KR102027620B1

KR102027620B1 - 이상성 시스템에서 담즙산, 이의 염 또는 유도체의 선택적 환원을 위한 공정

Info

Publication number: KR102027620B1
Application number: KR1020147035068A
Authority: KR
Inventors: 다니엘라 몬티; 에리카 엘리사 페란디; 세르지오 리바; 파우스토 포렌티니
Original assignee: 프로도티 케미시 에 엘리멘타리 에스.피.에이.
Priority date: 2012-05-28
Filing date: 2013-05-27
Publication date: 2019-10-01
Also published as: ITMI20120918A1; CN104350157A; WO2013179210A3; WO2013179210A2; ES2586628T3; KR20150018570A; EP2855693B1; NZ701882A; EP2855693B8; EP2855693A2; CN104350157B

Abstract

완충액/유기 용매 이상성 시스템에서 글루코스 탈수소화효소 (GDH) 및 NAD(P)H 보조인자의 재생성을 위한 공-기질로서의 글루코스의 존재에서 NAD(P)H-의존성 7β-하이드록시스테로이드 탈수소화효소 (7β-HSDH)의 작용에 의한 담즙산, 이의 염 또는 유도체, 가령 7-케토-리토콜산, 7-케토데옥시콜산 메틸 에스테르, 또는 7,12 디케토리토콜산 메틸 에스테르의 입체- 및 위치선택적 효소적 환원을 위한 신규한 공정.

Description

이상성 시스템에서 담즙산, 이의 염 또는 유도체의 선택적 환원을 위한 공정{PROCESS FOR THE SELECTIVE REDUCTION OF BILE ACIDS, THEIR SALTS OR DERIVATIVES, IN A BIPHASIC SYSTEM}

본 발명은 상업적으로 쉽게 구할 수 있는 상이한 담즙산 (예시로서 도식 1로 나타난 것), 이의 염 또는 유도체, 가령 예를 들면 7-케토-리토콜산 (3α-하이드록시-7-케토-5β-콜란산, (I)), 7-케토-데옥시콜산 메틸 에스테르 (3α,12α-디하이드록시-7-케토-5β-콜란산 메틸 에스테르, (II)) 및 7,12 디케토-리토콜산 메틸 에스테르 (3α-하이드록시-7,12-디케토-5β-콜란산 메틸 에스테르, (III))로부터 우르소데옥시콜산을 산업적으로 생산하기 위한 신규한 공정에 관한 것이다.

도식 1

화학식이 하기(도식 2)의 식 (IV) 으로 표현되는 우르소데옥시콜산, 즉. 3α,7β-디하이드록시-5β-콜란산 (UDCA)

도식 2

은 일반적으로 사람 담즙에 소량으로 존재하는 화합물로서, 담즙의 콜레스테롤 분해 능력을 증가시키는 화합물이다. UDCA는 이의 치료적 특성으로 공지되어 있다: 이것은 실제로 콜레스테롤 담석의 용해, 일차 담도 결절증 및 경화성 담관염을 비롯한 간 부위의 기능장애의 치료를 위해 사용된다.

따라서 UDCA의 산업적 생산을 위한 공정을 제공하는데 있어서 지대한 관심이 존재한다.

현재, UDCA는 소의 담즙으로부터 추출된 콜산 (3α,7α,12α-트리하이드록시-5β-콜란산 (CA))으로부터, 중간체 12-케토-케노데옥시콜산의 형성을 이용하는 화학 합성을 통해 생산된다 (Hoffmann A. F., Acta Chem . Scand ., 1963, 17, 173-186; Sammuelson B., Acta Chem . Scand ., 1960, 14, 17-20).

우르소데옥시콜산의 전통적인 화학 합성 대신에 다양한 합성 전략, 예를 들면 Bovara R., Carrea G., Riva S. 및 Secundo F. Biotechnology letters 1996, 18, 305-308에 기술된 방법이 제안되었다.

이들 전략은 콜산 또는 케노데옥시콜 산 (3α,7α-디하이드록시-5β-콜라노익산 (CDCA))의 상이한 산화된 유도체, 가령 예를 들면 7-케토-리토콜산, 7-케토-데옥시콜산, 및 7,12-디케토-리토콜산을 사용하며, 이들을 위치 7에서 화학적으로나 효소적으로 환원시킨다.

화학적 절차는 일반적으로 금속 나트륨/알코올 (예를 들면 메탄올, 이소프로판올)을 이용하여 미리 선택된 담즙산의 위치 7에서 케톤의 환원을 야기하지만 (앞서 언급한 Sammuelson B.), 그러한 방법을 이용하여 얻는 수율 및 전환은 UDCA 및 CDA의 혼합물 (보통 약 85:15의 비율)의 형성을 야기하는 입체선택성의 관점에서 그다지 만족스러운 것이 아니다.

제안된 대안적인 합성 방법은 7-케토-리토콜산의 위치 7에서 케톤을, 칼륨/tert-아밀 알코올를 이용하거나 (Batta A.K. et al ., J. Lipid Res .,1991, 32, 977-983) 또는 전기화학적 환원을 이용하여 (Zhao H. Tian H. et al .,J. Appl . Electrochem., 2010, 40, 1307-1316) 환원시키는 것을 포함하지만, 이들 방법 중 어느 것도 현재 산업적 규모로 사용되지 않는다.

화학 합성에 대한 대안으로서, 담즙산의 위치 7에서의 케톤의 환원은 효소적으로, 따라서 촉매 및 비-화학량론적 양으로 반응할 수 있는 보조인자의 적절한 재생성 시스템과 함께 커플링된, NAD(P)H-의존성 하이드록시스테로이드 탈수소화효소 (HDSH) 활성을 이용하여 얻어질 수 있다.

HSDH 활성은 거의 완벽한 위치선택성 및 입체선택성을 나타내며, 그러므로 화학 산화/환원에서 일어나는 것과 반대로, 산화/환원을 요하지 않는 하이드록실 기를 차단 보호하지 않고도 반응을 촉매하기 위해 사용될 수 있다.

HSDH로부터 산화-환원의 촉매된 반응이 가역적이기 때문에, 환원 반응과 커플링된 보조인자의 재생성 시스템이 사용해야 하는 NAD(P)H의 양을 줄일 목적을 위해서 뿐만 아니라 또한 증가된 전환 백분율로 반응의 평형을 촉진하기 위해 사용될 수 있다 (Kroutil W. et al ., Adv . Synth . Catal ., 2004, 346, 125-142).

정량적 전환은 환원 반응과 이차 탈수소화효소에 의해 촉매된 공-기질의 비-가역적 산화 반응을 커플링함으로써 얻어질 수 있다. 가장 흔히 사용되는 재생성 방법은 포르메이트 탈수소화효소 (FDH)에 의해 촉매되어 탄소 무수물을 제공하는 암모늄 포르메이트의 산화, 또는 글루코스 탈수소화효소 (GDH)에 의해 촉매되어 자발적으로 가수분해되면 글루콘산을 생성하는 글루코노-δ-락톤을 제공하는 글루코스의 산화를 포함한다. GDH가 활성의 관점에서 최적의 수율로 수득될 수 있고 심지어 산업적 사용의 조건에서 안정하기 때문에 두 번째 방법이 일반적으로 첫 번째 방법보다 더 자주 사용되며, 여기서 현재 이용가능한 FDH는 제한된 안정성 및 특정한 활성을 특징으로 한다 (van der Donk W., Zhao H. Curr . Opin . Biotech ., 2003, 14, 421-426). 문헌에는 Kosjek B, et al ., Org . Process Res . Dev., 2008,12, 584-588; Eguchi T.et al ., Biosci . Biotechnol . Biochem ., 1992, 56, 701-703;및 Nidetzky B. et al .,Biotechnol . Bioeng . 1996, 52, 387-396에 기술된 바와 같은 글루코스/GDH 재생성 시스템과 커플링된 케톤의 환원 반응의 수많은 예시가 보고된다.

글루코스/GDH 시스템은 그러므로 특허 MI2009A001168 및 US4542098에 각각 보고된 바와 같은 약품, 예를 들면 테스토스테론 및 L-카르니틴의 산업적 생산에서 사용되었다.

담즙산의 환원 반응과 관련하여, NAD(P)H 보조인자의 재생성을 위한 글루코스/GDH 시스템과 커플링된 일부 예시는 Riva S. et al ., J. Org . Chem ., 1986, 51, 2902-2906; Bovara R. et al ., Biotechnology letters, 상기와 동일; Carrea G.et al ., Biotechnol . Lett .,1992, 12, 1131-1135; Bovara R. et al ., 및 J. Org . Chem ., 1993, 58, 499-501에 기술된다.

그러한 반응은 그러나 실험실 규모로 수행되었으며 저 농도의 담즙산 기질 (보통 12.5 mM, 5 g/l와 같음)에서만 수행되었다.

또한, 7β-HSDH에 의해 촉매되는 입체선택적 및 위치선택적 환원 반응에서 기질로 7-케토-리토콜산을 이용하여 관심의 생성물인 UDCA를 생성할 때 관찰된 한 가지 단점은 50 mM (20 g/l)와 동일한 기질 농도에서도, 반응 혼합물이 완전한 겔화를 거치며, 따라서 완료될 때까지 반응 그 자체의 진행을 늦춘다는 사실이다.

겔의 형성은, 담즙산 및 특히 UDCA의 초분자(supramolecular) 구조를 형성하려는 자연적인 경향 및 글루코스/글루콘산 공-기질/부산물의 반응 환경의 존재 둘 다에 의해 야기되는 것으로 보이며, 상기 환경은 이의 현저한 친수성에 의해, 존재하는 다른 용질 (이 경우에는 담즙산)로부터 물 분자를 제거하는 경향이 있으므로 구조적 응집을 야기하는 경향이 있다.

그러나, 공지의 반응 조건에서, 경제적 관점에서 허용되는 것으로 간주되기 위해서는 UDCA는 적어도 50 - 100 mM (20-40 g/l)과 동일한 출발 기질 농도에서 수행되어야 하기 때문에 UDCA의 산업적인 생산의 적용은 불가능하다.

앞서 언급된 상기 Bovara R. et al ., J. Org . Chem . 문서는 NAD(P)H 보조인자의 재생성을 위해 글루코스/GDH 시스템과 커플링된 포스페이트 완충액 이상성 시스템: 에틸 아세테이트 = 1.5 : 1 내 7β-HSDH에 의해 촉매된 7-케토-데옥시콜산 메틸 에스테르 (유기상 내 25 mM, 10 g/l)의 환원 반응을 기술하지만, 여기서 수득된 전환은 20% 미만이고 따라서 추측컨대 효소의 비활성화로 인해 산업 수준으로는 적용이 불가능하다.

또한, 담즙산이 유기 용매에서 산의 형태 (예를 들면 7-케토-리토콜산) 또는 메틸 에스테르의 형태 (예를 들면 7-케토-데옥시콜산 메틸 에스테르)로 용해될 수 있는 반면, 7.5-8.0보다 높은 pH에서 물에서는 상응하는 나트륨 또는 칼륨 염의 형태로만 용해성이라는 점은 흥미롭다. 이러한 이유로 인해, 이상성 시스템에서, 수성상으로 존재하는 담즙산 또는 이의 유도체의 양은 매우 적다. 결과적으로, 이상성 시스템에서 HSDH에 의해 촉매되는 반응은 HSDH가 담즙산의 상승된 농도(> 50 mM)에서 저해되는 것이 관찰되었기 때문에 동종의 수성상에서보다 더 빠르고 더 정량적일 수 있다 (Ferrandi E.E., Bertolesi G.M., Polentini F., Negri A., Riva S., Monti D. Appl . Microbiol . Biotechnol ., 2012, in press, DOI: 10.1007/s00253-011-3798-x).

현재, 담즙산, 이의 염 또는 유도체, 가령 7-케토-리토콜산, 7-케토-데옥시리토콜산 메틸 에스테르 및 7,12-디케토-리토콜산 메틸 에스테르의 위치선택적 효소의 환원을 위한 신규한 공정이 놀랍게도 발견되었으며, 이는 상기 공정이 이상성 시스템 내 글루코스 탈수소화효소 (GDH)의 존재에서 NAD(P)H-의존성 7β-하이드록시스테로이드 탈수소화효소 (7β-HSDH)를 사용하며, 따라서 출발 기질을 상승된 양으로 용해시키는 것이 가능하므로, 겔 형성을 방지하고, 효소의 비활성화를 방지하고, 정량적 전환을 얻게 한다.

다양한 유기 용매의 존재에서 환원 반응의 전환 정도에 대한 다양한 변수, 가령 HSDH 및 GDH 효소의 양, 담즙산 기질 및 글루코스 공-기질의 농도, 온도 및 pH의 영향을 실험적으로 검증함으로써 본 발명의 공정이 발견되었다.

본 발명의 목적은 그러므로 이상성 시스템에서 담즙산, 이의 염 또는 유도체, 가령 7-케토-리토콜산, 7-케토-데옥시콜산 메틸 에스테르 및 7,12-디케토-리토콜산 메틸 에스테르의 위치 7에서 위치선택적 효소를 환원하기 위한 공정이며, 상기 공정은 NAD(P)H-의존성 7β-하이드록시스테로이드 탈수소화효소 (7β-HSDH), 글루코스를 공-기질로서 포함하는 NAD(P)H 보조인자의 재생 시스템, 글루코스 탈수소화효소 (GDH)의 존재에서 상기 화합물을 선형 또는 분지형 C₄-C₁₀ 알킬 알코올, 선형 또는 분지형 C₄-C₁₀ 케톤 및 아세트산의 선형 또는 분지형 C₃-C₅ 에스테르로 이루어진 군에서 선택된 유기 용매와 반응시키는 단계를 포함한다.

알코올 2-헥사놀, 3-옥타놀 및 4-메틸-2-펜타놀, 케톤 용매 2-펜타논 및 에스테르 i-프로필아세테이트가 특히 바람직하다.

본 발명의 공정에서 사용되는 NAD(P)H-의존성 7β-HSDH는 바람직하게는 30 내지 50 U/ml 범위의 효소 활성을 지니며, 여기서 효소 활성 (U)은 12.5 mM의 7-케토-리토콜산을 함유하는 어세이 용액에서, 일 분 이내에, 일 마이크로몰의 7-케토-리토콜산 기질을 위치 7이 환원된 상응하는 생성물로 전환시킬 수 있는 7β-HSDH 효소의 양을 의미한다.

본 발명의 공정에서 사용되는 NAD(P)H-의존성 GDH는 바람직하게는 20 내지 30 U/ml 범위의 효소 활성을 지니며, 여기서 효소 활성 (U)은 50 mM의 글루코스를 함유하는 어세이 용액에서, 일 분 이내에, 일 마이크로몰의 글루코스 기질을 상응하는 산화된 글루코노-δ-락톤 생성물로 전환시킬 수 있는 GDH 효소의 양을 의미한다.

출발 화합물, 즉 식 (I), (II) 또는 (III)의 기질은 바람직하게는 유기상 (25-300 mM) 내에서 1% 내지 12% (중량/부피)의 농도로 사용되며, 더 바람직하게는 5% 내지 10% (중량/부피) (125-250 mM)의 농도로 사용된다.

본 발명의 공정은 바람직하게는 실온에서, 즉 약 20 ℃- 25 ℃에서 수행되고 바람직하게는 7-7.5의 pH에서 수행된다.

사용되는 완충액은 바람직하게는 칼륨 포스페이트 완충액이다.

본 명세서에 기술된 공정에 걸리는 시간은 바람직하게는 4 시간 내지 24 시간, 및 더 바람직하게는 5 내지 10 시간이다.

NAD(P)⁺보조인자는 바람직하게는 100 내지 1000 μM, 바람직하게는 300 내지 500 μM 범위의 농도의 촉매적 양으로 사용된다.

글루코스 공-기질은 출발 기질에 대하여 등몰, 하지만 바람직하게는 약간 과량의 농도로 (바람직하게는 20 내지 50%) 사용된다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 환원 반응은 NAD(P)H-의존성 7β-하이드록시스테로이드 탈수소화효소 (7β-HSDH), 가령 도식 3에 나타나는담즙산의 환원 반응을 촉매하는 7β-HSDH, NAD(P)H 보조인자를 재생성하는 글루코스 탈수소화효소, 재생성 반응의 공-기질로서의 글루코스, 및 촉매량의 NAD(P)⁺ 보조인자를 함유하는 수성 상을 상기 기술된 것들로부터 선택된 유기 상에 부가하는 이상성 시스템에서 수행되고, 여기서 관심의 담즙산, 가령 도식 3에 나타난 바와 같은 화합물 (I), (II) 또는 (III)이 용해된다.

도식 3에서, 화합물 (IV)은 식 (I)의 출발 화합물로부터 출발하는 지점 a)에서 예시의 방식으로 묘사된 환원 공정에서 형성된 UDCA인, 반면 지점 b)는 지점 a)에 언급된 환원 반응과 커플링된 글루코스의 산화 반응을 기술한다. 식 (II) 및 (III)의 화합물의 환원 반응의 생성물은, 각각, 우르소콜산 메틸 에스테르 (3α,12α,7β-트리하이드록시-5β-콜란산 메틸 에스테르, (V)) 및 12-케토-우르소데옥시콜산 메틸 에스테르 (3α,7β-디하이드록시-12-케토-5β-콜란산 메틸 에스테르, (VI))이다.

본 발명의 공정에서 사용된 7β-HSDH는 앞서 이미 언급된 Ferrandi E.E. et al. 에 기술된 Clostridium absonum로부터의 NADPH-의존성 7β-HSDH, Liu L. et al., Appl . Microbiol . Biotechnol ., 2011, 90, 127-35에 기술된 Collinsella aerofaciens로부터의 NADPH-의존성 7β-HSDH, 또는 Pedrini P. et al ., Steroids, 2006, 71, 189-198에 기술된 Xanthomonas maltophilia로부터의 NADPH-의존성 7β-HSDH일 수 있다.

본 발명의 공정에서 사용된 글루코스 탈수소화효소는 Bacillus megaterium 로부터 (Heilmann H. J.et al ., Eur . J. Biochem., 1988, 174, 485-490; Ebeling W et al ., US5250415), Bacillus subtilis 로부터 (Fujita Y.et al ., J. Bacteriol., 1977, 132, 282-293), Gluconobacter suboxydans 로부터 (Adachi O. et al ., Agric. Biol . Chem., 1980, 44, 301-308), Thermoplasma acidophilum 로부터 (Smith L. D. et al ., Biochem . J., 1989, 261, 973-977; Bright J. R. et al ., Eur. J. Biochem., 1993, 211, 549-554), Sulfolobus solfataricus 로부터 (Giardina P. et al ., Biochem . J., 1986, 239, 517-522), Pseudomonas 로부터 (Sogabe A. et al . US5298411), 또는 Aspergillus oryzae 로부터 (Tsuji Y. et al ., US7655130) 유래할 수 있다.

본 발명의 공정으로 수득된 식 (V) 및 (VI)의 유도체는 출발 기질이 7-케토-데옥시콜산 메틸 에스테르 (II) 또는 7,12-디케토-리토콜산 메틸 에스테르 (III)일 경우 특허 EP0072293 및 Hoffmann A. F., 또는 Sammuelson B. (앞서 언급됨)에 기술된 바와 같이 UDCA의 화학적 합성에서 사용될 수 있다.

하기 실시예는 본 발명의 비-제한적인 예시로서 간주되어야 한다.

실시예

실시예 1 -이상성 시스템에서 7- 케토 - 리토콜산 (I)의 효소적 환원

4 g (10 mmol)의 7-케토-리토콜산 (I)을 90 ℃의 온도에서 수 분간 가열함으로써 4 ml의 탈이온수의 존재에서 40 ml의 4-메틸-2-펜타놀 (10% 중량/부피, 250 mM) 내에 용해하였다. 용액을 약 23 ℃까지 냉각되게 하고, 8 ml의 포스페이트 완충액 100 mM pH 9.2 및 2.2 g (12.2 mmol)의 글루코스를 부가하였다. 두 상을 혼합하기 위해 시스템을 교반 하에 유지하였고, 15 mg (0.023 mmol)의 NAD⁺, 130 U의 7β-HSDH (40 U/ml의 7β-HSDH를 함유하는 3.2 ml의 용액) 및 80 U의 GDH (25 U/ml의 GDH를 함유하는 3.2 ml의 용액)을 부가하였다. 온도 및 pH를 반응이 진행되는 동안 불변하게 유지하였다. 7-케토-리토콜산 (I)에서 우르소데옥시콜산 (IV)로의 완전한 전환 (> 99.5%)은 5 시간 만에 달성하였다. 전환의 정도는 HPLC 분석을 이용하여 평가하였다.

비교의 방식으로, 균질한 수성상(단상성)에서 기질 (I)에서 생성물 (IV)로의 환원 반응을 위한 최고 조건이 하기에 보고된다.

반응을 다음을 함유하는 100 ml의 총 부피에서 20 ℃ 및 pH 8.0에서 수행하였다: pH 8.0에서 4 g (10 mmol)의 7-케토-리토콜산 (I)의 나트륨 염 (4% 중량/부피, 100 mM, pH 8.0에서 0.2 M의 7-케토-리토콜산의 나트륨 염의 수성 용액을 희석하여 수득함), 2.2 g (12.2 mmol)의 글루코스, 240 U의 7β-HSDH (40 U/ml의 7β-HSDH를 함유하는 6 ml의 용액) 및 150 U의 GDH (25 U/ml의 GDH를 함유하는 6 ml의 용액), 40 mg (0.06 mmol)의 NAD⁺, 50 mM의 칼륨 포스페이트 완충액, pH 8.0.

약 16 시간 만에, 7-케토-리토콜산 (I)에서 우르소데옥시콜산 (UDCA (IV))으로의 전환 > 99%을 관찰하였으나, 교반 하에서도, 용액은 겔화되어, 반응의 완료를 방해하였다.

실시예 2 -이상성 시스템에서 7- 케토 - 데옥시콜산 메틸 에스테르 ( II ) 또는 7,12- 디케토 - 리토콜산 메틸 에스테르 ( III )의 효소적 환원

0.4 g (1 mmol)의 7-케토-데옥시콜산 메틸 에스테르 (II)를 5 ml의 i-프로필아세테이트 (8% 중량/부피, 200 mM)에 용해하였다. 3.5 ml의 포스페이트 완충액 50 mM pH 8.0 및 220 mg (1.22 mmol)의 글루코스를 이후 부가하였다. 시스템을 두 상을 혼합하기 위해 교반 하에 유지하였고, 이후 0.2 ml의 6 mg/ml의 NAD⁺(0.0018 mmol)의 용액, 20 U의 7β-HSDH (40 U/ml의 7β-HSDH를 함유하는 0.5 ml의 용액) 및 7.5 U의 GDH (25 U/ml의 GDH를 함유하는 0.3 ml의 용액)을 부가하였다. 온도 및 pH를 반응이 진행되는 동안 불변하게 유지하였다. 7-케토-데옥시콜산 메틸 에스테르 (II)에서 우르소콜산 메틸 에스테르 (V)로의 완전한 전환 (> 99.5%)은 5 시간 만에 달성하였다. 전환의 정도는 HPLC 분석을 이용하여 평가하였다.

동일한 반응 조건을 7,12-디케토-리토콜산 메틸 에스테르 (III)의 환원 반응에 적용하여 12-케토-우르소데옥시콜산 메틸 에스테르 (VI)를 얻었다. 출발 기질에서 예상 생성물로의 완전한 전환 (> 99.5%)은 5 시간 만에 달성하였다.

Claims

하기 식을 가지는 화합물 또는 이의 염 또는 유도체

의 위치 7에서의 위치선택적 효소적 환원을 위한 공정이되, 상기 공정은 상기 화합물을 NAD(P)H-의존성 7β-하이드록시스테로이드 탈수소화효소 (7β-HSDH), 글루코스를 공-기질로서 포함하는 NAD(P)H 보조인자의 재생 시스템, 글루코스 탈수소화효소 (GDH)의 존재에서, 선형 또는 분지형 C₄-C₁₀ 알킬 알코올, 선형 또는 분지형 C₄-C₁₀ 케톤 및 아세트산의 선형 또는 분지형 C₃-C₅ 에스테르로 이루어진 군에서 선택된 유기 용매와 반응시키는 단계를 포함하는 공정.
제1항에 있어서, 유기 용매는 2-헥사놀, 3-옥타놀, 4-메틸-2-펜타놀, 2-펜타논 또는 i-프로필아세테이트 에스테르인 공정.
제1항에 있어서, NAD(P)H-의존성 7β-HSDH는 30 내지 50 U/ml 범위의 효소 활성을 가지는 공정.
제1항에 있어서, NAD(P)H-의존성 GDH는 20 내지 30 U/ml 범위의 효소 활성을 가지는 공정.
제1항에 있어서, 식 (I), (II) 또는 (III)을 가지는 화합물, 이의 염 또는 유도체는 유기 상에서 1% 내지 12% (중량/부피) 범위 (25-300 mM)의 농도를 가지는 공정.
제1항에 있어서, NAD(P)⁺보조인자는 100 내지 1000 μM 범위의 농도의 촉매적 양으로 사용되는 공정.
제1항에 있어서, 글루코스 공-기질은 각각의 화합물 (I), (II) 또는 (III)에 대하여 등몰, 또는 과량의 농도로, 20 내지 50% 범위로 사용되는 공정.
제1항에 있어서, 환원은 정량적이거나, 99.5% 이상인 공정.
제1항에 있어서, 20 ℃ - 25 ℃에서 수행되는 공정.
제1항에 있어서, 7 내지 7.5의 pH에서 수행되는 공정.
제10항에 있어서, 칼륨 포스페이트 완충액으로 이루어진 완충액 시스템을 더욱 포함하는 공정.
우르소데옥시콜산 (IV)을 제조하기 위한 공정이되, 제1항에 따른 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 공정.
우르소콜산의 메틸 에스테르 (V)를 제조하기 위한 공정이되, 제1항에 따른 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 공정.
12-케토-우르소데옥시콜산의 메틸 에스테르 (VI)를 제조하기 위한 공정이되, 제1항에 따른 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 공정.