汉果苷IIIE的生成率分别为18.5％、19.4％、24.7％、33.2％、46.5％、53.8％、68.7％、61.2％、50.5％、38.8％、13.7％。因此，选择6.0作为最佳反应pH值。
实施例10粗酶液用量和底物浓度
按照1g菌体：10ml 0.1M NaOAc-HAc缓冲液(pH＝6.0)重悬表达EXG1菌体，破细胞离心获得粗酶液。在10ml反应体系中，粗酶液为2～8ml，罗汉果苷V浓度为1～10mg/ml，0.1MNaOAc-HAc缓冲液(pH＝6.0)为8～2ml。反应液于45℃振摇反应24小时后，取样进行HPLC分析。结果显示，在考察条件下，粗酶液用量为8ml，底物浓度为5mg/ml时，罗汉果苷IIIE的生成率为97.8％。因此，选择粗酶液体积(ml)与底物浓度(mg/ml)比值为8：5作为最佳反应投料比例。
表1不同粗酶用量对罗汉果苷IIIE生成率的影响
实施例11最佳反应时间
0.5L反应体系中，粗酶液为0.4L，罗汉果苷V浓度为5mg/ml，0.1M NaOAc-HAc缓冲液(pH＝6.0)为0.1L，45℃振摇反应，于不同时间点取样检测。结果显示，4h、8h、12h、16h、20h和24h的罗汉果苷IIIE的生成率分别为30.1％、58.2％、78.8％、91.3％、98.5％和98.4％。因此，最佳反应时间定为20小时。
实施例12罗汉果苷IIIE的纯化
在最佳反应条件下，将罗汉果苷ⅢE的生物合成体系扩大至0.5L规模，反应结束后，反应液煮沸10min以终止反应，离心去除变性蛋白质，冷冻干燥获得罗汉果苷IIIE的粗品2.52g。用10ml水溶解粗品，离心去除不溶性杂质，过滤后上清液上样至C18反相柱(内径2cm，长度70cm)，然后用含45％乙腈的水溶液进行等度洗脱，收集仅含罗汉果苷IIIE的洗脱液，减压除去乙腈，水相冻干后获得白色粉末状罗汉果苷IIIE 1.96g，纯度为97.8％，并进行核磁结构鉴定。
序列表
<110> 中国药科大学
<120> 一种罗汉果苷的制备方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1347
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgctttcgc ttaaaacgtt actgtgtacg ttgttgactg tgtcatcagt actcgctacc 60
ccagtccctg caagagaccc ttcttccatt caatttgttc atgaggagaa caagaaaaga 120
tactacgatt atgaccacgg ttccctcgga gaaccaatcc gtggtgtcaa cattggtggt 180
tggttacttc ttgaaccata cattactcca tctttgttcg aggctttccg tacaaatgat 240
gacaacgacg aaggaattcc tgtcgacgaa tatcacttct gtcaatattt aggtaaggat 300
ttggctaaaa gccgtttaca gagccattgg tctactttct accaagaaca agatttcgct 360
aatattgctt cccaaggttt caaccttgtc agaattccta tcggttactg ggctttccaa 420
actttggacg atgatcctta tgttagcggc ctacaggaat cttacctaga ccaagccatc 480
ggttgggcta gaaacaacag cttgaaagtt tgggttgatt tgcatggtgc cgctggttcg 540
cagaacgggt ttgataactc tggtttgaga gattcataca agtttttgga agacagcaat 600
ttggccgtta ctacaaatgt cttgaactac atattgaaaa aatactctgc ggaggaatac 660
ttggacactg ttattggtat cgaattgatt aatgagccat tgggtcctgt tctagacatg 720
gataaaatga agaatgacta cttggcacct gcttacgaat acttgagaaa caacatcaag 780
agtgaccaag ttatcatcat ccatgacgct ttccaaccat acaattattg ggatgacttc 840
atgactgaaa acgatggcta ctggggtgtc actatcgacc atcatcacta ccaagtcttt 900
gcttctgatc aattggaaag atccattgat gaacatatta aagtagcttg tgaatggggt 960
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Claims (7)

1.一种罗汉果苷的制备方法，其特征在于使用糖苷水解酶EXG1和EXG19定点水解罗汉果苷V生物合成罗汉果苷ⅢE。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的糖苷水解酶EXG1来源自酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae，序列如SEQ ID NO:1所示；糖苷水解酶EXG19为EXG1的突变体，序列如SEQ ID NO:2所示。
3.根据权利要求1所述的糖苷水解酶，其特征在于将EXG1和EXG19的编码基因插入大肠杆菌表达载体pET-22b(+)的多克隆位点，构建重组质粒pET-22b-exg1和pET-22b-exg19，转化至大肠杆菌BL21分别获得表达菌株E.coli(pET-22b-exg1)和E.coli(pET-22b-exg19)。
4.根据权利要求3所述的糖苷水解酶，其特征在于EXG1和EXG19的最佳蛋白可溶表达条件为温度15℃、诱导剂IPTG 0.4mM和诱导时间12小时。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于可用含EXG1或EXG19的大肠杆菌细胞提取液构建反应体系；或用含EXG1或EXG19的菌体构建原位或静息细胞反应体系。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于反应的pH为3.0-8.0，优选6.0；反应的温度为25-65℃，优选45℃；底物罗汉果苷V的浓度为1-10mg/mL，优选5mg/mL；反应时间为4-24小时，优选20小时；粗酶液(ml)与底物浓度(mg/ml)比值优选8：5。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于采用加热离心方法去除蛋白或菌体，上清液浓缩后用C18层析柱分离纯化获得高纯度罗汉果苷ⅢE。
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