CN112831489A - 一种阿洛酮糖3-差向异构酶固定化酶、其固定化方法与应用 - Google Patents

一种阿洛酮糖3-差向异构酶固定化酶、其固定化方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种阿洛酮糖3‑差向异构酶固定化酶，还提供了该阿洛酮糖3‑差向异构酶的固定化方法。本发明通过将阿洛酮糖3‑差向异构酶或其融合标签酶与固定化树脂相结合，制备获得阿洛酮糖3‑差向异构酶固定化酶。该固定化酶可应用于批次或连续反应催化果糖高效转化为D‑阿洛酮糖，提高了酶的重复使用率和使用周期，显著降低了D‑阿洛酮糖的生产成本，具有广泛应用前景。

Description

一种阿洛酮糖3-差向异构酶固定化酶、其固定化方法与应用
技术领域
本发明属于工业生物技术领域，具体涉及一种阿洛酮糖3-差向异构酶固定化酶，还涉及该固定化酶的制备方法，以及利用该固定化酶生产阿洛酮糖的应用。
背景技术
D-阿洛酮糖(D-allulose)是D-果糖碳-3位置的差向异构体，其甜味是蔗糖的70％，但热量只有0.2cal/g，同时具有改善脂质代谢、降低餐后血糖等特殊生理功能，且其口感和特性接近蔗糖，因此是蔗糖的理想替代品。相关报道指出，阿洛酮糖是α-葡萄糖苷酶，α-淀粉酶，麦芽糖酶和蔗糖酶的弱抑制剂，可以抑制淀粉和二糖在胃肠道中代谢为单糖，还通过肠道中的转运蛋白抑制机体对葡萄糖的吸收。因此，阿洛酮糖具有潜在的降血糖作用，可以降低人的餐后高血糖。阿洛酮糖可以应用于饮料、酸奶、冰淇淋、烘焙食品和其他高热量食品中的低热量甜味剂。美国食品与药物管理局(FDA)将D-阿洛酮糖认证为GRAS(Generally recognized as safe)后，又于2019年4月16日发布了一项指南草案，允许食品制造商在营养数据标签上从总糖和添加糖计数中排除阿洛酮糖，这使得阿洛酮糖受到市场的更大关注。
阿洛酮糖在自然界中含量极少，也被称为一种功能性“稀少糖”。目前生产阿洛酮糖的方法主要是酶转化法，即利用阿洛酮糖3-差向异构酶或塔格糖3-差向异构酶，以果糖为底物进行转化反应获得阿洛酮糖。随着大量阿洛酮糖3-差向异构酶或塔格糖3-差向异构酶被发现和定向进化，一批催化活性高、热稳定性强的优质酶已经被应用于阿洛酮糖的工业化生产中。
随着阿洛酮糖工业化生产的推进，阿洛酮糖3-差向异构酶或塔格糖3-差向异构酶的固定化备受关注。固定化酶可以增加酶的重复使用率和使用周期，更适合于连续化生产工艺，是进一步降低阿洛酮糖生产成本的关键因素之一。另外，固定化酶与游离酶相比，可以避免酶液中其他成分掺入到产物中，从而使得阿洛酮糖纯化工艺更加简化。CJ第一制糖株式会社的授权专利CN102869783B和CN104160023B中公布了产阿洛酮糖3-差向异构酶的工程菌株的固定化方法，并利用该固定化细胞进行阿洛酮糖的连续生产。这两项专利中都是利用海藻酸钙包埋的方法对产酶工程菌进行固定化，延长了固定化细胞的使用周期，但是包埋方式固定化的最大缺点是酶或细胞与载体的结合力很弱，可能造成酶或细胞的泄露。另外，海藻酸钙微球的制备过程较复杂，其硬度也较差，不利于长期使用。因此仍需开发更适合工业规模化生产的阿洛酮糖3-差向异构酶的固定化酶工艺，大幅增加固定化酶的重复使用率和使用周期，从而降低阿洛酮糖生产成本。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种阿洛酮糖3-差向异构酶固定化酶，以及该固定化酶的制备方法，利用该方法可以实现阿洛酮糖3-差向异构酶的简易、高效、低成本固定化，从而大幅提升阿洛酮糖3-差向异构酶的重复使用率和使用周期。
本发明采用以下技术方案：
本发明提供一种阿洛酮糖3-差向异构酶固定化酶，该固定化酶是来源于瘤胃菌的阿洛酮糖3-差向异构酶及其分子改造的酶蛋白与固定化树脂结合而成。
根据本发明的实施方案，所述阿洛酮糖3-差向异构酶固定化酶所固定的酶是来源于瘤胃菌的阿洛酮糖3-差向异构酶或其突变体，该酶包含与SEQ ID No.1具有至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％序列同一性的氨基酸序列。
根据本发明的实施方案，所述阿洛酮糖3-差向异构酶固定化酶所固定的阿洛酮糖3-差向异构酶或其突变体，是通过携带编码该酶或其突变体基因的大肠杆菌工程菌株或枯草芽孢杆菌工程菌株的发酵培养得到。
根据本发明的实施方案，所述阿洛酮糖3-差向异构酶固定化酶的载体是与阿洛酮糖3-差向异构酶之间能够形成共价结合、且不破坏酶活性的弱碱性大孔树脂，该大孔树脂可以是环氧型或氨基型，但不局限于这两种类型。
根据本发明的实施方案，所述阿洛酮糖3-差向异构酶固定化酶所固定的酶是来源于瘤胃菌的阿洛酮糖3-差向异构酶的改造酶，通过引入更多的碱性氨基酸，在不改变酶活的前提下，提高酶与载体环氧基之间的共价结合，从而加强固定化效果，提升固定化效率；如在酶的羧基端加上AKAKAKAKAK标签，通过赖氨酸中游离氨基与树脂上环氧基的交联，大幅提升固定化效率。
本发明还提供所述阿洛酮糖3-差向异构酶固定化酶的制备方法，具体步骤如下：
(1)树脂活化：将大孔树脂置于pH 7.5-8.0的磷酸钾缓冲液中活化；
(2)酶的制备：利用异源表达阿洛酮糖3-差向异构酶的工程菌发酵制备酶液，工程菌可以是大肠杆菌或枯草芽孢杆菌；
(3)固定化：将活化后的树脂加入到阿洛酮糖3-差向异构酶的酶液中进行固定化，固定化温度为20-40℃，固定化时间为12-24h；
(4)交联：利用浓度为0.2-0.5％的戊二醛溶液对固定化酶进行交联，洗净沥干水分后得到阿洛酮糖3-差向异构酶固定化酶。
本发明还提供所述阿洛酮糖3-差向异构酶固定化酶在生产阿洛酮糖中的具体应用。
根据本发明的实施方案，所述阿洛酮糖3-差向异构酶固定化酶能够转化果糖生成阿洛酮糖，原料中果糖浓度为20-75％，原料可以是纯果糖溶液，或者含有果糖的混合糖浆(如高果糖浆)，或者含有果糖的植物提取物(如果汁)。
根据本发明的实施方案，所述阿洛酮糖3-差向异构酶固定化酶转化果糖生成阿洛酮糖的转化反应的温度为40-70℃，低温反应可提高固定化酶的重复使用率或使用周期，高温反应有助于提升反应转化率。
根据本发明的实施方案，所述阿洛酮糖3-差向异构酶固定化酶转化果糖生成阿洛酮糖的反应体系中加入Mn2+或Co2+离子，离子浓度为0.2-2.0mM，金属离子的加入有助于提高固定化酶的重复使用率或使用周期。
根据本发明的实施方案，所述阿洛酮糖3-差向异构酶固定化酶转化果糖生成阿洛酮糖的转化方式可以选择批次反应，也可选择连续反应。
有益效果
本发明建立阿洛酮糖3-差向异构酶的固定化方法，获得了一种阿洛酮糖3-差向异构酶的固定化酶，该固定化酶与游离酶相比，热稳定性显著提升。使用该阿洛酮糖3-差向异构酶固定化酶能够以果糖或富含果糖的多种底物为原料生产阿洛酮糖，转化过程可采取批次或连续反应，大幅提升酶的重复使用率或使用周期，降低生产成本，具有广泛应用前景。
附图说明
图1通过添加标签提升阿洛酮糖3-差向异构酶固定化酶的热稳定性
图2阿洛酮糖3-差向异构酶固定化酶的重复使用率
具体实施方式
本文中，“阿洛酮糖”和“D-阿洛酮糖”、“果糖”和“D-果糖”均具有相同含义，可互换使用。
本文中，阿洛酮糖3-差向异构酶指来源于瘤胃菌的阿洛酮糖3-差向异构酶的野生型蛋白或突变蛋白。
本领域常规使用的大孔树脂均可用于本发明，实施例中所述的大孔树脂为环氧基大孔树脂或氨基大孔树脂。所述大孔树脂可以自产或商购获的，比如可以是购自天津南开和成科技有限公司的ES-1、ES-103、ES-108、ESR-1、ESR-2或ESQ-1中的至少一种。
下文将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。
实施例1阿洛酮糖3-差向异构酶的固定化方法
称取200g树脂(ES-1、ES-103、ES-108、ESR-1、ESR-2或ESQ-1)放入2L PBS缓冲液(磷酸氢二钾22.8g，磷酸二氢钾2.75g，定容到1000mL，pH约7.5)中进行活化，适当搅拌约2h后，过滤获得活化树脂。
阿洛酮糖3-差向异构酶来源于瘤胃菌，该酶的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，该酶的生产是通过携带该酶野生型蛋白或突变蛋白基因的工程菌株的发酵来实现。工程菌株可以是大肠杆菌，或者是枯草芽孢杆菌。大肠杆菌生产胞内酶，通过菌体高压均质破碎获得粗酶液；枯草芽孢杆菌生产胞外酶，发酵液离心上清即为粗酶液。取阿洛酮糖3-差向异构酶得粗酶液，其中适当重量的活化树脂，室温下搅拌过夜。使用不同树脂固定化阿洛酮糖3-差向异构酶，其固定化酶活性如表1所示。结果显示，使用天津南开和成科技有限公司的不同类型的大孔树脂都能较好固定化阿洛酮糖3-差向异构酶，其中环氧型树脂ES-108固定化酶的酶活最高。
表1不同树脂固定化酶活性
Figure RE-GDA0002753776790000041
实施例2阿洛酮糖3-差向异构酶的固定化效率和热稳定性的提升
为了进一步提升阿洛酮糖3-差向异构酶的固定化效率，增强酶与树脂载体的结合力，在阿洛酮糖3-差向异构酶的羧基端加入AKAKAKAKAK标签。标签上碱性氨基酸(赖氨酸)侧链上的氨基基团增加了酶与树脂上的环氧基结合位点，从而提升了固定化效率。实验结果发现，未加标签的阿洛酮糖3-差向异构酶与ES-108树脂的固定化效率为74.7％，而加入AKAKAKAKAK标签后的阿洛酮糖3-差向异构酶与ES-108树脂的固定化效率达到100％。实验结果还发现，加入标签后阿洛酮糖3-差向异构酶的比酶活没有明显变化。
进一步测定加入和未加入标签的阿洛酮糖3-差向异构酶的固定化酶在60℃下的热稳定性，具体方法为，取固定化酶在60℃下保温一定时间，然后加入果糖溶液测定酶活，以不经保温的固定化酶的酶活为100％，计算保温后固定化酶的剩余酶活。结果如图1所示，可见加入标签的阿洛酮糖3-差向异构酶固定化酶的热稳定性较未加标签的固定化酶显著提升，60℃下保温6h后仍然具有90％以上的活性。计算固定化酶半衰期，加入标签的固定化酶在60℃下的半衰期为47.9h，而未加标签的固定化酶在60℃下的半衰期只有14.4h。可见添加标签有助于固定化酶热稳定性的显著提升。对加标签的阿洛酮糖3-差向异构酶固定化酶的应用进行研究，测定其在批次反应和连续反应中的效果。
实施例3阿洛酮糖3-差向异构酶固定化酶的重复使用率
利用批次反应测定固定化酶的重复使用次数，以50％(w/v)果糖溶液为底物，加入固定化酶，加酶量10％(w/w)，反应温度55℃，反应2h后取样测定转化率；然后过滤得到固定化酶，加入到新鲜的50％(w/v)果糖溶液进行第二轮反应，反应2h后取样测定转化率；重复以上步骤直到反应50轮以上。结果如图2所示，可见在当前加酶量下阿洛酮糖3-差向异构酶固定化酶能够在2h内催化该差向异构化反应达到平衡，转化率30％左右；同时发现反应体系中加入Mn2+，能大幅提高阿洛酮糖3-差向异构酶固定化酶的稳定性，重复反应50次，果糖到阿洛酮糖的转化率28-29％。
实施例4阿洛酮糖3-差向异构酶固定化酶的重复使用率
该实施例在实施例2基础上进行调整，目的是进一步提高反应转化率、缩短反应时间。
利用批次反应测定固定化酶的重复使用次数，以50％(w/v)果糖溶液为底物，加入固定化酶，加酶量10％(w/w)，反应温度60℃，反应1h后取样测定转化率，其余步骤同实施例2。结果显示，在当前加酶量下阿洛酮糖3-差向异构酶固定化酶能够在1h内催化该差向异构化反应达到平衡，转化率超过30％，重复反应50次，果糖到阿洛酮糖的转化率30-31％。
实施例5阿洛酮糖3-差向异构酶固定化酶的重复使用率
该实施例在实施例2基础上进行调整，目的是减少加酶量、提高固定化酶重复使用率，从而降低成本。
利用批次反应测定固定化酶的重复使用次数，以50％(w/v)果糖溶液为底物，加入固定化酶，加酶量5％(w/w)，反应温度50℃，反应4h后取样测定转化率，其余步骤同实施例2。结果显示，在当前加酶量下阿洛酮糖3-差向异构酶固定化酶能够在4h内催化该差向异构化反应达到平衡，固定化酶重复反应次数达到80次，果糖到阿洛酮糖的转化率27-28％。
实施例6阿洛酮糖3-差向异构酶固定化酶的重复使用率
该实施例在实施例4基础上进行调整，目的是通过降低反应温度，进一步提高固定化酶重复使用率，并减少反应能耗。
利用批次反应测定固定化酶的重复使用次数，以50％(w/v)果糖溶液为底物，加入固定化酶，加酶量5％(w/w)，反应温度40℃，反应4h后取样测定转化率，其余步骤同实施例2。结果显示，在当前加酶量下阿洛酮糖3-差向异构酶固定化酶能够在4h内催化该差向异构化反应达到平衡，固定化酶重复反应次数达到100次，果糖到阿洛酮糖的转化率26-27％。
实施例7阿洛酮糖3-差向异构酶固定化酶反应器连续制备阿洛酮糖
将阿洛酮糖3-差向异构酶固定化酶填充到带有保温夹套的柱子(φ26×200)中，即为固定化酶反应器。通过反应条件及参数优化，发现保温夹套温度控制在50℃，将70％(w/v) 果糖溶液(含1mM Mn2+)以2.5ml/min的流速通过该固定化反应器时，反应器流出液中阿洛酮糖和果糖的比例基本达到平衡，平衡转化率为28-29％，该固定化反应器半衰期达到100 天以上。
以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所
<120> 一种阿洛酮糖3-差向异构酶固定化酶、其固定化方法与应用
<130> 2020.09.18
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 291
<212> PRT
<213> Ruminococcus sp.
<400> 1
Met Lys Tyr Gly Ile Tyr Tyr Ala Tyr Trp Glu Lys Glu Trp Asn Gly
1 5 10 15
Asp Tyr Lys Tyr Tyr Ile Asp Lys Ile Ser Lys Leu Gly Phe Asp Ile
20 25 30
Leu Glu Ile Ser Cys Gly Ala Phe Ser Asp Tyr Tyr Thr Lys Asp Gln
35 40 45
Glu Leu Ile Asp Ile Gly Lys Tyr Ala Lys Glu Lys Gly Val Thr Leu
50 55 60
Thr Ala Gly Tyr Gly Pro His Phe Asn Glu Ser Leu Ser Ser Ser Glu
65 70 75 80
Pro Asn Thr Gln Lys Gln Ala Ile Ser Phe Trp Lys Glu Thr Leu Arg
85 90 95
Lys Leu Lys Leu Met Asp Ile His Ile Val Gly Gly Ala Leu Tyr Gly
100 105 110
Tyr Trp Pro Val Asp Tyr Ser Lys Pro Phe Asp Lys Lys Arg Asp Leu
115 120 125
Glu Asn Ser Ile Lys Asn Met Lys Ile Ile Ser Gln Tyr Ala Glu Glu
130 135 140
Tyr Asp Ile Met Met Gly Met Glu Val Leu Asn Arg Phe Glu Gly Tyr
145 150 155 160
Met Leu Asn Thr Cys Asp Glu Ala Leu Ala Tyr Val Glu Glu Val Gly
165 170 175
Ser Ser Asn Val Gly Val Met Leu Asp Thr Phe His Met Asn Ile Glu
180 185 190
Glu Asp Asn Ile Ala Ala Ala Ile Arg Lys Ala Gly Asp Arg Leu Tyr
195 200 205
His Phe His Ile Gly Glu Gly Asn Arg Lys Val Pro Gly Lys Gly Met
210 215 220
Leu Pro Trp Asn Glu Ile Gly Gln Ala Leu Arg Asp Ile Asn Tyr Gln
225 230 235 240
His Ala Ala Val Met Glu Pro Phe Val Met Gln Gly Gly Thr Val Gly
245 250 255
His Asp Ile Lys Ile Trp Arg Asp Ile Ile Gly Asn Cys Ser Glu Val
260 265 270
Thr Leu Asp Met Asp Ala Gln Ser Ala Leu His Phe Val Lys His Val
275 280 285
Phe Glu Val
290

Claims (14)

1.一种阿洛酮糖3-差向异构酶固定化酶，其特征在于，该固定化酶是来源于瘤胃菌的阿洛酮糖3-差向异构酶与固定化树脂结合而成。
2.如权利要求1所述的阿洛酮糖3-差向异构酶固定化酶，其特征在于，该固定化酶所固定的阿洛酮糖3-差向异构酶包含与SEQ ID No.1具有至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％序列同一性的氨基酸序列。
3.如权利要求1所述的阿洛酮糖3-差向异构酶固定化酶，其特征在于，该固定化酶所固定的阿洛酮糖3-差向异构酶在如SEQ ID No.1所示的蛋白质的羧基端添加一段富含赖氨酸的标签，该标签优选为AKAKAKAKAK。
4.一种阿洛酮糖3-差向异构酶，其特征在于，该阿洛酮糖3-差向异构酶在如SEQ IDNo.1所示的蛋白质的羧基端添加一段富含赖氨酸的标签，该标签优选为AKAKAKAKAK。
5.如权利要求1所述的阿洛酮糖3-差向异构酶固定化酶，其特征在于，该固定化酶的载体是大孔树脂。
6.如权利要求1所述的阿洛酮糖3-差向异构酶固定化酶，其特征在于，该固定化酶的载体是ES-1、ES-103、ES-108、ESR-1、ESR-2或ESQ-1。
7.如权利要求1所述的阿洛酮糖3-差向异构酶固定化酶，其特征在于，该固定化酶的载体是环氧基大孔树脂。
8.如权利要求1所述的阿洛酮糖3-差向异构酶固定化酶，其特征在于，该固定化酶的载体是ES-108。
9.如权利要求1所述的阿洛酮糖3-差向异构酶固定化酶，其特征在于，该固定化酶按照如下方法制备：
(1)树脂活化：将大孔树脂置于pH 7.5-8.0的磷酸钾缓冲液中活化；
(2)酶的制备：利用异源表达阿洛酮糖3-差向异构酶的工程菌发酵制备酶液，工程菌可以是大肠杆菌或枯草芽孢杆菌；
(3)固定化：将活化后的树脂加入到阿洛酮糖3-差向异构酶的酶液中进行固定化，固定化温度为20-40℃，固定化时间为12-24h。
(4)交联：利用浓度为0.2-0.5％的戊二醛溶液对固定化酶进行交联，洗净沥干水分后得到阿洛酮糖3-差向异构酶固定化酶。
10.如权利要求1所述的阿洛酮糖3-差向异构酶固定化酶在生产阿洛酮糖中的应用。
11.如权利要求6所述的阿洛酮糖3-差向异构酶固定化酶在生产阿洛酮糖中的应用，其特征在于，原料中果糖浓度为20-75％。
12.如权利要求6所述的阿洛酮糖3-差向异构酶固定化酶在生产阿洛酮糖中的应用，其特征在于，转化温度为40-70℃。
13.如权利要求6所述的阿洛酮糖3-差向异构酶固定化酶在生产阿洛酮糖中的应用，其特征在于，反应体系中加入Mn2+或Co2+离子，离子浓度为0.2-2.0mM。
14.如权利要求6所述的阿洛酮糖3-差向异构酶固定化酶在生产阿洛酮糖中的应用，其特征在于，转化方式为批次反应或连续反应。
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