CN104911224A - 一种催化合成阿扎那韦中间体的方法 - Google Patents
一种催化合成阿扎那韦中间体的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104911224A CN104911224A CN201510363243.6A CN201510363243A CN104911224A CN 104911224 A CN104911224 A CN 104911224A CN 201510363243 A CN201510363243 A CN 201510363243A CN 104911224 A CN104911224 A CN 104911224A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- mesoporous material
- coenzyme
- magnetic
- reaction
- chloro
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 38
- 108010019625 Atazanavir Sulfate Proteins 0.000 title claims abstract description 12
- AXRYRYVKAWYZBR-GASGPIRDSA-N atazanavir Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)OC)C(C)(C)C)[C@@H](O)CN(CC=1C=CC(=CC=1)C=1N=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)OC)C(C)(C)C)C1=CC=CC=C1 AXRYRYVKAWYZBR-GASGPIRDSA-N 0.000 title claims abstract description 12
- AXRYRYVKAWYZBR-UHFFFAOYSA-N Atazanavir Natural products C=1C=C(C=2N=CC=CC=2)C=CC=1CN(NC(=O)C(NC(=O)OC)C(C)(C)C)CC(O)C(NC(=O)C(NC(=O)OC)C(C)(C)C)CC1=CC=CC=C1 AXRYRYVKAWYZBR-UHFFFAOYSA-N 0.000 title abstract description 4
- 229960003277 atazanavir Drugs 0.000 title abstract description 4
- 238000007036 catalytic synthesis reaction Methods 0.000 title 1
- 239000005515 coenzyme Substances 0.000 claims abstract description 34
- 239000013335 mesoporous material Substances 0.000 claims abstract description 34
- 108010031132 Alcohol Oxidoreductases Proteins 0.000 claims abstract description 23
- 102000005751 Alcohol Oxidoreductases Human genes 0.000 claims abstract description 23
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Natural products CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 28
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 22
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 20
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 20
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 19
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 claims description 14
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 12
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 10
- WYTZZXDRDKSJID-UHFFFAOYSA-N (3-aminopropyl)triethoxysilane Chemical compound CCO[Si](OCC)(OCC)CCCN WYTZZXDRDKSJID-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 9
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 9
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 9
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 9
- AUXNFZYATAMYJU-UHFFFAOYSA-N 1-chloro-4-phenylbutan-2-one Chemical compound ClCC(=O)CCC1=CC=CC=C1 AUXNFZYATAMYJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N Argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical group CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 229940107904 reyataz Drugs 0.000 claims description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 7
- 239000012267 brine Substances 0.000 claims description 6
- HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M sodium;chloride;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Cl-] HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 6
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 6
- XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N [[(2r,3r,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-3-hydroxy-4-phosphonooxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] [(2s,3r,4s,5s)-5-(3-carbamoylpyridin-1-ium-1-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methyl phosphate Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N 0.000 claims description 5
- 238000013016 damping Methods 0.000 claims description 5
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 5
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims description 5
- GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N Triethanolamine Chemical compound OCCN(CCO)CCO GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 claims description 4
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 4
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 claims description 4
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 claims description 4
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 claims description 4
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 claims description 4
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 claims description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 4
- 208000012839 conversion disease Diseases 0.000 claims description 3
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 238000009413 insulation Methods 0.000 claims description 2
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 claims description 2
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N nicotinamide-adenine dinucleotide Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N 0.000 claims description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims description 2
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 2
- 125000003944 tolyl group Chemical group 0.000 claims description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims 1
- 238000004064 recycling Methods 0.000 claims 1
- 229960004418 trolamine Drugs 0.000 claims 1
- 108010093096 Immobilized Enzymes Proteins 0.000 abstract description 9
- 238000011084 recovery Methods 0.000 abstract description 2
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 abstract description 2
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 abstract description 2
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 abstract description 2
- 125000005931 tert-butyloxycarbonyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(OC(*)=O)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 abstract 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 10
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 101710157860 Oxydoreductase Proteins 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N acetonitrile Substances CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- IGCKTFZPKIQAOU-AMGKYWFPSA-N tert-butyl (2s)-4-amino-2-benzyl-4-chloro-3-oxobutanoate Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)[C@H](C(=O)C(N)Cl)CC1=CC=CC=C1 IGCKTFZPKIQAOU-AMGKYWFPSA-N 0.000 description 4
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- 229940124321 AIDS medicine Drugs 0.000 description 2
- 241000383839 Novosphingobium Species 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 238000010025 steaming Methods 0.000 description 2
- HNSDLXPSAYFUHK-UHFFFAOYSA-N 1,4-bis(2-ethylhexyl) sulfosuccinate Chemical compound CCCCC(CC)COC(=O)CC(S(O)(=O)=O)C(=O)OCC(CC)CCCC HNSDLXPSAYFUHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000010894 Artemisia argyi Nutrition 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101001110310 Lentilactobacillus kefiri NADP-dependent (R)-specific alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 description 1
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 description 1
- -1 and wherein Proteins 0.000 description 1
- 230000000798 anti-retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 244000030166 artemisia Species 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000003912 environmental pollution Methods 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 238000010926 purge Methods 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N sulfuric acid Substances OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种催化合成阿扎那韦中间体的方法，包括制备磁性修饰的介孔材料，将羰基还原酶与辅酶共固定化于磁性介孔材料，并用该固定化酶催化 (3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-1-氯-4-苯基-(2R)-丁酮生成 (3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-1-氯-4-苯基-(2R)-丁醇中间体。本发明具有羰基还原酶与辅酶的回收利用率高、辅酶再生效率高、成本低、市场前景广阔等优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种羰基还原酶与辅酶共固定化体系催化合成阿扎那韦中间体(3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-1-氯-4-苯基-(2R)-丁醇的方法，属于生物技术和生物制药领域。
背景技术
目前，艾滋病治疗药物主要有三大种类，其中蛋白酶抑制剂（Pls）具有相当强的抗HIV作用，是目前经常使用的药物（约占26％）。抗HIV作用的蛋白酶抑制剂阿扎那韦（Atazanavir）是目前世界上主要的抗艾滋病药物。1998年，美国百时美施贵宝公司开发出了阿扎那韦的商品药--硫酸阿扎那韦，该药物在2003年6月经美国FDA批准上市，这也是全球首个每日一次给药的蛋白酶抑制剂，其主要与其他抗逆转录病毒药物联用治疗HIV病毒，中国也于2007年4月批准其上市，商品名称锐艾妥®。
(3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-1-氯-4-苯基-(2R)-丁醇（Ⅰ）是制备阿扎那韦的关键中间体，可由氯醇(3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-1-氯-4-苯基-2-丁酮（Ⅱ）不对称还原获得。还原法又可分为化学法和微生物法，化学法需要制备手性化学催化剂，制备工序繁琐且通常环境污染大。相对于化学法而言，酶催化转化法具有“反应条件温和、转化率高、易工业化放大”等优点，符合绿色可持续发展的要求。
Codexis（WO2011005527A2）及苏州汉酶（CN103468757A）均直接将游离酶及游离的辅酶应用在阿扎那韦中间体(3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-1-氯-4-苯基-(2R)-丁醇的合成中，羰基还原酶及辅酶均不能重复利用，辅酶价格昂贵，成本较高。
因此，通过生物法合成(3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-1-氯-4-苯基-(2R)-丁醇仍具有改进的空间。在已有的报道中，还未见有将羰基还原酶与辅酶共固定化用于制备阿扎那韦中间体(3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-1-氯-4-苯基-(2R)-丁醇的报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题为现有生物法合成(3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-1-氯-4-苯基-(2R)-丁醇成本过高、效率过低，而提高生物法合成(3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-1-氯-4-苯基-(2R)-丁醇的效率、降低其生产的成本为本发明的目的。
为了解决上述技术问题，本发明的技术方案为：
以(3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-1-氯-4-苯基-2-丁酮为底物，以羰基还原酶与辅酶为催化剂，在缓冲液、助溶剂和共底物存在的体系中催化合成(3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-1-氯-4-苯基-2-丁醇，并将羰基还原酶和辅酶共固定化于经过修饰后的磁性介孔材料上。
其中，对于修饰后的磁性介孔材料应理解为，该材料为共固定化酶的载体，而且该材料通过改性，具有磁性的物性。
在一个优选的实施方案中，以SBA-15、MCM-41、MCM-48之一为介孔材料，特别优选SBA-15；再通过介孔材料表面的羟基与磁性材料形成配位键获得磁性修饰的介孔材料；并用3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)修饰带有磁性的介孔材料使其表面带有氨基，示意图见图1。其中，介孔材料优选平均孔径为2-50 nm，比表面积为500-1500
m2/g。
在一个优选的实施方案中，修饰获得带有磁性的介孔材料的具体步骤为：（1）将介孔材料加入到含有(NH4)2Fe(SO4)2.6H2O、NH4Fe(SO4)2.12H2O的水溶液中，用氨水调节pH至11~12，40-70℃搅拌，获得含有磁性的介孔材料；（2）将步骤（1）中获得的磁性介孔材料加入至乙醇水溶液中，在氩气保护下搅拌，加入冰醋酸至pH维持在3.0-5.0，向体系中加入3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)，50-80℃搅拌24-36 h，分离获得固体，即得修饰后的磁性介孔材料。
在本发明所述的方法中，还包括了共底物和助溶剂，其中，共底物是指现有技术中为了降低生产成本，设计的辅酶循环体系，助溶剂是为了提高底物的分散效果；在该体系中共底物优选异丙醇，助溶剂优选甲苯。
在本发明所述的方法中，所用催化剂为氧化还原酶与辅酶，其中，氧化还原酶为现有氧化还原酶中的任一一种，只要其可以实现底物的非对称氧化还原即可，如在本发明中优选海洋新鞘氨醇杆菌羰基还原酶；辅酶为NAD/NADH或NADP/NADPH。
在本发明中，共固定化的方法在于，将辅酶加入到含羰基还原酶的pH 为6.0-7.0的磷酸盐缓冲液中，4℃静置0.2-2 h；然后加入修饰后的磁性介孔材料，100-150 rpm，25℃温浴2-8 h，得悬浮液；磁性吸附，去上清，磁性固体用生理盐水洗涤，重复2-4次，得固体即为羰基还原酶与辅酶共固定化酶体系；获得的固定化酶体系可经过冷冻干燥后，4℃保存。
在获得催化剂以后，可将该催化剂在共底物、助溶剂、缓冲体系存在的情况下与底物(3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-1-氯-4-苯基-2-丁酮接触，即可催化合成产物(3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-1-氯-4-苯基-2-丁醇。
在优选的方案中，底物初始浓度控制为50-200 mg/ml；助溶剂用量为总反应体积的5-20%；共固定化酶、异丙醇、底物的投料质量比为0.05-0.1:0.3-0.5:1；辅酶与羰基还原酶的质量比为1:5-20。
在优选的实施步骤中，获得羰基还原酶与辅酶共固定化酶体系后，将底物(3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-1-氯-4-苯基-2-丁酮、助溶剂、异丙醇、共固定化酶及三乙醇胺缓冲液（pH 8.0-8.5）加入到反应器中，100-150
rpm搅拌， 30-40℃保温反应，HPLC检测，转化率>99%，反应结束；并通过磁性吸附反应液中回收共固定化酶体系；并获得产物(3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-1-氯-4-苯基-(2R)-丁醇。
本发明的有益效果在于：
采用修饰后的磁性介孔材料共固定化羰基还原酶及辅酶催化合成(3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-1-氯-4-苯基-(2R)-丁醇，采用简单的磁性吸附即可回收利用羰基还原酶及辅酶，即简化了产品的分离纯化过程又使共固定化酶回收利用率高，更获得了共固定化辅酶再生体系，提高辅酶再生效率，降低了辅酶的用量，从而大幅度降低生产成本，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1 为磁性修饰的介孔材料固定化酶的模拟流程图；
图2 为实施例4中反应24 h后的HPLC谱图；
图3 为实施例4中反应48 h后的HPLC谱图；
图4 为实施例5中反应24 h后的HPLC谱图；
图5 为实施例5中反应48 h后的HPLC谱图；
图6 为(3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-1-氯-4-苯基-2-丁酮、(3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-1-氯-4-苯基-(2R)-丁醇及甲苯的标准品的HPLC谱图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明。所列的实施例仅作阐示之用，并表明本发明的精神和范围并非限于此中的细节及其修改案。
本发明所涉及的生物酶及其他试剂均为市场购买，其中试剂均未经进一步纯化，其中，氧化还原酶购自浙江九洲药业有限公司，为海洋新鞘氨醇杆菌羰基还原酶；辅酶为NAD或NADP，分别购自合肥博美生物科技责任有限公司和biosharp公司。
实施例1 本实施例说明获得修饰后的磁性介孔材料的方法
称取1 g SBA-15加入到含有1.75
g (NH4)2Fe(SO4)2.6H2O、4.29 g NH4Fe(SO4)2.12H2O的水溶液中，用5 M的氨水调节pH至11~12，65℃搅拌30 min，磁性吸附，获得含有磁性的介孔材料SBA-15/Fe3O4。称取1 g SBA-15/Fe3O4加入至500 ml乙醇水溶液（V/V=1:1）中，在氩气保护下搅拌，加入冰醋酸至pH值到4.0，向体系中逐滴加入50 ml 3-氨丙基三乙氧基硅烷，60℃搅拌24 h，磁性吸附，乙醇洗涤三次，即得修饰后的磁性介孔材料SBA-15/Fe3O4-NH2。
实施例2 本实施例说明获得共固定化酶的方法
称取50 mg辅酶NAD加入到10 ml含有50 mg/ml羰基还原酶的磷酸盐缓冲液(pH 7.0)中，4℃静置1 h；在上述溶液中加入1.5 g实施例1中制备的SBA-15/Fe3O4-NH2，25℃，100-150 rpm，温浴8 h，得悬浮液，磁性吸附去上清，沉淀用生理盐水洗涤，重复三次，得到的固体即为羰基还原酶与辅酶的共固定化酶，冷冻干燥后于4℃保存备用。
实施例3 本实施例说明另一共固定化酶的方法
称取50 mg辅酶NADP加入到10 ml含有50 mg/ml酮还原酶的磷酸盐缓冲液(pH 7.0)中，4℃静置1 h；在上述溶液中加入1.5 g实施例1中制备的SBA-15/Fe3O4-NH2，25℃，100-150 rpm，温浴8 h，得悬浮液，磁性吸附去上清，沉淀用生理盐水洗涤，重复三次，得到的固体即为羰基还原酶与辅酶的共固定化酶，冷冻干燥后于4℃保存备用。
实施例4 本实施例说明反应合成(3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-1-氯-4-苯基-(2R)-丁醇的方法
称取5 g底物(3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-1-氯-4-苯基-2-丁酮加入到37 ml三乙醇胺缓冲液中（pH 8.5），再依次加入10 ml甲苯、3 ml异丙醇、1.5 g实施例2中所述的共固定化酶，35℃搅拌，开始反应。48 h 后磁性吸附，将磁性吸附获得的固定化酶用生理盐水洗涤，5000 rpm离心10
min，此洗涤过程重复3次，将固定化酶冷冻干燥，4℃保存备用。将上清液用乙酸乙酯萃取，旋蒸，得到产物(3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-1-氯-4-苯基-(2R)-丁醇。
其中，附图2、3分别为反应24h和48h的HPLC图谱
有图可知，在反应24h后分别检测到产物与底物，但在48h底物已转化完毕，只有产物和甲苯。
反应结果显示，转化率达到99%的时间为48h。
实施例5 本实施例说明另一反应合成(3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-1-氯-4-苯基-(2R)-丁醇的方法
称取5 g底物(3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-1-氯-4-苯基-2-丁酮加入到37 ml三乙醇胺缓冲液中（pH 8.5），再依次加入10 ml甲苯、3 ml异丙醇、1.5 g实施例3中所述的共固定化酶，35℃搅拌，开始反应。48 h 后磁性吸附，将磁性吸附获得的固定化酶用生理盐水洗涤，此洗涤过程重复3次，将固定化酶冷冻干燥，4℃保存备用。将上清液用乙酸乙酯萃取，旋蒸，得到产物(3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-1-氯-4-苯基-(2R)-丁醇。
其中，附图4、5分别为反应24h和48h的HPLC图谱
由图可知，在反应24h后分别检测到产物与底物， 48h底物也基本反应转化。
反应结果显示，转化率达到99%的时间为60h。
实施例6 本实施例说明液相检测的方法标品的图谱
液相检测的方法与条件为：采用高效液相色谱（DIONEX
Ultimate 3000）进行检测，色谱柱为venusil MP
C18 (250 mm × 4.6 mm，5μm)，流动相为10 mM KH2PO4 (pH
4.0)-乙腈(梯度洗脱，比例见下表)，流速1.0 mL/min，柱温35 °C，UV检测波长210 nm，进样量为5 μL。
| 时间(min) | KH2PO4A(%) | 乙腈(%) |
| 0 | 55 | 45 |
| 20 | 30 | 70 |
| 25 | 30 | 70 |
| 25.1 | 55 | 45 |
| 30 | 55 | 45 |
标品的结果见附图6。附图6为(3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-1-氯-4-苯基-2-丁酮、(3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-1-氯-4-苯基-(2R)-丁醇及甲苯的标准品的HPLC谱图；其中，第一个峰为(3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-1-氯-4-苯基-2-丁醇；第二个峰为甲苯，第三个峰为(3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-1-氯-4-苯基-2-丁酮
实施例7，本实施例说明反应合成(3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-1-氯-4-苯基-(2R)-丁醇的优选实施例
本实施例采用实施例1和实施例2所述的方法获得修饰后的磁性介孔材料并进行固定化，在获得磁性修饰材料后，按照实施例2所述的方法进行固定化，与实施例2的不同之处在于，所用辅酶NAD的量为50mg，氧化还原酶的量为250 mg，然后采用实施例4所述的方法进行反应，与实施例4的不同之处在于，所用物料的量为底物 5g, 甲苯2.5ml、异丙醇1.91ml、固定化酶 0.93g、45ml缓冲液。
最终，反应转化率超过99%的时间为59 h。
实施例8 本实施例说明反应合成(3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-1-氯-4-苯基-(2R)-丁醇的优选实施例
本实施例所采用的方法与实施例7类似，与实施例7的不同之处在于，所用辅酶NAD的量为50mg，氧化还原酶的量为1g；然后采用实施例4所述的方法进行反应，与实施例4的不同之处在于，所用物料的量为底物 5g, 甲苯7.5ml、异丙醇3.18 ml、固定化酶 1.88g、39ml缓冲液。
最终，反应转化率超过99%的时间为43 h。
上述实施例只为说明本发明的技术构思与特点，本发明保护范围并不限定于此。
Claims (10)
1.一种催化合成阿扎那韦中间体的方法，以(3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-1-氯-4-苯基-2-丁酮为底物，以羰基还原酶与辅酶为催化剂，在缓冲液、助溶剂和共底物存在的体系中催化合成(3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-1-氯-4-苯基-2-丁醇，其特征在于，所述羰基还原酶和辅酶共固定化于经过修饰后的磁性介孔材料上。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，共底物为异丙醇，助溶剂为甲苯。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述介孔材料为SBA-15、MCM-41、MCM-48中的一种，优选SBA-15。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述辅酶为NAD/NADH或NADP/NADPH。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，获得所述修饰后的磁性介孔材料的步骤为：
（1）将介孔材料加入到含有(NH4)2Fe(SO4)2.6H2O、NH4Fe(SO4)2.12H2O的水溶液中，用氨水调节pH至11~12，40-70℃搅拌，获得含有磁性的介孔材料；
（2）将步骤（1）中获得的磁性介孔材料加入至乙醇水溶液中，在氩气保护下搅拌，加入冰醋酸至pH维持在3.0-5.0，向体系中加入3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)，50-80℃搅拌24-36 h，分离获得固体，即得修饰后的磁性介孔材料。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，底物初始浓度为50-200 mg/ml，助溶剂用量为总反应体积的5-20%，共固定化酶、异丙醇、底物的投料质量比为0.05-0.1:0.3-0.5:1。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，辅酶与羰基还原酶的质量比为1:5-20。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，反应体系的反应条件为：pH 8.0-8.5，搅拌速度100-150 转/分钟，温度30-40℃，反应转化率达到99%，结束反应。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，上述任一权利要求所述的介孔材料平均孔径为2-50 nm，比表面积为500-1500 m2/g。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，具体的合成步骤为：
（1）将介孔材料加入到含有(NH4)2Fe(SO4)2.6H2O、NH4Fe(SO4)2.12H2O的水溶液中，用氨水调节pH至11~12，40-70℃搅拌，获得含有磁性的介孔材料；
（2）将步骤（1）中获得的磁性介孔材料加入至乙醇水溶液中，在氩气保护下搅拌，加入冰醋酸至pH维持在3.0-5.0，向体系中加入3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)，50-80℃搅拌24-36 h，磁性吸附，即得修饰后的磁性介孔材料；
（3）将辅酶加入到含羰基还原酶的pH 为6.0-7.0的磷酸盐缓冲液中，4℃静置0.2-2 h；
（4）在步骤（3）的溶液中加步骤（2）中制备的修饰后的磁性介孔材料，100-150 rpm，25℃温浴2-8 h，得悬浮液，磁性吸附，去上清，磁性固体用生理盐水洗涤，重复2-4次，得固体即为羰基还原酶与辅酶共固定化酶体系，冷冻干燥后，4℃保存；
（5）将底物(3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-1-氯-4-苯基-2-丁酮、助溶剂、异丙醇、共固定化酶及pH 8.0-8.5为三乙醇胺的缓冲液加入到反应器中，100-150 rpm搅拌， 30-40℃保温反应，转化率>99%，反应结束；
（6）通过磁性吸附从步骤（5）的反应液中回收步骤（4）所述的共固定化酶体系；
（7）分离纯化所述步骤（5）的反应液，获得产物(3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-1-氯-4-苯基-(2R)-丁醇。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510363243.6A CN104911224B (zh) | 2015-06-26 | 2015-06-26 | 一种催化合成阿扎那韦中间体的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510363243.6A CN104911224B (zh) | 2015-06-26 | 2015-06-26 | 一种催化合成阿扎那韦中间体的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN104911224A true CN104911224A (zh) | 2015-09-16 |
| CN104911224B CN104911224B (zh) | 2018-12-25 |
Family
ID=54080665
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201510363243.6A Active CN104911224B (zh) | 2015-06-26 | 2015-06-26 | 一种催化合成阿扎那韦中间体的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN104911224B (zh) |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105754983A (zh) * | 2016-05-19 | 2016-07-13 | 河北周酶生物科技有限公司 | 一种用于制备依折麦布中间体的固定化酶及其制备方法 |
| CN107557412A (zh) * | 2017-10-09 | 2018-01-09 | 苏州人本药业有限公司 | 一种固定化酶催化合成nadph的方法 |
| CN109988789A (zh) * | 2019-04-29 | 2019-07-09 | 上海健康医学院 | 羰基还原酶CLEAs催化合成阿扎那韦中间体的方法 |
| CN110079564A (zh) * | 2019-04-29 | 2019-08-02 | 上海健康医学院 | 一种催化合成阿扎那韦中间体的方法及其应用 |
| CN110423741A (zh) * | 2019-07-16 | 2019-11-08 | 浙江工业大学 | 羰基还原酶-辅酶nadp+共固定化酶及其制备与应用 |
| CN111235123A (zh) * | 2020-03-27 | 2020-06-05 | 长兴制药股份有限公司 | 一种醇溶液高浓度耐受的羰基还原酶及其应用 |
| CN111378703A (zh) * | 2020-03-27 | 2020-07-07 | 长兴制药股份有限公司 | 一种(2s,3s)-2-羟基-4-苯基丁烷衍生物的制备方法 |
Citations (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101058820A (zh) * | 2007-05-15 | 2007-10-24 | 吉林大学 | 固定化脂肪酶催化合成α－亚麻酸单甘油酯的方法 |
| CN101096665A (zh) * | 2007-06-12 | 2008-01-02 | 河南省科学院 | 埃洛石在酶固定载体中的应用 |
| CN101671554A (zh) * | 2008-09-10 | 2010-03-17 | 首都医科大学 | 一种硅壳荧光磁性纳米粒及制备方法和应用 |
| CN101752048A (zh) * | 2008-12-17 | 2010-06-23 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一种有序短孔道磁性介孔材料 |
| CN101914519A (zh) * | 2010-07-08 | 2010-12-15 | 东南大学 | 一种杂化凝胶载体的固定化酶制备方法 |
| CN102286455A (zh) * | 2011-08-26 | 2011-12-21 | 湖南大学 | 固定化漆酶及其制备方法 |
| CN102703411A (zh) * | 2012-06-06 | 2012-10-03 | 华东理工大学 | 固定生物酶的顺磁性的环氧基介孔分子筛及其制备方法 |
| CN102732579A (zh) * | 2011-04-01 | 2012-10-17 | 浙江九洲药业股份有限公司 | 一种微生物转化制备(3s)-3-(叔丁氧羰基)氨基-1-氯-4-苯基-(2r)-丁醇的方法 |
| CN103468757A (zh) * | 2013-09-18 | 2013-12-25 | 苏州汉酶生物技术有限公司 | 一种阿扎那韦中间体的生物制备方法 |
| CN103638988A (zh) * | 2013-12-06 | 2014-03-19 | 上海师范大学 | 磁性介孔材料、其制备方法及应用 |
-
2015
- 2015-06-26 CN CN201510363243.6A patent/CN104911224B/zh active Active
Patent Citations (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101058820A (zh) * | 2007-05-15 | 2007-10-24 | 吉林大学 | 固定化脂肪酶催化合成α－亚麻酸单甘油酯的方法 |
| CN101096665A (zh) * | 2007-06-12 | 2008-01-02 | 河南省科学院 | 埃洛石在酶固定载体中的应用 |
| CN101671554A (zh) * | 2008-09-10 | 2010-03-17 | 首都医科大学 | 一种硅壳荧光磁性纳米粒及制备方法和应用 |
| CN101752048A (zh) * | 2008-12-17 | 2010-06-23 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一种有序短孔道磁性介孔材料 |
| CN101914519A (zh) * | 2010-07-08 | 2010-12-15 | 东南大学 | 一种杂化凝胶载体的固定化酶制备方法 |
| CN102732579A (zh) * | 2011-04-01 | 2012-10-17 | 浙江九洲药业股份有限公司 | 一种微生物转化制备(3s)-3-(叔丁氧羰基)氨基-1-氯-4-苯基-(2r)-丁醇的方法 |
| CN102286455A (zh) * | 2011-08-26 | 2011-12-21 | 湖南大学 | 固定化漆酶及其制备方法 |
| CN102703411A (zh) * | 2012-06-06 | 2012-10-03 | 华东理工大学 | 固定生物酶的顺磁性的环氧基介孔分子筛及其制备方法 |
| CN103468757A (zh) * | 2013-09-18 | 2013-12-25 | 苏州汉酶生物技术有限公司 | 一种阿扎那韦中间体的生物制备方法 |
| CN103638988A (zh) * | 2013-12-06 | 2014-03-19 | 上海师范大学 | 磁性介孔材料、其制备方法及应用 |
Cited By (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105754983A (zh) * | 2016-05-19 | 2016-07-13 | 河北周酶生物科技有限公司 | 一种用于制备依折麦布中间体的固定化酶及其制备方法 |
| CN105754983B (zh) * | 2016-05-19 | 2018-11-23 | 河北周酶生物科技有限公司 | 一种用于制备依折麦布中间体的固定化酶及其制备方法 |
| CN107557412A (zh) * | 2017-10-09 | 2018-01-09 | 苏州人本药业有限公司 | 一种固定化酶催化合成nadph的方法 |
| CN107557412B (zh) * | 2017-10-09 | 2020-02-28 | 苏州人本药业有限公司 | 一种固定化酶催化合成nadph的方法 |
| CN109988789A (zh) * | 2019-04-29 | 2019-07-09 | 上海健康医学院 | 羰基还原酶CLEAs催化合成阿扎那韦中间体的方法 |
| CN110079564A (zh) * | 2019-04-29 | 2019-08-02 | 上海健康医学院 | 一种催化合成阿扎那韦中间体的方法及其应用 |
| CN110423741A (zh) * | 2019-07-16 | 2019-11-08 | 浙江工业大学 | 羰基还原酶-辅酶nadp+共固定化酶及其制备与应用 |
| CN110423741B (zh) * | 2019-07-16 | 2021-08-17 | 浙江工业大学 | 羰基还原酶-辅酶nadp+共固定化酶及其制备与应用 |
| CN111235123A (zh) * | 2020-03-27 | 2020-06-05 | 长兴制药股份有限公司 | 一种醇溶液高浓度耐受的羰基还原酶及其应用 |
| CN111378703A (zh) * | 2020-03-27 | 2020-07-07 | 长兴制药股份有限公司 | 一种(2s,3s)-2-羟基-4-苯基丁烷衍生物的制备方法 |
| CN111235123B (zh) * | 2020-03-27 | 2020-10-27 | 长兴制药股份有限公司 | 一种醇溶液高浓度耐受的羰基还原酶及其应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN104911224B (zh) | 2018-12-25 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN104911224A (zh) | 一种催化合成阿扎那韦中间体的方法 | |
| Giannakopoulou et al. | Multienzymatic nanoassemblies: recent progress and applications | |
| CN111876452A (zh) | 一种利用生物酶一锅法制备玻色因的方法 | |
| Xu et al. | Asymmetric whole-cell bioreduction of sterically bulky 2-benzoylpyridine derivatives in aqueous hydrophilic ionic liquid media | |
| Li et al. | Co-immobilization of enoate reductase with a cofactor-recycling partner enzyme | |
| Santiago-Arcos et al. | Immobilization Screening and Characterization of an Alcohol Dehydrogenase and Its Application to the Multi-Enzymatic Selective Oxidation of 1,-Omega-Diols | |
| Ardao et al. | Reversible immobilization of rhamnulose-1-phosphate aldolase for biocatalysis: enzyme loading optimization and aldol addition kinetic modeling | |
| Rulli et al. | Towards catalyst compartimentation in combined chemo-and biocatalytic processes: Immobilization of alcohol dehydrogenases for the diastereoselective reduction of a β-hydroxy ketone obtained from an organocatalytic aldol reaction | |
| Wang et al. | Biocatalytic anti-Prelog stereoselective reduction of ethyl acetoacetate catalyzed by whole cells of Acetobacter sp. CCTCC M209061 | |
| CN103468757A (zh) | 一种阿扎那韦中间体的生物制备方法 | |
| CN101857887A (zh) | 一种利用重组菌无细胞提取物催化不对称转化制备光学纯芳基醇的方法 | |
| Velasco-Lozano et al. | Designing carrier-free immobilized enzymes for biocatalysis | |
| CN101240299B (zh) | 一种酵母细胞催化还原芳香酮制备光学活性醇的方法 | |
| CN101314787A (zh) | 用红酵母还原酶制剂制备光学活性手性仲醇的方法 | |
| CN105754983A (zh) | 一种用于制备依折麦布中间体的固定化酶及其制备方法 | |
| Hao et al. | Chemoenzymatic access to enantiopure N-containing furfuryl alcohol from chitin-derived N-acetyl-D-glucosamine | |
| Khanam et al. | Recent advances in immobilized ω-transaminase for chiral amine synthesis | |
| CN107227301A (zh) | 磁性联合交联酶聚集体生物催化剂及其制备方法和应用 | |
| Salvi et al. | Organic-inorganic epoxide hydrolase hybrid nanoflowers with enhanced catalytic activity: Hydrolysis of styrene oxide to 1-phenyl-1, 2-ethanediol | |
| CN102206683A (zh) | 一种酵母全细胞催化合成光学活性芳基邻二醇的方法 | |
| Sun et al. | Lipase AK from Pseudomonas fluorescens immobilized on metal organic frameworks for efficient biosynthesis of enantiopure (S)− 1-(4-bromophenyl) ethanol | |
| CN108285908B (zh) | 一种固定化双酶催化合成(s)-1-(2,6-二氯-3-氟-苯基)乙醇的方法 | |
| CN101709322A (zh) | 生物催化白桦脂醇合成白桦脂酸的方法 | |
| CN103710405A (zh) | 一种生物法制备孟鲁斯特中间体的方法 | |
| CN102634546B (zh) | 一种手性β-羟基酯类化合物的酶催化合成方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |