CN117965519A - 一种d-阿洛酮糖-3-差向异构酶固定化酶制剂的固定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明适用于生物工程技术领域，提出了一种D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶固定化酶制剂的固定方法，包括如下步骤：选用弱碱性阴离子交换树脂ZGA351，用碱性溶液和酸性溶液交替洗涤，得到预处理树脂；配制D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶酶液，然后加入Mn2+，得到预处理酶液；向预处理树脂中添加预处理酶液进行吸附，吸附完成后，得到D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶固定化酶制剂的溶液；向溶液中加入交联剂戊二醛，交联完成后，得到D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶固定化酶制剂。综上，本发明的固定方法使D‑阿洛酮糖的转化率高，酶制剂可以连续反应30天以上，降低了成本，更加适合工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种D-阿洛酮糖-3-差向异构酶固定化酶制剂的固定方法。
背景技术
D-阿洛酮糖（D-psicose）是自然界中含量极少的一种六碳糖，D-阿洛酮糖是一种低能量、不消化的食糖替代品，其具有降低血糖的功效，目前被国外许多制药企业当做甜味添加剂使用。此外，因D-阿洛酮糖可以通过美拉德反应使得食物具有较好的持水性，在食品领域用处广泛。D-阿洛酮糖还具有（1）降低血糖，作为Ⅱ型糖尿病人的辅助治疗剂、膳食补充剂和甜味剂；（2）降低血脂，减少脂肪合成酶活性，抑制腹腔内脂肪堆积；（3）抗氧化活性，具有很强的活性氧（ROS）清除能力及谷胱甘肽还原能力；（4）神经保和抗炎作用等。
D-阿洛酮糖是果糖的C-3位置的差向异构体，而D-阿洛酮糖-3-差向异构酶(D-allulose -3-epimerase，DAEase)是一类能将果糖进行三号位碳差向异构化生产D-阿洛酮糖的固定化酶，目前大约有20多种DAEase。现有技术中，生产D-阿洛酮糖的研究热点是采用固定化酶，此方法有反应速度快、转化率稳定、副产物少、成本低廉等优点。现有的固定化酶的方法主要有吸附法、包埋法、交联法和共价结合法。
吸附法是最早出现的固定化方法，吸附法又可以分为两种，分别是离子交换吸附和物理吸附。吸附法条件比较温和，不会很大程度地改变酶的构象，因此对酶的催化性能不会产生大的影响；但是酶和载体之间的结合力较弱，在一些特殊的条件下，比如高盐浓度、高温等条件下，酶就很容易从载体上脱落并且污染催化反应产物。
包埋法是将酶包埋于聚合物的孔隙中的固定化方法，根据包埋形态类型可将包埋法分为网格型和微囊型两种，利用聚丙烯酰胺、聚乙二醇、淀粉、明胶、海藻酸等载体的细微网格将酶包埋进去的方法称为网格型包埋，微囊型是指将酶包埋于高分子半透膜中形成微胶囊；包埋法容易出现酶的漏失和扩散限制等问题。
交联法指的是利用一些多功能交联试剂，如戊二醛等，在酶分子间或酶分子和载体分子间形成共价键，在不同的交联条件下，生产固定化酶。但是由于交联反应的无序性，可能在酶的活性中心发生交联而使酶活降低或失活。所以单一酶固定方式都有一定的缺陷。
共价结合法有稳固的共价键结合，使得酶不易从载体上脱落，可重复使用多次，但是易产生毒废料且化学试剂结合易使部分酶失活。
公开号为CN 110438113 的专利中公开了一种D-阿洛酮糖3-差向异构酶的固定化方法，其只使用包埋法，虽然说能够提高转化率，但是并没有公开转化率的数据，且55℃最多使用18批次，按照每批次使用时长4h计算，则最多使用72h，相当于3天，使用时间较短。
发明内容
有鉴于此，本发明提出了一种D-阿洛酮糖-3-差向异构酶固定化酶制剂的固定方法，该固定方法采用包埋法与交联法相结合的方式固定差向异构酶，简单高效，经济实用；并且采用该方法制备的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶，D-阿洛酮糖的转化率能够达到30%，并且可以连续反应30天以上。
本发明的技术方案是这样实现的：
一种D-阿洛酮糖-3-差向异构酶固定化酶制剂的固定方法，包括如下步骤：
步骤一 将树脂先用蒸馏水浸泡胀润，去掉表面杂质，然后用碱性溶液和酸性溶液交替洗涤，再用蒸馏水洗涤至pH7-8，最后用两倍树脂体积的蒸馏水浸泡3.5-4.5h，浸泡完全后在4℃冰箱保存备用，得到预处理树脂。
步骤二 使用pH为8的PBS缓冲液配制浓度为5000-10000U/L的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶酶液。向酶液中加入Mn2+，使Mn2+的质量浓度到0.8-1.3g/L，在4℃冰箱保存备用；得到预处理酶液；
固定方法中，向酶液中加入Mn2+，能够稳定D-阿洛酮糖-3-差向异构酶酶制剂的活性，使固定化细胞具有较高的活性和稳定性，从而提高D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的吸收率和D-阿洛酮糖的转化率。本发明的Mn2+，可以选用MnCl2。
步骤三 向上述预处理树脂中添加上述预处理酶液，在25-40℃、搅拌转速为100-300r/min的条件下吸附2-8h，吸附完成后，得到D-阿洛酮糖-3-差向异构酶固定化酶制剂的溶液。
步骤四 向上述溶液中加入体积分数为5-10%的交联剂，在30-40℃、搅拌转速为150-300r/min的条件下交联2-8h，交联完成后，得到D-阿洛酮糖-3-差向异构酶固定化酶制剂。
本发明以树脂作为固定化酶的载体，随后加入交联剂，采用树脂材料与交联剂，先吸附再交联的方式固定化过程，以包埋-交联法固定，得到D-阿洛酮糖-3-差向异构酶固定化酶制剂。
本发明中，树脂为离子交换树脂或大孔吸附树脂；离子交换树脂为弱碱性阴离子交换树脂；阴离子交换树脂的型号可以为ZGA313、ZGD630、D319、ZGA304、ZGA412、ZGA302、D213、ZGA351、LX-703SS中的一种。优选的，树脂为弱碱性阴离子交换树脂ZGA351，该树脂在大孔结构的苯乙烯——二乙烯苯共聚体上带有季铵基[—N(CH3)3OH]，与酶的官能团相结合后，固定的更加稳定，因此，其吸附效果相较于其他型号的树脂更好。
步骤三的吸附过程中，预处理酶液和预处理树脂的质量比为（5-10）：1，单位为g。
本发明中，交联剂选用双醛淀粉、聚乙二醇、二缩水甘油醚、戊二醛、京尼平、新戊二醇二缩水甘油醚中的一种。优选的，交联剂选用戊二醛。
优选的，吸附前后与加交联剂前后需使用Bradford试剂盒测溶液中蛋白浓度变化，蛋白减少量越大说明固定化效果越好。
优选的，步骤一中，交替洗涤为：采用质量浓度为3-5％的NaOH溶液和质量浓度为3-5％的HCl溶液进行交替清洗，共清洗3次，每次3-5h。
优选的，步骤二中，预处理酶液中D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的质量浓度为1-5g/L。
本发明的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶固定化酶制剂的固定方法相对于现有技术具有以下有益效果：
1、采用包埋法与交联法相结合的方式固定差向异构酶，提高D-阿洛酮糖-3-差向异构酶酶制剂的吸附效果和连续运行时间。
2、树脂的型号为ZGA351、交联剂选用戊二醛，通过两种原料的选择，进一步提高D-阿洛酮糖-3-差向异构酶酶制剂的吸附效果和D-阿洛酮糖的转化率，保证连续运行时间。
3、在D-阿洛酮糖-3-差向异构酶酶液中添加了Mn2+，吸附过程中保持温度为25-40℃，通过上述反应条件和参数的控制，再进一步提高D-阿洛酮糖-3-差向异构酶酶制剂的吸附效果和D-阿洛酮糖的转化率，固定化酶制剂可以连续运行30天以上，并且30天内转化率稳定保持在30%以上。
4、由于转化率高，在工业化生产D-阿洛酮糖的过程中能够反复回收利用，极大的降低了成本，更加适合工业化生产。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为对比例1中不同树脂吸附过程中D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的吸附率统计图；
图2为对比例1中不同树脂交联过程中D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的吸附率统计图；
图3为对比例2中不同树脂经过吸附和交联后的转化率统计图；
图4为对比例3中使用不同交联剂进行交联后的转化率统计图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施方式，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式仅仅是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。
实施例1
（1）将弱碱性阴离子交换树脂ZGA351先用蒸馏水浸泡胀润，去掉表面杂质，然后用质量浓度为3％的NaOH溶液和3％的HCl溶液交替洗涤，第一次洗涤3.2h，第二次洗涤4.5h，第三次洗涤3.8h。再用蒸馏水洗涤至pH为7，最后用两倍树脂体积的蒸馏水进行充分的浸泡，浸泡3.5h，浸泡完全后在4℃冰箱保存备用；得到预处理弱碱性阴离子交换树脂ZGA351；
（2）使用pH为8的PBS缓冲液配制浓度为5000 U/L的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶酶液，向酶液中加入Mn2+，使Mn2+的质量浓度到0.8g/L，在4℃冰箱保存备用；得到预处理酶液；
（3）向预处理弱碱性阴离子交换树脂ZGA351中添加预处理酶液，预处理酶液和预处理树脂的质量比为5：1；在25℃、搅拌转速为100 r/min条件下吸附2 h，吸附完成后，得到D-阿洛酮糖-3-差向异构酶固定化酶制剂溶液；
（4）向溶液中加入体积分数5 %的戊二醛交联剂，在30℃、搅拌转速为150r/min条件下交联2h，交联完成后，得到D-阿洛酮糖-3-差向异构酶固定化酶制剂。
实施例2
（1）将弱碱性阴离子交换树脂ZGA351先用蒸馏水浸泡胀润，去掉表面杂质，然后用质量浓度为4％的NaOH溶液和4％的HCl溶液交替洗涤，第一次洗涤3.8h，第二次洗涤4h，第三次洗涤4.5h。再用蒸馏水洗涤至pH为7.4，最后用两倍树脂体积的蒸馏水进行充分的浸泡，浸泡4h，浸泡完全后在4℃冰箱保存备用；得到预处理弱碱性阴离子交换树脂ZGA351；
（2）使用pH为8的PBS缓冲液配制浓度为6500 U/L的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶酶液，向酶液中加入Mn2+，使Mn2+的质量浓度到1.0 g/L，在4℃冰箱保存备用；得到预处理酶液；
（3）向预处理弱碱性阴离子交换树脂ZGA351中添加预处理酶液，预处理酶液和预处理树脂的质量比为8：1；在35℃、搅拌转速为220 r/min条件下吸附4.5 h，吸附完成后，得到D-阿洛酮糖-3-差向异构酶固定化酶制剂溶液；
（4）向溶液中加入体积分数7 %的戊二醛交联剂，在36℃、搅拌转速为230r/min条件下交联6h，交联完成后，得到D-阿洛酮糖-3-差向异构酶固定化酶制剂。
实施例3
（1）将弱碱性阴离子交换树脂ZGA351先用蒸馏水浸泡胀润，去掉表面杂质，然后用质量浓度为5％的NaOH溶液和5％的HCl溶液交替洗涤，第一次洗涤3.4h，第二次洗涤4.7h，第三次洗涤5h。再用蒸馏水洗涤至pH为8，最后用两倍树脂体积的蒸馏水进行充分的浸泡，浸泡4.5h，浸泡完全后在4℃冰箱保存备用；得到预处理弱碱性阴离子交换树脂ZGA351；
（2）使用pH为8的PBS缓冲液配制浓度为10000 U/L的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶酶液，向酶液中加入Mn2+，使Mn2+的质量浓度到1.3 g/L，在4℃冰箱保存备用；得到预处理酶液；
（3）向预处理弱碱性阴离子交换树脂ZGA351中添加预处理酶液，预处理酶液和预处理树脂的质量比为10：1；在40℃、搅拌转速为300 r/min条件下吸附8 h，吸附完成后，得到D-阿洛酮糖-3-差向异构酶固定化酶制剂溶液；
（4）向溶液中加入体积分数10 %的戊二醛交联剂，在40℃、搅拌转速为300r/min条件下交联8 h，交联完成后，得到D-阿洛酮糖-3-差向异构酶固定化酶制剂。
检测实验
a经过固定化得到的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶固定化酶制剂，用pH为8的PBS缓冲溶液冲洗三次备用。
b使用pH为8的PBS缓冲溶液配制终浓度为55%的果糖溶液。
c随后取5-10g冲洗之后的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶固定化酶制剂加入到树脂柱下端拧紧固定好，在柱底加入高度约1cm的玻璃珠，再填入高度约1cm的玻璃棉，将固定化完成的混合液加入柱中，赶出可能存在的气泡，在最上方再次填入约1cm的玻璃棉，加入底物将原有的液体置换出柱底出口，盖好层析柱并旋紧，开启柱塞泵。
d先以较高流速跑常温底物，用于置换存在柱中的缓冲液，同时校正蠕动泵流速（以出料口流速为准）。将树脂柱外部与水域循环连接，开启水浴加热，在树脂柱温度达到60℃左右开启进料（料液桶放在水浴锅中保持温度在60℃）蠕动泵。将泵速调至所需流速开始实验。实验条件为100-200mL/h，稳定运行1h后取样，随后使用高效液相色谱进行测定。
每天在出样口取2次样，计算30天平均转化率。
对比例1
按照实施例1所述的固定方法对D-阿洛酮糖-3-差向异构酶进行固定，不同之处在步骤(3)中除了ZGA351树脂之外，还采用D319树脂、D213树脂、ZGA302树脂、ZGA313树脂、ZGD630树脂和ZGA304树脂、ZGA412树脂分别对D-阿洛酮糖-3-差向异构酶固定化细胞进行吸附。其他条件一致。
将不同树脂进行吸附测其溶液中蛋白含量以检测吸附效果，结果如图1、图2所示。
对比例2
按照检测实验所述的测转化率方法对D-阿洛酮糖-3-差向异构酶酶制剂转化率进行测定，不同之处在于除了ZGA351树脂之外，还采用D319树脂、D213树脂、ZGA302树脂、D101树脂、ZGA313树脂、ZGD630树脂和 ZGA304树脂、ZGA412树脂、D319树脂。其他条件一致。
每天在出样口取2次样，30天平均转化率见结果图3。
由图1、图2可以得出，本发明选用ZGA351树脂可以很好吸附D-阿洛酮糖-3-差向异构酶，且ZGA351树脂的吸附效果均优于其他型号的树脂。由图3可以得出，用ZGA351树脂固定化得到的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶酶制剂30天内转化率稳定保持在30%以上，说明可以连续运行30天，并且30天内转化率均高于其他型号的树脂。
对比例3
按照实施例1所述的固定方法对D-阿洛酮糖-3-差向异构酶进行固定，不同之处为：步骤(4)除了戊二醛之外，还采用了双醛淀粉、聚乙二醇、二缩水甘油醚、京尼平、新戊二醇二缩水甘油醚分别对D-阿洛酮糖-3-差向异构酶固定化细胞进行交联。其他条件一致。
按照检测实验所述的测转化率方法对D-阿洛酮糖-3-差向异构酶酶制剂转化率进行测定，每天在出样口取2次样，30天平均转化率见结果图4。
由图4可以看出，本发明选用戊二醛进行交联反应，得到的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶酶制剂30天内转化率稳定保持在30%以上，说明可以连续运行30天，并且相较于其他树脂，30天内转化率更高。
对比例4
按照实施例2所述的固定方法对D-阿洛酮糖-3-差向异构酶进行固定，不同之处在步骤(2)中，向酶液中加入Mn2+，使Mn2+的质量浓度到0.5 g/L，其他条件均相同。
对比例5
按照实施例2所述的固定方法对D-阿洛酮糖-3-差向异构酶进行固定，不同之处在步骤(2)中，向酶液中加入Mn2+，使Mn2+的质量浓度到1.8g/L，其他条件均相同。
对比例6
按照实施例3所述的固定方法对D-阿洛酮糖-3-差向异构酶进行固定，向上述预处理树脂中添加上述预处理酶液，在20℃的温度条件下进行吸附，其他条件均相同。
对比例7
按照实施例3所述的固定方法对D-阿洛酮糖-3-差向异构酶进行固定，向上述预处理树脂中添加上述预处理酶液，在52℃的温度条件下进行吸附，其他条件均相同。
对比例8
按照实施例2所述的固定方法对D-阿洛酮糖-3-差向异构酶进行固定，不同之处在于删除步骤（4）；即只使用包埋法，不进行交联，其他条件均相同。
将实施例2-3和对比例4-8中的树脂分别进行吸附，检测溶液中蛋白含量以检测吸附效果；按照检测实验所述的测转化率方法，检测酶制剂转化率在30%以上的工作天数。检测结果见表1。
通过表中数据可以看出：
由于Mn2+能够稳定D-阿洛酮糖-3-差向异构酶酶制剂的活性，使固定化细胞具有较高的活性和稳定性。因此，在对比例4中，Mn2+浓度降低，将直接降低D-阿洛酮糖-3-差向异构酶酶制剂的连续运行时间，同时影响了转化率。对比例5中，Mn2+浓度增加，并不能很明显的延长运行时间和转化率，因此，Mn2+的质量浓度最适为0.8-1.3g/L。
对比例6中，由于吸附温度的降低，使吸附效果下降，则酶的数量下降；由于果糖的流速是一定的，酶的数量降低，则果糖转化成为D-阿洛酮糖的转化率直接降低。
对比例7中，由于温度过高，导致酶失活，吸附效果下降更多，则酶的数量下降；由于果糖的流速是一定的，酶的数量降低，则果糖转化成为D-阿洛酮糖的转化率也降低。
对比例8只使用包埋法，由于酶容易从树脂上脱落，导致连续工作时间缩短，检测酶制剂转化率在30%以上的工作天数仅为9天。
以上所述仅为本发明的较佳实施方式而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种D-阿洛酮糖-3-差向异构酶固定化酶制剂的固定方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一 选用弱碱性阴离子交换树脂，树脂型号ZGA351，用碱性溶液和酸性溶液交替洗涤，再用蒸馏水洗涤至pH为7-8，最后用蒸馏水浸泡，得到预处理树脂；
步骤二 配制浓度为5000-10000U/L的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶酶液；然后向酶液中加入Mn2+，得到预处理酶液；
步骤三 向所述预处理树脂中添加所述预处理酶液进行吸附，吸附完成后，得到D-阿洛酮糖-3-差向异构酶固定化酶制剂的溶液；
步骤四 向所述溶液中加入体积分数为5-10%的交联剂戊二醛，在30-40℃、搅拌转速为150-300r/min的条件下交联2-8h，交联完成后，得到D-阿洛酮糖-3-差向异构酶固定化酶制剂。
2.如权利要求1所述的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶固定化酶制剂的固定方法，其特征在于：所述步骤二中，向酶液中加入Mn2+后，使Mn2+的质量浓度到0.8-1.3g/L。
3.如权利要求1所述的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶固定化酶制剂的固定方法，其特征在于：所述步骤二中，预处理酶液中D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的质量浓度为1-5g/L。
4.如权利要求1所述的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶固定化酶制剂的固定方法，其特征在于：所述步骤三的吸附过程中，在25-40℃、搅拌转速为100-300r/min条件下进行吸附，吸附时间为2-8h。
5.如权利要求4所述的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶固定化酶制剂的固定方法，其特征在于：所述步骤三的吸附过程中，预处理酶液和预处理树脂的质量比为（5-10）：1。
6.如权利要求1所述的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶固定化酶制剂的固定方法，其特征在于：所述步骤一中，交替洗涤为：采用质量浓度为3-5％的NaOH溶液和3-5％的HCl溶液进行交替清洗。
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