CN104350157B - 在双相系统中选择性还原胆汁酸，它们的盐或衍生物的方法 - Google Patents
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Abstract
立体和区域选择性酶促还原胆汁酸，它们的盐或衍生物，如7‑酮基‑石胆酸，7‑酮基脱氧胆酸甲酯，或7,12二酮基石胆酸甲酯的新方法，所述方法在葡萄糖脱氢酶(GDH)和葡萄糖作为用于NAD(P)H辅因子的再生的共底物的存在下，在缓冲剂/有机溶剂两相体系中，通过NAD(P)H‑依赖性7β‑羟基类固醇脱氢酶(7β‑HSDH)的反应而进行。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于从不同的胆汁酸，它们的盐或衍生物(以举例的方式在方案1中示出)工业生产熊去氧胆酸的新方法，所述胆汁酸，它们的盐或衍生物是容易商购获得的，例如7-酮基-石胆酸(3α-羟基-7-酮基-5β-胆烷酸，(Ⅰ))，7-酮基-脱氧胆酸甲酯(3α，12α-二羟基-7-酮基-5β-胆烷酸甲酯，(Ⅱ))和7,12-二酮基-石胆酸甲酯(3α-羟基-7,12-二酮基-5β-胆烷酸甲酯，(Ⅲ))。
熊去氧胆酸，即3α，7β-二羟基-5β-胆烷酸(UDCA)，它的结构式被呈现在下式(IV)中(方案2)，
是这样的化合物，其通常以小批量存在于人胆汁中，在那里它增加了胆汁对于胆固醇的增溶能力。UDCA是因其治疗特性而著名的：它确实是用于肝区功能障碍的治疗，包括胆固醇胆石，原始胆汁性肝硬化(primitive biliary cirrhosis)和硬化性胆管炎的化解(dissolution)。
因此，令人非常感兴趣的是工业生产熊去氧胆酸的方法。
背景技术
目前，熊去氧胆酸是如下制备：通过从胆酸(3α，7α，12α-三羟基-5β-胆烷酸(CA))化学合成，所述胆酸从牛胆汁提取，通过中间体12-酮基-鹅去氧胆酸的形成(HoffmannA.F.,Acta Chem.Scand.,1963,17,173–186；Sammuelson B.,Acta Chem.Scand.,1960,14,17–20)。
代替熊去氧胆酸的传统的化学合成的各种合成策略已经被提出，例如在BovaraR.,Carrea G.,Riva S.和Secundo F.Biotechnology letters 1996,18,305-308中所述。
这些策略使用胆酸或鹅去氧胆酸(3α，7α-二羟基-5β-胆烷酸(CDCA))的不同氧化衍生物，诸如例如7-酮基-石胆酸，7-酮基-去氧胆酸，和7,12-二酮基-石胆酸，它们通过化学或酶促在7位被还原。
化学过程通常导致在预选胆汁酸的第7位的酮通过金属钠/醇(例如甲醇，异丙醇)而被还原(SammuelsonB.，已经被引用)，但是通过这样的方法所获得的产率和转化率的都没有在立体选择性方面完全令人满意，导致UDCA和CDA的混合物的形成(通常在85:15左右的比例)。
建议的替代合成方法包括，7-酮基-石胆酸7位的酮通过钾/叔戊醇而还原(Batta的AK等人，J.Lipid Res.,1991,32,977-983)或通过电化学还原(Zhao H.Tian H.等人,J.Appl.Electrochem.,2010,40,1307–1316)，但这些方法目前均没有在工业规模上被使用。
作为替代化学合成，可以使用NAD(P)H-依赖性羟基类固醇脱氢酶(HDSH)活性联合辅因子的合适的再生系统，从而实现在胆汁酸7位的酮的酶促还原，因此其可以是以催化和非化学计量的数量进行反应。
所述HSDH活性表明是几乎绝对区域选择性和立体选择性的，因此可用于催化反应，而不会导致对不需要氧化/还原的所述羟基的预防性保护，其与在化学氧化/还原中需要发生的是相反的。
因为从HSDHs的氧化-还原的催化反应是可逆的，与还原反应联合的辅因子再生系统可以被利用，以不仅用于减少NAD(P)H的用量的目的，还可以促进该反应的平衡朝向于增加转化率百分比(Kroutil W.等人,Adv.Synth.Catal.,2004,346,125-142)。
可以通过联合还原反应与通过第二脱氢酶催化的辅因子非可逆的氧化反应，而得到定量转换。最常用的再生方法包括甲酸铵的氧化(其得到甲酸脱氢酶(FDH)催化的碳酸酐)，或葡萄糖的氧化，其得到葡糖酸-δ-内酯，其自发地水解，得到葡糖酸，由葡萄糖脱氢酶催化(GDH)。与第一方法相比，第二种方法一般是更经常使用，因为，在活性方面GDHs能够以最佳产率获得，而且在工业使用条件是更加稳定的，而目前可用的FDH特征在于有限的稳定性和比活性(van der Donk W.,Zhao H.Curr.Opin.Biotech.,2003,14,421-426)。文献中报道了，与葡萄糖/GDH的再生系统联合的酮的还原反应的许多例子，如在Kosjek B,等人,Org.Process Res.Dev.,2008,12,584–588；Eguchi T.等人,Biosci.Biotechnol.Biochem.,1992,56,701-703；and Nidetzky B.等人,Biotechnol.Bioeng.1996,52,387–396中所述。
葡萄糖/GDH系统也因此被用在药品例如睾酮和L-肉碱的工业生产中，分别报道在专利MI2009A001168和US4542098中。
对于胆汁酸的还原反应，联合用于NAD(P)H辅因子的再生的葡萄糖/GDH系统的一些例子在Riva S.等人,J.Org.Chem.,1986,51,2902-2906；Bovara R.等人,Biotechnologyletters,already cited；Carrea G.等人,Biotechnol.Lett.,1992,12,1131-1135；BovaraR.等人,and J.Org.Chem.,1993,58,499-501中进行说明。
然而，此类反应只在实验室规模进行，并且仅仅采用低浓度的胆汁酸底物(通常为12.5mM，等于5克/升)。
此外，当使用7-酮基-石胆酸作为由7β-HSDH催化的立体选择性和区域选择性还原反应中的底物，以得到目的产物UDCA时，观察到一个缺点，它是一个事实，即，即使在底物浓度等于50mM(20克/升)的情况下，反应混合物会受到完全凝胶化，从而妨碍反应本身进展直到完成。
凝胶的形成似乎是由以下两点引起的：胆汁酸，特别是熊去氧胆酸形成超分子结构的自然趋势，以及，反应环境中存在葡萄糖/葡萄糖酸共底物/副产物，由于它们显著的亲水性，它们倾向于从存在的其它溶质除去水分子(在这种情况下，胆汁酸)，因此趋向于促进结构聚集。
然而，在已知的反应条件下，不可能实现UDCA的工业生产，其中，从经济的观点来看的，为了被认为是可接受的，所述生产必须在起始底物浓度至少等于50-100mM时进行(20-40克/升)。
已经在上面引用的文献Bovara R.等,J.Org.Chem.描述了，7-酮基-脱氧胆酸甲基酯(25mM在有机相中，10克/升)由7β-HSDH在磷酸盐缓冲双相体系：乙酸乙酯＝1.5:1催化的还原反应，其联合了用于NAD(P)H辅因子的再生的葡萄糖/GDH的系统，但在该文献中所得到的转化率小于20％，因此在工业水平上是不适用的，可能原因是酶失活。
此外，令人感兴趣地注意到的是，胆汁酸如何只在相应的钠盐或钾盐的形式中在pH大于7.5-8.0的溶于水，而在有机溶剂中，它们以酸的形式可以是可溶解的(例如7-酮基-石胆酸)，或者在甲基酯(例如7-酮基-去氧胆酸甲基酯)的形式中是可溶解的。出于这个原因，在两相系统中，胆汁酸或它们的衍生物在水相中存在的量非常低。因此，在两相体系中通过HSDH催化的反应可以是比在均一的水相中更快和更定量的，因为，已被观察到的是，HSDHs在胆汁酸的升高的浓度(>50毫摩尔)被抑制(Ferrandi E.E.,Bertolesi G.M.,Polentini F.,Negri A.,Riva S.,Monti D.Appl.Microbiol.Biotechnol.,2012,inpress,DOI:10.1007/s00253-011-3798-x)。
发明内容
现在，已经令人惊奇地发现一种新的方法，其用于区域选择性酶促还原的胆汁酸，它们的盐或衍生物，如7-酮基-石胆酸，7-酮基-脱氧石胆酸甲酯和7,12-二酮基-石胆酸甲基酯，其中，所述方法在双相系统中在葡萄糖脱氢酶(GDH)的存在下，使用NAD(P)H-依赖性7β-羟基类固醇脱氢酶(7β-HSDH)，由此使能够溶解升高的量的起始底物，避免形成凝胶，避免酶失活，并获得定量的转换。
本发明的方法如下被发现：通过实验确认，在各种有机溶剂的存在下，各种参数，如HSDH和GDH酶的量，胆汁酸底物和葡萄糖共底物的浓度，温度和pH值对还原反应转化度的影响。
因此，本发明的目的是用于在两相系统中，在胆汁酸，它们的盐或衍生物如7-酮基-石胆酸，7-酮基-脱氧胆酸甲酯和7,12-二酮基-石胆酸甲酯的7位上进行区域选择性酶促还原的方法，该方法包括在NAD(P)H依赖性7β-羟基类固醇脱氢酶(7β-HSDH)和包含葡萄糖作为共底物的NAD(P)H的辅因子的再生系统所述系统，葡萄糖脱氢酶(GDH)和选自直链的或支链的C4-C10烷基醇，直链或支链的C4-C10酮和乙酸的直链或支链的C3-C5酯的有机溶剂的存在下，所述化合物进行反应。
醇类2-己醇，3-辛醇，4-甲基-2-戊醇，酮溶剂2-戊酮和酯乙酸异丙酯是特别优选的。
在本发明的方法中使用的NAD(P)H-依赖性7β-HSDHs优选具有为30至50U/ml的酶活性，其中的酶活性(U)意指，7β-HSDH酶的量，所述量在一分钟内，在含有12.5mM 7-酮基-石胆酸的测定溶液中，能够转化一微摩尔的7-酮基-石胆酸底物为相应的在7位上还原的产物。
在本发明的方法中使用的NAD(P)H-依赖性GDHs优选具有为的酶活性，其中的酶活性(U)指的是GDH酶的量，所述量能够在含有50mM葡萄糖的测定液中，在一分钟内，将一个微摩尔葡萄糖底物转化成的相应氧化葡糖酸-δ-内酯产物。
起始化合物，即式(I)，(II)或(III)的底物，优选在有机相(25-300mM)中以范围从1％至12％(重量/体积)的浓度被使用，更优选以范围为5％至10％(重量/体积)(125-250mM)的浓度被使用。
本发明的方法优选在室温下进行，即在约20℃-25℃，并优选在pH7-7.5进行。
所使用的缓冲液优选是缓冲剂磷酸钾。
这里所描述的方法的持续时间优选为4小时至24小时之间，并且更优选为5至10小时之间。
NAD(P)+辅因子优选以催化量使用，所述催化量的浓度范围为100至1000μM，优选为300至500μM。
在相对于所述起始底物的等摩尔浓度使用葡萄糖共底物，但优选稍微过量(优选为20至50％)。
具体实施方式
按照本发明的一个方面，所述还原反应是在两相系统中通过加入水相而进行的，所述水相含有NAD(P)H-依赖性7β-羟基类固醇脱氢酶(7β-HSDH)，例如催化胆汁酸的还原反应的7β-HSDH，如在方案3中所示，重新生成NAD(P)H辅因子的葡萄糖脱氢酶，作为再生反应共底物的葡萄糖，以及对选自在上文描述的那些的有机相而言是催化量的NAD(P)+辅因子，其中感兴趣的胆汁酸溶解，如化合物(Ⅰ)，(II)或(III)，如方案3所示的。
在方案3中，化合物(Ⅳ)是熊去氧胆酸(UDCA)，其在还原方法中被形成，例如在以下点举例说明的，点a)从式(Ⅰ)的起始化合物开始，而点b)描述葡萄糖的氧化反应，其与在点a)中提到的还原反应相联合。式(Ⅱ)和(Ⅲ)的化合物的还原反应的产物分别是，乌索胆酸甲酯(3α，12α，7β-三羟基-5β-胆烷酸甲酯，(Ⅴ))和12-酮基-熊去氧胆酸甲酯(3α，7β-二羟基-12-酮基-5β-胆烷酸甲酯，(VI))。
在本发明的方法中使用的7β-HSDH可以是来自不同梭菌(Clostridium absonum)的NADPH依赖性7β-HSDH，如在上面已经提到的Ferrandi E.E.等人中所说明的，来自产气柯林斯菌(Collinsella aerofaciens)的NADPH依赖性7β-HSDH，如在Liu L.等，Appl.Microbiol.Biotechnol.,2011,90,127-35中所说明，或来自嗜麦芽黄单胞菌(Xanthomonas maltophilia)的NADPH依赖性7β-HSDH，如在Pedrini P.等，Steroids,2006,71,189–198中说明。
在本发明的方法中使用的葡萄糖脱氢酶可以是来自巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)(Heilmann H.J.等人，Eur.J.Biochem.,1988,174,485-490；Ebeling W等，US5250415)，来自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)(Fujita Y.等，J.Bacteriol.,1977,132,282-293)，来自弱氧化葡糖杆菌(Gluconobacter suboxydans)(Adachi O.等，Agric.Biol.Chem.,1980,44,301–308)，来自嗜酸热原体(Thermoplasma acidophilum)(Smith L.D.等人，Biochem.J.,1989,261,973-977；Bright J.R.等人，Eur.J.Biochem.,1993,211,549-554)，来自硫矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus)(Giardina P.等人，Biochem.J.,1986,239,517-522)，来自假单胞菌属(Pseudomonas)(Sogabe A.等US5298411)，或米曲霉菌(Aspergillus oryzae)(Tsuji Y.等，US7655130)的葡萄糖脱氢酶。
当起始底物是7-酮基-脱氧胆酸甲基酯(II)或-7,12-二酮基-石胆酸甲基酯(Ⅲ)时采用本发明的方法获得的式(V)和(VI)的衍生物可在UDCA的化学合成中使用，如在专利EP0072293和Hoffmann A.F.，或Sammuelson B.中描述的(已经被引用)。
下面的实施例将被认为是本发明的非限制性说明。
实施例
实施例1-在7-酮基-石胆酸(Ⅰ)的两相系统中的酶促还原
在4毫升去离子水的存在下，通过在90℃的温度加热数分钟，将4克(10毫摩尔)7-酮基-石胆酸(Ⅰ)溶于40毫升4-甲基-2-戊醇(pentanolo)(10％重量/体积，250毫摩尔)。将该溶液放置冷却至约23℃，和加入8毫升的磷酸盐缓冲液100mM pH9.2和2.2克(12.2毫摩尔)葡萄糖。将体系保持搅拌以混合两相，然后加入15毫克(0.023毫摩尔)的NAD+，130U的7β-HSDH(3.2毫升含有40U/ml的7β-HSDH的溶液)和80U的GDH(3.2毫升含有25U/ml的GDH的溶液)。在反应过程中，保持温度和pH值恒定。在5小时的时间实现了，7-酮基-石胆酸(Ⅰ)到熊去氧胆酸(Ⅳ)的完全转化(>99.5％)溶液。转化度用HPLC分析进行评价。
通过比较，在均匀水相(单相)中对于底物(Ⅰ)至产物(IV)的还原反应的最佳条件，将在下面被报道。
该反应在20℃和pH 8.0在100毫升的总体积中进行，所述总体积含有：4克(10mmol)的在pH8.0的7-酮基-石胆酸(Ⅰ)的钠盐(4％重量/体积，100mM，通过稀释pH 8.0的0.2M的7-酮基-石胆酸的钠盐的水溶液获得的)，2.2克(12.2毫摩尔)的葡萄糖，240U的7β-HSDH(6毫升含40U/ml的7β-HSDH的溶液)和150U的GDH(6毫升含25U/ml的GDH的溶液)，40毫克(0.06毫摩尔)的NAD+，50mM的磷酸钾缓冲液，pH 8.0。
但在约16小时的时间内，观察到的是，7-酮基-石胆酸(Ⅰ)到熊去氧胆酸(UDCA(IV))的转换>99％，即使在搅拌下，所述溶液也胶化(gelifies)，阻碍反应完成。
实施例2在7-酮基-脱氧胆酸甲基酯(Ⅱ)或7,12-二酮基-石胆酸甲基酯(III)的两相系统中的酶促还原
0.4克(1毫摩尔)7-酮基-脱氧胆酸甲基酯(Ⅱ)溶解在5毫升的乙酸异丙酯(8％重量/体积，200mM)。然后加入3.5毫升的磷酸盐缓冲液50mM的pH 8.0和220毫克(1.22毫摩尔)的葡萄糖。将体系保持在搅拌下，以混合两相，然后加入0.2毫升的6毫克/ml的NAD+的溶液(0.0018毫摩尔)，20U的7β-HSDH(0.5毫升含有40U/ml的7β-HSDH的溶液)和7.5U的GDH(0.3毫升含25U/ml GDH的溶液)。在反应过程中，温度和pH保持恒定。在5小时的时间内，实现7-酮基-脱氧胆酸甲基酯(Ⅱ)至乌索胆酸甲酯(Ⅴ)的完全转化(>99.5％)。转化度用HPLC分析进行评价。
在相同的反应条件用于7,12-二酮基-石胆酸甲基酯(Ⅲ)的还原反应，以得到12-酮基-熊去氧胆酸甲基酯(VI)。起始底物至所期望的产物的完全转化(>99.5％)在5小时的时间内被实现。
Claims (14)
1.用于在下式的化合物的7位上进行区域选择性酶促还原的方法
(I),7-酮基-石胆酸 R＝H；R'＝H
(II),7-酮基-脱氧胆酸甲基酯 R＝OH；R'＝CH3
(III),7,12-二酮基-石胆酸甲基酯 R＝＝O；R'＝CH3，
所述方法包括在NAD(P)H-依赖性7β-羟基类固醇脱氢酶(7β-HSDH)和NAD(P)H辅因子再生系统的存在下所述的化合物进行反应，所述再生系统包括葡萄糖作为共底物，葡萄糖脱氢酶(GDH)以及选自4-甲基-2-戊醇或乙酸异丙酯的有机溶剂；所述方法是在pH 7至7.5进行的并包括磷酸盐缓冲液。
2.根据权利要求1的方法，其中所述NAD(P)H-依赖性7β-HSDH具有的酶活性为30至50U/ml。
3.根据权利要求1的方法，其中所述NAD(P)H-依赖性GDH具有的酶活性为
4.根据权利要求1的方法，其中式(I)、(II)或(III)的化合物，在有机相中具有的浓度范围为1％至12％重量/体积，相当于25-300mM。
5.根据权利要求1的方法，其中式(I)、(II)或(III)的化合物，在有机相中具有的浓度范围为5％至10％重量/体积，相当于125-250mM。
6.根据权利要求1-5中任一项的方法，其中在100至1000μM的浓度范围，以催化量使用NAD(P)+辅因子。
7.根据权利要求6的方法，其中在300至500μM的浓度范围，以催化量使用NAD(P)+辅因子。
8.根据权利要求1-5中任一项的方法，其中以相对于每个化合物(Ⅰ)，(Ⅱ)或(Ⅲ)的等摩尔浓度，或以的范围的过量，使用所述葡萄糖共底物。
9.根据权利要求1-5中任一项的方法，其中所述还原高于或等于99.5％。
10.根据权利要求1-5中任一项的方法，在20℃-25℃进行所述方法。
11.根据权利要求1-5中任一项的方法，磷酸盐缓冲液是磷酸钾缓冲液。
12.一种制备熊去氧胆酸(Ⅳ)的方法，
(IV)，熊去氧胆酸 R＝H；R′＝H
其特征在于，它包括根据权利要求1至11中任一项的方法。
13.一种制备乌索胆酸的甲基酯(Ⅴ)的方法，
(V)，乌索胆酸 R＝OH；R′＝CH3
其特征在于，它包括根据权利要求1至11中任一项的方法。
14.一种制备12-酮基-熊去氧胆酸的甲酯(Ⅵ)的方法，
(VI)12-酮基-熊去氧胆酸 R＝＝O；R′＝CH3
其特征在于，它包括根据权利要求1至11中任一项的方法。
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