CN103014080A - 6-氰基-（3r,5r）-二羟基己酸叔丁酯的生物制备方法 - Google Patents

6-氰基-（3r,5r）-二羟基己酸叔丁酯的生物制备方法 Download PDF

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Abstract

一种6-氰基-（3R,5R）-二羟基己酸叔丁酯的生物制备方法，其以6-氰基-（5R）-羟基-3-氧代己酸叔丁酯为底物，该底物在生物催化剂、辅因子和辅因子再生系统的存在下发生还原反应生成6-氰基-（3R,5R）-二羟基己酸叔丁酯，所述的还原反应在pH为6~8的水相缓冲液中进行。本发明通过对工艺条件的优化，主要是通过对还原反应的pH的优化，提高底物浓度，降低酶用量，从而降低了生产成本，实现了高效率的生物转化过程。

Description

6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯的生物制备方法
技术领域：
本发明属于生物制药和绿色化学领域，具体涉及一种6-氰基-（3R,5R）-二羟基己酸叔丁酯的生物制备方法。
背景技术：
降胆固醇的他汀类药物是目前世界最畅销的药物大类。2010年世界最畅销药物，辉瑞公司的立普妥(商品名称Lipitor，年销售额119亿美元)有效活性为阿托伐他汀(atorvastatin)(Nature 2012,485:185-194)。6-氰基-（3R,5R）-二羟基己酸叔丁酯是用于合成此类降胆固醇他汀类药物的关键手性中间体。目前可以通过化学法或酶法加以制备(Angew.Chem.Int.Ed.2005,44:362-365)。
目前化学法工艺生产6-氰基-（3R,5R）-二羟基己酸叔丁酯是利用硼烷类衍生物在-70摄氏度以下的条件下将6-氰基-（5R）-羟基-3-氧代己酸叔丁酯还原。该工艺需要极端反应条件，易燃，能耗严重并且产品的立体异构纯度只能达到98%(US 2009/0216029A1)。
美国的科德克希思公司开发的合成路线是利用源于酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的基因工程改造的酮还原酶催化从6-氰基-（5R）-羟基-3-氧代己酸叔丁酯到6-氰基-（3R,5R）-二羟基己酸叔丁酯的还原反应，同时利用一种葡萄糖脱氢酶完成辅酶（NADPH）的再生反应。通过该工艺路线可以获得立体异构纯的6-氰基-（3R,5R）-二羟基己酸叔丁酯（de值大于99%）（WO 2008/042876A2）。
但是该工艺中存在着底物浓度较低，酶用量较大等问题，例如在该专利中制备产物的实例中，其初始底物浓度为300mg/mL，酶粉用量为底物的1.2%，辅酶用量为底物的0.05%，该种用量使得生产成本较高。
发明内容：
本发明所要解决的技术问题是提供一种改进的6-氰基-（3R,5R）-二羟基己酸叔丁酯的生物制备方法。
为解决以上技术问题，本发明采用如下技术方案：
一种6-氰基-（3R,5R）-二羟基己酸叔丁酯的生物制备方法，其以6-氰基-（5R)羟基-3-氧代己酸叔丁酯为底物，该底物在生物催化剂、辅因子和辅因子再生系统的存在下发生还原反应生成6-氰基-（3R,5R）-二羟基己酸叔丁酯，所述的生物催化剂为酮还原酶，所述的辅因子再生系统包括葡萄糖和葡萄糖脱氢酶，所述的还原反应在pH为6~8的水相缓冲液中进行，在起始时的反应体系中，所述的底物6-氰基-（5R)-羟基-3-氧代己酸叔丁酯的浓度为350~400mg/mL，所述的酮还原酶与所述的底物6-氰基-（5R)-羟基-3-氧代己酸叔丁酯的质量比为0.005~0.04:1。
进一步地，在起始时的反应体系中，所述的辅因子：所述的葡萄糖：所述的葡萄糖脱氢酶;所述的6-氰基-（5R)-羟基-3-氧代己酸叔丁酯的质量比为0.0005~0.002：0.9~1.8：0.01~0.04：1。
进一步地，所述的辅因子为NAD/NADH或NADP/NADPH。
优选地，所述的辅因子为NADP/NADPH。
优选地，所述的水相缓冲液为三乙醇胺盐酸缓冲溶液。
优选地，所述的还原反应在pH为7.0的水相缓冲液中进行。
进一步地，所述的制备方法的实施过程如下：在反应容器中依次加入葡萄糖、所述的水相缓冲液，搅拌均匀，继续加入底物6-氰基-（5R)-羟基-3-氧代己酸叔丁酯，搅拌均匀，用氢氧化钠溶液调节pH6~8，再继续加入葡萄糖脱氢酶和酮还原酶，用氢氧化钠溶液调节pH6~8，再加入所述的辅因子，用氢氧化钠溶液维持pH6~8，搅拌反应，利用LC-MS检测反应进程，待转化率达90~99%时，结束反应。
本发明所采用的酮还原酶（苏州汉酶生物技术有限公司，KRED101）、葡萄糖脱氢酶（苏州汉酶生物技术有限公司，GDH102）均可商购获得。
本发明的有益效果在于:
本发明通过对工艺条件的优化，提高底物浓度，降低酶用量，从而降低了生产成本，实现了高效率的生物转化过程，适合产业化生产。
具体实施方式：
本发明的反应式如下：
Figure BDA00002615153300021
下面的实施例可以使本专业的技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
实施例一：反应监测方法
开发了一种LC-MS检测方法测定6-氰基-（5R）-羟基-3-氧代己酸叔丁酯到6-氰基-（3R,5R）-二羟基己酸叔丁酯的转化。检测时，取不同时间点反应液50μL，加入甲醇950μL，混匀后用0.45μm微孔滤膜过滤，然后进样检测（进样量1μL）。色谱条件：色谱柱SB-C182.1×50mm，3.5μm；流动相A水（10mM HCOONH4-0.1%HCOOH），B乙腈；流速0.3mL/min;流动相梯度0-0.5min 22%B，0.5-0.6min 22%B-100%B，0.6-1.0min 100%B，1.0-1.1min 100%B，1.1-5.0min 22%B。6-氰基-（5R）-羟基-3-氧代己酸叔丁酯的保留时间为2.7min，6-氰基-（3R,5R）-二羟基己酸叔丁酯的保留时间为1.8min。质谱条件：干燥气流速12L/min；鞘气压力40PSI；干燥气温度350℃；毛细管电压3500V；检测模式正离子；检测离子172.1，174.2，228.1，230.1，245.3，247.2，250.1，252.1。
实施例二：产物含量检测方法
对照品溶液制备：称取6-氰基-（5R）-羟基-3-氧代己酸叔丁酯对照品125mg，并称取6-氰基-（3R,5R）-二羟基己酸叔丁酯对照品125mg至50mL容量瓶，用甲醇溶解定容。从母液中取3mL,4mL，5mL,6mL,7mL加入10mL容量瓶，定容至刻度，过滤至液相小瓶，进样8μL。样品溶液制备：称取6-氰基-（5R）-羟基-3-氧代己酸叔丁酯与6-氰基-（3R,5R）-二羟基己酸叔丁酯样品各100mg，至50mL容量瓶，用甲醇溶解定容。过滤至液相小瓶，进样8μL。按照外标法计算含量。色谱条件：色谱柱eclipse XDB-C18,4.6×150mm,5μm；流动相A水（0.1%HCOOH），B乙腈；0-10min 25%B；ELSD检测器条件：温度50℃，气体流速1.5L/min，增益值1。
实施例三：克级制备工艺
向100.0mL的三口烧瓶中依次加入8.0g葡萄糖，10.00mL缓冲溶液（100mM,pH=7.00的三乙醇胺盐酸盐溶液),将该混合体系置于带有磁力搅拌的30℃水浴上搅拌溶解后，滴入6.83g底物，搅拌均匀后以2.0M NaOH溶液调节pH至7.0，随后在900rpm的搅速下加入0.15g葡萄糖脱氢酶冻干粉，0.05g酮还原酶-101冻干粉，调节pH至7.0，再加入5mg NADP冻干粉；同时以2.0M NaOH溶液维持pH在7.0开始反应。每隔2-3小时取样中控反应情况，24小时后LC-MS显示转化率>97%，结束反应，再用实施例二所述的方法检测产物的含量。
实施例四：百克级制备工艺
向反应器中依次加入800.0g葡萄糖，1.00L缓冲溶液（100mM,pH=7.00的三乙醇胺盐酸盐溶液),将该混合体系置于带有机械搅拌的30℃水浴上搅拌溶解后，滴入683g底物，搅拌均匀后以2.0M NaOH溶液调节pH至7.0，随后加入15g葡萄糖脱氢酶冻干粉，5g酮还原酶-101冻干粉，调节pH至7.0，再加入500mg NADP冻干粉；同时以2.0M NaOH溶液维持pH在7.0开始反应。每隔2-3小时取样中控反应情况，24小时后LC-MS显示转化率>97%，结束反应，再用实施例二所述的方法检测产物的含量。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1. 一种6-氰基-（3R,5R）-二羟基己酸叔丁酯的生物制备方法，其以6-氰基-（5R）-羟基-3-氧代己酸叔丁酯为底物，该底物在生物催化剂、辅因子和辅因子再生系统的存在下发生还原反应生成6-氰基-（3R,5R）-二羟基己酸叔丁酯，其特征在于：所述的生物催化剂为酮还原酶，所述的辅因子再生系统包括葡萄糖和葡萄糖脱氢酶，所述的还原反应在pH为6~8的水相缓冲液中进行，在起始时的反应体系中，所述的底物6-氰基-（5R）-羟基-3-氧代己酸叔丁酯的浓度为350~400 mg/mL，所述的酮还原酶与所述的底物6-氰基-（5R）-羟基-3-氧代己酸叔丁酯的质量比为0.005~0.04:1。
2. 根据权利要求1所述的6-氰基-（3R,5R）-二羟基己酸叔丁酯的生物制备方法，其特征在于：在起始时的反应体系中，所述的辅因子：所述的葡萄糖：所述的葡萄糖脱氢酶;所述的6-氰基-（5R）-羟基-3-氧代己酸叔丁酯的质量比为0.0005~0.002：0.9~1.8：0.01~0.04：1。
3. 根据权利要求1所述的6-氰基-（3R,5R）-二羟基己酸叔丁酯的生物制备方法，其特征在于：所述的辅因子为NAD/NADH或NADP/NADPH。
4. 根据权利要求3所述的6-氰基-（3R,5R）-二羟基己酸叔丁酯的生物制备方法，其特征在于：所述的辅因子为NADP/NADPH。
5. 根据权利要求1所述的6-氰基-（3R,5R）-二羟基己酸叔丁酯的生物制备方法，其特征在于：所述的水相缓冲液为三乙醇胺盐酸缓冲溶液。
6. 根据权利要求1所述的6-氰基-（3R,5R）-二羟基己酸叔丁酯的生物制备方法，其特征在于：所述的还原反应在pH为7.0的水相缓冲液中进行。
7. 根据权利要求1或2所述的6-氰基-（3R,5R）-二羟基己酸叔丁酯的生物制备方法，其特征在于：所述的制备方法的实施过程如下：在反应容器中依次加入葡萄糖、所述的水相缓冲液，搅拌均匀，继续加入底物6-氰基-（5R）-羟基-3-氧代己酸叔丁酯，搅拌均匀，用氢氧化钠溶液调节pH6~8，再继续加入葡萄糖脱氢酶和酮还原酶，用氢氧化钠溶液调节pH6~8，再加入所述的辅因子，用氢氧化钠溶液维持pH6~8，搅拌反应，利用LC-MS检测反应进程，待转化率达90~99%时，结束反应。
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Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103468757A (zh) * 2013-09-18 2013-12-25 苏州汉酶生物技术有限公司 一种阿扎那韦中间体的生物制备方法
CN104357502A (zh) * 2014-10-16 2015-02-18 尚科生物医药（上海）有限公司 一种(3r,5r)-6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯的生物制备方法
CN104372039A (zh) * 2013-08-12 2015-02-25 南京朗恩生物科技有限公司 双酶法制备瑞舒伐他汀侧链中间体的方法
CN104830921A (zh) * 2015-04-27 2015-08-12 上海工业生物技术研发中心 一种酶法制备他汀类化合物中间体的方法
CN106086149A (zh) * 2016-06-20 2016-11-09 苏州汉酶生物技术有限公司 一种化学‑酶法制备熊去氧胆酸的方法
CN113528588A (zh) * 2021-06-15 2021-10-22 海南卓科制药有限公司 一种左卡尼汀的制备方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102643757A (zh) * 2011-12-29 2012-08-22 浙江工业大学 生物催化制备6-氰基-(3r,5r)-二羟基己酸叔丁酯及菌株
CN102676596A (zh) * 2011-03-16 2012-09-19 苏州国镝医药科技有限公司 生物酶手性合成立普妥中间体ats-7

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102676596A (zh) * 2011-03-16 2012-09-19 苏州国镝医药科技有限公司 生物酶手性合成立普妥中间体ats-7
CN102643757A (zh) * 2011-12-29 2012-08-22 浙江工业大学 生物催化制备6-氰基-(3r,5r)-二羟基己酸叔丁酯及菌株

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
毛芳芳: "具有非对映选择性还原６－氰基－（５Ｒ）－羟基－３－羰基己酸叔丁酯活性的微生物菌株筛选与鉴定", 《化学与生物工程》, vol. 29, no. 7, 31 July 2012 (2012-07-31), pages 12 - 16 *
王盛: "母细胞不对称催化还原制备重要他汀类手性药物中间体的研究", 《中国硕士学位论文工程科技I辑》, 30 September 2006 (2006-09-30), pages 016 - 106 *

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104372039A (zh) * 2013-08-12 2015-02-25 南京朗恩生物科技有限公司 双酶法制备瑞舒伐他汀侧链中间体的方法
CN103468757A (zh) * 2013-09-18 2013-12-25 苏州汉酶生物技术有限公司 一种阿扎那韦中间体的生物制备方法
CN104357502A (zh) * 2014-10-16 2015-02-18 尚科生物医药（上海）有限公司 一种(3r,5r)-6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯的生物制备方法
CN104830921A (zh) * 2015-04-27 2015-08-12 上海工业生物技术研发中心 一种酶法制备他汀类化合物中间体的方法
CN104830921B (zh) * 2015-04-27 2019-07-02 上海工业生物技术研发中心 一种酶法制备他汀类化合物中间体的方法
CN106086149A (zh) * 2016-06-20 2016-11-09 苏州汉酶生物技术有限公司 一种化学‑酶法制备熊去氧胆酸的方法
CN106086149B (zh) * 2016-06-20 2020-01-21 苏州汉酶生物技术有限公司 一种化学-酶法制备熊去氧胆酸的方法
CN113528588A (zh) * 2021-06-15 2021-10-22 海南卓科制药有限公司 一种左卡尼汀的制备方法

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