CN105316244B

CN105316244B - 一种转化合成2-pe的酵母静息细胞及制备和高收率转化合成2-pe的方法

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Publication number: CN105316244B
Application number: CN201510549618.8A
Authority: CN
Inventors: 黄筱萍; 刘兰; 黄国昌; 熊大维; 金丹风
Original assignee: INSTITUTE OF MICROBIOLOGY JIANGXI ACADEMY OF SCIENCES
Current assignee: INSTITUTE OF MICROBIOLOGY JIANGXI ACADEMY OF SCIENCES
Priority date: 2015-09-01
Filing date: 2015-09-01
Publication date: 2018-08-14
Anticipated expiration: 2035-09-01
Also published as: CN105316244A

Abstract

本发明一种转化合成2‑PE的酵母静息细胞，中文命名：酿酒酵母SH003，英文命名：Saccharomyces cerevisiae SH003，于2015年6月19日保藏于位于中国·武汉·武汉大学的中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号CCTCC NO：M 2015389。本发明还公开了一种转化合成2‑PE的酵母静息细胞的制备方法，以及使用酵母静息细胞高收率转化合成2‑PE的方法。本发明采用酵母静息细胞生产2‑PE，细胞可重复利用，不需要在无菌条件下进行操作，反应液组分简单，采用乙醇作为辅助底物，对产物的分离纯化不造成影响，利用树脂原位吸附产物不仅可提高转化合成2‑PE产量，还可与提取工艺耦合，所生产的2‑PE产品香味纯正。与酵母细胞生长细胞生物转化2‑PE的工艺相比，具有生长周期短，易于提取，操作简便，成本低，环境污染小等优点，有较大的工业化应用潜力。

Description

一种转化合成2-PE的酵母静息细胞及制备和高收率转化合成 2-PE的方法

技术领域

本发明属生物化工合成2-PE技术领域，具体涉及一种用酵母静息细胞转化合成2-PE的方法。本发明所述酵母静息细胞于2015年6月19日保藏于位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M 2015389，保藏物名称为：酿酒酵母 SH003，Saccharomyces cerevisiae SH003。

背景技术

β-苯乙醇（β-phenylethanol，2-PE）亦称2-苯乙醇，因具有柔和、愉快而持久的玫瑰香气而广泛用于食品、烟草和日化产品中。天然2-PE是从玫瑰精油中提取获得，受到植物原料等因素影响，无法进行大规模工业生产且价格昂贵。利用微生物转化法可以取代从植物精油中生产2-PE。目前主要是通过添加前体物质L-苯丙氨酸（L-Phe）来微生物转化合成2-PE，酵母细胞通过艾氏途径（Ehrlich pathway），即L-Phe通过转氨作用生成苯丙酮酸，再脱羧形成苯乙醛后，在脱氢酶的作用下生成2-PE。酵母细胞在自身生长代谢过程中会产生大量的乙醇，乙醇和2-PE浓度过高又抑制酵母细胞的转化作用，是生物转化法生产2-PE产率低下的主要原因，也是制约生物法生产天然2-PE的技术关键。酵母细胞转化L-Phe生产2-PE时，当反应液中2-PE浓度达到2g/L时，可抑制大部分酵母细胞的生长，当反应液中2-PE浓度达到4g/L时，是酵母细胞转化合成的极限值。采用水/有机溶剂两相体系进行产物原位转移（ISPR）技术可一定程度解决生物催化过程中的产物抑制效应，但后续分离纯化步骤繁杂，提取精制收率低。利用树脂吸附的ISPR技术亦可提高2-PE产量，但在实际操作过程中容易染菌而使其应用受到限制。采用生长细胞转化合成2-PE过程中，由于生长细胞培养基中含大量糖、蛋白粉、酵母粉等有机物，在糖酵解过程中会产生大量乙醇、杂醇（丁醇）和杂酸（丁酸和异丁酸等）等副产物，有机物、杂酸、杂醇的存在会降低产品品质，并使后续分离纯化困难。

针对现有转化合成技术存在的问题和技术难点，我们采用酵母静息细胞以整体细胞作为反应催化剂，可以有效地控制反应液的组成，同时减少了培养基成分对转化过程的影响，反应液组分简单、副产物少、无需在无菌条件下操作、产品易于分离纯化、细胞可重复利用，且在转化过程中不必担心底物、产物及有毒副产物对细胞生长的影响。目前在各个领域的已展开了静息细胞研究，如天然化合物的生物合成、药物前体化合物转化、乳酸、乙酸的生产等领域。但到目前为止，国内外还未见到采用静息细胞转化合成2-PE的相关报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种制备2-PE的酵母静息细胞及其制备方法。本发明要解决的另一个问题是提供一种使用酵母静息细胞高收率、高纯度制备2-PE的方法。

本发明通过以下技术方案解决上述技术问题：

一种转化合成2-PE的酵母静息细胞，中文命名：酿酒酵母SH003，英文命名：Saccharomyces cerevisiae SH003，于2015年6月19日保藏于位于中国·武汉·武汉大学的中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号CCTCC NO：M 2015389。

一种转化合成2-PE的酵母静息细胞的制备方法，其步骤包括：

（1）从斜面培养基挑取1～2环菌苔至30mL细胞增殖培养液中，于28℃、180r/min振荡培养18-24h；

（2）再以2%的接种量接种于细胞增殖培养液中，于500mL三角瓶中装100mL细胞增殖培养液，于28℃、180r/min振荡培养24h，进行细胞扩增培养；

（3）再进行离心收集菌体细胞，离心转速5000r/min，离心5-10min，弃上清，收集菌体；

（4）用pH值为6.0-6.8、浓度为0.1mol/L的磷酸钠缓冲液离心洗涤细胞两次；

（5）再将菌体重悬于pH值为5.1-5.5、浓度为0.1 mol/L的磷酸钾缓冲液中，配制酵母静息细胞浓度为8-12%(w/w)的菌悬液，于4℃冰箱中保存备用。

为了获得更好的技术效果，上述培养酵母细胞的斜面培养基组分：葡萄糖20g/L，蛋白胨3 g/L，酵母粉 2 g/L，麦芽汁 2 g/L；上述细胞增殖培养液组分：葡萄糖 30 g/L，蛋白胨 5 g/L，酵母粉 3 g/L，麦芽汁 3 g/L，pH值为5.8～6.2；步骤（4）中所述酵母静息细胞浓度为8-12%(w/w)的菌悬液保存有效期不少于90天。

本发明还包括一种使用酵母静息细胞高收率转化合成2-PE的方法，其步骤为：

（1）取酵母静息细胞浓度为8-12%(w/w)的菌悬液30mL于250mL的三角瓶中；

（2）向菌悬液中加入0.15-0.60g的底物L-Phe和0.3-0.9g的辅助底物；

（3）再向混合液中加入促进转化合成的溶液A和溶液B，其中溶液A添加量20-100uL，溶液B添加量20-100uL；

（4）将混合液置于25-30℃下，100-200r/min振荡反应16-48h；反应结束后，离心转速3500-5000r/min，离心5-10min，上清液中即含制备的2-PE。

作为优化，步骤（3）中，溶液A含有0.4-1.0mol/L的Mg²⁺和0.2-1.0mol/L的Zn²⁺，溶液B含有0.1-0.5mol/L的维生素B₁和1.0-2.0mol/L的α－酮戊二酸；

作为优化，步骤（1）中，在混合液中加入占混合液质量10%(W/W)的大孔树脂，所述大孔树脂为HZ816大孔吸附型树脂，其湿视密度为0.65-0.75g/mL，范围粒度为0.315-1.25mm，该树脂对产物2-PE吸附容量高，对底物L-Phe基本无吸附作用；步骤（4）中，转化反应结束后，真空抽滤分离混合液与大孔树脂，大孔树脂用纯水洗净后浸泡于8-10倍大孔树脂体积的乙醇中进行产物洗脱；洗脱液减压蒸馏去除乙醇，得高纯度2-PE产品；

作为优化，步骤（4）后，混合液于10000r/min离心10min，取上清液，所述上清液通过大孔树脂柱，过柱流速为0.5-2.0m³/（m³·h），再用5-7倍树脂体积的乙醇洗脱产物，洗脱流速为1.0-3.5m³/（m3·h），收集乙醇洗脱液；洗脱液减压蒸馏去除乙醇，得2-PE产品；所述大孔树脂为HZ816大孔树脂，其湿视密度为0.65-0.75g/mL，范围粒度为0.315-1.25mm，该树脂对产物2-PE吸附容量高，对底物L-Phe基本无吸附作用；

作为优化，所述辅助底物为乙醇、D-甘露糖、蔗糖、葡萄糖中的一种；

作为优化，所述辅助底物优选为乙醇；

作为优化，步骤（4）中离心分离后获得的稀湿菌体用pH值为6.8、浓度为0.1mol/L的磷酸钠缓冲液常温离心洗涤两次，离心转速5000r/min离心10min；再将菌体重悬于pH值为5.1、浓度为0.1mol/L的磷酸钾中，配制酵母静息细胞浓度为8-12%（w/w）的菌悬液；再按步骤（1）-（4）所述方法重复使用合成2-PE；重复次数不少于8次。

本发明的特点在于采用酵母静息细胞生产2-PE，细胞可重复利用，不需要在无菌条件下进行操作，反应液组分简单，采用乙醇作为辅助底物，对产物的分离纯化不造成影响，利用树脂原位吸附产物不仅可提高转化合成2-PE产量，还可与提取工艺耦合，所生产的2-PE产品香味纯正。溶剂乙醇可回收利用，主要的废水排放为增殖培养液上清液，及设备清洗水，可生化性强。与酵母细胞生长细胞生物转化2-PE的工艺相比，具有生长周期短，易于提取，操作简便，成本低，环境污染小等优点，有较大的工业化应用潜力。

附图说明

附图1本发明实施例2-苯乙醇分离提取工艺流程图。

具体实施方式

下面结合实施例进一步详细阐述本发明的内容。

实施例1:一种转化合成2-PE的酵母静息细胞及其制备方法

一种转化合成2-PE的酵母静息细胞的制备方法，其步骤包括：

（1）培养酵母细胞的斜面培养基组分：葡萄糖20g/L，蛋白胨3 g/L，酵母粉 2 g/L，麦芽汁 2 g/L，115℃灭菌20min；细胞增殖培养液组分：葡萄糖 30 g/L，蛋白胨 5 g/L，酵母粉 3 g/L，麦芽汁 3 g/L，pH值为5.8～6.2，115℃灭菌20min；

（2）从冰箱保存的斜面培养基上挑取2环菌苔接种于装有30mL细胞增殖培养液的250mL三角瓶中，于28℃、180r/min振荡培养18-24h；

（3）用无菌移液管吸取2mL步骤（2）制备的液体，接种于装有100mL增殖培养液的500mL三角瓶中，共接种20瓶，于28℃、180r/min摇床振荡培养24h，进行细胞扩增培养，本步骤的目的是为收集菌体细胞，并保持每瓶内细胞活性相同；

（4）再进行离心收集菌体细胞，离心转速5000r/min，离心10min，弃上清液，收稀湿菌体62.4g；

（5）用pH值为6.8、浓度为0.1mol/L的磷酸钠缓冲液离心洗涤稀湿菌体两次，离心转速5000r/min，离心15min，弃上清液；

（6）再将菌体重悬于pH值为5.1、浓度为0.1 mol/L的磷酸钾缓冲液中，配制酵母静息细胞浓度为10%（w/w）的菌悬液，获菌悬液624g，置4℃冰箱保存备用。

实施例2 酵母静息细胞辅酶NADH再生辅助底物的筛选

一种使用实施例1制备的酵母静息细胞高收率转化合成2-PE中，辅酶NADH再生辅助底物的筛选的方法，其步骤为：

（1）将实施例1制备的酵母静息细胞菌悬液分装到250mL三角瓶中，每瓶装液量30mL，分装8瓶；

（2）每个三角瓶中加入0.24g底物 L-Phe；

（3）其中一瓶三角瓶为对照样，不添加辅助底物；另外七瓶三角瓶中分别添加0.6g辅助底物，它们分别为葡萄糖、蔗糖、D-甘露糖、D-木糖、甲醇、乙醇、丙醇；

（4）再向上述8瓶三角瓶中各加入60uL的溶液A和60uL的溶液B；溶液A含有1mol/L的Mg²⁺和1 mol/L的Zn²⁺，溶液B含有0.5mol/L的维生素B₁和2mol/L的α－酮戊二酸；

（5）将上述8瓶三角瓶置于26℃下，摇床200r/min振荡反应24h；

（6）反应结束后，分别取8瓶三角瓶中的混合液于5000r/min离心10min，取上清液，采用高效液相色谱法检测L-Phe和2-PE含量。

经检测发现，在不添加辅助底物的对照样中，基本上没有2-苯乙醇的产生；不同的辅助底物对合成2-PE的影响很大，其中辅助底物乙醇、D-甘露糖、蔗糖和葡萄糖对转化合成2-PE有明显的促进作用，其2-PE产量分别为3.45g/L、3.36g/L，3.17g/L和3.12g/L，而加入辅助底物木糖、甲醇和丙醇没有促进作用，基本上没有2-PE产生。

在上述辅助底物中，乙醇的促进作用最为显著。这表明酵母静息细胞自身没有再生辅酶NADH能力，添加辅助底物构建与酵母静吸细胞自身代谢耦合的辅酶再生系统，是实现酵母静息细胞转化合成2-苯乙醇和重复利用的必要手段。

实施例3:溶液A和溶液B及缓冲溶液影响评价试验

一种使用实施例1制备的酵母静息细胞高效合成2-PE的方法，其步骤为：

（1）将实施例1制备的酵母静息细胞液分装到250mL三角瓶中，每瓶装液量30mL，分装6瓶；

（2）向6瓶三角瓶中分别加入底物0.24g的L-Phe和辅助底物0.6g的无水乙醇；

（3）向其中3瓶三角瓶中分别加入60uL的溶液A和60uL的溶液B，进行三个平行试验；另外三瓶不添加溶液A和溶液B作为平行对照；

（4）将6瓶三角瓶置于30℃下，摇床200r/min振荡反应24h；

（5）反应结束后，混合液于3500r/min离心5min，取上清液，采用高效液相色谱法检测L-Phe和2-PE含量。

反相高效液相色谱法测定L-Phe和2-PE含量：取上清液，稀释，用0.22μm聚醚水性滤膜过滤后，于HPLC分析。

高效液相色谱检测条件，流动相为甲醇∶水＝50%∶50%（v/v），流速为1.0mL/min，检测波长260nm，柱温30℃，进样量10μL。

三个平行试验平均2-PE产量达3.54g/L，摩尔产率为59.6%。

不添加溶液A和溶液B的平行对照实施例中，转化结束后，2-PE产量为2.9-3.1g/L，与上述加入溶液A和溶液B的实施例相比，加入溶液A和溶液B对转化合成2-PE有明显的促进作用，2-PE产量提高13－22%。因此，本发明添加微量的无机离子溶液A和转化促进因子溶液B对酵素母艾氏代谢途径中的酶活具有一定的调节作用，可显著提高转化合成2-PE产量，比未加入提高产量13－22%。

缓冲液评价对比例：在实施例1步骤（6）中，采用pH值为5.1、浓度为0.1mol/L的磷酸钠缓冲液替换pH值为5.1、浓度为0.1 mol/L的磷酸钾缓冲液，配制酵母静息细胞浓度为10%（w/w）的菌悬液，再按上述相同的反应步骤进行转化反应，3次平行试验， 2-PE平均产量达3.21g/L，摩尔产率为43.5%。

经试验对比发现，酵母静息细胞在pH值为5.1、浓度为0.1mol/L磷酸钾缓冲液中转化合成2-苯乙醇能力较高，比在pH值为5.1、浓度为0.1mol/L磷酸钠缓冲液中转化合成获得的2-PE浓度高10%以上，这表明K⁺对本发明艾氏代谢途径的酶活具有调节作用，有利于酵母静息细胞的转化合成。

本发明采用在磷酸钾缓冲液中进行酵母静息细胞的转化反应，比采用其它缓冲液体系如磷酸钠缓冲液更有利于促进细胞的转化合成2-PE。

实施例4：酵母静息细胞重复利用与保存实验

与生长细胞相比，采用酵母静息细胞转化合成2-PE最大的特点就是在于酵母静息细胞可以重复使用。

将实施例2步骤（6）反应结束后离心分离出的稀湿菌体用pH值为6.8、浓度为0.1mol/L的磷酸钠缓冲液常温离心洗涤两次，离心转速5000r/min离心10min，再将菌体重悬于pH值为5.1、浓度为0.1mol/L的磷酸钾中，配制酵母静息细胞浓度为12%（w/w）的菌悬液。

再按获得的酵母静息细胞菌悬液实施例3中的方法进行反应，反应条件同实施例3，反应结束后的上清液采用高效液相色谱法检测L-Phe和2-PE含量。重复将离心分离出的稀湿菌体在上述相同的条件下反复使用酵母静息细胞8次，验证酵母静息细胞催化稳定性。

经试验对比发现，酵母静息细胞第1次平均转化合成2-PE产量为3.54g/L，以第1次转化酵母静息细胞的生物活性为100%计，前3次重复利用试验中，酵母静息细胞的生物活性变化很小，均保持在98%以上，酵母静息细胞重复使用第4次后，酵母静息细胞的细胞生物活性开始下降，随后酵母静息细胞的生物活性保持较平稳的状态，重复利用第8次时，其生物活性仍达91.6%，表明在本发明优化的转化条件下，酵母静息细胞可以多次重复使用，2-PE产率无明显下降，反应结果见表1。

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将上述第1次使用后的酵母静息细胞稀湿菌体用pH值为6.8、浓度为0.1mol/L的磷酸钠缓冲液常温离心洗涤两次，离心转速5000r/min离心10min，再将菌体重悬于pH值为5.1、浓度为0.1mol/L的磷酸钾中，配制酵母静息细胞浓度为8%（w/w）的菌悬液，置4℃冰箱保存，分别在保存30d、60d和90d时取出，按本实施例上述相同的条件进行转化反应使用一次，2-PE产量分别为3.47g/L、3.38g/L和3.33g/L，酵母静息细胞的转化生物活性无明显下降。

本发明采用酵母静息细胞转化转化合成2-PE的酵母静息细胞菌体可以重复使用。菌体反复使用8次，酵母静息细胞的生物活性变化很小，细胞第8次使用的生物活性比首次使用的细胞生物活性仅下降8%左右，酵母静息细胞在4℃冰箱中保存3个月其催化活性没有变化，表明酵母静息细胞催化活性非常稳定。

实施例5：大孔树脂影响评价

选用的吸附树脂对产物吸附容量较大，对底物吸附容量低，HZ816大孔树脂树脂对2-PE的吸附率为103.5mg/g，对底物L-Phe的吸附率仅为5.8mg/g，产物的吸咐量是底物的约18倍，是一种较理想的产物分离树脂。用10倍树脂体积的95%的乙醇静态洗脱2-PE，洗脱液中2-PE量为98.3mg，2-PE的洗脱率为95%。

在实施例3反应中，在步骤（1）中加入占酵母静息细胞反应液10%(w/w)的大孔树脂，按表2配料加入底物L-Phe，辅助底物无水乙醇，于26℃、摇床200r/min振荡反应20h，按表中补料量补加L-Phe和无水乙醇，继续反应至40h结束转化反应。其中样品1、2为不添加树脂的对照。其他转化条件均同实施例3，吸附在树脂中的2-PE用30mL95%的乙醇洗脱，反应液和树脂洗脱液采用高效液相色谱法检测L-Phe和2-PE含量。实验设计和结果见表2。

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试验结果表明：1、通过样品1和3进行比较发现，在反应液中加入大孔树脂，2-PE产量由3.541g/L提高到4.850g/L，产量提高37%，转化率由59.638%提高到81.680%；反应液中2-PE浓度保持在较低水平，大量的产物2-PE被吸附在树脂中；

2、比较样品1和2,在不添加树脂的条件下，底物和辅助底物浓度的增加，虽然可以提高产量，但是转化率下降明显；样品2和5进行比较发现，当底物和辅助底物添加量相同时，反应液加入大孔树脂后，2-PE产量由3.884g/L提高到9.343g/L，转化率由34.888%提高到83.924%；

3、通过样品3和4进行比较发现，反应液加入大孔树脂后，2-PE的产量和转化率明显提高，所需的酵母静息细胞辅酶NADH再生速度和需求量随之增加，辅助底物的增加有助于静息细胞辅酶NADH再生，促进2-PE产量由4.850g/L提高到5.347g/L，转化率由81.680%提高到90.056%；此时2-PE产量比未添加树脂时产量提高163.9%；

4、在L-Phe浓度为8g/L时，加入树脂后2-PE产量由3.884g/L提高到5.347g/L，产量提高了37%，转化率达90%；提高底物浓度至15g/L(样品5)时产量达9.34g/L，比未加树脂产量提高163.8%。继续提高底物浓度为20g/L(样品6)，2-PE产量没有明显增加，转化率明显下降，树脂对2-PE的吸附率分别为82.4mg/g和84.0mg/g，表明此时树脂吸附已基本达到饱和状态，要进一步提高产量，须加大树脂的添加量。

实施例6：5L罐放大试验

5L罐放大试验高收率制备2-PE，其步骤为：

（1）培养酵母细胞的斜面培养基组分：葡萄糖20g/L，蛋白胨3 g/L，酵母粉 2 g/L，麦芽汁 2 g/L，115℃灭菌20min；细胞增殖培养液组分：葡萄糖 30 g/L，蛋白胨 5 g/L，酵母粉 3 g/L，麦芽汁 3 g/L，pH5.8～6.2，115℃灭菌20min；

（2）从冰箱保存的斜面培养基上挑取2环菌苔接种于装有60mL增殖培养液的250mL三角瓶中，于28℃摇床180r/min振荡18h；

（3）将步骤（2）制备的液体，接种于装有3L增殖培养液的5L发酵罐中，于28℃、搅拌转速180r/min、通入空气，通气量0.5vvm（vvm:air volume/culture volume/min，即通气比，为每分钟通气量与罐体实际料液体积的比值）培养24h，进行细胞扩增培养，培养过程中pH从5.45降至4.90；

（4）培养结束再进行离心收集菌体细胞，离心转速5000r/min，离心10min，弃上清液，收稀湿菌体216g；

（5）用pH值为6.8、浓度为0.1mol/L的磷酸钠缓冲液离心洗涤稀湿菌体两次，离心转速5000r/min，离心10min；

（6）再将菌体重悬于pH值为5.1、浓度为0.1mol/L的磷酸钾缓冲液中，配制8%（w/w）的菌体浓度的酵母静息细胞液，获酵母静息细胞菌悬液2.7L；

（7）称取预处理好的大孔树脂270g，加入酵母静息细胞菌悬液中；

（8）向混合液中加入27g的底物L-Phe和64mL的辅助底物乙醇；

（9）再向混合液中加入1.8mL的溶液A和1.8mL的溶液B；

（10）将混合液置于25℃下，搅拌转速150r/min，通气量0.2vvm，转化过程中流加1mol/L的H₃PO₄溶液控制体系pH在5.1；反应24h后补加L-Phe 27g，无水乙醇32mL，42h后结束转化反应；

（11）反应结束后，真空抽滤，分离的大孔树脂用纯水淋洗，尽量去除菌体细胞，获反应清液2.92L，水洗液0.85L；

（12）反应清液和水洗液于10000r/min离心10min，取上清液，采用高效液相色谱法检测L-Phe和2-PE含量；

（13）将步骤（11）洗净的大孔树脂装柱，用无水乙醇进行动态洗脱吸附在树脂中的2-PE，流速为4.5m³/（m³·h），共收集洗脱乙醇液2.47L。

经检测，反应清液、水洗液和洗脱乙醇液中2-PE含量分别为1.21g/L，0.644g/L和8.287g/L，即2-PE量分别为3.53g，0.547g和20.47g，转化生成2-PE总量为24.54g，折成反应液(2.7L)中的2-PE浓度为9.09g/L，摩尔转化率为61.23%。

实施例7：2-PE的提取

实施例6中的反应清液和水洗液共3.77L， 2-PE产量累计4.077g，5000r/min离心5min，，上清液通过大孔树脂HZ-816树脂柱吸附2-PE，流速为2.0m³/（m³·h），再用无水乙醇洗脱，洗脱流速为3.5m³/（m³·h），收集洗脱液1.052L，洗脱液中2-PE浓度为3.68g/L，2-PE总量为3.873g，2-PE回收率为95%。

实施例6中的洗脱乙醇液2.47L（2-PE量20.47g）于5000r/min离心5min，取上清液与上述1.052L洗脱液混合，减压蒸馏去除乙醇，操作条件：真空度225mmHg（30.0kPa），塔顶温度36.4℃，釜温55～70℃，回流比R=0.5～1。馏出乙醇可回收使用，浓缩后的2-PE溶液2－PE含量为92.4%，香味纯正，可进一步精制获得纯度更高的2-PE产品。

在常规合成2-PE的反应中，高浓度的乙醇与2-PE对酵母细胞的生长细胞有抑制作用，主要是干扰细胞膜的物质传递和电势，但我们通过试验发现高浓度的乙醇对酵母静息细胞没有抑制作用，反而进一步促进反应物的转化。本发明中，添加乙醇目的有二，其一，酵母菌通过艾氏途径转化合成2-苯乙醇发生了氧化还原反应，即苯乙醛在脱氢酶的作用下生成2-苯乙醇，而还原反应主要受脱氢酶和还原型辅酶NADH的影响，由于酵母细胞中脱氢酶在还原苯乙醛时要不断消耗作为电子供体的还原型辅酶NADH，通常酵母细胞内NADH浓度很低，而活性酵母细胞为了保持正常的生理氧化还原状态会不断再生还原型辅酶NADH，以保持细胞内正常的氧化还原状态；但是和活性酵母细胞相比，酵母静息细胞自身没有再生辅酶能力，虽然外部添加辅酶NADH可提高还原酶活性，但其价格昂贵，本发明通过高浓度乙醇进行还原型辅酶NADH再生，乙醇添加量为5-20g/L，可有效还原乙醇脱氢酶辅酶NAD为NADH，而且与糖类辅助底物相比，乙醇作为辅酶辅助底物对2-PE合成效果最为显著，且乙醇作为辅助底物便于后期产物的分离纯化；其二，在常规合成反应中生长细胞培养基中含大量糖、蛋白粉、酵母粉等有机物，同时加入树脂也可能造成反应液染菌，而本发明中通过添加高浓度乙醇，不利于杂菌的生长，对提高产品品质有很大作用。

酵母静息细胞催化反应专一性强，反应液中仅添加了底物L-Phe、辅酶NADH的再生底物乙醇和微量的有利于转化反应用的无机盐的维生素，反应液组分非常简单，由于没有其它培养基成分对转化过程的影响，酵母静息细胞除维持艾氏代谢途径外，其它代谢途径基本都处于非活化的状态，且整个转化过程无需在无菌条件下操作，操作方便。以酵母静息细胞转化工艺结合大孔树脂作为吸附介质的ISPR技术，可显著提高2-PE的产率，并使下游提取精制易于实施。

本发明实施例中的实验操作，从酵母静息细胞的制备、转化过程、保存均无需在无菌条件下操作，与生长酵母细胞相比，酵母静息细胞具操作简便，反应液组成简单，细胞可多次重复使用，易于产业化，为生物转化生产2-PE提供了一新的途径。

Claims

1.一种转化合成2-PE的酵母静息细胞高收率转化合成2-PE的方法，其步骤为：

（1）取转化合成2-PE的酵母静息细胞质量百分比浓度为8-12%的菌悬液30mL于250mL的三角瓶中；所述转化合成2-PE的酵母静息细胞，中文命名：酿酒酵母SH003，英文命名：Saccharomyces cerevisiae SH003，于2015年6月19日保藏于位于中国·武汉·武汉大学的中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号CCTCC NO：M 2015389；

（2）向菌悬液中加入0.15-0.45g的底物L-Phe和0.3-1.2g的辅助底物；所述辅助底物为乙醇、D-甘露糖、蔗糖、葡萄糖中的一种；

（3）再向混合液中加入促进转化合成的溶液A和溶液B，其中溶液A添加量20-100uL，溶液B添加量20-100uL；所述溶液A含有0.4-1.0mol/L的Mg²⁺和0.2-1.0mol/L的Zn²⁺；所述溶液B含有0.1-0.5mol/L的维生素B₁和1.0-2.0mol/L的α－酮戊二酸；

2.如权利要求1所述转化合成2-PE的酵母静息细胞高收率转化合成2-PE的方法，其特征在于，步骤（1）中，在混合液中加入占混合液质量10%的大孔树脂，所述大孔树脂为HZ816大孔吸附型树脂，其湿视密度为0.65-0.75g/mL，范围粒度为0.315-1.25mm，该树脂对产物2-PE吸附容量高，对底物L-Phe基本无吸附作用；步骤（4）中，转化反应结束后，真空抽滤分离混合液与大孔树脂，大孔树脂用纯水洗净后浸泡于8-10倍大孔树脂体积的乙醇中进行产物洗脱；洗脱液减压蒸馏去除乙醇，得高纯度2-PE产品。

3.如权利要求1所述转化合成2-PE的酵母静息细胞高收率转化合成2-PE的方法，其特征在于，步骤（4）后，混合液于10000r/min离心10min，取上清液，所述上清液通过大孔树脂柱，过柱流速为0.5-2.0m³/（m³·h），再用5-7倍树脂体积的乙醇洗脱产物，洗脱流速为1.0-3.5m³/（m³·h），收集乙醇洗脱液；洗脱液减压蒸馏去除乙醇，得2-PE产品；所述大孔树脂为HZ816大孔树脂，其湿视密度为0.65-0.75g/mL，范围粒度为0.315-1.25mm，该树脂对产物2-PE吸附容量高，对底物L-Phe基本无吸附作用。

4.如权利要求1所述转化合成2-PE的酵母静息细胞高收率转化合成2-PE的方法，其特征在于，所述辅助底物优选为乙醇。

5.如权利要求1所述转化合成2-PE的酵母静息细胞高收率转化合成2-PE的方法，其特征在于，步骤（4）中离心分离后获得的稀湿菌体用pH值为6.8、浓度为0.1mol/L的磷酸钠缓冲液常温离心洗涤两次，离心转速5000r/min离心10min；再将菌体重悬于pH值为5.1、浓度为0.1mol/L的磷酸钾中，配制酵母静息细胞质量百分浓度为8-12%的菌悬液；再按步骤（1）-（4）所述方法重复使用合成2-PE；重复次数不少于8次。