CN107022587A - 一种酶法催化合成依折麦布中间体的方法 - Google Patents

一种酶法催化合成依折麦布中间体的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN107022587A
CN107022587A CN201710285381.6A CN201710285381A CN107022587A CN 107022587 A CN107022587 A CN 107022587A CN 201710285381 A CN201710285381 A CN 201710285381A CN 107022587 A CN107022587 A CN 107022587A
Authority
CN
China
Prior art keywords
tubular reactor
substrate
enzyme
carbonyl reductase
concentration
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201710285381.6A
Other languages
English (en)
Inventor
贺沁婷
汪斌
梁国斌
舒莉
程洁红
程庆霖
童霏
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jiangsu University of Technology
Original Assignee
Jiangsu University of Technology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jiangsu University of Technology filed Critical Jiangsu University of Technology
Priority to CN201710285381.6A priority Critical patent/CN107022587A/zh
Publication of CN107022587A publication Critical patent/CN107022587A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/14—Nitrogen or oxygen as hetero atom and at least one other diverse hetero ring atom in the same ring

Landscapes

  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种酶法催化合成依折麦布中间体的方法，本发明以自制羰基还原酶为催化酶，以NADP为辅酶，对(4S)‑3‑[5‑(4‑氟苯基)‑1,5‑二氧代戊基)‑4‑苯基‑2‑恶唑烷酮在管式反应器中循环反应生成(4S)‑3‑[(5S)‑5‑(4‑氟苯基)‑5‑羟基戊酰基)‑4‑苯基‑1,3‑氧氮杂环戊烷‑2‑酮，本发明将羰基还原酶在管式反应器中与底物反应，使得酶在反应体系充分和底物接触，提高了反应效率，用膜组件截留酶，使后续分离简单。

Description

一种酶法催化合成依折麦布中间体的方法
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种酶法催化合成依折麦布中间体的方法。
背景技术
依折麦布是由先灵葆雅(ScheringPliugh)公司和默克(Merck)共同研发的一种新型抑制胆固醇吸收的降血脂药物。该药品于2002年底被美国食品药物管理局(FDA)批准在德国和美国上市，商品名为ezetrol(益识纯)。依折麦布(Ezetimibe)与他汀类药物联合使用成为调脂治疗新方法。专利2016年到期，开发生产该药物有重要的社会效益及巨大的经济效益。
依折麦布结构中有3个手性中心，两个手性中心在β-内酰胺上，另外一个是(S)-羟基的构建。构建(S)-羟基的方法为化学法或者生物法还原(4S)-3-[5-(4-氟苯基)-1,5-二氧代戊基)-4-苯基-2-恶唑烷酮，其中化学法得到的产物光学纯度较低，降低了产品品质；而生物法具有反应条件温和，反应转化率高，产物化学纯度和光学纯度高等优点。目前报道的生物催化酶主要有羰基还原酶。羰基还原酶是一类通过分子内亲核取代机制催化邻卤醇转化为环氧化物的脱卤酶，可以高效高选择地催化环氧化物和邻卤醇之间的转化，因而可以用来合成具有光学纯的醇类化合物，具有传统化学合成法所无法比拟的优越性。羰基还原酶在辅酶作用下就能催化底物(4S)-3-[5-(4-氟苯基)-1,5-二氧代戊基)-4-苯基-2-恶唑烷酮为(4S)-3-[(5S)-5-(4-氟苯基)-5-羟基戊酰基)-4-苯基-1,3-氧氮杂环戊烷-2-酮，如下式所述。
但是，现有的羰基还原酶催化法仍然存在以下不足：(1)目前游离羰基还原酶反应结束后，需要采用活性炭等将羰基还原酶从反应体系中吸附出来，一方面，会有少量羰基还原酶残留在反应液中，且在后续精馏过程中也很难去除，从而影响了产品的品质；另一方面，活性炭在吸附羰基还原酶的同时也会吸附一部分(4S)-3-[(5S)-5-(4-氟苯基)-5-羟基戊酰基)-4-苯基-1,3-氧氮杂环戊烷-2-酮，从而影响产品的收率，尤其是增加了后处理的复杂程度。(2)目前固定化羰基还原酶方法，有效需要用化学法固载在载体上，酶活力损失大；其次酶占固定化酶中比例低于5％，增加了反应器体积，提高了投资成本。
发明内容
本发明的目的是克服现有羰基还原酶还原(4S)-3-[5-(4-氟苯基)-1,5-二氧代戊基)-4-苯基-2-恶唑烷酮时羰基还原酶易残留、需要用化学法固载在载体上，酶活力损失大等问题，提供一种酶法催化合成依折麦布中间体的方法，反应条件温和，反应速度快，酶利用率高，酶易于和反应体系分离，成本低，产物得率高，光学纯度高，适合工业化生产。
本发明是通过以下技术方案实现上述目的的，一种酶法催化合成依折麦布中间体的方法，所述依折麦布中间体为(4S)-3-[(5S)-5-(4-氟苯基)-5-羟基戊酰基)-4-苯基-1,3-氧氮杂环戊烷-2-酮，包括如下步骤：
1)羰基还原酶的制备：所述羰基还原酶由菌株Bacillus amyloliquefaciens发酵产生，发酵培养基为：葡萄糖30-50g，蛋白胨3-5g，酵母膏3-5g，柠檬酸0.5-1.5g，Na2HPO4·12H2O 3-5g，乙醇10-20mL，蒸馏水定容至1L得pH 5.5-7.5的悬浮液，经121℃灭菌15min得发酵培养基；然后接种进行发酵培养，培养时间24-48小时，发酵过程中转速200-300转/min，发酵结束后过滤掉固体，得到的滤液即为羰基还原酶；
2)将辅酶NADP加入1)产生的羰基还原酶中，并加入磷酸盐缓冲液调节至pH为6.5-7.0得混合酶液；然后将混合酶液加入到一端用膜组件封住的管式反应器中，再将管式反应器另一端也用膜组件封住；
3)将底物(4S)-3-[5-(4-氟苯基)-1,5-二氧代戊基)-4-苯基-2-恶唑烷酮加入到溶剂中，溶剂中同时加入氢供体NADP和金属离子，配置成一定浓度底物溶液，然后将底物溶液置于原料槽中；
4)用蠕动泵将原料槽中的底物溶液从管式反应器底部加入，流经管式反应器的底物溶液从管式反应器顶部循环回原料槽中，用高效液相色谱检测底物转化率，至底物转化率高于99.5％终止循环，停止反应；
具体地，步骤2)所述羰基还原酶浓度为1～50g/L，辅酶NADP浓度为0.2～20g/L；
具体地，步骤2)所述的管式反应器的膜组件为聚乙烯管材，管式反应器的主体材质为不锈钢管材，所述管式反应器的管径与管长比为1:5～1:20。
具体地，步骤2)所述的膜组件为PVC纳滤材料。
具体地，步骤3)所述的溶剂为缓冲溶液与异丙醇混合溶液，比例为1:2～2:1，底物浓度为5～30g/L，缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液或Tris-HCl缓冲溶液，所述溶剂的pH为7.5～8.5。
具体地，步骤3)所述的氢供体NADP浓度为0.2～20g/L，金属离子为Mg2+或Mn2+，浓度为0.1-1g/L。
具体地，步骤4)最终转化率为99.5％-99.7％。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
(1)本发明将羰基还原酶在管式反应器中与底物反应，使得酶在反应体系充分和底物接触，提高了反应效率，用膜组件截留酶，使后续分离简单。
(2)本发明转化率高，可达99.5％-99.7％；没有副反应存在，制得的产物光学纯度高。
(3)本发明反应条件温和，反应速度快，成本低，操作稳定性好，适合工业化生产。
本发明所述的NADP为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，nicotinamide adeninedinucleotide phosphate。
附图说明
图1为本发明酶法催化合成依折麦布中间体的工艺流程图，其中1为管式反应器，2为膜组件，3为蠕动泵，4为原料槽。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面结合具体实施方式，对本发明进一步详细说明。应该理解，这些描述只是示例性的，而并非要限制本发明的范围。
实施例
羰基还原酶的制备：所述羰基还原酶由菌株Bacillus amyloliquefaciens发酵产生，发酵培养基为：葡萄糖40g，蛋白胨4g，酵母膏4g，柠檬酸1.0g，Na2HPO4·12H2O 4g，乙醇10-20mL，蒸馏水定容至1L得pH 5.5-7.5的悬浮液，经121℃灭菌15min得发酵培养基；然后接种进行发酵培养，培养时间36小时，发酵过程中转速200-300转/min，发酵结束后过滤掉固体，得到的滤液即为羰基还原酶。
1)将羰基还原酶和NADP+溶于磷酸缓冲溶液中，配制200mL浓度为3mg/mL的羰基还原酶溶液，0.3mg/mL NADP+溶液。将200mL酶溶液加入到200mL管式反应器中，两端用膜组件，管式反应器保温在25℃；
2)将4g底物溶于200mL溶剂中(异丙醇：磷酸盐缓冲溶液缓冲溶液＝1:2，溶剂pH＝8.0)，同时加入1mg MgCl2配成底物溶液，将底物溶液放置在原料槽里，并保温在25℃；
3)开动蠕动泵，将底物溶液从原料槽中加入到管式反应器中，流速为10mL/min，高效液相色谱检测反应进程，循环反应10h后转化率达到99.8％，纯度达到99.5％，收率93％；
实施例2-6与实施例1基本相同，不同之处如表1。
尽管已经详细描述了本发明的实施方式，但是应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，可以对本发明的实施方式做出各种改变、替换和变更。

Claims (5)

1.一种酶法催化合成依折麦布中间体的方法，所述依折麦布中间体为(4S)-3-[(5S)-5-(4-氟苯基)-5-羟基戊酰基)-4-苯基-1,3-氧氮杂环戊烷-2-酮，包括如下步骤：
1)羰基还原酶的制备：所述羰基还原酶由菌株Bacillus amyloliquefaciens发酵产生，发酵培养基为：葡萄糖30-50g，蛋白胨3-5g，酵母膏3-5g，柠檬酸0.5-1.5g，Na2HPO4·12H2O 3-5g，乙醇10-20mL，蒸馏水定容至1L得pH 5.5-7.5的悬浮液，经121℃灭菌15min得发酵培养基；然后接种进行发酵培养，培养时间24-48小时，发酵过程中转速200-300转/min，发酵结束后过滤掉固体，得到的滤液即为羰基还原酶；
2)将辅酶NADP加入1)产生的羰基还原酶中，并加入磷酸盐缓冲液调节至pH为6.5-7.0得混合酶液；然后将混合酶液加入到一端用膜组件封住的管式反应器中，再将管式反应器另一端也用膜组件封住；
3)将底物(4S)-3-[5-(4-氟苯基)-1,5-二氧代戊基)-4-苯基-2-恶唑烷酮加入到溶剂中，溶剂中同时加入氢供体NADP和金属离子，配置成一定浓度的底物溶液，然后将底物溶液置于原料槽中；
4)用蠕动泵将原料槽中的底物溶液从管式反应器底部加入，流经管式反应器的底物溶液从管式反应器顶部循环回原料槽中，用高效液相色谱检测底物转化率，至底物转化率高于99.5％终止循环，停止反应。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤2)所述混合酶液中羰基还原酶浓度为1～50g/L，辅酶NADP浓度为0.2～20g/L。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤2)所述的管式反应器的膜组件为聚乙烯管材，管式反应器的主体材质为不锈钢管材，所述管式反应器的管径与管长比为1:5～20。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤3)所述的溶剂为缓冲溶液与异丙醇组成的pH为7.5～8.5混合溶液，缓冲溶液与异丙醇的体积比例为1:2～2:1；所述底物浓度为5～30g/L；缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液或Tris-HCl缓冲溶液。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤3)所述的氢供体NADP浓度为0.2～20g/L，金属离子为Mg2+或Mn2+，浓度为0.1-1g/L。
CN201710285381.6A 2017-04-27 2017-04-27 一种酶法催化合成依折麦布中间体的方法 Pending CN107022587A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710285381.6A CN107022587A (zh) 2017-04-27 2017-04-27 一种酶法催化合成依折麦布中间体的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710285381.6A CN107022587A (zh) 2017-04-27 2017-04-27 一种酶法催化合成依折麦布中间体的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN107022587A true CN107022587A (zh) 2017-08-08

Family

ID=59527542

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710285381.6A Pending CN107022587A (zh) 2017-04-27 2017-04-27 一种酶法催化合成依折麦布中间体的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107022587A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109097412A (zh) * 2018-07-24 2018-12-28 江苏理工学院 一种生物法合成依折麦布中间体的方法
CN113072516A (zh) * 2021-03-30 2021-07-06 浙江亚瑟医药有限公司 一种胆固醇吸收选择性抑制剂类药物中间体的合成方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104860980A (zh) * 2015-04-23 2015-08-26 南京博优康远生物医药科技有限公司 一种用于合成依折麦布的中间体及其制备方法和应用
CN105200089A (zh) * 2015-10-15 2015-12-30 江苏暨明医药科技有限公司 (s)-1-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶制备方法及其装置
CN105754983A (zh) * 2016-05-19 2016-07-13 河北周酶生物科技有限公司 一种用于制备依折麦布中间体的固定化酶及其制备方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104860980A (zh) * 2015-04-23 2015-08-26 南京博优康远生物医药科技有限公司 一种用于合成依折麦布的中间体及其制备方法和应用
CN105200089A (zh) * 2015-10-15 2015-12-30 江苏暨明医药科技有限公司 (s)-1-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶制备方法及其装置
CN105754983A (zh) * 2016-05-19 2016-07-13 河北周酶生物科技有限公司 一种用于制备依折麦布中间体的固定化酶及其制备方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
林伟玲等: "响应面法优化解淀粉芽孢杆菌产细菌纤维素发酵条件", 《安徽农业科学》 *
罗先金等: "《化工设计》", 31 July 2007, 中国纺织出版社 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109097412A (zh) * 2018-07-24 2018-12-28 江苏理工学院 一种生物法合成依折麦布中间体的方法
CN113072516A (zh) * 2021-03-30 2021-07-06 浙江亚瑟医药有限公司 一种胆固醇吸收选择性抑制剂类药物中间体的合成方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101591681B (zh) 一种微生物转化生产二羟基丙酮的方法
US10378028B2 (en) System for hydrogen production under limited aerobic conditions
CN110904161A (zh) 一种采用酶法生产高纯度(r)-(-)-3-羟基丁酸的方法
CN104911224A (zh) 一种催化合成阿扎那韦中间体的方法
CN101857887B (zh) 一种利用重组菌无细胞提取物催化不对称转化制备光学纯芳基醇的方法
CN103224963B (zh) 一种海洋菌株催化不对称还原制备手性胺的方法
CN104988133A (zh) 一种醛酮还原酶和葡萄糖脱氢酶的包埋共固定化方法
CN107022587A (zh) 一种酶法催化合成依折麦布中间体的方法
CN106047950A (zh) 一种(s)‑1‑(2,6‑二氯‑3‑氟苯基)乙醇的生物制备方法
CN103233045A (zh) 一种制备（r）-1-[（3，5-双三氟甲基）苯基]乙醇的方法
Johanson et al. Reaction and strain engineering for improved stereo-selective whole-cell reduction of a bicyclic diketone
CN102250970A (zh) 由甘油发酵合成1,3-二羟基丙酮的方法
CN101709322B (zh) 生物催化白桦脂醇合成白桦脂酸的方法
Ou et al. Synthesis of S-licarbazepine by asymmetric reduction of oxcarbazepine with Saccharomyces cerevisiae CGMCC No. 2266
CN109097412A (zh) 一种生物法合成依折麦布中间体的方法
CN105112468B (zh) 一种多酶耦联体系制备手性胺的方法
CN105567756B (zh) 一种海洋菌株及其胺脱氢酶催化制备手性胺的方法
CN101864370B (zh) 转化奎宁酮为r-3-奎宁醇的酵母菌株及其转化方法
CN105316244B (zh) 一种转化合成2-pe的酵母静息细胞及制备和高收率转化合成2-pe的方法
CN104232696A (zh) 不对称还原前手性羰基化合物生产手性醇的方法
CN108285908A (zh) 一种固定化双酶催化合成(s)-1-(2,6-二氯-3-氟-苯基)乙醇的方法
CN105420307A (zh) 一种制备(s)-n-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶的方法
CN102732579A (zh) 一种微生物转化制备(3s)-3-(叔丁氧羰基)氨基-1-氯-4-苯基-(2r)-丁醇的方法
CN110016444A (zh) 不动杆菌zjph1806及其制备咪康唑手性中间体的应用
Xu et al. Efficient asymmetric biosynthesis of (R)-(−)-epinephrine in hydrophilic ionic liquid-containing systems

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20170808

RJ01 Rejection of invention patent application after publication