CN103468757A

CN103468757A - 一种阿扎那韦中间体的生物制备方法

Info

Publication number: CN103468757A
Application number: CN2013104298867A
Authority: CN
Inventors: 尹将来; 鞠鑫; 李斌; 陶军华
Original assignee: SUZHOU ENZYMEWORKS Inc
Current assignee: SUZHOU ENZYMEWORKS Inc
Priority date: 2013-09-18
Filing date: 2013-09-18
Publication date: 2013-12-25

Abstract

本发明涉及阿扎那韦中间体的生物制备方法 ，其以 (S)- 叔丁基 (4- 氯 -3- 羰基 -1- 苯丁基 -2- 基 ) 氨基甲酸酯为底物，实施如下：在反应器中加入底物、助溶剂及葡萄糖，搅拌均匀，称取酮还原酶酶粉，葡萄糖脱氢酶和辅因子溶于 pH8～9 的水相缓冲溶液中，将所得混合溶液加入反应器中，搅拌，控制温度 32 ℃ ～34 ℃，开始反应，反应开始时，底物的质量体积比浓度为 0.05～0.2g/ml ，酶、辅因子、葡萄糖、底物三者的投料质量比为 0.02～0.03∶0.001～0.005∶0.8～1.2∶1 。 与已有方法相比，本发明实现了高反应效率和更加绿色、温和的生物转化过程，具有重要的应用价值。

Description

一种阿扎那韦中间体的生物制备方法

技术领域

本发明属于生物制药和生物化工技术领域，具体涉及一种阿扎那韦中间体的生物制备方法。

背景技术

阿扎那韦(Atazanavir,CAS:198904-31-3)是美国施贵宝公司研究开发的一种蛋白酶抑制剂类抗病毒药物，商品名锐艾妥(英文商品名Reyataz)，通常与其它药物一同使用于治疗艾滋病。2003年FDA批准上市后，2009年该药全球销售额为52亿美元，排名第70位。随着全球范围内“非典”、“甲流”和禽流感等疫情的频繁爆发和艾滋病防控工作的深入，人们对抗病毒药物的需求不断加大。可以预见的是，该类药物的销售额和排名还会进一步上升。

阿扎那韦的主要活性成分分子结构较为复杂，但是其分子核心的两个手性中心可以由式I化合物（化学名称：叔丁基((2S,3R)-4-氯-3-羟基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯）提供。式I化合物可以由式II化合物（化学名称：(S)-叔丁基(4-氯-3-羰基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯）通过还原反应获得。

在由式II化合物制备式I化合物的传统化学法生产工艺中，需要使用大量的苯硼酸类化合物，而这类化合物属于易燃易爆化学品，反应过程控制难度较大，污染严重(WO2011060302A1,WO2011121091A1)。

与化学法相比，生物转化方法条件温和，效率高，三废少，是具有极高工业化应用价值的技术。生物转化方法能够有效地实现类似的还原反应。Almac Science公司开发了利用来源未知的羰基还原酶(CRED)催化该反应，底物浓度约5%，酶投量为2%(Tetrahedron:Asymmetry20:2462　2466,2009)，其主要问题是底物浓度较低。Codexis公司开发的利用基因改造过的来自芳烃降解新鞘脂菌(Novosphingobium aromaticivorans)的酮还原酶(KRED)还原该中间体对应的酮得到手性醇，底物浓度20%，酶投量约为0.7%(WO2011005527A2)，其主要问题是反应要求在45℃下进行，温度较高。由于该方法要用易挥发的异丙醇，同时产生易挥发的丙酮副产物，需在较高温度下进行压力控制，工艺稳定性控制较难；同时较高温度违反了绿色化学的基本原则，不利于节能环保。该工艺放大生产时导致酶的活性和稳定性下降，直接影响了酶催化的工艺稳定性，阻碍了该酶催化工艺的规模化放大生产。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种改进的阿扎那韦中间体的生物制备方法。

为解决以上技术问题，本发明采取如下技术方案：

一种阿扎那韦中间体的生物制备方法，该阿扎那韦中间体为叔丁基((2S,3R)-4-氯-3-羟基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯，所述方法以(S)-叔丁基(4-氯-3-羰基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯为底物，使该底物在酮还原酶作用下发生不对称还原反应生成阿扎那韦中间体，特别是，所述的方法实施如下：在反应器中加入底物、助溶剂以及葡萄糖搅拌均匀，另称取酮还原酶酶粉，葡萄糖脱氢酶和辅因子溶于pH8～9的水相缓冲溶液中，并将所得混合溶液加入至反应器中，搅拌，控制温度在32℃～34℃之间，开始反应，HPLC检测反应转化率，至转化率大于等于96%时，结束反应，其中反应开始时，底物的质量体积比浓度为0.05～0.2g/ml，酶、辅因子、葡萄糖、底物三者的投料质量比为0.02～0.03:0.001～0.005:0.8～1.2:1，所述辅因子为NAD/NADH或NADP/NADPH，所述助溶剂为乙腈或甲苯或二者的组合。

进一步地，反应结束后，加入乙酸乙酯继续搅拌萃取，合并有机相，干燥过滤，浓缩得到固体产物，即为纯度大于等于97%、光学纯度大于等于99.5%的阿扎那韦中间体。

优选地，反应开始时，底物的质量体积比浓度为0.1～0.2g/ml。更优选地，反应开始时，底物的质量体积比浓度为0.13～0.2g/ml。

根据本发明，助溶剂的用量可以为1～10ml/g底物，优选为1～5ml/g底物。

优选地，酶、辅因子、葡萄糖、底物三者的投料质量比为0.02～0.03:0.001～0.004:0.9～1.1:1。

所述的水相缓冲液优选为三乙醇胺缓冲溶液。

本发明中所用的全部原料均可商购获得。

本发明说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。

由于以上技术方案的实施，本发明与已有技术相比具有如下优势：

本发明所提供的方法。与已有方法相比，通过对辅酶循环体系的改进（采用葡萄糖脱氢酶和葡萄糖组成辅酶循环体系）和反应体系的优化，实现了高反应效率和更加绿色、温和的生物转化过程，具有重要的应用价值。

附图说明

图1为实施例1中反应1小时后的HPLC谱图；

图2为实施例1中反应20小时后的HPLC谱图；

图3为叔丁基-4-氯-3-羟基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯消旋体标准品的HPLC谱图；

图4为实施例2所得固体产物的HPLC谱图。

具体实施方式

本发明提供一种改进的阿扎那韦中间体的生物制备方法，其解决了化学法生产阿扎那韦中间体中的危险和污染问题，相对于化学法，其优势在于不使用易燃易爆的化学试剂，不使用大量有机溶剂，减少了污染；本发明方法还解决了传统生物法生产阿扎那韦中间体所存在的底物浓度低、能耗大，效率低等问题，相对于Almac的技术，底物浓度优势明显。相对于Codexis的技术，底物浓度和酶用量在同一水平上，但是通过改进辅酶循环体系，降低了反应温度，减少了控制风险，实现了绿色节能反应。

本发明方法的反应流程图如下：

反应所用的全部原料均通过商购获得。其中酮还原酶(KRED)来自苏州汉酶生物技术有限公司，商品名称及型号EW-016。

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明并不限于以下实施例。

实施例1（酶反应小试）

在5mL的反应器中加入100mg底物((S)-叔丁基(4-氯-3-羰基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯)，400μL助溶剂乙腈，100mg葡萄糖搅拌均匀；称取3mg酮还原酶(KRED)酶粉，3mg葡萄糖脱氢酶(GDH)和0.36mg NAD溶于1400μL pH8.5的三乙醇胺缓冲溶液中，并将此混合溶液加入至反应器中搅拌、33℃水浴开始反应；1小时后取样进行HPLC检测，转化率为37%，20小时后取样进行HPLC检测，转化率为96%（1小时和20小时取样的HPLC图谱分别参见图1和图2，图中7.48分钟对应的产物，8.08分钟对应的为底物）。

实施例2（酶反应放大）

在2L的反应器中加入100g底物((S)-叔丁基(4-氯-3-羰基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯)，170mL甲苯以及100g葡萄糖，搅拌均匀；称取1.2g酮还原酶(KRED)酶粉、1.2g葡萄糖脱氢酶(GDH)酶粉和0.15g NAD溶于585mL pH8.5的三乙醇胺缓冲溶液中，并将此混合溶液加入至反应器中搅拌、33℃水浴开始反应；24小时后HPLC检测，底物转化率为97%。加入乙酸乙酯继续搅拌萃取，合并有机相，干燥过滤，浓缩得到固体产物85g，收率85%，纯度97.7%，光学纯度为99.8%（手性HPLC）(手性HPLC消旋体标准品如图3所示，产物如图4所示)。

上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种阿扎那韦中间体的生物制备方法，所述阿扎那韦中间体为叔丁基((2S,3R)-4-氯-3-羟基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯，所述方法以(S)-叔丁基(4-氯-3-羰基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯为底物，使该底物在酮还原酶作用下发生不对称还原反应生成阿扎那韦中间体，并利用葡萄糖脱氢酶与葡萄糖进行辅酶循环，其特征在于，所述的方法实施如下：在反应器中加入所述底物、助溶剂以及葡萄糖搅拌均匀，另称取酮还原酶酶粉，葡萄糖脱氢酶和辅因子溶于pH8～9的水相缓冲溶液中，并将所得混合溶液加入至反应器中，搅拌，控制温度在32℃～34℃之间，开始反应，HPLC检测反应转化率，至转化率大于等于96%时，结束反应，其中反应开始时，底物的质量体积比浓度为0.05～0.2g/ml，酶、辅因子、葡萄糖、底物三者的投料质量比为0.02～0.03:0.001～0.005:0.8～1.2:1，所述的辅因子为NAD/NADH或NADP/NADPH，所述的助溶剂为乙腈或甲苯或二者的组合。

2.根据权利要求1所述的阿扎那韦中间体的生物制备方法，其特征在于：反应结束后，加入乙酸乙酯继续搅拌萃取，合并有机相，干燥过滤，浓缩得到固体产物，即为纯度大于等于97%、光学纯度大于等于99.5%的阿扎那韦中间体。

3.根据权利要求1所述的阿扎那韦中间体的生物制备方法，其特征在于：反应开始时，底物的质量体积比浓度为0.1～0.2g/ml。

4.根据权利要求3所述的阿扎那韦中间体的生物制备方法，其特征在于：反应开始时，底物的质量体积比浓度为0.13～0.2g/ml。

5.根据权利要求1所述的阿扎那韦中间体的生物制备方法，其特征在于：助溶剂的用量为1～10ml/g底物。

6.根据权利要求5所述的阿扎那韦中间体的生物制备方法，其特征在于：助溶剂的用量为1～5ml/g底物。

7.根据权利要求1所述的阿扎那韦中间体的生物制备方法，其特征在于：酶、辅因子、葡萄糖、底物三者的投料质量比为0.02～0.03:0.001～0.004:0.9～1.1:1。

8.根据权利要求1所述的阿扎那韦中间体的生物制备方法，其特征在于：所述的水相缓冲液为三乙醇胺缓冲溶液。