AT513721B1 - Verfahren zur enzymatischen Regenerierung von Redoxkofaktoren - Google Patents

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Abstract

Verfahren zur enzymatischen Regenerierung der Redoxkofaktoren NAD+ /NADH undNADP+/NADPH in einer Ein-Topf-Reaktion, wobei als Resultat mindestens zweier weitererim selben Reaktionsansatz ablaufender enzymatisch katalysierter Redoxreaktionen(Produktbildungsreaktionen) einer der beiden Redoxkofaktoren in seiner reduzierten Formanfällt und der jeweils andere in seiner oxidierten Form, das dadurch gekennzeichnet, dass a)bei der Regenerierungsreaktion, die den reduzierten Kofaktor wieder in seine ursprünglicheoxidierte Form überführt, Sauerstoff oder eine Verbindung der allgemeinen FormelRtC(O)COOH reduziert wird, und b) bei der Regenerierungsreaktion, die den oxidiertenKofaktor wieder in seine ursprüngliche reduzierte Form überführt, eine Verbindung derallgemeinen Formel R2CH(OH)R3 oxidiert wird wobei in den Verbindungen Rt, R2 und R3verschiedene Bedeutungen haben.

Description

Sst«r«chsstte SKässHiartil: AT 513 721 B1 2014-09-15
Beschreibung
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
[0001] Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur enzymatischen Regenerierung der Redoxkofaktoren NAD7NADH und NADP7NADPH in einer Ein-Topf-Reaktion, wobei als Resultat mindestens zweier weiterer im selben Reaktionsansatz ablaufender enzymatisch katalysierter Redoxreaktionen (= Produktbildungsreaktionen) einer der beiden Redoxkofaktoren in seiner reduzierten Form anfällt und der jeweils andere in seiner oxidierten Form.
STAND DER TECHNIK
[0002] Enzymkatalysierte Redoxreaktionen werden in industriellen Prozessen beispielsweise in der Herstellung von chiralen Alkoholen, α-Aminosäuren und α-Hydroxysäuren verwendet. Die Mehrheit der Enzyme, die in industriellen Redoxreaktionen zum Einsatz kommen, verwendet Kofaktoren wie NADH oder NADPH. Unter den enzymatischen Redoxreaktionen sind jene besonders interessant, bei denen die Redox-Kofaktoren durch in situ Kofaktor-Regenerierungssysteme wiederhergestellt werden. Der Grund dafür liegt darin, dass die Verwendung von nur katalytischen Mengen der teuren Kofaktoren (NAD(P)+/NAD(P)H) möglich ist. Die Erreichbarkeit von geeigneten Dehydrogenasen und anderen Enzymen hat zur Entwicklung diverser Kofaktor-Regenerierungssysteme geführt.
[0003] Die bis jetzt beschriebenen Regenerationssysteme könnte man klassifizieren als: enzymgekoppelt, substratgekoppelt, in vivo (natürliche Kofaktor-Regenerierungssysteme in lebenden Organismen), photochemisch, chemisch oder elektro-enzymatisch. Das hier beschriebene Verfahren betrifft ein enzymgekoppeltes Regenerierungssystem. Vorteile von enzymgekoppelten Systemen sind die hohe Selektivität, die Anwendbarkeit zur Herstellung verschiedener Produkte und die hohe Wiederverwendungsrate des Kofaktors (total turnover number, TTN).
[0004] Mitte der 1990er Jahre wurde ein erster industrieller Prozess unter Verwendung eines enzymgekoppelten Kofaktor-Regenerierungssystems im Tonnen-Maßstab angewendet. In diesem Prozess wurde Formatdehydrogenase aus Candida boidinii eingesetzt. Die bisher bekannten industriellen Prozesse verwenden in der Regel ein Redoxenzym zur Produktsynthese sowie ein weiteres Enzym zur Kofaktor-Regenerierung.
[0005] Davon zu unterscheiden sind Verfahren, bei denen zwei oder mehr an der Produktbildung beteiligte enzymatische Redoxreaktionen und zwei enzymatische Systeme zur Kofaktor-Regenerierung (zeitgleich oder sequentiell) in einem Reaktionsansatz ablaufen, ohne dass ein Zwischenprodukt isoliert wird. In letzter Zeit haben solche enzymatischen Kaskadenreaktionen -hier als Ein-Topf-Reaktionen bezeichnet - signifikante Aufmerksamkeit erregt da sie effektiv Betriebskosten, Betriebszeit und Umweltauswirkungen reduzieren. Zusätzlich ermöglichen enzymatische Kaskaden von Redoxreaktionen Transformationen, die durch klassische chemische Verfahren nicht einfach umzusetzen sind.
[0006] Es ist allerdings eine Herausforderung, mehrere Reaktionen (Oxidation und Reduktion) in einer Ein-Topf-Reaktion mit paralleler Kofaktor-Regenerierung gleichzeitig durchzuführen, da oft sehr divergente Reaktionsbedingungen für die einzelnen Transformationen notwendig sind. Bis jetzt wurden nur sehr wenige Ein-Topf-Versuche umfassend Oxidations- und Reduktionsreaktionen mit zugehörigen Kofaktor-Regenerierungssystemen durchgeführt.
[0007] In der Literatur (Advanced Synth. Catal., 2008, Volume 351, Issue 9, pl303-1311) wurde der Versuch einer Ein-Topf-Reaktion unter Verwendung von 7a- Hydroxysteroiddehydrogenase (HSDH), 7ß-HSDH und 12a-HSDH beschrieben. In dem Verfahren wurde eine sowohl regiose-lektive als auch stereoselektive Oxidation an den Positionen 7 und 12 von Cholsäure durchgeführt, gefolgt von einer regio- und stereoselektiven Reduktion an Position 7. In dem Prozess wurde als Kofaktor-Regenerierungssystem sowohl eine Laktatdehydrogenase (NAD+-abhängig) als auch eine Glukosedehydrogenase (NADP+-abhängig) verwendet. Als Kosubstrate wurden Pyruvat und Glukose verwendet. Obwohl dieses Verfahren ursprünglich auf einen echten Ein- 1/29 ästeimdsiscte AT 513 721 B1 2014-09-15
Topf- Prozess abzielte, wurden letztendlich Oxidations- und Reduktionsreaktion getrennt ausgeführt. Dabei erfolgte die Aufteilung von oxidativen und reduktiven Schritten entweder in einem sogenannten „Teebeutel“-Reaktor oder im Membranreaktor. Diese Aufteilung war notwendig, um aufgrund der niedrigen Kofaktor-Selektivität von NADPH- Glukosedehydrogenase die Produktion von Nebenprodukten zu vermeiden. In der Ein-Topf- Reaktion setzte die Glukosedehydrogenase NADP+ aber teilweise auch NAD+ um, was die Oxidation behinderte. In dem beschriebenen Prozess wurden nur 12,5 mM (-0,5%) des Substrats Cholsäure eingesetzt, was den Prozess ökonomisch uninteressant macht.
[0008] Es wurde weiterhin ein Versuch beschrieben, die Deracemisierung von Racematen sekundärer Alkohole über ein prochirales Keton als Zwischenprodukt unter Verwendung eines Ein-Topf-Systems durchzuführen (J. Am. Chem. Soc., 2008, Volume 130, p13969- 13972). Die Deracemisierung von sekundären Alkoholen wurde über zwei Alkoholdehydrogenasen (S- und R-spezifisch) mit unterschiedlicher Kofaktor-Spezifizität erreicht. In dem System wurde NADP durch NADPH Oxydase (Wasserestoffperoxyd produzierende) und NADH durch Formiatdehyd-rogenase regeneriert. Als Kosubstrate wurden Formiat und Sauerstoff verwendet. In dem System wurden 4 Enzyme ohne Aufteilung von oxidativen und reduktiven Schritten eingesetzt. Ein Nachteil des Verfahren ist die sehr geringe Konzentration des eingesetzten Substrats von 0,2-0,5%, was für industrielle Zwecke nicht geeignet ist.
[0009] Ein weiteres Ein-Topf-System wurde in WO 2009/121785 A2 beschrieben. In dem Verfahren wurde ein Stereoisomer eines optisch aktiven sekundären Alkohols zum Keton oxidiert und dann zum entsprechenden optischen Antipoden reduziert, wobei zwei Alkoholdehydrogenasen mit entgegengesetzten Stereoselektivitäten und unterschiedlichen Kofaktor-Spezifitäten verwendet wurden. Die Kofaktoren wurde mittels eines sogenannten „Hydrid-Transfer-Systems“ unter Verwendung nur eines zusätzlichen Enzyms regeneriert. Um die Kofaktoren zu regenerieren wurden verschiedene Enzyme wie z.B. Formiatdehydrogenase, Glukosedehydrogenase, Lactatdehydrogenase verwendet. Ein Nachteil dieses Verfahrens ist die geringe Konzentration der verwendeten Substrate.
[0010] Der Nachteil der bis jetzt bekannten enzymatischen Ein-Topf-Verfahren mit Kofaktor-Regenerierungssystemen ist insgesamt die sehr geringe Substratkonzentration, was für industrielle Prozesse unwirtschaftlich ist.
[0011] I m Gegensatz dazu sind bereits viele einzelne enzymatische Redoxreaktionen bekannt, bei denen Kofaktor-Regenerierungssysteme verwendet werden. Die Versuche wurden mit ganzen Mikroorganismen, Zell-Lysaten oder isolierten Enzymen mit gleichzeitiger NAD(P)H-oder NAD(P)+-Regenerierung beschrieben. Bekannte enzymatische Kofaktor-Regenerierungssysteme für einzelne Redoxreaktionen beinhalten beispielsweise Formiatdehydrogenase für NADH (Formiat als Kosubstrat), Alkoholdehydrogenase aus Pseudomonas sp. für NADH (2-Propanol als Kosubstrat), Hydrogenase für NADH und NADPH (H2 als Kosubstrat), Glukose-6-phosphatdehydrogenase aus L. mesenteroides für NADPH (Glukose-6-phosphat als Kosubstrat), Glukosedehydrogenase für NADH und NADPH (Glukose als Kosubstrat), NADH Oxydase für NADH (02 als Kosubstrat) und Phosphitdehydrogenase für NADH (Phosphit als Kosubstrat).
[0012] Ein Anwendungsbeispiel solcher einzelner Redoxreaktionen ist die Herstellung chiraler Hydroxyverbindungen ausgehend von entsprechenden prochiralen Ketoverbindungen. In diesen Verfahren wird der Kofaktor mittels eines zusätzlichen Enzyms regeneriert. Diesen Verfahren ist gemeinsam, dass sie eine isolierte Reduktionreaktion darstellen und NAD(P)H regenerieren (siehe z.B. EP 1 152 054).
[0013] Enzymatische Verfahren unter Verwendung von Hydroxysteroiddehydrogenasen gekoppelt mit Kofaktor-Regenerierungssystem, die bei höheren Substratkonzentrationen (ca. >1%) ablaufen wurden beschrieben (EP 1 731 618; WO 2007/118644; Appl. Microbiol. Biotechnol., 2011 Volume 90 p127-135). In den Verfahren wurden die Kofaktoren NAD(P)H oder NAD(P) mittels verschiedene Enzyme wie zum Beispiel Laktatdehydrogenase (Pyruvat als Kosubstrat), Alkoholdehydrogenase aus T. brockii (Isopropanol als Kosubstrat), Alkoholdehydrogenase aus L. brevis, L. minor, Leuconostoc carnosum, T. ethanolicus, Clostridium beijerinckii regeneriert. 2/29
Ssterriichbcte pstäßSar»): AT 513 721 B1 2014-09-15
Diese bekannten Verfahren beziehen sich jedoch lediglich auf die isolierten Einzelreaktionen zur Oxidation von Hydroxyverbindung oder zur Reduktion von Oxoverbindung.
[0014] E in Kofaktor-Regenerierungssystem für NADH unter Verwendung von Malatdehydrogenase („Malatenzym“) wurde bereits beschrieben (Can. J. Chem. Eng. 1992, Volume 70, p 306-312). In der Publikation wurde es zur reduktiven Aminierung von Pyruvat durch Alanindehydrogenase verwendet. Das bei der Kofaktor-Regenerierung entstehende Pyruvat wurde anschließend in der produktbildenden Reaktion eingesetzt.
[0015] In der WO 2004/022764 ist ebenfalls beschrieben, NADH durch Malatdehydrogenase zu regenerieren. Anders als in der vorher beschriebenen Publikation wurde das bei der oxidativen Decarboxylierung von Malat entstehende Pyruvat nicht weiterverwendet.
[0016] E in Beispiel einer enzymatischen Reduktion von D-Xylose zu Xylitol mit Kofaktor-Regenerierungssystem wurde beschrieben (FEBS J., 2005, Volume 272, p 3816- 3827). Als Kofaktor-Regenerierungsenzym wurde eine NADPH-abhängige Mutante von Phosphitdehydrogenase aus Pseudomonas sp. verwendet. Auch hierbei handelt es sich um eine Einzelreaktion zur Produktbildung.
[0017] Weitere Beispiele einer enzymatischen Herstellung von chiralen enantiomerenangerei-cherten organischen Verbindungen, wie zum Beispiel Alkoholen oder Aminosäuren wurden beschrieben (Organic Letters, 2003, Volume 5, p. 3649-3650; US 7,163,815; Biochem. Eng. J., 2008, Volume 39(2) p. 319-327; EP 1 285 962). In den Systemen wurde als Kofakor- Regenerierungsenzym eine NAD(P)H-abhängige Oxidase aus Lactobacillus brevis oder Lactobacillus sanfranciscensis verwendet. Bei den Versuchen handelt es sich auch um Einzelreaktionen zur Produktbildung.
[0018] In WO 2011/000693 wird eine 17beta-Hydroxysteroiddehydrogenase sowie ein Verfahren beschrieben, mit dem es möglich ist, Redoxreaktionen an Position 17 von 4-Androsten-3,17- dion durchzuführen. Hierbei handelt es sich wiederum um eine isolierte Reduktionsreaktion. Es entfallen bei den genannten einzeln ablaufenden Oxidations- oder Reduktionsreaktionen die Vorteile einer Ein-Topf-Reaktion, wie z.B. Wirtschaftlichkeit durch Zeit- und Materialersparnis sowie besserer Umsatz durch enzymatische Kaskadenreaktionen.
AUFGABENSTELLUNG UND BESCHREIBUNG DES VERFAHRENS
[0019] Ziel der vorliegenden Erfindung war die Bereitstellung eines Verfahrens zur Regenerierung der Redox-Kofaktoren NAD7NADH und NADP+/NADPH, um damit zwei oder mehr enzymatisch katalysierte Redoxreaktionen in einem Reaktionsansatz wirtschaftlich durchzuführen.
[0020] Diese Aufgabe wird gemäß vorliegender Erfindung in einem Verfahren der eingangs genannten Art dadurch gelöst, dass ein Verfahren zur enzymatischen Regenerierung der Re-doxkofaktoren NAD7NADH und NADP7NADPH in einer Ein-Topf-Reaktion, wobei als Resultat mindestens zweier weiterer im selben Reaktionsansatz ablaufender enzymatisch katalysierter Redoxreaktionen (Produktbildungsreaktionen) einer der beiden Redoxkofaktoren in seiner reduzierten Form anfällt und der jeweils andere in seiner oxidierten Form, bereitgestellt wird, das dadurch gekennzeichnet ist dass [0021] a) bei der Regenerierungsreaktion, die den reduzierten Kofaktor wieder in seine ursprüngliche oxidierte Form überführt, Sauerstoff oder eine Verbindung der allgemeinen Formel Ö
O worin R-ι für eine geradkettige oder verzweigtkettige (Ci-C4)-Alkylgruppe oder für eine (C1-C4)-Carboxyalkylgruppe steht, reduziert wird, und 3/29
fctefreichisdies ßsfcttM: AT 513 721 B1 2014-09-15 [0022] b) bei der Regenerierungsreaktion, die den oxidierten Kofaktor wieder in seine ursprüngliche reduzierte Form überführt, ein (C4-C8)-Cycloalkanol oder eine Verbindung der allgemeinen Formel
worin R2 und R3 unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus H, (CrC6)-Alkyl, worin Alkyl geradkettig oder verzweigt ist, (CrC6)-Alkenyl, worin Alkenyl geradkettig oder verzweigt ist und ein bis drei Doppelbindungen enthält, Aryl, insbesondere C6-C12 Aryl, Carboxyl, oder (Ci-C4)-Carboxyalkyl, insbesondere auch Cycloalkyl, z.B. C3-C8 Cycloalkyl, oxidiert wird.
[0023] Ein Verfahren, das gemäß vorliegender Erfindung bereitgestellt wird, wird hierin auch als „Verfahren gemäß (nach) vorliegender Erfindung“ bezeichnet.
[0024] In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren gemäß vorliegender Erfindung zur enzymatischen Regenerierung der Redoxkofaktoren NAD+/NADH und NADP7NADPH in einer Ein-Topf-Reaktion, wobei als Resultat mindestens zweier weiterer im selben Reaktionsansatz ablaufender enzymatisch katalysierter Redoxreaktionen (=Produktbildungsreaktionen) einer der beiden Redoxkofaktoren in seiner reduzierten Form anfällt und der jeweils andere in seiner oxidierten Form, zur Verfügung, dass dadurch gekennzeichnet, dass [0025] a) bei zur Regenerierung des oxidierten Kofaktors eine Verbindung der allgemeinen Formel I reduziert wird, 0
O wobei Ri für eine substituierte oder unsubstituierte C1-C4-Alkylgruppe steht, und [0026] b) bei der Regenerierung des reduzierten Kofaktors eine Verbindung der allgemeinen Formel II oxidiert wird,
li wobei R2 und R3 unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus [0027] 1) -H, [0028] 2) -(CrC6)-Alkyl, worin Alkyl geradkettig oder verzweigtkettig ist, [0029] 3) -(CrC6)-Alkenyl, worin Alkenyl geradkettig oder verzweigtkettig ist und gegebenenfalls bis zu drei Doppelbindungen enthält, [0030] 4) -Cycloalkyl, insbesondere C3-C8 Cycloalkyl, [0031] 5) -Aryl, insbesondere C6-C12 Aryl, [0032] 6) -(CrC4)-Carboxyalkyl, falls es sich bei Verbindung I um Pyruvat handelt, gege benenfalls auch Carboxyl.
[0033] In einem weiteren Aspekt sind in einem Verfahren gemäß vorliegender Erfindung R2und R3 unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus H, (Ci-C8)-Alkyl, worin Alkyl geradkettig oder verzweigt ist, (CrC8)-Alkenyl, worin Alkenyl geradkettig oder verzweigt ist 4/29 5>«ssßisrti(: AT 513 721 B1 2014-09-15 und ein bis drei Doppelbindungen enthält, Aryl, insbesondere C6-Ci2 Aryl, Carboxyl, oder (Cr C4)-Carboxyalkyl.
[0034] Gegenüber dem Stand der Technik stellt ein Verfahren gemäß vorliegender Erfindung eine wesentliche Verbesserung von Verfahren dar, bei denen Verbindungen sowohl enzymatisch oxidiert als auch reduziert werden, da es damit ermöglicht wird, die nötigen Oxidationsund Reduktionsreaktionen sowie die zugehörigen Reaktionen zur Kofaktor-Regenerierung in einem Reaktionsansatz ablaufen zu lassen und gleichzeitig wesentlich höhere Substratkonzentrationen einzusetzen als dies im Stand der Technik der Fall ist.
[0035] In einem Verfahren gemäß vorliegender Erfindung werden die Kofaktoren NADH und NADPH eingesetzt. Dabei bezeichnet NAD+ die oxidierte Form und NADH die reduzierte Form von Nicotinamidadenindinucleotid während NADP+ die oxidierte Form und NADPH die reduzierte Form von Nicotinamidadenindinucleotidphosphat bezeichnen.
[0036] Als „Oxidationsreaktion(en)“ und „Reduktionsreaktion(en)“ werden hier diejenigen enzymkatalysierten Redoxreaktionen bezeichnet, die nicht Teil der Kofaktor-Regenerierung sind und in einem Verfahren gemäß vorliegender Erfindung an der Bildung des Produkts beteiligt sind. „Oxidationsreaktion(en)“ und „Reduktionsreaktion(en)“ sind unter dem Begriff „Produktbildungsreaktionen“ zusammengefasst. Die Produktbildungsreaktionen in einem Verfahren gemäß vorliegender Erfindung beinhalten jeweils mindestens eine Oxidationsreaktion sowie mindestens eine Reduktionsreaktion.
[0037] Wird NAD+ als Kofaktor für die Oxidationsreaktion(en) verwendet so ist NADPH der Kofaktor für die Reduktionsreaktion(en). Wird NADP+ als Kofaktor für die Oxidationsreaktion(en) verwendet so ist NADH der Kofaktor für die Reduktionsreaktion(en). In einem Verfahren gemäß vorliegender Erfindung können Oxidationsreaktion(en) und Reduktionsreaktion(en) entweder zeitlich parallel oder zeitlich nacheinander, bevorzugt zeitlich parallel im selben Reaktionsansatz durchgeführt werden.
[0038] Als Substrate werden hier diejenigen Verbindungen bezeichnet, die mit dem Ziel der Produktbildung eingesetzt werden. Als Kosubstrate werden hier diejenigen Verbindungen bezeichnet, die bei der Kofaktor-Regenerierung umgesetzt werden.
[0039] In einem Verfahren gemäß vorliegender Erfindung können sowohl ein Substrat, als auch mehrere Substrate eingesetzt werden. Dabei können Reduktions- und/oder Oxidationsreakti-on(en) sowohl am selben Substrat (Molekülgrundgerüst), als auch an verschiedenen Substraten, bevorzugt am selben Substrat, erfolgen. Weiterhin können in einem Verfahren gemäß vorliegender Erfindung Reduktions- und/oder Oxidationsreaktion an derselben oder an verschiedenen funktionellen Gruppen stattfinden.
[0040] Ein Verfahren gemäß vorliegender Erfindung eignet sich für eine Vielzahl von Reaktionen, beispielsweise zur Konfigurationsumkehr stereoisomerer Hydroxyverbindungen mittels Oxidation zum entsprechenden Keton und darauffolgender Reduktion zur entgegengesetzt stereospezifischen Hydroxyverbindung.
[0041] Unter „Ein-Topf-Reaktion“ wird hier ein Verfahren bezeichnet, bei dem zwei oder mehr an der Produktbildung beteiligte enzymatische Redoxreaktionen und zwei enzymatische Systeme zur Kofaktor-Regenerierung in einem Reaktionsansatz ablaufen, ohne dass ein Zwischenprodukt isoliert wird.
[0042] Die Nennung einer Säure oder des Salzes einer Säure schließt hier den jeweils nicht genannten Begriff ein. Ebenfalls schließt die Nennung von Säuren, insbesondere Gallensäuren, hier alle davon abgeleiteten Ester mit ein. Weiter sind hier (partiell) mit Schutzgruppen versehene Verbindungen bei der Nennung der zugrundeliegenden Substanzen mit eingeschlossen. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren gemäß vorliegender Erfindung dadurch gekennzeichnet, dass Oxidationsreaktion und Reduktionsreaktion zeitlich parallel ablaufen.
[0043] In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren 5/29
österreichisches pslaitsnit AT 513 721 B1 2014-09-15 gemäß vorliegender Erfindung dadurch gekennzeichnet, dass sowohl Oxidationsreaktion als auch Reduktionsreaktion am selben Molekülgrundgerüst stattfinden.
[0044] In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren gemäß vorliegender Erfindung dadurch gekennzeichnet, dass als Verbindung der Formel I (2-Oxosäure) Pyruvat (Kosubstrat) eingesetzt wird, welches mittels einer Laktatdehydrogenase zu Laktat reduziert wird, das heisst, dass bei der Regenerierungsreaktion, die den reduzierten Kofaktor wieder in seine ursprüngliche oxidierte Form überfuhrt mittels einer Laktatdehydrogenase Pyruvat zu Laktat reduziert wird.
[0045] In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren gemäß vorliegender Erfindung dadurch gekennzeichnet, dass als Verbindung der Formel II (sekundärer Alkohol) 2-Propanol (Isopropylalkohol, IPA) (Kosubstrat) eingesetzt wird, welches mittels einer Alkoholdehydrogenase zu Aceton oxidiert wird, das heisst, dass bei der Regenerierungsreaktion, die den oxidierten Kofaktor wieder in seine ursprüngliche reduzierte Form überführt mittels einer Alkoholdehydrogenase 2-Propanol zu Aceton oxidiert wird.
[0046] In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren gemäß vorliegender Erfindung dadurch gekennzeichnet, dass Sauerstoff eingesetzt wird, welcher mittels einer NADH Oxidase reduziert wird.
[0047] In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren gemäß vorliegender Erfindung dadurch gekennzeichnet, dass als sekundärer Alkohol Malat (Kosubstrat) eingesetzt wird, welches mittels einer Oxalacetat-decarboylierenden Malatdehydrogenase („Malatenzym“) zu Pyruvat und C02 oxidiert wird, z.B. dass bei der Regenerierungsreaktion, die den oxidierten Kofaktor wieder in seine ursprüngliche reduzierte Form überführt mittels einer Malatdehydrogenase Malat zu Pyruvat und C02 oxidiert wird.
[0048] Das entstehende Pyruvat wird bei dieser Ausführungsform in einer weiteren Redoxreaktion umgesetzt, die nicht zur Produktbildung dient, sondern die zweite Kofaktor-Regenerierungsreaktion darstellt.
[0049] In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren gemäß vorliegender Erfindung dadurch gekennzeichnet, dass es eingesetzt wird zur Durchführung von jeweils mindestens einer Oxidationsreaktion und mindestens einer Reduktionsreaktion im selben Reaktionsansatz an Verbindungen der allgemeinen Formel
II! worin [0050] R4 Wasserstoff, eine Methylgruppe, eine Hydroxygruppe oder eine Oxogruppe, [0051] R5 Wasserstoff, eine Hydroxygruppe, eine Oxogruppe oder eine Methylgruppe, [0052] R6 Wasserstoff oder eine Hydroxygruppe, [0053] R7 Wasserstoff, - COR13, worin R13 eine unsubstituierte oder mit einer Hydroxygruppe substituierte CrC4-Alkylgruppe ist, oder eine substituierte, insbesondere mit einer Hydroxygruppe, oder unsubstituierte CrC4 Carboxyalkylgruppe, oder R6, und R7 zusammen eine Oxogruppe bedeuten, [0054] R8 Wasserstoff, eine Methylgruppe, eine Hydroxygruppe oder eine Oxogruppe, 6/29
österreichisches fStHitSKit AT 513 721 B1 2014-09-15 [0055] R9 Wasserstoff, eine Methylgruppe, eine Hydroxygruppe oder eine Oxogruppe, [0056] Rio Wasserstoff, eine Methylgruppe oder ein Halogen, [0057] Rn Wasserstoff, eine Methylgruppe, eine Hydroxygruppe, eine Oxogruppe oder Halogen, und [0058] R12 Wasserstoff, eine Hydroxygruppe, eine Oxogruppe oder eine Methylgruppe bedeuten, wobei das Strukturelement
einen Benzolring oder einen Ring mit 6 Kohlenstoffatomen und 0,1 oder 2 C-C- Doppelbindungen bedeutet; wobei bevorzugt das Substrat/die Substrate für die an der Produktbildung beteiligte(n) Redukti-onsreaktion(en) in einer Konzentration von <5% (w/v) im Reaktionsansatz vorliegt/vorliegen.
[0059] In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren gemäß vorliegender Erfindung dadurch gekennzeichnet, dass eine enzymatische Umwandlung von Dehydroepiandrosteron (DHEA) zu Testosteron erfolgt.
[0060] In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren gemäß vorliegender Erfindung dadurch gekennzeichnet, dass eine enzymatische Epimerisierung der Hydroxysteroidverbindung 3a,7a-Dihydroxy-5ß-cholansäure (Chenodeoxycholsäure, CDC) durch Oxidation zu Ketolithocholsäure (KLC) und Reduktion zu 3a,7ß-Dihydroxy-5ß-cholansäure (Ursodeoxycholsäure, UDC) mittels zweier entgegengesetzt stereospezifischer Hydroxysteroiddehydrogenasen erfolgt.
[0061] In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren gemäß vorliegender Erfindung dadurch gekennzeichnet, dass ein C5- oder C6-Zucker als Substrat eingesetzt wird, z.B. dass das Verfahren zur Isomerisierung von C5- oder C6-Zuckern eingesetzt wird.
[0062] In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren gemäß vorliegender Erfindung dadurch gekennzeichnet, dass eine Isomerisierung von Glukose durch Reduktion zu Sorbitol und Oxidation zu Fruktose erfolgt, z.B. dass das Verfahren eingesetzt wird zur Isomerisierung von Glukose durch Reduktion zu Sorbitol und nachfolgende Oxidation zu Fruktose. Ein Verfahren gemäß vorliegender Erfindung wird bevorzugt in einem wässrigen System durchgeführt, wobei es möglich ist, dass das Substrat für Oxidations- und Reduktionsreaktion zum Teil ungelöst in Form einer Suspension und/oder als zweite flüssige Phase vorliegt.
[0063] In einer besonderen Ausführungsform ist ein Verfahren gemäß vorliegender Erfindung dadurch gekennzeichnet, dass das Substrat/die Substrate für die an der Produktbildung beteiligtein) Oxidationsreaktion(en) in einer Konzentration von mindestens 5% (w/v) und mehr, bevorzugt 7% (w/v) und mehr, insbesondere bevorzugt 9% (w/v) und mehr im Reaktionsansatz vorliegt/vorliegen.
[0064] In einer besonderen Ausführungsform ist ein Verfahren gemäß vorliegender Erfindung dadurch gekennzeichnet, dass bei den Produktbildungsreaktionen insgesamt ein Umsatz von >70%, insbesondere >90% erreicht wird.
[0065] In einem Verfahren gemäß vorliegender Erfindung kann dem wässrigen System ein Puffer zugesetzt werden. Geeignete Puffer sind zum Beispiel Kaliumphosphat, Tris-HCI und Glycin mit einem pH-Wert von 5 bis 10, vorzugsweise von 6 bis 9. Weiters, oder alternativ können dem System Ionen zur Stabilisierung der Enzyme, wie zum Beispiel Mg2+ oder sonstige Zusätze, wie zum Beispiel Glycerin zugesetzt werden. Die Konzentration der zugesetzten 7/29
Ssterriichbcte pstäßSar»): AT 513 721 B1 2014-09-15
Kofaktoren NAD(P)+ und NAD(P)H beträgt in einem Verfahren gemäß vorliegender Erfindung üblicherweise zwischen 0,001 mM und 10 mM, vorzugsweise zwischen 0,01 mM und 1 mM.
[0066] Abhängig von den verwendeten Enzymen kann das Verfahren gemäß vorliegender Erfindung bei einer Temperatur von 10°C bis 70°C, vorzugsweise von 20°C bis 45°C durchgeführt werden.
[0067] Unter Hydroxysteroiddehydrogenasen (HSDH) versteht man solche Enzyme, die die Oxidation von Hydroxygruppen zu den entsprechenden Ketogruppen oder umgekehrt die Reduktion von Ketogruppen zu den entsprechenden Hydroxygruppen am Steroidgerüst katalysieren. Geeignete Hydroxysteroiddehydrogenasen, die für Redoxreaktionen an Hydroxysteroiden eingesetzt werden können, sind zum Beispiel 3 α-HSDH, 3ß-HSDH, 7 a-HSDH, 7ß-HSDH oder 17ß-HSDH.
[0068] Geeignete Enzyme mit 7a-HSDH-Aktivität sind zum Beispiel erhältlich aus Clostridien (Clostridium absonum, Clostridium sordelii), Escherichia coli oder Bacteroides fragilis.
[0069] Geeignete Enzyme mit 7ß-HSDH-Aktivität sind zum Beispiel erhältlich aus Ruminococ-cus sp. oder Clostridium absonum.
[0070] Geeignete Laktatdehydrogenasen sind zum Beispiel erhältlich aus Oryctolagus cunicu-lus.
[0071] Geeignete Alkoholdehydrogenasen sind zum Beispiel erhältlich aus Lactobacillus kefir.
[0072] Eine geeignete Xylosereduktase ist zum Beispiel erhältlich aus Candida tropicalis.
[0073] Geeignete Sorbitoldehydrogenasen sind zum Beispiel erhältlich aus Schafsleber, Bacillus subtilis oder Malus domestica.
[0074] Geeignete NADH Oxidasen sind zum Beispiel erhältlich aus Leuconostoc mesenteroi-des, Streptococcus mutans, Clostridium aminovalericum.
[0075] Enzyme werden in einem Verfahren gemäß vorliegender Erfindung bevorzugt als in E. coli rekombinant überexprimierte Proteine verwendet, wobei weiterhin bevorzugt die entsprechenden Zell-Lysate ohne weitere Aufreinigung eingesetzt werden. Die Enzym-Einheit 1 U entspricht dabei derjenigen Enzymmenge, die benötigt wird, um 1 pmol Substrat pro min umzusetzen.
BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN
[0076] Fig. 1 zeigt das Reaktionsschema der Epimerisierung von Chenodeoxy-cholsäure zu Ursodeoxycholsäure über das Zwischenprodukt 3a-Hydroxy-7oxo-5ß-cholansäure mit Kofaktor-Regenerierung unter Verwendung von 2-Propanol und Pyruvat. [0077] Fig.2 zeigt das Reaktionsschema der Epimerisierung von Chenodeoxy-cholsäure zu Ursodeoxycholsäure über das Zwischenprodukt 3a-Hydroxy-7oxo-5ß-cholansäure mit Kofaktor-Regenerierung unter Verwendung von Malat und Pyruvat. [0078] Fig. 3 zeigt das Reaktionsschema der Epimerisierung von Chenodeoxy-cholsäure zu Ursodeoxycholsäure über das Zwischenprodukt 3a-Hydroxy-7oxo-5ß-cholansäure mit Kofaktor-Regenerierung unter Verwendung von 2-Propanol und Sauerstoff. [0079] Fig. 4 zeigt das Reaktionsschema der Isomerisierung von Glukose zu Fruktose mit Kofaktor-Regenerierung unter Verwendung von 2-Propanol und Pyruvat. [0080] Fig. 5 zeigt das Reaktionsschema der Isomerisierung von Glukose zu Fruktose mit Kofaktor-Regenerierung unter Verwendung von 2-Propanol und Sauerstoff. 8/29 k Ssterpekhlifc ^ »stäßSs«}!: AT 513 721 B1 2014-09-15 [0081] Fig. 6 zeigt das Reaktionsschema der Epimerisierung von Cholsäure zu 3a,7ß-Dihydroxy- 12-oxo-5ß-cholansäure über die Zwischenprodukte 3a,7a-Dihydroxy-12-oxo-5ß-cholansäure und 3a-Hydroxy-7,12-dioxo-5ß-cholansäure mit Kofaktor-Regenerierung unter Verwendung von 2-Propanol und Pyruvat.
[0082] Fig. 7 zeigt das Reaktionsschema der Epimerisierung von Cholsäure zu 3a,7ß-Dihydroxy- 12-oxo-5ß-cholansäure über die Zwischenprodukte 3a,7a-Dihydroxy-12-oxo-5ß-cholansäure und 3a-Hydroxy-7,12-dioxo-5ß-cholansäure mit Kofaktor-Regenerierung unter Verwendung von 2-Propanol und Sauerstoff.
[0083] Fig. 8 und Fig. 9 zeigen Reaktionsschemata der Epimerisierung von Cholsäure zu 3a,7ß- Dihydroxy-12-oxo-5ß-cholansäure über die Zwischenprodukten 3a,7a-Dihydroxy-12-oxo- 5ß-cholansäure und 3a-Hydroxy-7,12-dioxo-5ß-cholansäure mit Kofaktor-Regenerierung unter Verwendung von 2-Propanol, Pyruvat und Sauerstoff.
[0084] Fig. 10 zeigt die möglichen Reaktionswege der Epimerisierung von Cholsäure zu 3a,7ß- Dihydroxy-12-oxo-5ß-cholansäure über verschiedene Zwischenprodukten mit Kofaktor-Regenerierungssystemen. Um NAD+ wiederherzustellen wurden abwechselnd Laktatdehydrogenase (Pyruvat als Substrat) und NADH Oxidase (Sauerstoff als Substrat) eingesetzt. Um NADPH zu regenerieren wurde Alkoholdehydrogenase (Isopropanol als Substrat) eingesetzt.
[0085] Fig. 11 zeigt das Reaktionsschema der Epimerisierung von Chenodeoxy-cholsäure zu Ursodeoxycholsäure über das Zwischenprodukt 3a-Hydroxy-7oxo-5ß-cholansäure (7- Ketolithocholsäure = 7K-LCA = KLC) mit Kofaktor-Regenerierung unter Verwendung von 2-Propanol und 2-Pentanol (jeweils Alkoholdehydrogenase) sowie Pyruvat (Laktat-Dehydrogenase) und Sauerstoff (NADH-Oxidase).
[0086] In den Abbildungen werden die folgenden Abkürzungen verwendet: [0087] BsSDH = Sorbitol-Dehydrogenase aus Bacillus subtilis [0088] CA = 3α,7a, 12a-T rihydroxy-5ß-cholansäure [0089] 7ß-CA = 3a,12a7ß-Trihydroxy-5ß-cholansäure [0090] Caoxo = Clostridium aminovalericum NADH Oxidase [0091] CDC = 3a,7a-Dihydroxy-5ß-cholansäure [0092] CDCA = 3a,7a-Dihydroxy-5ß-cholansäure [0093] CtXR = Candida tropicalis Xylosereduktase [0094] 7a-HSDH = 7a- Hyd roxysteroi dd ehyd rogen ase [0095] 12a-HSDH - 12a-Hydroxysteroiddehydrogenase [0096] 7ß-HSDH = 7ß-Hydroxysteroiddehydrogenase [0097] KLC = 3a-Hydroxy-7-oxo- 5ß-cholansäure [0098] 7K-LCA = 3a-Hydroxy-7-oxo- 5ß-cholansäure [0099] LacDH = Laktatdehydrogenase NAD(H)-abhängig [00100] LkADH = Lactobacillus kefir Alkoholdehydrogenase NADP(H)-abhängig [00101] Lmoxid = Leuconostoc mesenteroides NADH-Oxidase [00102] MalDH = E. coli Malatdehydrogenase NADP(H)-abhängig 9/29
Ssterriichbcte pstäßSar»):
[00103] 7oxo-CA [00104] 12oxo-CDC [00105] 12oxo-KLC [00106] 12oxo-UDC [00107] SISDH [00108] SmOxo [00109] UDC [00110] UDCA AT 513 721 B1 2014-09-15 3a, 12 a-Dihydroxy-7-oxo-5ß-cholansäure 3a,7a-Dihydroxy-12-oxo-5ß-cholansäure 3a-Hydroxy-7,12-dioxo-5ß-cholansäure 3a,7ß-Dihydroxy-12-oxo-5ß-cholansäure Schafsleber-Sorbitoldehydrogenase Streptococcus mutans NADH Oxidase 3a,7ß-Dihydroxy-5ß-cholansäure 3a,7ß-Dihydroxy-5ß-cholansäure [00111] In den nachfolgenden Beispielen sind alle Tempreaturangaben in Grad Celsius (°C). Die folgenden Abkürzungen werden verwendet: [00112] EtOAc Ethylacetat [00113] H Stunde(n) [00114] IPA Isopropylalkohol (2-Propanol) [00115] MeOH Methanol [00116] Rt Raumtemperatur [00117] Beispiel 1 [00118] Epimerisierung von Chenodeoxycholsäure zu Ursodeoxycholsäure durch 7a-Hydroxy-steroiddehydrogenase und 7ß-Hydroxysteroiddehydrogenase unter der Verwendung eines Laktatdehydrogenase- und Alkoholdehydrogenase-abhängigen Kofaktor-Regenerierungssystems [00119] Ein 0,5 ml-Ansatz enthält 50 mg Chenodeoxycholsäure, 12 U der rekombinanten 7 a-Hydroxysteroiddehydrogenase aus Escherichia coli, 6 U der rekombinanten 7ß- Hydroxystero-iddehydrogenase aus Ruminococcus torques sowie 0,5 mM NAD+ und 0,3 mM NADPH. Zur Regenerierung von NAD+ werden 6 U rekombinante Laktatdehydrogenase und 350 mM Natrium-Pyruvat eingesetzt. Für die Regenerierung von NADPH werden 6 U der rekombinanten Alkoholdehydrogenase aus Lactobacillus kefir und anfänglich 2.4% IPA (w/v) eingesetzt. Die Reaktion wird in einem wässrigen Kaliumphosphatpuffer (100 mM, pH = 7,8) bei 25°C und unter kontinuierlichem Schütteln (850 rpm) durchgeführt. Es wird weiterhin ein offenes System verwendet, um die Verdampfung von Aceton zu ermöglichen und die Reaktion in Richtung Ursodeoxycholsäure zu verschieben. Es werden 1,6% (w/v) IPA nach 6 h, 2,4% (w/v) IPA nach 16 h, 3,9% (w/v) IPA nach 24 h und 0,8% (w/v) IPA nach 40 h nachdosiert. Außerdem werden nach 24 h 20 μΙ 4-Methyl-2-pentanol zugegeben. Nach 46 h werden 200 μΙ 2-Pentanol, sowie 1,6% (w/v) IPA zugegeben. Nach 48 h beträgt der Anteil von Ursodeoxycholsäure an allen Gallensäuren in der Reaktionsmischung >97%.
[00120] Beispiel 2 [00121] Epimerisierung von Chenodeoxycholsäure zu Ursodeoxycholsäure durch 7a-Hydro-xysteroiddehydrogenase und 7ß-Hydroxysteroiddehydrogenase unter der Verwendung eines Laktatdehydrogenase- und Malatdehydrogenase-abhängigen Kofaktor-Regenerierungssystems [00122] Ein 0,5 ml-Ansatz enthält 50 mg Chenodeoxycholsäure, 20 U der rekombinanten 7a-Hydroxysteroiddehydrogenase aus Escherichia coli, 20 U der rekombinanten 7ß- Hydroxystero-iddehydrogenase aus Ruminococcus torques sowie 1 mM NAD+ und 1 mM NADPH.
[00123] Zur Regenerierung von NAD+ werden 10 U der Laktatdehydrogenase (Sigma-Aldrich) und zum Start der Reaktion 16,5 mM Natrium-Pyruvat eingesetzt. Für die Regenerierung von NADPH werden 20 U der rekombinanten Malatdehydrogenase aus Escherichia coli und 320 10/29 ?<ste.'f«cfeäies paififtisiiii: AT 513 721 B1 2014-09-15 mM Natrium-Malat eingesetzt. Die Reaktion wird in einem wässrigen Kaliumphosphatpuffer (100 mM, pH = 7,8) bei 25°C und unter kontinuierlichem Schütteln (850 rpm) durchgeführt. Es wird weiterhin ein offenes System verwendet, um ein Entweichen des entstehenden C02 zu ermöglichen. Es wurden 20 U 7a-HSDH sowie 10 U Laktatdehydrogenase nach 16 h und 40 h nachdosiert. Es wurden 10 7ß-HSDH nach 20 h, 24 h, 44 h und 48 h nachdosiert. Weiterhin wurden 10 U Malatdehydrogenase nach 40 h nachdosiert. Nach 72 h beträgt der Anteil von Ursodeoxycholsäure an allen Gallensäuren in der Reaktionsmischung ca. 90%.
[00124] Beispiel 3 [00125] Epimerisierung von Chenodeoxycholsäure zu Ursodeoxycholsäure durch 7a-Hydro-xysteroiddehydrogenase und 7ß-Hydroxysteroiddehydrogenase unter der Verwendung eines NADH Oxidase- und Alkoholdehydrogenase-abhängigen Kofaktor-Regenerierungssystems [00126] Ein 0,5 ml-Ansatz enthält 50 mg Chenodeoxycholsäure, 12 U der rekombinanten 7 a-Hydroxysteroiddehydrogenase aus Escherichia coli, 7,5 U der rekombinanten 7ß- Hydroxystero-iddehydrogenase aus Ruminococcus torques sowie 1 mM NAD+ und 1 mM NADPH. Zur Regenerierung von NAD+ werden 20 U der rekombinanten NADH-Oxidase aus Clostridium aminova-lericum eingesetzt. Für die Regenerierung von NADPH werden 5 U der rekombinanten Alkoholdehydrogenase aus Lactobacillus kefir und anfänglich 2 % IPA (w/v) eingesetzt. Die Reaktion wird in einem wässrigen Kaliumphosphatpuffer (100 mM, pH 6) bei 25°C und unter kontinuierlichem Schütteln (850 rpm) durchgeführt. Es wird weiterhin ein offenes System verwendet, um die Verdampfung von Aceton zu ermöglichen und die Reaktion in Richtung Ursodeoxycholsäure zu verschieben. Es werden 2% IPA nach 18 h, 22 h, 26 h und 41h sowie 5% IPA nach 41h und 48 h nachdosiert. Nach 24 h werden 20 U NADH-Oxidase und nach 41 h 7,5 U 7ß-Hydroxyste-roiddehydrogenase sowie 5 U Alkoholdehydrogenase nachdosiert. Nach 48 h beträgt der Anteil von Ursodeoxycholsäure an allen Gallensäuren in der Reaktionsmischung ca. 95-98%.
[00127] Beispiel 4 [00128] Aufarbeitung und Analytik der Gallensäuren [00129] Nach Beendigung von Reaktionen, wie sie in den Beispielen 1 bis 3 beschrieben sind, wird das Reaktionsgemisch mit EtOAc extrahiert. Das Lösungsmittel wird anschließend mittels Abdampfens entfernt. Die Umsetzung der Chenodeoxycholsäure zu Ursodeoxycholsäure wird nach dem Lösen in einer Mischung von MeOH:Acetonitril:Natriumphosphatpuffer pH = 3, 0,78 g/l (40:30:37), mittels HPLC verfolgt. Dabei wird eine Reversed-Phase-Trennsäule (ZORBAX®Eclipse® XDB C18, Fluss 0,8 ml/min) und ein Lichtbrechungsdetektor (RID), Agilent 1260 Infinity®, beide von Agilent Technologies Inc., benutzt.
[00130] Beispiel 5 [00131] Umsatz von Glucose zu Fructose durch eine Xylosereduktase und eine Sorbitoldehyd-rogenase unter der Verwendung einer Alkoholdehydrogenase zum Recycling des NADPH und einer Lactatdehydrogenase zum Recycling des NAD+ [00132] Ein 0,5 ml Ansatz enthält 50 mg/ml Glucose und 6 U/ml der rekombinanten Xylosereduktase aus Candida tropicalis und 0,1 mM NADP+. Zur Regeneration des Kofaktors werden 7% IPA und die rekombinante Alkoholdehydrogenase aus Lactobacillus kefir zugefugt. Die Enzyme werden in Form von Zelllysat eingesetzt. Die Reaktion findet für 24 h bei 40° C und pH = 9 unter kontinuierlichem Schütteln (900 rpm) in einem offenem System statt. Das offene System führt zur Entfernung des Acetons, was die Reaktion in Richtung Sorbitol- Bildung treibt. Im offenen System verdampfen Wasser und IPA ebenfalls, sodass diese nach 6 h und 21h nachdosiert werden. Nach 24 h wird das Reaktionsgefaß bei 60°C unter Vakuum inkubiert, um die Enzyme zu deaktivieren und die organischen Lösungsmittel zu verdampfen. Nach dem Abkühlen auf Rt werden die rekombinante Sorbitoldehydrogenase aus Bacillus subtilis in einer Endkonzentration von 5 U/ml, ZnCI2 in einer Endkonzentration von 1 mM und NAD+ in einer Endkonzentration von 0,1 mM zugefügt. Zur Kofaktor-Regenerierung werden 5 U/ml (Endkonzentration) Lactat-Dehydrogenase aus Kaninchenmuskel und 300 mM Pyruvat eingesetzt. Der Ansatz wird auf 0,5 ml mit Wasser aufgefüllt. Die Reaktion findet für 24 h bei 40°C und pH = 9 unter 11 /29 ?<ste.'f«cfeäies paififtisiiii: AT 513 721 B1 2014-09-15 kontinuierlichem Schütteln (900 rpm) im geschlossenem System statt. Es wird ein Umsatz von >90% erreicht.
[00133] Beispiel 6 [00134] Umsatz der Glucose zu Fructose durch eine Xylosereduktase und eine Sorbitoldehyd-rogenase unter der Verwendung einer Alkoholdehydrogenase zum Recycling des NADPH und einer Oxidase zum Recycling des NAD+ [00135] Ein 0,5 ml Ansatz enthält 50 mg/ml Glucose, 6 U/ml der rekombinanten Xylosereduktase aus Candida tropicalis und 0,1 mM NADP+. Zur Regeneration des Kofaktors werden 7% IPA und die rekombinante Alkoholdehydrogenase aus Lactobacillus kefir zugefügt. Die Enzyme werden in Form von Zelllysat eingesetzt. Die Reaktion findet für 24 h bei 40°C und pH = 8 unter kontinuierlichem Schütteln (900 rpm) in einem offenem System statt. Das offene System führt zur Entfernung des Acetons, was die Reaktion Richtung Sorbitol- Bildung treibt. Im offenen System verdampfen Wasser und IPA ebenfalls, sodass diese nach 6 h und 21h nachdosiert werden. Nach 24 h wird das Reaktionsgefaß bei 60°C unter Vakuum inkubiert, um die Enzyme zu deaktivieren und IPA, sowie entstandenes Aceton zu verdampfen. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur werden die rekombinante Sorbitoldehydrogenase aus Bacillus subtilis in einer Endkonzentration von 5 U/ml, CaCI2 in einer Endkonzentration von 1 mM und eine Mischung aus NAD+ und NADH in einer Endkonzentration von 0,1 mM zugefügt. Zur Kofaktor-Regenerierung werden 10 U/ml (Endkonzentration) der Oxidase aus Leuconostoc mesenteroi-des eingesetzt. Der Ansatz wird auf 0,5 ml mit Wasser aufgefüllt. Die Enzyme werden in Form von Zelllysat eingesetzt. Die Reaktion findet für 24 h bei 40°C und pH = 8 unter kontinuierlichem Schütteln (900 rpm) im offenen System statt, um genug Sauerstoffversorgung für die Oxidase aus der Luft zu gewährleisten. Im offenen System bei 40°C verdampft Wasser, was nach 6 h und 21h nachdosiert werden muss. Es wird ein Umsatz der Glucose zu Fructose von >98% erreicht.
[00136] Beispiel 7 [00137] Aufarbeitung und Analytik der Zucker [00138] Der Ansatz wird für 10 min bei 65°C inkubiert um die Enzyme zu deaktivieren und anschließend zentrifugiert. Der Überstand wird dann über einen 0,2 μΜ PVDF Filter filtriert und mittels Ligand-Exchange-HPLC analysiert (Agilent Technologies Inc.). Aufgetrennt werden Zucker und Polyole dabei über eine Blei-Säule von Showa Denko K.K. (Shodex® Sugar SP0810) mit einem Fluss von 0,5 ml/min Wasser (VWR International GmbH, HPLC Grade) bei 80°C. Die Detektion erfolgt mittels Lichtbrechungsdetektor (RID, Agilent 1260 Infinity®, Agilent Technologies Inc.). Es wird ein Inlinefilter von Agilent Technologies Inc., sowie als Vorsäulen eine Anionen-Austauscher-Säule (Shodex® Axpak-WAG), eine Reversed-Phase Säule (Shodex® Asahipak® ODP-50 6E) und eine Zucker-Vorsäule (SUGAR SP-G) von Showa Denko K.K. verwendet.
[00139] Beispiel 8 [00140] Biokonversion von Cholsäure zu 3a,7ß-Dihydroxy-12-oxo-5ß-cholansäure durch 12a-Hydroxysteroiddehydrogenase, 7a-Hydroxysteroiddehydrogenase und 7ß-Hydroxysteroidde-hydrogenase unter der Verwendung eines Laktatdehydrogenase- und Alkoholdehydrogenase-abhängigen Kofaktor-Regenerierungssystems [00141] Ein 0,5 ml-Ansatz enthält 25 mg Cholsäure, 12,5 U der rekombinanten 12a-Hydroxy-steroiddehydrogenase aus Eggertella lenta oder Lysinibacillus sphaericus, 16 U der rekombinanten 7a-Hydroxysteroiddehydrogenase aus Escherichia coli, 6 U der rekombinanten 7ß-Hydroxysteroiddehydrogenase aus Ruminococcus torques sowie 1 mM NAD+ und 1 mM NADPH. Zur Regenerierung von NAD+ werden 12,5 U der rekombinanten Laktatdehydrogenase aus Oryctolagus cuniculus (Muskel Isoform) und 200 mM Natrium-Pyruvat eingesetzt. Für die Regenerierung von NADPH werden 5 U der rekombinanten Alkoholdehydrogenase aus Lactobacillus kefir und anfänglich 2 % IPA (w/v) eingesetzt. Die Reaktion wird in einem wässrigen Kaliumphosphatpuffer (100 mM, pH 7.8) bei 25 °C unter kontinuierlichem Schütteln (850 rpm) 12/29
Ssterriichbcte pstäßSar»): AT 513 721 B1 2014-09-15 durchgeführt. Es wird weiterhin ein offenes System verwendet, um die Verdampfung von Aceton zu ermöglichen und die Reaktion in Richtung 3a,7ß-Dihydroxy-12-oxo-5ß-cholansäure zu verschieben. Es werden 2% IPA nach 18 h, und 24 h nachdosiert. Nach 48 h sind 61 % der eingesetzten Cholsäure zu 3a,7a-dihydroxy-12-oxo-5ß-cholansäure umgesetzt.
[00142] Beispiel 9 [00143] Biokonversion von Cholsäure zu 3a,7ß-Dihydroxy-12-oxo-5ß-cholansäure durch 12a-Hydroxysteroiddehydrogenase, 7a-Hydroxysteroiddehydrogenase und 7ß-Hydroxysteroidde-hydrogenase unter der Verwendung eines Laktatdehydrogenase-, NADH-Oxidase- und Alkoholdehydrogenase-abhängigen Kofaktor-Regenerierungssystems [00144] Ein 0,5 ml-Ansatz enthält 25 mg Cholsäure, 12,5 U der rekombinanten 12a- Hydroxys-teroiddehydrogenase aus Eggertella lenta oder Lysinibacillus sphaericus, 16 U der rekombinanten 7a-Hydroxysteroiddehydrogenase aus Escherichia coli, 6 U der rekombinanten 7ß-Hydroxysteroiddehydrogenase aus Ruminococcus torques sowie 1 mM NAD+ und 1 mM NADPH. Zur Regenerierung von NAD+ werden 5 U der rekombinanten NADH-Oxidase aus Leuconostoc mesenteroides und 12,5 U der rekombinanten Laktatdehydrogenase aus Orycto-lagus cuniculus (Muskel Isoform) und 200 mM Natrium-Pyruvat eingesetzt. Für die Regenerierung von NADPH werden 5 U der rekombinanten Alkoholdehydrogenase aus Lactobacillus kefir und anfänglich 2 % IPA (w/v) eingesetzt. Die Reaktion wird in einem wässrigen Kaliumphosphatpuffer (100 mM, pH 7.8) bei 25 °C unter kontinuierlichem Schütteln (850 rpm) durchgeführt. Es wird weiterhin ein offenes System verwendet, um die Verdampfung von Aceton zu ermöglichen und die Reaktion in Richtung 3a,7ß-Dihydroxy-12-oxo-5ß-cholansäure zu verschieben. Es werden 2 % IPA (w/v) nach 18 h, und 24 h nachdosiert. Nach 48 h sind 70% der eingesetzten Cholsäure zu 3α,7a- dihydroxy-12-oxo-5ß-cholansäure umgesetzt.
[00145] Beispiel 10 [00146] Epimerisierung von Chenodeoxycholsäure zu Ursodeoxycholsäure durch 7a-Hydro-xysteroiddehydrogenase und 7ß-Hydroxysteroiddehydrogenase unter der Verwendung eines Laktatdehydrogenase- und Alkoholdehydrogenase-abhängigen Kofaktor-Regenerierungssystems. Vorteil der Zugabe von Manganchlorid (MnCI2) [00147] Ein 0,5 ml-Ansatz enthält 50 mg Chenodeoxycholsäure, 12 U der rekombinanten 7a-Hydroxysteroiddehydrogenase aus Escherichia coli, 6 U der rekombinanten 7ß- Hydroxystero-iddehydrogenase aus Ruminococcus torques sowie 0,5 mM NAD+ und 0,3 mM NADPH. Zur Regenerierung von NAD+ werden 6 U rekombinante Laktatdehydrogenase und 350 mM Natrium-Pyruvat eingesetzt. Für die Regenerierung von NADPH werden 6 U der rekombinanten Alkoholdehydrogenase aus Lactobacillus kefir und anfänglich 2,4% IPA (w/v) eingesetzt. Die Reaktion wird in einem wässrigen Kaliumphosphatpuffer (100 mM, pH = 7,8) mit 5 mM MnCI2 bei 25°C und unter kontinuierlichem Schütteln (850 rpm) durchgeführt. Es wird weiterhin ein offenes System verwendet, um die Verdampfung von Aceton zu ermöglichen und die Reaktion in Richtung Ursodeoxycholsäure zu verschieben. Es werden 1,6%(w/v) IPA nach 6 h, 2,4%(w/v) IPA nach 16 h und 3,9%(w/v) IPA nach 24 h nachdosiert. Nach 36 h werden 200 μ1 2-Pentanol sowie 3 %(w/v) IPA zugegeben und nach 48 h werden 100 pl 2-Pentanol und 4 % (w/v) IPA nachdosiert. Nach 64 h beträgt der Anteil von Ursodeoxycholsäure an allen Gallensäuren in der Reaktionsmischung >99%. Es beträgt insbesondere der Anteil von Chenodeoxycholsäure ca. 0,3 %. Bei einem Kontrollansatz ohne Zugabe von MnCI2 liegt der Anteil von Chenodeoxycholsäure bei ca. 2 % und der Anteil von Ursodeoxycholsäure bei ca. 97,5 % (jeweils Mittelwerte aus 5 Experimenten).
[00148] Beispiel 11 [00149] Epimerisierung von Chenodeoxycholsäure zu Ursodeoxycholsäure durch 7a-Hydro-xysteroiddehydrogenase und 7ß-Hydroxysteroiddehydrogenase unter der Verwendung eines Alkoholdehydrogenase-abhängigen Kofaktor-Regenerierungssystems sowie eines kombinierten Laktatdehydrogenase- und NADH- Oxidase-abhängigen Kofaktor-Regenerierungssystems [00150] Ein 0,5 ml-Ansatz enthält 50 mg Chenodeoxycholsäure, 12 U der rekombinanten 7a- 13/29
Ssterfükhbcte pstÄrtti: AT 513 721 B1 2014-09-15
Hydroxysteroiddehydrogenase aus Escherichia coli, 6 U der rekombinanten 7ß-Hydroxysteroid-dehydrogenase aus Ruminococcus torques sowie 0,5 mM NAD+ und 0,3 mM NADPH. Zur Regenerierung von NAD+ werden 6 U rekombinante Laktatdehydrogenase und 350 mM Natrium-Pyruvat eingesetzt. Zur Regenerierung von NAD+ werden zusätzlich 9 U der rekombinanten NADH Oxidase aus Leuconostoc mesenteroides sowie 6 U der rekombinanten NADH Oxidase aus Clostridium aminovalericum eingesetzt. Für die Regenerierung von NADPH werden 6 U der rekombinanten Alkoholdehydrogenase aus Lactobacillus kefir und anfänglich 2,4% IPA (w/v) eingesetzt. Die Reaktion wird in einem wässrigen Kaliumphosphatpuffer (100 mM, pH = 7,8) bei 25 °C und unter kontinuierlichem Schütteln (850 rpm) durchgeführt. Es wird weiterhin ein offenes System verwendet, um die Verdampfung von Aceton zu ermöglichen und die Reaktion in Richtung Ursodeoxycholsäure zu verschieben. Es werden 1,6%(w/v) IPA nach 6 h, 2,4%(w/v) IPA nach 16 h und 3,9%(w/v) IPA nach 24 h nachdosiert. Nach 36 h werden 200 μΙ 2-Pentanol sowie 3 %(w/v) IPA zugegeben und nach 48 h werden 100 μΙ 2-Pentanol und 4 % (w/v) IPA nachdosiert. Nach 64 h beträgt der Anteil von Ursodeoxycholsäure an allen Gallensäuren in der Reaktionsmischung >99%. Es beträgt insbesondere der Anteil von Chenodeoxycholsäure ca. 0,2 %. Bei einem Kontrollansatz ohne Zugabe von NADH-Oxidase liegt der Anteil von Chenodeoxycholsäure bei ca. 2 % und der Anteil von Ursodeoxycholsäure bei ca. 97,5 % (gleicher Kontrollansatz wie für Beispiel 11; jeweils Mittelwerte aus 5 Experimenten).
[00151] Beispiel 12 [00152] Epimerisierung von Chenodeoxycholsäure zu Ursodeoxycholsäure durch 7a-Hydroxy-steroiddehydrogenase und 7ß-Hydroxysteroiddehydrogenase unter der Verwendung eines Alkoholdehydrogenase-abhängigen Kofaktor-Regenerierungssystems sowie eines kombinierten Laktatdehydrogenase- und NADH-Oxidase-abhängigen Kofaktor-Regenerierungssystems. Additiver Effekt von 2- Pentanol und 2-Propanol [00153] Ein 50 ml-Ansatz enthält 5 g Chenodeoxycholsäure, 24 U/ml der rekombinanten 7a-Hydroxysteroiddehydrogenase aus Escherichia coli, 12 U/ml der rekombinanten 7ß- Hydroxysteroiddehydrogenase aus Ruminococcus torques sowie 0,5 mM NAD+ und 0,3 mM NADPH. Zur Regenerierung von NAD+ werden 12 U/ml rekombinante Laktatdehydrogenase und 350 mM Natrium-Pyruvat eingesetzt. Zur Regenerierung von NAD+ werden zusätzlich 18 U/ml der rekombinanten NADH Oxidase aus Leuconostoc mesenteroides sowie 12 U/ml der rekombinanten NADH Oxidase aus Clostridium aminovalericum eingesetzt. Für die Regenerierung von NADPH werden 12 U/ml der rekombinanten Alkoholdehydrogenase aus Lactobacillus kefir und anfänglich 1,5 % IPA (w/v) eingesetzt. Die Reaktion wird in einem wässrigen Kaliumphosphatpuffer (100 mM, pH = 7,8) mit 5 mM MnCI2 bei 25°C durchgeführt. In einem 3-Halskolben wird mit einem KPG-Rührer bei ca. 100 rpm gerührt. Eine Entfernung des bei der Reaktion entstehenden Acetons wird durch einen Luftstrom von ca. 400-600 ml/min durch das Reaktionsgefäß gewährleistet. Da ebenfalls 2-Propanol verdampft, sind Nachdosierungen notwendig. Diese betragen im Beispiel 0,75 ml (1,5 h), 0,75 ml (3 h), 0,5 ml (4 h), 0,75 ml (6 h), 0,75 ml (8 h), 0,5 ml (11 h), 0,5 ml (14 h), 0,5 ml (17 h), 0,5 ml (21 h), 1 ml (23 h), 2,5 ml (25 h), 4 ml (29 h). Nach ca. 30 h werden 20 ml 2-Pentanol sowie 2 ml 2-Propanol zugegeben. Nach 46 h Gesamt-Reaktionszeit beträgt der Anteil von 7-Ketolithocholsäure ca. 1 % (bezogen auf die Summe von Chenodeoxycholsäure, Ursodeoxycholsäure und 7-Ketolithocholsäure). Es wird nun weiter 2-Propanol zugegeben: 3 ml (46 h), 4 ml (52 h), 4 ml (54 h) sowie zusätzlich 10 ml 2-Pentanol. Nach 72 h Gesamt-Reaktionszeit kann der Anteil von 7- Ketolithocholsäure auf weniger als 0,2 % gesenkt werden. Der Anteil von Ursodeoxycholsäure beträgt >99 %.
[00154] Beispiel 13 [00155] Aufarbeitung und Analytik der Gallensäuren [00156] Nach Beendigung von Reaktionen, wie sie in den Beispielen 8 bis 12 beschrieben sind, können die in den Proben enthaltenen Gallensäuren mittels einer Methode wie sie in Beispiel 4 beschrieben ist analysiert werden. 14/29

Claims (17)

  1. Ssterriichbcte pstäßSar»): AT 513 721 B1 2014-09-15 Patentansprüche 1. Verfahren zur enzymatischen Regenerierung der Redoxkofaktoren NAD7NADH und NADP7NADPH in einer Ein-Topf-Reaktion, wobei als Resultat mindestens zweier weiterer im selben Reaktionsansatz ablaufender enzymatisch katalysierter Redoxreaktionen, nämlich Produktbildungsreaktionen, einer der beiden Redoxkofaktoren in seiner reduzierten Form anfällt und der jeweils andere in seiner oxidierten Form, dadurch gekennzeichnet, dass a) bei der Regenerierungsreaktion, die den reduzierten Kofaktor wieder in seine ursprüngliche oxidierte Form überführt, Sauerstoff oder eine Verbindung der allgemeinen Formel
    worin R1 für eine geradkettige oder verzweigtkettige (Ci-C4)-Alkylgruppe oder für eine (CrC^-Carboxyalkylgruppe steht, reduziert wird, und b) bei der Regenerierungsreaktion, die den oxidierten Kofaktor wieder in seine ursprüngliche reduzierte Form überführt, ein (C4-C8)-Cycloalkanol oder eine Verbindung der allgemeinen Formel
    li worin R2 und R3 unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus H, (C-|-C6)-Alkyl, worin Alkyl geradkettig oder verzweigt ist, (C-|-C6)-Alkenyl, worin Alkenyl geradkettig oder verzweigt ist und ein bis drei Doppelbindungen enthält, Aryl, insbesondere (C6-Ci2)-Aryl, Carboxyl, oder (CrC4)-Carboxyalkyl, insbesondere auch Cycloalkyl, z.B. (C3-C8)-Cycloalkyl, oxidiert wird.
  2. 2. Verfahren nach Anspruch 1 zur enzymatischen Regenerierung der Redoxkofaktoren NAD7NADH und NADP7NADPH in einer Ein-Topf-Reaktion, wobei als Resultat mindestens zweier weiterer im selben Reaktionsansatz ablaufender enzymatisch katalysierter Redoxreaktionen, nämlich Produktbildungsreaktionen, einer der beiden Redoxkofaktoren in seiner reduzierten Form anfällt und der jeweils andere in seiner oxidierten Form, dadurch gekennzeichnet, dass a) bei zur Regenerierung des oxidierten Kofaktors eine Verbindung der allgemeinen Formel I reduziert wird, O
    0 wobei Ri für eine substituierte oder unsubstituierte (CrC4-Alkylgruppe steht, und b) bei der Regenerierung des reduzierten Kofaktors eine Verbindung der allgemeinen Formel II oxidiert wird,
    15/29
    österreichisches pslaitsnit AT 513 721 B1 2014-09-15 wobei R2 und R3 unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus 1) -H), 2) -(Ci-C6)-Alkyl, worin Alkyl geradkettig oder verzweigtkettig ist, 3) -(Ci-C6)-Alkenyl, worin Alkenyl geradkettig oder verzweigtkettig ist und gegebenenfalls bis zu drei Doppelbindungen enthält,
  3. 4) -Cycloalkyl, insbesondere (C3-C8)Cycloalkyl,
  4. 5) -Aryl, insbesondere (C6-Ci2)Aryl, 6) -(CrC4)-Carboxyalkyl, falls es sich bei Verbindung I um Pyruvat handelt, gegebenenfalls auch Carboxyl. 3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, worin R2 und R3 unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus H, (CrC6)-Alkyl, worin Alkyl geradkettig oder verzweigt ist, (CrC6)-Alkenyl, worin Alkenyl geradkettig oder verzweigt ist und ein bis drei Doppelbindungen enthält, Aryl, insbesondere (C6-C12)- Aryl, Carboxyl oder (CrC4)-Carboxyalkyl.
  5. 4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass ein Substrat verwendet wird, an dem Oxidationsreaktion(en) und Reduktionsreaktion(en) am selben Molekülgrundgerüst stattfinden.
  6. 5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren derart durchgeführt wird, dass Oxidationsreaktion(en) und Reduktionsreaktion(en) zeitlich parallel ablaufen.
  7. 6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass bei der Regenerierungsreaktion, die den oxidierten Kofaktor wieder in seine ursprüngliche reduzierte Form überführt mittels einer Alkoholdehydrogenase 2-Propanol zu Aceton oxidiert wird.
  8. 7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass bei der Regenerierungsreaktion, die den reduzierten Kofaktor wieder in seine ursprüngliche oxidierte Form überführt mittels einer Laktatdehydrogenase Pyruvat zu Laktat reduziert wird.
  9. 8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass bei der Regenerierungsreaktion, die den oxidierten Kofaktor wieder in seine ursprüngliche reduzierte Form überführt mittels einer Malatdehydrogenase Malat zu Pyruvat und C02 oxidiert wird.
  10. 9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass als Substrat eine Verbindung der allgemeinen Formel
    II! worin R4 Wasserstoff, eine Methylgruppe, eine Hydroxygruppe oder eine Oxogruppe, R5 Wasserstoff, eine Hydroxygruppe, eine Oxogruppe oder eine Methylgruppe, R6 Wasserstoff oder eine Hydroxygruppe, 16/29
    österreichisches fStHitSKit AT 513 721 B1 2014-09-15 R7 Wasserstoff, -COR13, worin R13 eine unsubstituierte oder mit einer Hydroxygruppe substituierte Ci-C4-Alkylgruppe ist, oder eine substituierte, insbesondere mit einer Hydroxygruppe, oder unsubstituierte C1-C4 Carboxyalkylgruppe, oder R6 und R7 zusammen eine Oxogruppe bedeuten, Re Wasserstoff, eine Methylgruppe, eine Hydroxygruppe oder eine Oxogruppe, Rg Wasserstoff, eine Methylgruppe, eine Hydroxygruppe oder eine Oxogruppe, Rio Wasserstoff, eine Methylgruppe oder Halogen, Rn Wasserstoff, eine Methylgruppe, eine Hydroxygruppe, eine Oxogruppe oder Halogen, und R12 Wasserstoff, eine Hydroxygruppe, eine Oxogruppe oder eine Methylgruppe bedeuten, wobei das Strukturelement
    einen Benzolring oder einen Ring mit 6 Kohlenstoffatomen und 0, 1 oder 2 C-C- Doppelbindungen bedeutet; jeweils mindestens einer Oxidationsreaktion und mindestens einer Reduktionsreaktion im selben Reaktionsansatz unterworfen wird, insbesondere wobei das Substrat/die Substrate für die an der Produktbildung beteilig-te(n) Reduktionsreaktion(en) in einer Konzentration von <5% (w/v) im Reaktionsansatz vorliegt/vorliegen.
  11. 10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass Dehydroepiandrosteron (DHEA) der Formel
    > jeweils mindestens einer Oxidationsreaktion und mindestens einer Reduktionsreaktion im selben Reaktionsansatz unterworfen wird, insbesondere wobei das Substrat/die Substrate für die an der Produktbildung beteiligte(n) Reduktionsreaktion(en) in einer Konzentration von <5% (w/v) im Reaktionsansatz vorliegt/vorliegen, wobei Testosteron der Formel Θ
    Vjll erhalten wird. 17/29 ästereidsisdiis AT 513 721 B1 2014-09-15
  12. 11. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass 3a,7a-Dihydroxy-5ß- cholan-säure (Chenodeoxycholsäure) der Formel
    durch Oxidation zu Ketolithocholsäure der Formel
    und nachfolgende Reduktion zur stereoisomeren Hydroxyverbindung 3 a,7ß-Dihydroxy- 5 ß-cholansäure (Ursodeoxycholsäure) der Formel
    mittels zweier entgegengesetzt stereospezifischer Hydroxysteroiddehydrogenasen enzymatisch epimerisiert wird.
  13. 12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Oxidationsreaktion durch eine 7a-Hydroxysteroiddehydrogenase aus E. coli katalysiert wird.
  14. 13. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Reduktionsreaktion durch eine 7ß-Hydroxysteroiddehydrogenase aus Ruminococcus torques katalysiert wird.
  15. 14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass es eingesetzt wird zur Isomerisierung von C5- oder C6-Zuckern.
  16. 15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass es eingesetzt wird zur Isomerisierung von Glukose durch Reduktion zu Sorbitol und nachfolgende Oxidation zu Fruktose.
  17. 16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass das Sub-strat/die Substrate für die an der Produktbildung beteiligte(n) Oxidationsreaktion(en) in einer Konzentration von 5% (w/v) und mehr, insbesondere von 7% (w/v) und mehr, insbesondere von 9% (w/v) und mehr im Reaktionsansatz vorliegt/vorliegen. Hierzu 11 Blatt Zeichnungen 18/29
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