CN106086149B - 一种化学-酶法制备熊去氧胆酸的方法 - Google Patents

一种化学-酶法制备熊去氧胆酸的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种化学‑酶法制备熊去氧胆酸的方法，以鹅去氧胆酸为初始底物，依次经过化学法和生物酶法制备熊去氧胆酸，期间采用了7‑KLCA还原酶作为生物催化剂，不会出现现有技术中采用化学法制得7‑酮石胆酸过程中残留的氧化剂导致后期酶失活的情况发生，且采用本发明的制备方法所制得的产物的ee值高，综合成本低。

Description

一种化学-酶法制备熊去氧胆酸的方法
技术领域
本发明涉及制药领域，具体涉及一种化学-酶法制备熊去氧胆酸的方法。
背景技术
熊去氧胆酸(Ursodeoxycholic Acid，UDCA)结构如式1所示，用于治疗胆固醇型胆结石，形成及胆汁缺乏性脂肪泻，也可用于预防药物性结石形成。
目前已经公开的制备熊去氧胆酸的方法中，“活熊引流取胆”的方法由于与野生动物保护法规冲突，且违反人道主义，受到限制。因此，从家禽的胆汁中提取胆酸类物质，如鹅去氧胆酸(Chenodeoxycholic acid，CDCA)并转化为熊去氧胆酸的方法的报道较多(式2)。例如专利CN201210473483等报道了将CDCA酶法氧化为7-酮石胆酸(7-KLCA),后经酶法还原获得UDCA的方法，由于采用的两步酶反应的辅酶均没有循环再生，因此需按当量加入，用量较高(式3)。而专利201310002127.2等报道了将CDCA化学法氧化为7-KLCA，并化学法还原为UDCA。化学法通常采用NBS等氧化剂，和硼氢化钠或醇钠等还原剂，存在的问题是产物ee不高，通常仅为90％，因此需要额外的后处理步骤，降低了收率，提高了成本(式4)。
Figure DEST_PATH_GDA0001053636760000012
Figure DEST_PATH_GDA0001053636760000021
发明内容
本发明的目的是提供克服现有技术的不足，提供一种化学-酶法制备熊去氧胆酸的方法。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：一种化学-酶法制备熊去氧胆酸的方法，包括如下步骤：
1)以鹅去氧胆酸为底物，在酒石酸及溶剂条件下，室温加入氧化剂，氧化反应生成7-酮石胆酸，其中，所述的溶剂为甲醇，所述的氧化剂为次氯酸钠溶液，起始反应体系中，所述鹅去氧胆酸的底物浓度为0.1～0.2g/mL；所述酒石酸与鹅去氧胆酸的投料质量比为1:2～1:3，所述氧化剂与鹅去氧胆酸的投料质量比为4:1～6:1；
2)以步骤1)制得的7-酮石胆酸为底物，在生物催化剂、辅因子和辅酶再生系统的存在下，发生还原反应生成目标产物熊去氧胆酸，其中，所述的生物催化剂为7-KLCA还原酶，所述的辅酶再生系统为一水葡萄糖和葡萄糖脱氢酶，所述反应在温度为25～40℃、pH为6～7的水相缓冲溶液中，在助溶剂条件下进行，其中，所述的一水葡萄糖：7-KLCA还原酶:葡萄糖脱氢酶：7-酮石胆酸的投料质量比为：0.8～1.2:0.005～0.02:0.005～0.02:1。
优选地，所述步骤2)中的辅因子为NADP，所述辅因子与鹅去氧胆酸的投料质量比为0.001～0.0005:1。
优选地，所述步骤2)在pH为6.5的磷酸缓冲溶液进行。
优选地，所述步骤2)中，所述的助溶剂为正己醇和曲拉通X-100的混合液，所述助溶剂的投料体积为反应总体积的5％～30％。
优选地，步骤2)中的葡萄糖脱氢酶为购自苏州汉酶生物技术有限公司生产的牌号为EW002的葡萄糖脱氢酶。
优选地，所述步骤2)中的7-KLCA还原酶的基因序列与序列1-20中的任一序列具有至少90％的同源性。
进一步优选地，所述7-KLCA还原酶是在非致病微生物中的表达产物。
更进一步优选地，所述的非致病微生物为大肠杆菌。
优选地，具体实施过程如下：
1)将鹅去氧胆酸、酒石酸加入到甲醇中，室温条件下搅拌滴加次氯酸钠溶液，滴加完毕后，搅拌反应，HPLC检测反应进程，当底物转化率达90～99％时，反应结束，加入亚硫酸钠，搅拌加水过滤，得到7-酮石胆酸；
2)在反应容器中，依次加入步骤1)得到的7-酮石胆酸、所述的一水葡萄糖及缓冲溶液，在25～40℃、pH为6～8的水浴锅中，400～450rpm搅拌均匀，而后加入所述的助溶剂，待搅拌均匀后加入所述的7-KLCA还原酶、葡萄糖脱氢酶、辅因子进行还原反应，控制反应体系pH在6.5±0.1，HPLC检测反应进程，当转化率达90-99％时，调节体系pH至3.0～3.2，等体积乙酸乙酯多次萃取、合并有机相，调节pH至9.5～9.7，等体积水反萃取，合并水相，并旋蒸得到熊去氧胆酸产品。
由于上述技术方案的运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：本发明的化学-酶法制备熊去氧胆酸的方法，采用了化学法将鹅去氧胆酸氧化成7-酮石胆酸，再通过生物酶法将7-酮石胆酸还原至熊去氧胆酸，期间所采用的生物催化剂为7-KLCA还原酶，并对第一步氧化过程进行了优化，有效地杜绝了现有技术中采用在采用化学法制备7-酮石胆酸过程中残留的氧化剂导致第二步还原过程中酶失活的情况发生，大大提高了产物的ee值，且综合成本更低。
具体实施方式
本发明的反应式如下：
Figure DEST_PATH_GDA0001053636760000031
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明并不限于以下实施例。实施例中采用的实施条件可以根据具体使用的不同要求做进一步调整，未注明的实施条件为常规实验中的条件。
实施例1制备7-KLCA
将CDCA 5g，酒石酸2g加入50ml甲醇中，室温搅拌10分钟。缓慢滴加 次氯酸钠溶液(活性氯5％)25mL，3小时滴加完毕，继续搅拌5小时，HPLC监控反应，转化率99％。反应结束后，加入亚硫酸钠0.5g，搅拌后加入水200mL，过滤得7-KLCA 5g，含量95％。
实施例2制备UDCA
向100mL三口反应烧瓶中，加入5g 7-KLCA，4g一水葡萄糖，45mL 0.1M pH 6.5的PBS缓冲溶液，置于35℃水浴锅中，400-450rpm机械搅拌5min；
向反应瓶中加入5mL正己醇，曲拉通X-100 0.25mL，待搅拌均匀后，向反应瓶中加入7-KLCA还原酶(由序列20在大肠杆菌中表达获得)0.1g、葡萄糖脱氢酶(来自苏州汉酶生物技术有限公司，编号EW002)0.1g，NADP 0.005g，开始反应，反应过程中用1M NaOH溶液控制pH在6.5±0.1。4小时后反应完毕，调节pH至3.0，等体积乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，调节pH至9.5，等体积水反萃取三次，合并水相，旋蒸得到产品4.7g，HPLC检测产品含量为95％，纯度98％。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。
Figure IDA0001053636780000011
Figure IDA0001053636780000021
Figure IDA0001053636780000031
Figure IDA0001053636780000041
Figure IDA0001053636780000051
Figure IDA0001053636780000071

Claims (9)

1.一种化学-酶法制备熊去氧胆酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）以鹅去氧胆酸为底物，在酒石酸及溶剂条件下，室温加入氧化剂，氧化反应生成7-酮石胆酸，其中，所述的溶剂为甲醇，所述的氧化剂为次氯酸钠溶液，起始反应体系中，所述鹅去氧胆酸的底物浓度为0.1~0.2g/mL；所述酒石酸与鹅去氧胆酸的投料质量比为1:2~1:3，所述氧化剂与鹅去氧胆酸的投料质量比为4:1~6:1；
2）以步骤1）制得的7-酮石胆酸为底物，在生物催化剂、辅因子和辅酶再生系统的存在下，发生还原反应生成目标产物熊去氧胆酸，其中，所述的生物催化剂为7-KLCA还原酶，所述的辅酶再生系统为一水葡萄糖和葡萄糖脱氢酶，所述反应在温度为25~40℃、pH为6~7的水相缓冲溶液中，在助溶剂条件下进行，其中，所述的一水葡萄糖：7-KLCA还原酶:葡萄糖脱氢酶：7-酮石胆酸的投料质量比为：0.8~1.2:0.005~0.02:0.005~0.02:1。
2.根据权利要求1所述的化学-酶法制备熊去胆酸的方法，其特征在于，所述步骤2）中的辅因子为NADP，所述辅因子与鹅去氧胆酸的投料质量比为0.001~0.0005:1。
3.根据权利要求1所述的化学-酶法制备熊去胆酸的方法，其特征在于，所述步骤2）在pH为6.5的磷酸缓冲溶液进行。
4.根据权利要求1所述的化学-酶法制备熊去胆酸的方法，其特征在于，所述步骤2）中，所述的助溶剂为正己醇和曲拉通X-100的混合液，所述助溶剂的投料体积为反应总体积的5%~30%。
5.根据权利要求1所述的化学-酶法制备熊去胆酸的方法，其特征在于，步骤2）中的葡萄糖脱氢酶为购自苏州汉酶生物技术有限公司生产的牌号为EW002的葡萄糖脱氢酶。
6.根据权利要求1所述的化学-酶法制备熊去胆酸的方法，其特征在于，所述步骤2）中的7-KLCA还原酶的基因序列与序列1-20中的任一序列具有至少90%的同源性。
7.根据权利要求6所述的化学-酶法制备熊去胆酸的方法，其特征在于，所述7-KLCA还原酶是在非致病微生物中的表达产物。
8.根据权利要求7所述的化学-酶法制备熊去胆酸的方法，其特征在于，所述的非致病微生物为大肠杆菌。
9.根据权利要求1所述的化学-酶法制备熊去胆酸的方法，其特征在于，具体实施过程如下：
1）将鹅去氧胆酸、酒石酸加入到甲醇中，室温条件下搅拌滴加次氯酸钠溶液，滴加完毕后，搅拌反应，HPLC检测反应进程，当底物转化率达90~99%时，反应结束，加入亚硫酸钠，搅拌加水过滤，得到7-酮石胆酸；
2）在反应容器中，依次加入步骤1）得到的7-酮石胆酸、所述的一水葡萄糖及缓冲溶液，在25~40℃、pH为6~8的水浴锅中，400~450rpm搅拌均匀，而后加入所述的助溶剂，待搅拌均匀后加入所述的7-KLCA还原酶、葡萄糖脱氢酶、辅因子进行还原反应，控制反应体系pH在6.5±0.1，HPLC检测反应进程，当转化率达90-99%时，调节体系pH至3.0~3.2，等体积乙酸乙酯多次萃取、合并有机相，调节pH至9.5~9.7，等体积水反萃取，合并水相，并旋蒸得到熊去氧胆酸产品。
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