ES2268356T3

ES2268356T3 - Procedimiento para la deshidrogenacion de compuestos azaandrostano.

Info

Publication number: ES2268356T3
Application number: ES03722882T
Authority: ES
Inventors: Istvan Bartho; Berta Monika Herine; Tamas Devenyi; Gabor Hantos; Katalin Olasz; Razso Agnes Pecsne
Original assignee: Richter Gedeon Vegyeszeti Gyar RT
Current assignee: Richter Gedeon Vegyeszeti Gyar Nyrt
Priority date: 2002-05-10
Filing date: 2003-05-07
Publication date: 2007-03-16
Anticipated expiration: 2023-05-07
Also published as: DE60306768D1; US6762302B2; HU227117B1; HU0201584D0; EP1504021B1; EP1504021A1; HUP0201584A2; ATE332912T1; AU2003230042A1; PT1504021E; WO2003095472A1; DK1504021T3; US20030215902A1; DE60306768T2

Abstract

Procedimiento para la preparación de compuestos de fórmula I (I) (Ver fórmula) en la que R1 es un grupo -NH-tert-butilo o 4-metilpiperidino, por bioconversión de los compuestos de fórmula II (II) (Ver fórmula), en la que R1 es un grupo -NH-tert-butilo o un grupo 4-metilpiperidino, por medio de un biocatalizador que tiene actividad esteroide-Delta1- deshidrogenasa, utilizando un inductor de la enzima, caracterizado porque se añade un estabilizador para mantener el nivel apropiado de enzima, un agente formador de complejos para acelerar la disolución continua del sustrato y un portador de electrones conocido para mejorar la bioconversión.

Description

Procedimiento para la deshidrogenación de compuestos azaandrostano.

Antecedentes de la invención Campo de la invención

La presente invención se refiere a un nuevo procedimiento para la deshidrogenación de compuestos azaandrostano.

Técnica anterior

Los 4-azaesteroides son bien conocidos como inhibidores específicos de la enzima testosterona-5\alpha-reductasa. Según datos publicados anteriormente, es evidente que para obtener el efecto deseado es necesario introducir un doble enlace en la posición C-1,2 de la molécula.

Existe tanto métodos sintéticos como bioquímicos para introducir el doble enlace en la posición C-1,2 de los 4-azaesteroides.

Uno de los métodos sintéticos consiste en la introducción del doble enlace \Delta^{1} con anhídrido bencenoselénico en clorobenceno en ebullición (por ejemplo, Patente Nº EP 155 096).

Como alternativa, la deshidrogenación se puede llevar a cabo con quinonas (por ejemplo: 2,3-dicloro-5,6-dicianobenzoquinona) en presencia de agentes de sililación (por ejemplo: bistrimetilsililtrifluoroacetamina) (Patente Nº EP 298 652).

Según los procedimientos descritos en los documentos EP 428 366 y EP 655 459, para introducir el doble enlace C-1,2 se puede emplear el derivado 2-halógeno de un esteroide como intermedio. La patente Nº CA 2 271 974 describe un procedimiento en el que el doble enlace \Delta^{1} se introduce en un azaesteroide utilizando un compuesto 2,2-dibromo-azaesteroide como intermedio.

En otro procedimiento, los derivados 2-halógeno se preparan a partir del compuesto 4-aza no sustituido apropiado a través de un intermedio trialquilsililtrifluorometanosulfonato con yoduro o cloruro de trimetilsililo y yoduro (Patente Nº EP 473 226). El compuesto \Delta^{1} deseado se obtiene a partir de este derivado 2-halógeno-4-aza con tert-butóxido de potasio en una solución de dimetilformamida con un rendimiento de aproximadamente el 60%.

Estos métodos sintéticos requieren unas condiciones de reacción sumamente agresivas que tienen varios inconvenientes. En primer lugar, se forman impurezas. En segundo lugar, las impurezas, aunque en pequeñas concentraciones (por debajo del 0,1%), no están caracterizadas y algunas pueden ser tóxicas. Además, algunos de los reactivos empleados son cancerígenos, inflamables y exigen condiciones completamente secas o son muy corrosivos y por ello peligrosos desde el punto de vista medioambiental.

En contraposición a esto, en los métodos bioquímicos las condiciones requeridas para la deshidrogenación \Delta^{1} son suaves y producen menor número de derivados peligrosos y menos peligrosos desde el punto de vista medioambiental. En consecuencia, la formación de compuestos tóxicos es menos probable. Además, en vez de en dos pasos sintéticos, la transformación se puede realizar en un solo paso.

Aunque la deshidrogenación \Delta^{1} de los esteroides es bien conocida en la literatura (Microbial Transformations of Steroids, Chamey, W.; Herzog, H. L.; Academic Press, Nueva York, Londres (1967)), existen muy pocos ejemplos de introducción microbiológica de un doble enlace en la posición C-1,2 de azaesteroides, probablemente debido al bien conocido efecto antibacteriano de los azaesteroides (J. Bacteriol., 93(2), 627-35 (1967); Steroids, 27(4), 525-41 (1976); Chem. Ind., 52, 1660-1 (1970)).

La introducción microbiana de un doble enlace \Delta^{1} en compuestos 12a-aza se ha llevado a cabo con cepas Nocardia sp. y Arthrobacter sp. (Mazur y col. J. Org. Chem., 28(9), 2442-3 (1963)). Según Mazur y col., la conversión de 12a-aza-C-homo-1,4-pregnadieno-3,12,20-triona se pudo realizar a una concentración de 0,29 g/l con un rendimiento del 62%; la conversión de 12a-aza-17\alpha-hidroxi-C-homo-1,4-pregnadieno-3,12,20-triona se pudo realizar a una concentración de 0,17 g/l con un rendimiento del 17%; y la conversión de 12a-aza-C-homo-5\alpha-pregn-1-eno-3,12,20-triona se pudo realizar a una concentración de 0,29 g/l con un rendimiento del 26%.

De igual forma, se han utilizado las cepas Arthrobacter sp. y Nocardia sp. para \Delta^{1-}deshidrogenar el sustrato 17-N-tert-butilcarbamoil-4-azaandrostan-3-ona a una concentración de 0,1-1,0 g/l con un rendimiento del 20-80% (Patente Nº EP 786 011). En este método, las enzimas \Delta^{1-}deshidrogenasa de las cepas anteriores fueron inducidas por la adición de hidrocortisona, se suspendió la biomasa separada en un tampón (pH=6-8) saturado con disolvente orgánico y la bioconversión se desarrolló en presencia de menadiona o de fenacina metosulfato. La bioconversión se llevó a cabo en un pequeño volumen. En el único ejemplo descrito, la conversión se realizó durante 3 días en un volumen de 20 ml a una concentración de sustrato de 0,26 g/l con un rendimiento del 60%. Sin embargo, para la realización industrial, se debe determinar el nivel de concentración apropiado y aumentarlo progresivamente según el procedimiento. Según nuestros experimentos, cuando se incrementa progresivamente el procedimiento, la conversión cae drásticamente. Por tanto, para la realización industrial es esencial una modificación elemental de este procedimiento.

Sumario de la invención

El objeto de la presente invención es proporcionar un procedimiento de bioconversión que evite los inconvenientes de todos los métodos sintéticos a la vez que permite su realización industrial. Más concretamente, la invención se refiere a un procedimiento para la producción de compuestos de fórmula general (I), donde R_{1} es un grupo -NH-tert-butilo o un grupo 4-metilpiperidino, por bioconversión de los compuestos de fórmula general (II), donde R_{1} es como se ha descrito anteriormente, utilizando un biocatalizador que tiene actividad enzimática esteroide-\Delta^{1}-deshidrogenasa, en la que la actividad de la enzima necesaria para la bioconversión se obtiene por inducción.

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En una realización preferente, la presente invención engloba un método para la producción de un compuesto de fórmula I que comprende los pasos de:

a): preparar un cultivo de un biocatalizador o un extracto de un biocatalizador;

b): añadir al cultivo o al extracto un inductor de actividad esteroide-\Delta^{1} -deshidrogenasa;

c): añadir al cultivo o al extracto un portador de electrones, un estabilizador y un compuesto de fórmula II; e

d): incubar el cultivo o el extracto durante el tiempo que sea necesario para que se produzca la bioconversión del compuesto de fórmula II al compuesto de fórmula I.

En otra realización preferente, la presente invención engloba un método para la producción de un compuesto de fórmula I que comprende los pasos de:

a): preparar un cultivo de un biocatalizador o de un extracto de un biocatalizador, en el que dicho cultivo o extracto tenga un volumen de aproximadamente al menos 1 l;

b): añadir al cultivo o al extracto un inductor de esteroide-\Delta^{1}-deshidrogenasa;

c): añadir al cultivo o al extracto un portador de electrones, un estabilizador, un agente formador de complejos o emulsificador y un compuesto de fórmula II; e

e): incubar el cultivo o el extracto durante el tiempo que sea necesario para que se produzca la bioconversión del compuesto de fórmula II al compuesto de fórmula I.

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a): preparar un cultivo de biocatalizador o de un extracto de biocatalizador;

b): añadir al cultivo o al extracto un inductor de la actividad esteroide-\Delta^{1}-deshidrogenasa;

c): añadir al cultivo o al extracto un portador de electrones en una concentración de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 3,5 g/l y un estabilizador en una concentración de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 1,0 g/l y un compuesto de fórmula II; e

d): incubar el cultivo o el extracto durante el tiempo que sea necesario para que se produzca la bioconversión del compuesto de fórmula II al compuesto de fórmula I

siempre y cuando no se añada un eliminador de oxígeno al cultivo o al extracto.

Descripción detallada de la invención

La invención se refiere a un procedimiento para la producción de compuestos de fórmula general (I), donde R_{1} es un grupo -NH-tert-butilo o 4-metilpiperidino, por bioconversión de los compuestos de fórmula general (II), donde R_{1} es tal como se ha descrito anteriormente, utilizando un biocatalizador que tiene actividad enzimática esteroide-\Delta^{1}-deshidrogenasa, mediante la inducción de la actividad de la enzima, el mantenimiento de la actividad enzimática al nivel necesario añadiendo un estabilizador, la aceleración de la disolución continua del sustrato añadiendo un agente formador de complejos y la finalización de la conversión añadiendo un portador de electrones.

El término bioconversión se define como la conversión del compuesto (II) al compuesto (I) a través del uso de un biocatalizador de tal modo que al menos se produzca una cantidad apreciable de compuesto (I).

El término biocatalizador se define como cualquier microorganismo que contiene o al que se pueda inducir una actividad enzimática esteroide-\Delta^{1}-deshidrogenasa. Como ejemplos de biocatalizadores se citan, pero sinlimitarlos a: bacterias, hongos y células animales. El método de la invención se puede llevar a cabo con los métodos mencionados anteriormente y conocidos de preparación de un biocatalizador (por ejemplo: células intactas, extractos libres de células, preparaciones inmovilizadas de las mismas). Por ejemplo, células intactas de Arthrobacter simplex se pueden utilizar incubando un cultivo sumergido en un medio líquido que contenga una fuente de carbono, preferentemente glucosa a una concentración de 1-15 g/l, una fuente de nitrógeno, tal como un extracto de levadura a una concentración de 1-10 g/l, y sales inorgánicas. El cultivo se incuba a 25-38ºC, preferentemente a 35ºC, durante 20-72 horas. Luego se añade una solución que contiene el o los agentes que inducen la actividad enzimática esteroide-\Delta^{1}-deshidrogenasa. Para los expertos en la materia, es obvio que el procedimiento de la invención se puede llevar a cabo con otros biocatalizadores que tengan la actividad enzimática esteroide-\Delta^{1}-deshidrogenasa, por ejemplo células intactas vivas o en reposo, lisados celulares y preparaciones libres o inmovilizadas de los mismos (J. Am. Chem. Soc., 108, 6732, (1986); Chem. Rev., 92, 1071-1140 (1992)).

En los métodos de la invención se emplean las cepas Arthrobacter sp. y Nocardia sp. Además, aunque los azaesteroides tienen un efecto antibacteriano, sorprendentemente descubrimos que, además de las cepas Arthrobacter sp. y Nocardia sp., las cepas que pertenecen a los géneros Bacillus y Mycobacterium eran capaces de \Delta^{1}-deshidrogenar los 4-azaesteroides. Ente algunas cepas específicas que se pueden utilizar se encuentran, sin limitarse a: Arthrobacter simplex (ATCC 6946), Bacillus subtilis (NRRL B-558), Bacillus sphaericus (ATCC 7045), Bacillus lentus (ATCC 13805), Nocardia corallina (ATCC 4275) y Mycobacterium sp. (NRRL B-3683). La producción de extractos libres de células de esteroide-\Delta^{1}-deshidrogenasa, así como la inmovilización de las células intactas de todas estas cepas, está ampliamente descrita en la literatura (J. A. Chem. Soc., 108, 6732, (1986); Chem Rev., 92, 1071-1140 (1992)).

La actividad de la enzima \Delta^{1}-deshidrogenasa es inducida por un método conocido, por ejemplo por adición de hidrocortisona. Entre otros inductores que se pueden utilizar se encuentran, sin limitarse a: prednisolona, prednisona, cortisona y androsta-1,4-dieno-3,17-diona. No obstante, la actividad de la enzima disminuye a lo largo del tiempo debido al consumo de la coenzima o a la actividad de enzimas proteolíticas. Para mantener la actividad de la enzima se pueden utilizar varios métodos conocidos tales como la modificación química o inmovilización enzimática, la inclusión de la enzima en una cápsula de liposomas y el uso de aditivos (derivados de azúcares: polioles, ésteres; aminoácidos, proteínas, dextrinas; lecitina, DMSO). World Biotech. Rep., 1, 379-390 (1984); Patente Nº JP 62-096084; Biotechnol. Bioengineer. 75, 615-618 (2001); Patentes Nº JP 96196330, JP 89185636, JP 86253336.

En ausencia de un agente de inducción, la actividad de la enzima \Delta^{1}-deshidrogenasa puede disminuir. Para compensar esta disminución es necesario añadir más agente de inducción. En el caso de una bioconversión que se prolongue durante varios días, se debe añadir continuamente el agente de inducción a fin de mantener la concentración necesaria del mismo.

La inducción de la enzima se puede realizar mediante cualquier método conocido tal como adición de una solución metanólica de hidrocortisona en el cultivo a una concentración de aproximadamente 10 a aproximadamente 100 mg/l. Debido a que la hidrocortisona es degradada enzimáticamente, su efecto de inducción disminuye continuamente. Por tanto, para mantener la alta actividad de la enzima necesaria para la bioconversión, se requiere la adición repetida de hidrocortisona (en total 2,7 g/l). La frecuencia de la administración de hidrocortisona depende de su velocidad de disgregación enzimática. La hidrocortisona se administra preferentemente un vez al día.

Según un método preferente, la inducción se puede efectuar mediante la adición de esteroides que sean resistentes a la degradación por enzimas bacterianas tal como 9a-hidroxilasa y que sean sustratos de la enzima \Delta^{1}-deshidrogenasa o que ya tengan un doble enlace \Delta^{1}, a una concentración de aproximadamente 10 a aproximadamente 100 mg/l.

Sorprendentemente hemos tenido resultados excelentes con el procedimiento de bioconversión de forma que, tras la inducción de la actividad de la enzima \Delta^{1}-deshidrogenasa, se añade un estabilizador que mantenga el nivel apropiado de enzima, un agente formador de complejos que acelere la disolución continua del sustrato y un portador de electrones conocido que complete la bioconversión.

Se descubrió que compuestos que no inducen actividad enzimática \Delta^{1}-deshidrogenasa pueden estabilizar las enzimas ya presentes en el sistema y preservar su actividad \Delta^{1}-deshidrogenasa durante un tiempo prolongado sin ninguna otra intervención. El 5\alpha-androstanodiol o su derivado 17-metil, el 13-etilgon-4-eno-3,17-diona o su derivado acetoxi o hidroxi, la 9,11-deshidrohidrocortisona o su derivado acetato, la estra-4-eno-3,17-diona o su derivado acetoxi o hidroxi y la 13-etil-10,11\alpha-dihidroxigon-4-eno-3,17-diona que se añaden para estabilizar la enzima pueden preservar la actividad cuando se añaden a una concentración final de aproximadamente 10 a 100 mg/l. El estabilizador preferente es la 13-etil-10,11\alpha-dihidroxigon-4-eno-3,17-diona, que mantiene el efecto de inducción a una concentración de 50 mg/l durante días sin que se experimente pérdida de la actividad deshidrogenasa durante 3-5 semanas cuando el cultivo se almacena a 5-12ºC.

La inmensa mayoría de los esteroides son poco solubles en agua. Sin embargo, la adición de un sustrato esteroide disuelto en un disolvente orgánico no proporcionaría suficiente biodisponibilidad en el sistema de bioconversión. Por tanto, en el método de la presente invención se pueden utilizar emulsificadores o agentes formadores de complejos para incrementar la accesibilidad biológica del sustrato en las bioconversiones realizadas en sistemas acuosos. Se puede utilizar un emulsificador tal como monooleato de polioxietilensorbitano (por ejemplo: TWEEN-80) (Patente Nº HU 216 874) a una concentración de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 4 g/l. Entre otros emulsificadores que se pueden utilizar se citan, sin limitarse a, TEGIN® y TAGAT® (Goldschmidt Chemical Corp.). Como alternativa, se puede utilizar ventajosamente un agente formador de complejos, por ejemplo \alpha-, \beta- y \gamma-ciclodextrinas y derivados de ciclodextrina (Appl. Microbiol. Biotechnol., 32, 556-559 (1990); "Cyclodextrins and their Industrial Uses", D. Duchene, Ediciones de Sante, Paris (1987); Appl. Microbiol. Biotechnol., 58, 393-399 (2002); Patente Nº RU 2 039 824). Otro agente formador de complejos que se puede utilizar es TAMOL® (BASF).

En el procedimiento de la presente invención, al medio se puede añadir ciclodextrina y derivados de ciclodextrina en una concentración de aproximadamente 1 a aproximadamente 50 g/l. Son preferentes la metil-\beta-ciclodextrina y la hidroxipropil-\beta-ciclodextrina. Se define un derivado de ciclodextrina como una ciclodextrina modificada con uno o más grupos de tal modo que la ciclodextrina modificada mantiene la capacidad de actuar como un agente formador de complejos. Entre los grupos que se pueden utilizar se citan, sin limitarse a, metilo, dimetilo, random-metilo, carboximetilo y succinilo.

Debido a que la conversión enzimática del sustrato de fórmula (II) al producto de fórmula general (I) es una reacción de equilibrio, para llevar a cabo la conversión e incrementar la velocidad de reacción, según el procedimiento de la invención, se utilizan portadores de electrones tales como naftoquinona, menadiona, bisulfito de menadiona y metosulfato de fenacina. Preferentemente se utiliza bisulfito de menadiona en una concentración de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 3,5 g/l, en especial en una concentración de al menos 0,1, 0,5, 1,5 o 2,0 g/l, en particular en una concentración de aproximadamente 3,1 g/l. La adición se puede realizar de una vez o en varias partes, preferentemente se añade en cuatro partes. El portador de electrones se añade preferentemente a intervalos de 18-24 horas.

Obsérvese que este elemento del procedimiento de la invención es bastante sorprendente, ya que al incrementar en dos órdenes de magnitud la cantidad habitual de portador de electrones que se aplica básicamente se puede aumentar la velocidad de conversión sin utilizar más aditivos para eliminar las especies de oxígeno tóxico formadas. La idea preconcebida publicada era que el uso de mayores cantidades de portador de electrones provocría la formación de derivados de oxígeno tóxico, los cuales tendrían que ser eliminados mediante eliminadores de oxígeno. Véase el procedimiento descrito en la patente estadounidense Nº 4,749,649.

La aplicación de uno cualquiera de los tres elementos de esta invención (estabilizador, agente formador de complejos, portador de electrones) individualmente tiene como resultado un incremento del 10-15% en la bioconversión en comparación con el que se obtiene en su ausencia. Sin embargo, el uso combinado de todos ellos no tiene sorprendentemente un simple efecto aditivo sino un efecto sinérgico que da como resultado una bioconversión de más del 90%. Mientras que la bioconversión se puede llevar a cabo en cualquier volumen, en la presente invención favorablemente se lleva a cabo en un volumen de al menos 1 l, preferentemente de al menos 5 l.

La bioconversión se lleva a cabo durante un periodo de tiempo suficiente como para que se produzca una cantidad apreciable de bioconversión, preferentemente de al menos 24 horas, en especial de al menos 72 horas.

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La actividad del cultivo inducido se puede aumentar por métodos conocidos, por ejemplo generando una alta concentración celular. Esto se puede llevar a cabo mediante el abastecimiento de elementos nutritivos, la inoculación repetida o separación de células y resuspensión de éstas en un volumen reducido. Las células se pueden resuspender en una solución tampón a pH 6-8, en una solución saturada con un disolvente orgánico o en un medio fresco. Según un método preferente, las células se separan y se resuspenden en un medio fresco que contiene los ingredientes mencionados para poder alcanzar una concentración multiplicada por cinco o diez. El sustrato de fórmula general (II) se añade a este cultivo de alta actividad en una solución etanólica, en una concentración de aproximadamente 0,2 a aproximadamente 2 g/l, preferentemente a una concentración final de aproximadamente
1 g/l.

Los siguientes ejemplos ilustran los métodos de la presente invención sin limitarla a los mismos. Otras modificaciones y adaptaciones adecuadas de la variedad de condiciones y parámetros que normalmente se aplican en química sintética y bioconversión y que son obvios para los expertos en la materia están dentro del espíritu y alcance de la invención.

El contenido de ingredientes activos de los productos cristalinos obtenidos en los siguientes ejemplos se determinó mediante HPLC.

Las condiciones de medida fueron las siguientes:

: Columna: LiChroCART 250-4, LiChrospher 100 CN (5 pm)

: Eluyente: tetrahidrofurano:agua = 30:60

: Velocidad de flujo: 0,7 ml/min

: Volumen inyectado: 20 \mul

: Detección: UV, 210 nm

: Temperatura: 60ºC

Ejemplo 1

El cultivo Arthrobacter simplex (ATCC 6946) se mantuvo en un medio sólido con la siguiente composición:

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Se incubó el medio inoculado a 32ºC durante 4 días, luego se almacenó a 4-10ºC durante otros 30 días para iniciar los cultivos. A fin de producir cultivos vegetativos, se lavó una placa de agar y transfirió a un medio de 100 ml con la siguiente composición, que se esterilizó en un matraz Erlenmeyer de 500 ml:

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Se incubó el cultivo a 32ºC durante 24 horas en un agitador giratorio a 200 rpm, luego se trasladó a un medio de 5 l con la siguiente composición, que se esterilizó en una cuba de fermentación de 9 l:

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El cultivo se llevó a cabo a 35ºC a 200 rpm y una velocidad de flujo de aire de 40 l/h. Se indujo la producción de la enzima \Delta^{1}-deshidrogenasa después de 20 horas de cultivo mediante la adición de 500 mg de hidrocortisona disuelta en metanol. Tras 8 horas de inducción, se centrifugó el cultivo a 4.800 rpm, se desechó el sobrenadante y se suspendieron aproximadamente 100 ml de concentrado celular en 500 ml de medio fresco. Se repitió esta operación ocho veces dando en total 4 l de biocatalizador.

La bioconversión se realizó en la cuba de fermentación anteriormente mencionada a 30ºC a 250 rpm y una velocidad e flujo de aire de 60 l/h.

Se indujo la formación de enzima \Delta^{1}-deshidrogenasa por segunda vez mediante la adición de 250 mg de hidrocortisona. Tras 2 horas, se añadieron 250 mg de 13-etil-10,11\alpha-dihidroxigon-4-eno-3,17-diona en una solución metanólica.

Se aceleró la disolución del sustrato mediante la adición de 120 g de hidroxipropil-\beta-ciclodextrina. Se añadieron 800 mg de sustrato 17\beta-tert-butilcarbamoil-4-azaandrostan-3-ona a la mezcla en una solución etanólica.

Después de la adición del sustrato, se añadieron 8 g de bisulfito de menadiona, un portador de electrones, en cuatro partes de 2 g cada una, a intervalos de 19, 20 y 24 horas respectivamente. Después de la adición de cada parte del portador de electrones, se aumentó la velocidad de flujo de aire en un 20% con respecto a la original, proporcionando niveles de oxígeno disuelto del 21, 25, 30 y 36% de saturación del aire. Tras 72 horas de bioconversión, se extrajo el cultivo con un volumen de cloroformo equivalente y se concentró la capa orgánica hasta sequedad.

El producto cristalino bruto obtenido consistía en 1.315 mg que contenían 755 g de 17\beta-tert-butilcarbamoil-4-azaandrost-1-eno-3-ona (conversión del 94,4%). El contenido de ingrediente activo del producto cristalino obtenido se determinó por HPLC como se ha descrito anteriormente.

Ejemplo 2

Se aplicó el procedimiento descrito en el Ejemplo 1, pero se utilizaron 800 mg de 4-metil-1-[(5\alpha,17\beta)-3-oxo-4-azaandrostano-17-il]carbonil]piperidina como sustrato.

El producto cristalino bruto obtenido consistía en 1.422 mg que contenían 488 mg de 4-metil-1-[(5\alpha,17\beta)-3-oxo-4-azaandrost-1-eno-17-il]carbonilpiperidina como producto (conversión del 61%).

Ejemplo 3

Se aplicó el procedimiento descrito en el Ejemplo 1 para cada uno de los siguientes estabilizadores: 5\alpha-androestanodiol y su derivado 17-metil, 13-etil-4-goneno-3,17-diona y sus derivados acetoxi y 11\alpha-hidroxi, 9,11-deshidrohidrocortisona y su derivado acetato, 4-estren-3,17-diona y sus derivados acetoxi y 11\alpha-hidroxi.

Los productos cristalinos brutos obtenidos (en el orden de los compuestos de arriba) consistían en 1.315, 1.611, 1.665, 1.412, 1.189, 1.653, 1.312, 1.425, 1.222, 1.345 mg, los cuales contenían 611, 288, 318, 555, 297, 411, 428, 371, 387, 424 mg de 17\beta-tert-butilcarbamoil-4-azaandrost-1-eno-3-ona, respectivamente. Estos corresponden a una conversión del 76, 36, 40, 69, 37, 51, 54, 46, 48, 53%, respectivamente.

Ejemplo 4

Se preparó un cultivo del microorganismo Mycobacterium sp. (NRRL B-3683) por los métodos del estado anterior de la técnica, luego se aplicó el procedimiento descrito en el Ejemplo 1 para llevar a cabo la bioconversión.

El producto cristalino bruto obtenido consistía en 1.616 mg que contenían 36 mg de 17\beta-tert-butilcarbamoil-4-azaandrost-1-eno-3-ona (conversión del 4,5%).

Ejemplo 5

Se preparó un cultivo del microorganismo Baccillus subtilis (NRRL B-558) por métodos del estado anterior de la técnica, luego se aplicó el procedimiento descrito en el Ejemplo 1 para llevar a cabo la bioconversión.

El producto cristalino bruto obtenido consistía en 1.325 mg que contenían 14,4 mg de 17\beta-tert-butilcarbamoil-4-azaandrost-1-eno-3-ona (conversión del 1,8%).

Ejemplo 6

Se añadieron 8 g de hidrocortisona en solución metanólica a un cultivo del microorganismo Arthrobacter simplex (ATCC 6946) (80 l, densidad óptica de 18-25), que se había preparado por métodos del estado anterior de la técnica, para llevar acabo la inducción de la enzima \Delta^{1}-deshidrogenasa.

La fermentación se realizó a 35ºC a 200 rpm y una velocidad de flujo de aire de 960 l/h. Se suprimió la formación de espuma ocasional mediante la adición de un agente antiespumante Struktol SB2020.

Se utilizó un cultivo de 5.000-8.000 U/l para iniciar la deshidrogenación de la dihidrofinasterida. Se enfrió el cultivo inducido a 30ºC y se añadieron 80 g de dihidrofinasterida en 800 ml de etanol. Se ajustó el pH a 7,5-7,7 mediante la adición de una disolución de NAOH de 200 g/l o de 100 g/l de H_{3}PO_{4} mientras se mantenían la velocidad de agitación y de flujo constantes. Después de finalizar la conversión, se extrajo el cultivo con acetato de etilo y se aisló el producto por métodos conocidos.

El producto cristalino bruto obtenido consistía en 166 g que contenían 6,8 g de 17\beta-tert-butilcarbamoil-4-azaandrost-1-eno-3-ona (conversión del 8,5%).

Ejemplo 7

Se aplicó el procedimiento descrito en el Ejemplo 6, pero además de la inducción, se estabilizó la formación de la enzima \Delta^{1}-deshidrogenasa. La hidrocortisona, que es el inductor más adecuado para la enzima, puede metabolizarse en un cultivo de alta densidad celular, lo que puede llevar a la inactivacion gradual de la enzima ya formada. Según nuestros experimentos, se evitó dicha inactivación añadiendo, además de hidrocortisona, 6 g de 13-etil-10,11\alpha-dihidroxigon-4-eno-3,17-diona, que no es inductiva en sí misma, en una solución metanólica, al comienzo de la inducción.

El producto cristalino bruto obtenido consistía en 138 g que contenían 24,96 g de 17\beta-tert-butilcarbamoil-4-azaandrost-1-eno-3-ona (conversión del 31,2%).

Ejemplo 8

Se aplicó el procedimiento descrito en el Ejemplo 6, pero antes de la adición del sustrato se añadió una solución esterilizada de 6.000 g de 2-hidroxipropil-beta-ciclodextrina (40% en masa) para acelerar la disolución del sustrato.

El producto cristalino bruto obtenido consistía en 177 g que contenían 13,8 g de 17\beta-tert-butilcarbamoil-4-azaandrost-1-eno-3-ona (conversión del 11,1%).

Ejemplo 9

Se aplicó el procedimiento descrito en el Ejemplo 6, pero después de la adición del sustrato se añadieron 64 g de bisulfito de menadiona en 360 ml de agua esterilizada como portador de electrones.

El producto cristalino bruto obtenido consistía en 121 g que contenían 22,3 g de 17\beta-tert-butilcarbamoil-4-azaandrost-1-eno-3-ona (conversión del 17,8%).

Ejemplo 10

Se aplicó el procedimiento descrito en el Ejemplo 6, pero también se adoptaron los métodos descritos en los Ejemplos 7 y 8.

El producto cristalino bruto obtenido consistía en 169 g que contenían 43,8 g de 17\beta-tert-butilcarbamoil-4-azaandrost-1-eno-3-ona (conversión del 35%).

Ejemplo 11

Se aplicó el procedimiento descrito en el Ejemplo 6, pero también se adoptaron los métodos descritos en los Ejemplos 7 y 9.

El producto cristalino bruto obtenido consistía en 151 g que contenían 35 g de 17\beta-tert-butilcarbamoil-4-azaandrost-1-eno-3-ona (conversión del 28%).

Ejemplo 12

Se aplicó el procedimiento descrito en el Ejemplo 6, pero también se adoptaron los métodos descritos en los Ejemplos 8 y 9.

El producto cristalino bruto obtenido consistía en 187 g que contenían 27,5 g de 17\beta-tert-butilcarbamoil-4-azaandrost-1-eno-3-ona (conversión del 22%).

Ejemplo 13

Se aplicó el procedimiento descrito en el Ejemplo 6, pero también se adoptaron los métodos descritos en los Ejemplos 7, 8 y 9.

El producto cristalino bruto obtenido consistía en 154 g que contenían 64 g de 17\beta-tert-butilcarbamoil-4-azaandrost-1-eno-3-ona (conversión del 80%).

Claims

1. Procedimiento para la preparación de compuestos de fórmula I

7

en la que R_{1} es un grupo -NH-tert-butilo o 4-metilpiperidino, por bioconversión de los compuestos de fórmula II

8

en la que R_{1} es un grupo -NH-tert-butilo o un grupo 4-metilpiperidino, por medio de un biocatalizador que tiene actividad esteroide-\Delta^{1}-deshidrogenasa, utilizando un inductor de la enzima, caracterizado porque se añade un estabilizador para mantener el nivel apropiado de enzima, un agente formador de complejos para acelerar la disolución continua del sustrato y un portador de electrones conocido para mejorar la bioconversión.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicho biocatalizador es una bacteria seleccionada del formado por Arthrobacter y Nocardia.

3. Procedimiento según la reivindicación 2, en el que dicha bacteria es Arthrobacter simplex.

4. Procedimiento según las reivindicaciones 1-3, en el que dicho biocatalizador es una bacteria seleccionada del grupo formado por Bacillus y Mycobacterium.

5. Procedimiento según las reivindicaciones 1-4, en el que dicho inductor es hidrocortisona.

6. Procedimiento según la reivindicación 5, en el que dicha hidrocortisona se usa en una concentración de aproximadamente 10 a aproximadamente 100 mg/l.

7. Procedimiento según las reivindicaciones 1-6, en el que dicho portador de electrones es seleccionado del grupo formado por naftoquinona, menadiona, bisulfito de menadiona y metosulfato de fenacina.

8. Procedimiento según la reivindicación 7, en el que dicho portador de electrones se añade en una concentración de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 3,5 g/l.

9. Procedimiento según las reivindicaciones 1-8, en el que dicho estabilizador es seleccionado del grupo formado por 5\alpha-androstanodiol o su derivado 17-metil, 13-etilgon-4-eno-3,17-diona o su derivado acetoxi o hidroxi, 9,11-deshidrohidrocortisona o su derivado acetato, estr-4-eno-3,17-diona o su derivado acetoxi o hidroxi y 13-etil-10,11\alpha-dihidroxigon-4-eno-3,17-diona.

10. Procedimiento según la reivindicación 9, en el que dicho estabilizador es 13-etil-10,11\alpha-dihidroxigon-4-eno-3,17-diona.

11. Procedimiento según las reivindicaciones 9 y 10, en el que dicho estabilizador se añade en una concentración de aproximadamente 10 a aproximadamente 100 mg/l.

12. Procedimiento según las reivindicaciones 1-11, en el que dicho agente formador de complejos es una ciclodextrina o un derivado de ciclodextrina seleccionado del grupo formado por \alpha-ciclodextrina, \beta-ciclodextrina, \gamma-ciclodextrina, metil-\beta-ciclodextrina e hidroxipropil-\beta-ciclodextrina.

13. Procedimiento según las reivindicaciones 1-12, en el que dicho agente formador de complejos es hidroxipropil-\beta-ciclodextrina en una concentración de aproximadamente 1 a aproximadamente 50 g/l.