JP6329086B2 - 酸化還元補因子の酵素的な再生のためのプロセス - Google Patents
酸化還元補因子の酵素的な再生のためのプロセス Download PDFInfo
- Publication number
- JP6329086B2 JP6329086B2 JP2014556034A JP2014556034A JP6329086B2 JP 6329086 B2 JP6329086 B2 JP 6329086B2 JP 2014556034 A JP2014556034 A JP 2014556034A JP 2014556034 A JP2014556034 A JP 2014556034A JP 6329086 B2 JP6329086 B2 JP 6329086B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- reaction
- acid
- oxo
- oxidation
- dehydrogenase
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 title claims description 97
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 title claims description 97
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 85
- 230000008569 process Effects 0.000 title claims description 81
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 title claims description 21
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 119
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 99
- XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N [[(2r,3r,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-3-hydroxy-4-phosphonooxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] [(2s,3r,4s,5s)-5-(3-carbamoylpyridin-1-ium-1-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methyl phosphate Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N 0.000 claims description 62
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 claims description 61
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 56
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 claims description 47
- 238000006722 reduction reaction Methods 0.000 claims description 41
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 41
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 39
- 102000007698 Alcohol dehydrogenase Human genes 0.000 claims description 33
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 33
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 claims description 31
- 102000003855 L-lactate dehydrogenase Human genes 0.000 claims description 29
- 108700023483 L-lactate dehydrogenases Proteins 0.000 claims description 29
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M Pyruvate Chemical compound CC(=O)C([O-])=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 27
- 238000006345 epimerization reaction Methods 0.000 claims description 27
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims description 26
- RUDATBOHQWOJDD-UHFFFAOYSA-N (3beta,5beta,7alpha)-3,7-Dihydroxycholan-24-oic acid Natural products OC1CC2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(CCC(O)=O)C)C1(C)CC2 RUDATBOHQWOJDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 25
- 108010007843 NADH oxidase Proteins 0.000 claims description 25
- RPKLZQLYODPWTM-KBMWBBLPSA-N cholanoic acid Chemical compound C1CC2CCCC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]1(C)CC2 RPKLZQLYODPWTM-KBMWBBLPSA-N 0.000 claims description 23
- 108010032887 7 beta-hydroxysteroid dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 22
- 108010014831 7-alpha-hydroxysteroid dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 22
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 claims description 22
- RUDATBOHQWOJDD-UZVSRGJWSA-N ursodeoxycholic acid Chemical compound C([C@H]1C[C@@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)CC1 RUDATBOHQWOJDD-UZVSRGJWSA-N 0.000 claims description 22
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 claims description 20
- 230000009467 reduction Effects 0.000 claims description 20
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 19
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 claims description 19
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims description 19
- 102100039358 3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase type-2 Human genes 0.000 claims description 18
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 18
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims description 18
- 238000006479 redox reaction Methods 0.000 claims description 18
- 229960001661 ursodiol Drugs 0.000 claims description 18
- 150000001875 compounds Chemical group 0.000 claims description 16
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 15
- 125000004043 oxo group Chemical group O=* 0.000 claims description 15
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 14
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 14
- 150000002431 hydrogen Chemical class 0.000 claims description 14
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 claims description 14
- 238000005580 one pot reaction Methods 0.000 claims description 14
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 13
- MIHNUBCEFJLAGN-RAEYQWLJSA-N 3alpha,7beta-dihydroxy-12-oxo-5beta-cholanic acid Chemical compound C([C@H]1C[C@@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)C(=O)C1 MIHNUBCEFJLAGN-RAEYQWLJSA-N 0.000 claims description 12
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 claims description 11
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 claims description 11
- 108010026217 Malate Dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 10
- 102000013460 Malate Dehydrogenase Human genes 0.000 claims description 10
- 150000002440 hydroxy compounds Chemical class 0.000 claims description 10
- BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N malic acid Chemical compound OC(=O)C(O)CC(O)=O BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 claims description 9
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 claims description 9
- 108010062875 Hydroxysteroid Dehydrogenases Proteins 0.000 claims description 9
- 102000011145 Hydroxysteroid Dehydrogenases Human genes 0.000 claims description 9
- 238000006317 isomerization reaction Methods 0.000 claims description 9
- 230000000707 stereoselective effect Effects 0.000 claims description 8
- BHQCQFFYRZLCQQ-UHFFFAOYSA-N (3alpha,5alpha,7alpha,12alpha)-3,7,12-trihydroxy-cholan-24-oic acid Natural products OC1CC2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(CCC(O)=O)C)C1(C)C(O)C2 BHQCQFFYRZLCQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 241000192031 Ruminococcus Species 0.000 claims description 7
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 claims description 6
- BHQCQFFYRZLCQQ-OELDTZBJSA-N cholic acid Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 BHQCQFFYRZLCQQ-OELDTZBJSA-N 0.000 claims description 6
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 claims description 6
- BJEPYKJPYRNKOW-REOHCLBHSA-N (S)-malic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](O)CC(O)=O BJEPYKJPYRNKOW-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 5
- RHCPKKNRWFXMAT-RRWYKFPJSA-N 3alpha,12alpha-dihydroxy-7-oxo-5beta-cholanic acid Chemical compound C1C[C@@H](O)C[C@H]2CC(=O)[C@H]3[C@@H]4CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]4(C)[C@@H](O)C[C@@H]3[C@]21C RHCPKKNRWFXMAT-RRWYKFPJSA-N 0.000 claims description 5
- 229940049920 malate Drugs 0.000 claims description 5
- 239000001630 malic acid Substances 0.000 claims description 5
- 235000011090 malic acid Nutrition 0.000 claims description 5
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 claims description 5
- 230000007306 turnover Effects 0.000 claims description 5
- 125000004178 (C1-C4) alkyl group Chemical group 0.000 claims description 4
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- MUMGGOZAMZWBJJ-DYKIIFRCSA-N Testostosterone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 MUMGGOZAMZWBJJ-DYKIIFRCSA-N 0.000 claims description 4
- RUDATBOHQWOJDD-BSWAIDMHSA-N chenodeoxycholic acid Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)CC1 RUDATBOHQWOJDD-BSWAIDMHSA-N 0.000 claims description 4
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 150000002367 halogens Chemical class 0.000 claims description 4
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- -1 C 6 sugars Chemical class 0.000 claims description 3
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 claims description 2
- FMGSKLZLMKYGDP-USOAJAOKSA-N dehydroepiandrosterone Chemical compound C1[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)(C(CC4)=O)[C@@H]4[C@@H]3CC=C21 FMGSKLZLMKYGDP-USOAJAOKSA-N 0.000 claims description 2
- PXBRQCKWGAHEHS-UHFFFAOYSA-N dichlorodifluoromethane Chemical compound FC(F)(Cl)Cl PXBRQCKWGAHEHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 claims description 2
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 claims description 2
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 claims description 2
- 229960003604 testosterone Drugs 0.000 claims description 2
- BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N NAD zwitterion Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 46
- 229950006238 nadide Drugs 0.000 description 46
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 34
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 34
- 229940076788 pyruvate Drugs 0.000 description 24
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 21
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N nicotinamide-adenine dinucleotide Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 21
- JYVLIDXNZAXMDK-UHFFFAOYSA-N pentan-2-ol Chemical compound CCCC(C)O JYVLIDXNZAXMDK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 17
- 239000000047 product Substances 0.000 description 15
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 14
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 14
- 241001468191 Lactobacillus kefiri Species 0.000 description 10
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N Pyruvic acid Chemical compound CC(=O)C(O)=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 10
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 10
- DXOCDBGWDZAYRQ-AURDAFMXSA-N 7-oxolithocholic acid Chemical compound C1C[C@@H](O)C[C@H]2CC(=O)[C@H]3[C@@H]4CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]4(C)CC[C@@H]3[C@]21C DXOCDBGWDZAYRQ-AURDAFMXSA-N 0.000 description 9
- 239000003613 bile acid Substances 0.000 description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 8
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 8
- DXOCDBGWDZAYRQ-UHFFFAOYSA-N (3alpha,5beta)-3-Hydroxy-7-oxocholan-24 -oic acid Natural products C1CC(O)CC2CC(=O)C3C4CCC(C(CCC(O)=O)C)C4(C)CCC3C21C DXOCDBGWDZAYRQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- MIHNUBCEFJLAGN-UHFFFAOYSA-N 12-oxo-chenodeoxycholic acid Natural products OC1CC2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(CCC(O)=O)C)C1(C)C(=O)C2 MIHNUBCEFJLAGN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 7
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 7
- 102000016912 Aldehyde Reductase Human genes 0.000 description 6
- 108010053754 Aldehyde reductase Proteins 0.000 description 6
- 0 CC(C1)=*C*C1=C Chemical compound CC(C1)=*C*C1=C 0.000 description 6
- 241000192130 Leuconostoc mesenteroides Species 0.000 description 6
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 6
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108010073927 12-alpha-hydroxysteroid dehydrogenase Proteins 0.000 description 5
- MAFJMPFLJJCSTB-FQBQTYDJSA-N 7,12-dioxolithocholic acid Chemical compound C1C[C@@H](O)C[C@H]2CC(=O)[C@H]3[C@@H]4CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]4(C)C(=O)C[C@@H]3[C@]21C MAFJMPFLJJCSTB-FQBQTYDJSA-N 0.000 description 5
- 241000193457 Anaerocolumna aminovalerica Species 0.000 description 5
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 5
- 108010009384 L-Iditol 2-Dehydrogenase Proteins 0.000 description 5
- 102100026974 Sorbitol dehydrogenase Human genes 0.000 description 5
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 5
- 229940107700 pyruvic acid Drugs 0.000 description 5
- 150000003333 secondary alcohols Chemical class 0.000 description 5
- 229960002920 sorbitol Drugs 0.000 description 5
- MIHNUBCEFJLAGN-DMMBONCOSA-N 3alpha,7alpha-dihydroxy-12-oxo-5beta-cholanic acid Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)C(=O)C1 MIHNUBCEFJLAGN-DMMBONCOSA-N 0.000 description 4
- 241000222178 Candida tropicalis Species 0.000 description 4
- 108010050375 Glucose 1-Dehydrogenase Proteins 0.000 description 4
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 4
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 125000004181 carboxyalkyl group Chemical group 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 125000006727 (C1-C6) alkenyl group Chemical group 0.000 description 3
- 125000004169 (C1-C6) alkyl group Chemical group 0.000 description 3
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 3
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 3
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 3
- 108090000698 Formate Dehydrogenases Proteins 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 3
- 125000003342 alkenyl group Chemical group 0.000 description 3
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 125000000468 ketone group Chemical group 0.000 description 3
- 150000002576 ketones Chemical class 0.000 description 3
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- HSINOMROUCMIEA-FGVHQWLLSA-N (2s,4r)-4-[(3r,5s,6r,7r,8s,9s,10s,13r,14s,17r)-6-ethyl-3,7-dihydroxy-10,13-dimethyl-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-tetradecahydro-1h-cyclopenta[a]phenanthren-17-yl]-2-methylpentanoic acid Chemical compound C([C@@]12C)C[C@@H](O)C[C@H]1[C@@H](CC)[C@@H](O)[C@@H]1[C@@H]2CC[C@]2(C)[C@@H]([C@H](C)C[C@H](C)C(O)=O)CC[C@H]21 HSINOMROUCMIEA-FGVHQWLLSA-N 0.000 description 2
- 125000006552 (C3-C8) cycloalkyl group Chemical group 0.000 description 2
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004380 Cholic acid Substances 0.000 description 2
- 241001147706 Clostridium sardiniense Species 0.000 description 2
- RFSUNEUAIZKAJO-VRPWFDPXSA-N D-Fructose Natural products OC[C@H]1OC(O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-VRPWFDPXSA-N 0.000 description 2
- 241000853331 Eggerella Species 0.000 description 2
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M Lactate Chemical compound CC(O)C([O-])=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 description 2
- 240000001929 Lactobacillus brevis Species 0.000 description 2
- 241000193386 Lysinibacillus sphaericus Species 0.000 description 2
- 108010002998 NADPH Oxidases Proteins 0.000 description 2
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 2
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 2
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 2
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 2
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 2
- 241000589774 Pseudomonas sp. Species 0.000 description 2
- 241000194019 Streptococcus mutans Species 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 2
- 238000010523 cascade reaction Methods 0.000 description 2
- 229960002471 cholic acid Drugs 0.000 description 2
- 235000019416 cholic acid Nutrition 0.000 description 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 2
- 125000000753 cycloalkyl group Chemical group 0.000 description 2
- KXGVEGMKQFWNSR-UHFFFAOYSA-N deoxycholic acid Natural products C1CC2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(CCC(O)=O)C)C1(C)C(O)C2 KXGVEGMKQFWNSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 229940039696 lactobacillus Drugs 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 2
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 2
- 238000004064 recycling Methods 0.000 description 2
- 238000012958 reprocessing Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 2
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SBPPWJIDARICBS-PGCXOGMSSA-N (5r,5ar,8ar,9r)-5-[[(4ar,6r,7r,8r,8as)-7,8-dihydroxy-2-phenyl-4,4a,6,7,8,8a-hexahydropyrano[3,2-d][1,3]dioxin-6-yl]oxy]-9-(3,4,5-trimethoxyphenyl)-5a,6,8a,9-tetrahydro-5h-[2]benzofuro[6,5-f][1,3]benzodioxol-8-one Chemical compound COC1=C(OC)C(OC)=CC([C@@H]2C3=CC=4OCOC=4C=C3[C@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@@H]4OC(OC[C@H]4O3)C=3C=CC=CC=3)O)[C@@H]3[C@@H]2C(OC3)=O)=C1 SBPPWJIDARICBS-PGCXOGMSSA-N 0.000 description 1
- KVUXYQHEESDGIJ-UHFFFAOYSA-N 10,13-dimethyl-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-tetradecahydro-1h-cyclopenta[a]phenanthrene-3,16-diol Chemical compound C1CC2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CC(O)CC1(C)CC2 KVUXYQHEESDGIJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010070743 3(or 17)-beta-hydroxysteroid dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 101710172561 3alpha-hydroxysteroid dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- WVYWICLMDOOCFB-UHFFFAOYSA-N 4-methyl-2-pentanol Chemical compound CC(C)CC(C)O WVYWICLMDOOCFB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100031126 6-phosphogluconolactonase Human genes 0.000 description 1
- 108010029731 6-phosphogluconolactonase Proteins 0.000 description 1
- 108010031025 Alanine Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 101900076106 Bacillus subtilis Sorbitol dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 241000606124 Bacteroides fragilis Species 0.000 description 1
- JVMCMMXFADJQKU-RJQVITQBSA-N C[C@H](CCC(O)=O)[C@@H](CC1)[C@@](C)(CC[C@@H]2[C@@](C)(CCCC3)[C@@H]3C3)C1C2[C@@H]3O Chemical compound C[C@H](CCC(O)=O)[C@@H](CC1)[C@@](C)(CC[C@@H]2[C@@](C)(CCCC3)[C@@H]3C3)C1C2[C@@H]3O JVMCMMXFADJQKU-RJQVITQBSA-N 0.000 description 1
- 241001112696 Clostridia Species 0.000 description 1
- 241000193403 Clostridium Species 0.000 description 1
- 241000193454 Clostridium beijerinckii Species 0.000 description 1
- 241001478240 Coccus Species 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 description 1
- 102100034067 Dehydrogenase/reductase SDR family member 11 Human genes 0.000 description 1
- 108020005199 Dehydrogenases Proteins 0.000 description 1
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-M Formate Chemical compound [O-]C=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108010018962 Glucosephosphate Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 101000864782 Homo sapiens Surfactant-associated protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 108010020056 Hydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 102000000428 Lactate Dehydrogenases Human genes 0.000 description 1
- 108010080864 Lactate Dehydrogenases Proteins 0.000 description 1
- 235000013957 Lactobacillus brevis Nutrition 0.000 description 1
- 244000025090 Lactobacillus sanfrancisco Species 0.000 description 1
- 235000013864 Lactobacillus sanfrancisco Nutrition 0.000 description 1
- 244000207740 Lemna minor Species 0.000 description 1
- 241000192003 Leuconostoc carnosum Species 0.000 description 1
- 244000141359 Malus pumila Species 0.000 description 1
- 235000011430 Malus pumila Nutrition 0.000 description 1
- PWHULOQIROXLJO-UHFFFAOYSA-N Manganese Chemical compound [Mn] PWHULOQIROXLJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010036197 NAD phosphite oxidoreductase Proteins 0.000 description 1
- 102000004722 NADPH Oxidases Human genes 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 1
- 241000134861 Ruminococcus sp. Species 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100030059 Surfactant-associated protein 2 Human genes 0.000 description 1
- 244000269722 Thea sinensis Species 0.000 description 1
- 241000186337 Thermoanaerobacter ethanolicus Species 0.000 description 1
- TVXBFESIOXBWNM-UHFFFAOYSA-N Xylitol Natural products OCCC(O)C(O)C(O)CCO TVXBFESIOXBWNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000222124 [Candida] boidinii Species 0.000 description 1
- 241001464870 [Ruminococcus] torques Species 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 229940061720 alpha hydroxy acid Drugs 0.000 description 1
- 150000001280 alpha hydroxy acids Chemical class 0.000 description 1
- 150000004716 alpha keto acids Chemical class 0.000 description 1
- 150000001371 alpha-amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000008206 alpha-amino acids Nutrition 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- AEMFNILZOJDQLW-QAGGRKNESA-N androst-4-ene-3,17-dione Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)(C(CC4)=O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 AEMFNILZOJDQLW-QAGGRKNESA-N 0.000 description 1
- 229960005471 androstenedione Drugs 0.000 description 1
- AEMFNILZOJDQLW-UHFFFAOYSA-N androstenedione Natural products O=C1CCC2(C)C3CCC(C)(C(CC4)=O)C4C3CCC2=C1 AEMFNILZOJDQLW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 125000003716 cholic acid group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000084 colloidal system Substances 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- WPUMTJGUQUYPIV-JIZZDEOASA-L disodium (S)-malate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C(=O)[C@@H](O)CC([O-])=O WPUMTJGUQUYPIV-JIZZDEOASA-L 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 235000019439 ethyl acetate Nutrition 0.000 description 1
- OJCSPXHYDFONPU-UHFFFAOYSA-N etoac etoac Chemical compound CCOC(C)=O.CCOC(C)=O OJCSPXHYDFONPU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 238000007871 hydride transfer reaction Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 229910052748 manganese Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011572 manganese Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- COTNUBDHGSIOTA-UHFFFAOYSA-N meoh methanol Chemical compound OC.OC COTNUBDHGSIOTA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N meso ribitol Natural products OCC(O)C(O)C(O)CO HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- XZYHDXZNNDZXSR-UHFFFAOYSA-N n-(1,1-dioxothiolan-3-yl)-n-methyl-2-[(4-phenyl-5-pyridin-4-yl-1,2,4-triazol-3-yl)sulfanyl]acetamide Chemical compound N=1N=C(C=2C=CN=CC=2)N(C=2C=CC=CC=2)C=1SCC(=O)N(C)C1CCS(=O)(=O)C1 XZYHDXZNNDZXSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009707 neogenesis Effects 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- KHPXUQMNIQBQEV-UHFFFAOYSA-N oxaloacetic acid Chemical compound OC(=O)CC(=O)C(O)=O KHPXUQMNIQBQEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000033116 oxidation-reduction process Effects 0.000 description 1
- 238000005895 oxidative decarboxylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 238000005191 phase separation Methods 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 1
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000006340 racemization Effects 0.000 description 1
- 108010065742 rat 3 beta-hydroxy-delta 5-steroid dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 238000006268 reductive amination reaction Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 235000019265 sodium DL-malate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001394 sodium malate Substances 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 150000003431 steroids Chemical group 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- LMBFAGIMSUYTBN-MPZNNTNKSA-N teixobactin Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H]1C(N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C[C@@H]2NC(=N)NC2)C(=O)N[C@H](C(=O)O[C@H]1C)[C@@H](C)CC)=O)NC)C1=CC=CC=C1 LMBFAGIMSUYTBN-MPZNNTNKSA-N 0.000 description 1
- BHQCQFFYRZLCQQ-UTLSPDKDSA-N ursocholic acid Chemical compound C([C@H]1C[C@@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 BHQCQFFYRZLCQQ-UTLSPDKDSA-N 0.000 description 1
- 239000000811 xylitol Substances 0.000 description 1
- HEBKCHPVOIAQTA-SCDXWVJYSA-N xylitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO HEBKCHPVOIAQTA-SCDXWVJYSA-N 0.000 description 1
- 229960002675 xylitol Drugs 0.000 description 1
- 235000010447 xylitol Nutrition 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
- C12P19/28—N-glycosides
- C12P19/30—Nucleotides
- C12P19/36—Dinucleotides, e.g. nicotineamide-adenine dinucleotide phosphate
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/02—Monosaccharides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P33/00—Preparation of steroids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P41/00—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture
- C12P41/002—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by oxidation/reduction reactions
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
Description
本発明は、酸化還元補因子であるNAD+/NADHおよびNADP+/NADPHを1ポットでの反応において酵素的に再生するためのプロセスに関する。ここで、同一の反応バッチ内で進行する、少なくとも2つのさらなる酵素学的に触媒された酸化還元反応(生成物形成反応)の結果として、この2つの酸化還元補因子はそれぞれその一方がその還元型形態で蓄積し、他方がその酸化型形態で蓄積する。
酵素学的に触媒された酸化還元反応は、工業的な操作において使用されており、例えば、キラルアルコール、α−アミノ酸およびα−ヒドロキシ酸の生産に使用されている。工業的な酸化還元反応に使用される酵素の大部分が、補因子(例えばNADHまたはNADPH)を使用する。酵素的な酸化還元反応の中で、酸化還元補因子がインサイチュでの補因子再生系によって復元されていることは、特に興味深い。その理由は、高価な補因子(NAD(P)+/NAD(P)H)を触媒量にのみ使用することが可能であるからである。好適なデヒドロゲナーゼおよび他の酵素の利用可能性は、種々の補因子再生系の発達を生み出している。
本発明の目的は、1つの反応バッチにおいて経済的な様式にて酵素学的に触媒された2つ以上の酸化還元反応を行うために、酸化還元補因子NAD+/NADHおよびNADP+/NADPHの少なくとも一方(例えばNADP+/NADPH)を再生するためのプロセスを提供することにある。
a)還元された上記補因子をその元々の酸化型へ変換する再生反応において、酸素または一般式Iの化合物
が還元され、
b)酸化された上記補因子をその元々の還元型へ変換する再生反応において、(C4−C8)シクロアルカノールまたは一般式IIの化合物
が酸化されることによって特徴付けられる。
同一の反応バッチ内で進行する、さらに少なくとも2つの、酵素学的に触媒された酸化還元反応(生成物形成反応)の結果として、この2つの酸化還元補因子の一方がその還元型にて堆積し、もう一方がその酸化型にて堆積し、
a)上記酸化された補因子の再生の間に、一般式Iの化合物
が還元され、
b)上記還元された補因子の再生の間に、一般式IIの化合物
1)H、
2)(C1−C6)アルキル(ここで、アルキルは直鎖または分枝鎖である。)、
3)(C1−C6)アルケニル(ここで、アルケニルは直鎖または分枝鎖であり、必要に応じて二重結合を3個まで含んでいる。)、
4)シクロアルキル(特に、(C3−C8)シクロアルキル)、
5)アリール(特に、C6−C12アリール)、
6)(C1−C4)カルボキシアルキル(特に、一般式Iの化合物がピルビン酸である場合)、および、必要に応じて、カルボキシル
からなる群より選択される。)
が酸化される。
ここで、化合物がどちらも酵素学的に触媒されそして還元される。なぜなら、必要とされる酸化反応および還元反応、ならびに1つの反応バッチ内での補因子再生に関連する反応を実行することが可能となり、同時に、従来技術に従うものよりも顕著に高い基質濃度を使用することが可能となるからである。
ここで、R4は、水素、メチル基、ヒドロキシ基またはオキソ基を示し、
R5は、水素、ヒドロキシ基、オキソ基またはメチル基を示し、
R6は、水素またはヒドロキシ基を示し、
R7は、水素、−COR13(ここで、R13は、非置換であるかまたはヒドロキシ基で置換されているC1−C4アルキル基、あるいは、非置換であるかまたは(特にヒドロキシ基で)置換されているC1−C4カルボキシアルキル基である。)を示し、
または、R6およびR7は一緒になってオキソ基を示し、
R8は、水素、メチル基、ヒドロキシ基またはオキソ基を示し、
R9は、水素、メチル基、ヒドロキシ基またはオキソ基を示し、
R10は、水素、メチル基、またはハロゲンを示し、
R11は、水素、メチル基、ヒドロキシ基、オキソ基またはハロゲンを示し、そして
R12は、水素、ヒドロキシ基、オキソ基またはメチル基を示し、
ここで、下記構造要素
(A)酸化によって、一般式X
(B)酸化によって、一般式XIII
(C)酸化によって、一般式XIIIの3α,12α−ジヒドロキシ−7−オキソ−5β−コラン酸を得、引き続く酵素的な還元によって、一般式XIV
[図1]チエノデオキシコール酸の、中間体3α−ヒドロキシ−7オキソ−5β−コラン酸を介した、ウルソデオキシコール酸へのエピマー化の反応スキームを示す。この反応は、2−プロパノールおよびピルビン酸を用いた補因子再生を伴う。
[図2]チエノデオキシコール酸の、中間体3α−ヒドロキシ−7オキソ−5β−コラン酸を介した、ウルソデオキシコール酸へのエピマー化の反応スキームを示す。この反応は、リンゴ酸およびピルビン酸を用いた補因子再生を伴う。
[図3]チエノデオキシコール酸の、中間体3α−ヒドロキシ−7オキソ−5β−コラン酸を介した、ウルソデオキシコール酸へのエピマー化の反応スキームを示す。この反応は、2−プロパノールおよび酸素を用いた補因子再生を伴う。
[図4]グルコースのフルクトースへの異性化の反応スキームを示す。この反応は、2−プロパノールおよびピルビン酸を用いた補因子再生を伴う。
[図5]グルコースのフルクトースへの異性化の反応スキームを示す。この反応は、2−プロパノールおよび酸素を用いた補因子再生を伴う。
[図6]コラン酸の、中間体3α,7α−ジヒドロキシ−12−オキソ−5β−コラン酸および3α−ヒドロキシ−7,12−ジオキソ−5β−コラン酸を介した、3α,7β−ジヒドロキシ−12−オキソ−5β−コラン酸へのエピマー化の反応スキームを示す。この反応は、2−プロパノールおよびピルビン酸を用いた補因子再生を伴う。
[図7]コラン酸の、中間体3α,7α−ジヒドロキシ−12−オキソ−5β−コラン酸および3α−ヒドロキシ−7,12−ジオキソ−5β−コラン酸を介した、3α,7β−ジヒドロキシ−12−オキソ−5β−コラン酸へのエピマー化の反応スキームを示す。この反応は、2−プロパノールおよび酸素を用いた補因子再生を伴う。
[図8]コラン酸の、中間体3α,7α−ジヒドロキシ−12−オキソ−5β−コラン酸および3α−ヒドロキシ−7,12−ジオキソ−5β−コラン酸を介した、3α,7β−ジヒドロキシ−12−オキソ−5β−コラン酸へのエピマー化の反応スキームを示す。この反応は、2−プロパノール、ピルビン酸および酸素を用いた補因子再生を伴う。
[図9]コラン酸の、中間体3α,7α−ジヒドロキシ−12−オキソ−5β−コラン酸および3α−ヒドロキシ−7,12−ジオキソ−5β−コラン酸を介した、3α,7β−ジヒドロキシ−12−オキソ−5β−コラン酸へのエピマー化の反応スキームを示す。この反応は、2−プロパノール、ピルビン酸および酸素を用いた補因子再生を伴う。
[図10]コラン酸の、種々の中間体および補因子再生系を介した、3α,7β−ジヒドロキシ−12−オキソ−5β−コラン酸へのエピマー化の推定の反応スキームを示す。NAD+の再生には、代替的に乳酸デヒドロゲナーゼ(基質としてピルビン酸)およびNADHオキシダーゼ(基質として酸素)が使用された。NADPHの再生にはアルコールデヒドロゲナーゼ(基質としてイソプロパノール)が使用された。
[図11]チエノデオキシコラン酸の、中間体 3α−ヒドロキシ−7オキソ−5β−コラン酸 (7−ケトリトコラン酸=7K−LCA=KLC)を介した、ウルソデオキシコラン酸へのエピマー化の反応スキームを示す。この反応は、2−プロパノールおよび2−ペンタノール(いずれの場合も、アルコールデヒドロゲナーゼ)、ならびにピルビン酸(乳酸デヒドロゲナーゼ)および酸素(NADHオキシダーゼ)を用いた補因子再生を伴う。
BsSDH Bacillus subtilis由来の
ソルビトールデヒドロゲナーゼ
CA 3α,7α,12α−トリヒドロキシ−5β−コラン酸
7β−CA 3α,7β,12α−トリヒドロキシ−5β−コラン酸
Caoxo Clostridium aminovalericum由来の
NADH オキシダーゼ
CDC, CDCA 3α,7α−ジヒドロキシ−5β−コラン酸
CtXR Candida tropicalis由来の
キシロースレダクターゼ
7α−HSDH 7α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ
7β−HSDH 7β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ
12α−HSDH 12α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ
KLC 3α−ヒドロキシ−7−オキソ−5β−コラン酸
7K−LCA 3α−ヒドロキシ−7−オキソ−5β−コラン酸
LacDH 乳酸デヒドロゲナーゼ:NAD(H)−依存性
LkADH Lactobacillus kefir由来の
アルコールデヒドロゲナーゼ:NADP(H)−依存性
Lmoxid Leuconostoc mesenteroides由来の
NADHオキシダーゼ
MalDH E.coli由来のリンゴ酸デヒドロゲナーゼ
:NADP(H)−依存性
7oxo−CA 3α,12α−ジヒドロキシ−7−オキソ−5β−コラン酸
12oxo−CDC 3α,7α−ジヒドロキシ−12−オキソ−5β−コラン酸
12oxo−KLC 3α−ヒドロキシ−7,12−ジオキソ−5β−コラン酸
12oxo−UDC 3α,7β−ジヒドロキシ−12−オキソ−5β−コラン酸
SISDH ヒツジ肝ソルビトールデヒドロゲナーゼ
SmOxo Streptococcus mutans由来の
NADHオキシダーゼ
UDC, UDCA 3α,7β−ジヒドロキシ−5β−コラン酸。
EtOAc 酢酸エチル
h 時間(s)
IPA イソプロピルアルコール(2−プロパノール)
MeOH メタノール
Rt 室温。
[実施例1]
乳酸デヒドロゲナーゼおよびアルコールデヒドロゲナーゼに依存性の補因子再生系を用いる、7α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼおよび7β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼによる、チエノデオキシコール酸のウルソデオキシコール酸へのエピマー化
0.5mLのチャージは、50mg チエノデオキシコール酸、12U リコンビナント7α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ(E.coli由来)、6U リコンビナント7β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ(Ruminococcus torques由来)、ならびに0.5mM NAD+および0.3mM NADPHを含む。NAD+の再生のために、6U リコンビナント乳酸デヒドロゲナーゼおよび350mM ピルビン酸ナトリウムを用いる。NADPHの再生のために、6U リコンビナントアルコールデヒドロゲナーゼ(Lactobacillus kefir由来)および最初に2.4%(w/v)のIPAを用いる。この反応を、水性のリン酸カリウム緩衝液(100mM、pH=7.8)を25℃で連続的に振盪(850rpm)しながら用いる。アセトンの蒸発を容易にするために、そしてウルソデオキシコール酸へ向かう反応のシフトを容易にするために、開放系を使用し続ける。6時間後に1.6%(w/v) IPAを、16時間後に2.4%(w/v) IPAを、24時間後に3.9%(w/v) IPAを、40時間後に0.8%(w/v) IPAを、さらに加える。さらに、24時間後に20μLの4−メチル−2−ペンタノールを加える。46時間後に200μLの2−ペンタノールおよび1.6%(W/v) IPAを添加する。48時間後、反応混合物中の全ての胆汁酸におけるウルソデオキシコール酸の割合は、97%以上である。
乳酸デヒドロゲナーゼおよびリンゴ酸デヒドロゲナーゼに依存性の補因子再生系を用いる、7α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼおよび7β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼによる、チエノデオキシコール酸のウルソデオキシコール酸へのエピマー化
0.5mLのチャージは、50mg チエノデオキシコール酸、20U リコンビナント7α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ(E.coli由来)、20U リコンビナント7β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ(Ruminococcus torques由来)、ならびに1mM NAD+および1mM NADPHを含む。NAD+の再生のために、10U 乳酸デヒドロゲナーゼ(Sigma-Aldrich)を用い、反応開始のために、16.5mM ピルビン酸ナトリウムを用いる。NADPHの再生のために、20U リコンビナントリンゴ酸デヒドロゲナーゼ(E.coli由来)および320mM リンゴ酸ナトリウムを用いる。反応を、水性のリン酸カリウム緩衝液(100mM、pH=7.8)を25℃で連続的に振盪(850rpm)しながら用いる。初期のCO2からの回避を可能にするために、開放系を使用し続ける。20Uの7α−HSDHおよび10Uの7β−HSDHを、20時間後、24時間後、44時間後および48時間後に添加する。さらに、10Uのリンゴ酸デヒドロゲナーゼを40時間後に添加する。72時間後、反応混合物中の全ての胆汁酸におけるウルソデオキシコール酸の割合は、約90%である。
NADHオキシダーゼおよび乳酸デヒドロゲナーゼに依存性の補因子再生系を用いる、7α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼおよび7β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼによる、チエノデオキシコール酸のウルソデオキシコール酸へのエピマー化
0.5mLのチャージは、50mg チエノデオキシコール酸、12U リコンビナント7α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ(E.coli由来)、7.5U リコンビナント7β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ(Ruminococcus torques由来)、ならびに1mM NAD+および1mM NADPHを含む。NAD+の再生のために、20U リコンビナントのNADHオキシダーゼ(Clostridium aminovalericum由来)を用いる。NADPHの再生のために、5U リコンビナントアルコールデヒドロゲナーゼ(Lactobacillus kefir由来)および最初に2.4%(w/v)のIPAを用いる。反応を、水性のリン酸カリウム緩衝液(100mM、pH=7.8)を25℃で連続的に振盪(850rpm)しながら用いる。アセトンの蒸発を容易にするために、そしてウルソデオキシコール酸へ向かう反応のシフトを容易にするために、開放系を使用し続ける。2% IPAを、18時間後、22時間後、26時間後および41時間後に、そして5% IPAを41時間後および48時間後に添加する。20UのNADHオキシダーゼを、24時間後に添加し、7.5Uの7β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼおよび5Uのアルコールデヒドロゲナーゼを41時間後に添加する。48時間後、反応混合物中の全ての胆汁酸におけるウルソデオキシコール酸の割合は、約95〜98%である。
胆汁酸の再処理および分析
実施例1〜3に記載された反応が完了すると、反応混合物をEtOAcで抽出する。続いて、蒸発によって溶媒を除去する。蒸発の残余を、MeOH:アセトニトリル:リン酸ナトリウム緩衝液(pH=3)が40:30:37の混合物(0.78g/L)に溶解し、チエノデオキシコール酸のウルソデオキシコール酸への返還をHPLCによってモニタリングする。逆相分離カラム(ZORBAX(登録商標)Eclipse(登録商標) XDB C18,流速0.8mL/分)および光屈折検出器(RID)、Agilent 1260 Infinity(登録商標)(いずれもAgilent Technologies Inc.,)を使用する。
NADPHの再利用のためのアルコールデヒドロゲナーゼおよびNAD+の再利用のための乳酸デヒドロゲナーゼを用いる、キシロースレダクターゼおよびソルビトールデヒドロゲナーゼを介するグルコースのフルクトースへの変換
0.5mLのチャージは、50mg/mL グルコース、6U/mLのリコンビナントキシロースレダクターゼ(Candida tropicalis由来;E.coli BL21 (DE3)にて過剰発現させる)および0.1mM NADP+を含む。補因子の再生のために、7% IPAおよびリコンビナントアルコールデヒドロゲナーゼ(Lactobacillus kefir由来;E.coli BL21 (DE3)にて過剰発現させる)を用いる。これらの酵素を、細胞溶解物の形態にて使用する。反応を、開放系にて、pH9(50mM Tris・HCl緩衝液)、40℃で連続的に振盪(900rpm)しながら24時間行う。開放系は、アセトンの蒸発を導き、これは、ソルビトールの形成へ向けて反応を駆動する。この開放系において、水およびIPAもまた蒸発する。その結果、これらは6時間後及び21時間後に添加される。各時点で、総量0.5mLおよびIPA濃度(7%(v/v))を調整する。24時間後、反応容器を、酵素を不活性化しかつ有機溶媒を蒸発させるために、減圧下にて60℃でインキュベートする。室温への冷却後に、リコンビナントソルビトールデヒドロゲナーゼ(Bacillus subtilis由来;E.coli BL21 (DE3)にて過剰発現させる)を、最終濃度5U/mLで添加し、ZnCl2を最終濃度1mMで、NAD+を最終濃度0.1mMで添加する。補因子再生系のために、5U/mL(最終濃度)の乳酸デヒドロゲナーゼ(ウサギ筋肉由来(Sigma Aldrich))および300mMピルビン酸を使用する。このチャージを水で0.5mLにする。この反応を、閉鎖系にて40℃で連続的に振盪(900rpm)しながら24時間さらに行う。D−グルコースのD−フルクトースへの変換は90%以上に達する。
NADPHを再利用するためのアルコールデヒドロゲナーゼおよびNAD+を再利用するためのNADHオキシダーゼを用いる、キシロースレダクターゼおよびソルビトールデヒドロゲナーゼを介するグルコースのフルクトースへの変換
0.5mLのチャージは、50mg/mL グルコース、6U/mLのリコンビナントキシロースレダクターゼ(Candida tropicalis由来;E.coli BL21 (DE3)にて過剰発現させる)および0.1mM NADP+を含む。補因子の再生のために、7%(v/v) IPAおよびリコンビナントアルコールデヒドロゲナーゼ(Lactobacillus kefir由来;E.coli BL21 (DE3)にて過剰発現させる)を用いる。これらの酵素を、細胞溶解物の形態にて使用する。反応を、開放系にて、pH8(50mM Tris・HCl緩衝液)、40℃で連続的に振盪(900rpm)しながら24時間行う。開放系は、アセトンの蒸発を導き、これは、ソルビトールの形成へ向けて反応を駆動する。この開放系において、水およびIPAもまた蒸発する。その結果、これらは6時間後及び21時間後に添加される。各時点で、総量0.5mLおよびIPA濃度(7%(v/v))を調整する。24時間後、反応容器を、酵素を不活性化しかつIPAおよび形成された任意のアセトンを蒸発させるために、減圧下にて60℃でインキュベートする。室温への冷却後に、リコンビナントD−ソルビトールデヒドロゲナーゼ(Bacillus subtilis由来;E.coli BL21 (DE3)にて過剰発現させる)を、最終濃度5U/mLで添加し、CaCl2を最終濃度1mMで、NAD+およびNADHを最終濃度0.1mMで添加する。補因子再生系のために、10U/mL(最終濃度)のNADH(Lactobacillus kefir由来;E.coli BL21 (DE3)にて過剰発現させる)を使用する。これらの酵素を、細胞溶解物の形態にて使用する。このチャージを水で0.5mLにする。この反応を、NADHオキシダーゼのために空気中から十分な酸素の供給を保証するために、開放系にて40℃で連続的に振盪(900rpm)しながら24時間行う。6時間後および21時間後にこのチャージを水で容積0.5mLにする。D−グルコースのD−フルクトースへの変換は98%に達する。
糖の再処理および分析
酵素を不活性化するためにチャージを65℃で10分間インキュベートし、続いて遠心分離する。次いで、上清を、0.2μM PVDF膜で濾過し、リガンド交換HPLC(Agilent Technologies Inc.)によって分析する。この際に、水(VWR International GmbH, HPLC Grade)を流速0.5mL/分、80℃で用いるリードカラム(Showa Denko K.K. (Shodex(登録商標) Sugar SP0810))を介して、糖とポリオールとを分離する。Agilent Technologies Inc.のインラインフィルター、プレカラムとしての陰イオン交換カラム(Shodex(登録商標) Axpak-WAG)、逆相カラム(Shodex(登録商標) Asahipak(登録商標) ODP-50 6E)およびShowa Denko K.K.の糖プレカラム(SUGAR SP-G)を用いる。
乳酸デヒドロゲナーゼおよびアルコールデヒドロゲナーゼに依存性の補因子再生系を用いる、12α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、7α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼおよび7β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼによる、コラン酸の3α,7β−ジヒドロキシ−12−オキソ−5β−コラン酸への変換
0.5mLのチャージは、25mgのコラン酸、12.5Uのリコンビナント12α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ(Eggertella lentaまたはLysinibacillus sphaericusに由来)、16Uのリコンビナント7α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ(E.coli由来)、6Uのリコンビナント7β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ(Ruminococcus torques由来)、ならびに1mM NAD+および1mM NADPHを含む。NAD+の再生のために、12.5Uのリコンビナント乳酸デヒドロゲナーゼ(Oryctolagus cuniculus由来;筋肉アイソフォーム)および200mM ピルビン酸ナトリウムを使用する。NADPHの再生のために、5Uのリコンビナントアルコールデヒドロゲナーゼ(Lactobacillus kefir由来)および最初は2%のIPA(w/v)を使用する。反応を、水性のリン酸カリウム緩衝液(100mM、pH7.8)中にて25℃で連続的に振盪しながら行う(850rpm)。アセトンの蒸発を可能にし、反応を3α,7β−ジヒドロキシ−12−オキソ−5β−コラン酸へシフトさせるために、開放系をさらに使用する。18時間後及び24時間後に、2% IPA(w/v)をさらに添加する。48時間後に、使用したコラン酸(61%)が、3α,7α−ジヒドロキシ−12−オキソ−5β−コラン酸と反応する。
乳酸デヒドロゲナーゼ、NADHオキシダーゼおよびアルコールデヒドロゲナーゼに依存性の補因子再生系を用いる、12α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、7α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼおよび7β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼによる、コラン酸の3α,7β−ジヒドロキシ−12−オキソ−5β−コラン酸への変換
0.5mLのチャージは、25mgのコラン酸、12.5Uのリコンビナント12α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ(Eggertella lentaまたはLysinibacillus sphaericusに由来)、16Uのリコンビナント7α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ(E.coli由来)、6Uのリコンビナント7β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ(Ruminococcus torques由来)、ならびに1mM NAD+および1mM NADPHを含む。NAD+の再生のために、5UのリコンビナントNADHオキシダーゼ(Leuconostoc mesenteroides由来)、12.5Uのリコンビナント乳酸デヒドロゲナーゼ(Oryctolagus cuniculus由来;筋肉アイソフォーム)および200mM ピルビン酸ナトリウムを使用する。NADPHの再生のために、5Uのリコンビナントアルコールデヒドロゲナーゼ(Lactobacillus kefir由来)および最初は2%のIPA(w/v)を使用する。反応を、水性のリン酸カリウム緩衝液(100mM、pH7.8)中にて25℃で連続的に振盪しながら行う(850rpm)。アセトンの蒸発を可能にし、反応を3α,7β−ジヒドロキシ−12−オキソ−5β−コラン酸へシフトさせるために、開放系をさらに使用する。18時間後及び24時間後に、2% IPA(w/v)をさらに添加する。48時間後に、使用したコラン酸(70%)が、3α,7α−ジヒドロキシ−12−オキソ−5β−コラン酸と反応する。
乳酸デヒドロゲナーゼおよびアルコールデヒドロゲナーゼに依存性の補因子再生系を用いる、7α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼおよび7β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼによる、チエノデオキシコール酸のウルソデオキシコール酸へのエピマー化.マンガンコロイド(MnCl2)を添加する利点
0.5mLのチャージは、50mgチエノデオキシコラン酸、12Uのリコンビナント7α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ(E.coli由来)、6Uのリコンビナント7β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ(Ruminococcus torques由来)、ならびに0.5mM NAD+および0.3mM NADPHを含む。NAD+の再生のために、6Uのリコンビナント乳酸デヒドロゲナーゼおよび350mM ピルビン酸ナトリウムを使用する。NADPHの再生のために、6Uのリコンビナントアルコールデヒドロゲナーゼ(Lactobacillus kefir由来)および最初は2.4%のIPA(w/v)を使用する。反応を、5mMのMnCl2を含む水性のリン酸カリウム緩衝液(100mM、pH7.8)中にて25℃で連続的に振盪しながら行う(850rpm)。アセトンの蒸発を可能にし、反応をウルソデオキシコラン酸へシフトさせるために、開放系をさらに使用する。1.6% IPA(w/v)を6時間後に、2.4% IPA(w/v)を16時間後に、3.9% IPA(w/v)を24時間後にさらに添加する。36時間後に、200μLの2−ペンタノールおよび3%(w/v)のIPAを添加し、48時間後に、100μLの2−ペンタノールおよび4%(w/v)のIPAをさらに添加する。64時間後に、反応混合物中において胆汁酸の全てのウルソデオキシコラン酸の割合は99%以上である。特に、チエノデオキシコラン酸の割合は0.3%である。MnCl2を添加しないコントロールチャージにおいて、チエノデオキシコラン酸の割合は2%であり、ウルソデオキシコラン酸の割合は97.5%である(5回の実験からの平均値)。
アルコールデヒドロゲナーゼに依存性の補因子再生系を乳酸デヒドロゲナーゼおよびNADHオキシダーゼに依存性の補因子再生系と組み合わせて用いる、7α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼおよび7β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼによる、チエノデオキシコール酸のウルソデオキシコール酸へのエピマー化
0.5mLのチャージは、50mgチエノデオキシコラン酸、12Uのリコンビナント7α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ(E.coli由来)、6Uのリコンビナント7β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ(Ruminococcus torques由来)、ならびに0.5mM NAD+および0.3mM NADPHを含む。NAD+の再生のために、6Uのリコンビナント乳酸デヒドロゲナーゼおよび350mM ピルビン酸ナトリウムを使用する。NAD+の再生のために、9UのリコンビナントNADHオキシダーゼ(Leuconostoc mesenteroides由来)および6UのリコンビナントNADHオキシダーゼ(Clostridium aminovalericum由来)をさらに使用する。NADPHの再生のために、6Uのリコンビナントアルコールデヒドロゲナーゼ(Lactobacillus kefir由来)および最初は2.4%のIPA(w/v)を使用する。反応を、水性のリン酸カリウム緩衝液(100mM、pH7.8)中にて25℃で連続的に振盪しながら行う(850rpm)。アセトンの蒸発を可能にし、反応をウルソデオキシコラン酸へシフトさせるために、開放系をさらに使用する。1.6% IPA(w/v)を6時間後に、2.4% IPA(w/v)を16時間後に、3.9% IPA(w/v)を24時間後にさらに添加する。36時間後に、200μLの2−ペンタノールおよび3%(w/v)のIPAを添加し、48時間後に、100μLの2−ペンタノールおよび4%(w/v)のIPAをさらに添加する。64時間後に、反応混合物中において胆汁酸の全てのウルソデオキシコラン酸の割合は99%以上である。特に、チエノデオキシコラン酸の割合は0.2%である。NADHオキシダーゼを添加しないコントロールチャージにおいて、チエノデオキシコラン酸の割合は2%であり、ウルソデオキシコラン酸の割合は97.5%である(実施例11におけるコントロールチャージと同じ;5回の実験からの平均値)。
アルコールデヒドロゲナーゼに依存性の補因子再生系を乳酸デヒドロゲナーゼおよびNADHオキシダーゼに依存性の補因子再生系と組み合わせて用いる、7α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼおよび7β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼによる、チエノデオキシコール酸のウルソデオキシコール酸へのエピマー化.2−ペンタノールおよび2−プロパノールのさらなる利点
50mLのチャージは、5gチエノデオキシコラン酸、24Uのリコンビナント7α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ(E.coli由来)、12Uのリコンビナント7β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ(Ruminococcus torques由来)、ならびに0.55mM NAD+および0.3mM NADPHを含む。NAD+の再生のために、12Uのリコンビナント乳酸デヒドロゲナーゼおよび350mM ピルビン酸ナトリウムを使用する。NAD+の再生のために、18UのリコンビナントNADHオキシダーゼ(Leuconostoc mesenteroides由来)および12UのリコンビナントNADHオキシダーゼ(Clostridium aminovalericum由来)をさらに使用する。NADPHの再生のために、12Uのリコンビナントアルコールデヒドロゲナーゼ(Lactobacillus kefir由来)および最初は1.5%のIPA(w/v)を使用する。反応を、5mMのMnCl2を含む水性のリン酸カリウム緩衝液(100mM、pH7.8)中にて25℃で連続的に振盪しながら行う(850rpm)。三方活栓中で、KPGスターラを用いて100rpmで攪拌する。反応から産生するアセトンの除去は、反応容器を通すエアスチーム(400〜600mL/分)によってもたらされる。同時に2−プロパノールが同様に蒸発されるので、さらなる添加(例えば、0.75mL(1、5h)、0.75mL(3h)、0.5mL(4h)、0.75mL(6h)、0.75mL(8h)、0.5mL(11h)、0.5mL(14h)、0.5mL(17h)、0.5mL(21h)、1mL(23h)、2.5mL(25h)、4mL(29h))が必要である。30h後に、20mLの2−ペンタノールおよび2mLの2−プロパノールを添加する。総反応時間の46時間後に、7−ケトリトコラン酸の割合は、(チエノデオキシコラン酸、ウルソデオキシコラン酸および7−ケトリトコラン酸の合計に対して)約1%である。さらに、2−プロパノールを添加し(3mL(46h)、4mL(52h)、4mL(54h))、10mLの2−ペンタノールを添加する。総反応時間の72時間後に、7−ケトリトコラン酸の割合は、0.2%を下回り得る。ウルソデオキシコラン酸の割合は99%以上である。
胆汁酸の検査および分析
実施例8〜12に記載した反応の完了後に、試験に存在した胆汁酸を、実施例4に記載の方法によって分析し得る。
Claims (19)
- 1ポットでの反応にて酸化還元補因子NAD+/NADHおよびNADP+/NADPHの少なくとも一方を酵素的に再生するためのプロセスであって、
同一の反応バッチ内で進行する、さらに少なくとも2つの、酵素学的に触媒された酸化還元反応(生成物形成反応)の結果として、この酸化還元補因子NAD + /NADHが還元型(NADH)にて堆積し、この酸化還元補因子NADP + /NADPHが酸化型(NADP + )にて堆積し、
a)NADHをその元々の酸化型へ変換する再生反応において、酸素またはピルビン酸がそれぞれNADHオキシダーゼまたは乳酸脱水素酵素によって還元され、
b)NADP + をその元々の還元型へ変換する再生反応において、2−プロパノールまたはリンゴ酸がそれぞれアルコールデヒドロゲナーゼまたはリンゴ酸デヒドロゲナーゼによって酸化される、プロセス。 - 酸化反応および還元反応が同一の分子骨格に対して行われる、請求項1に記載のプロセス。
- 前記酸化反応および前記還元反応が時間的に並行して進行する、請求項1または2に記載のプロセス。
- 前記NADP + をNADPHへ変換する前記再生反応において、2−プロパノールが、アルコールデヒドロゲナーゼによってアセトンへ酸化される、請求項1〜3のいずれか1項に記載のプロセス。
- 前記NADHをNAD + へ変換する前記再生反応において、ピルビン酸が、乳酸デヒドロゲナーゼによって乳酸へ還元される、請求項1〜3のいずれか1項に記載のプロセス。
- 前記NADP + をNADPHへ変換する前記再生反応において、リンゴ酸が、リンゴ酸デヒドロゲナーゼによってピルビン酸およびCO2へ酸化される、請求項5に記載のプロセス。
- 一般式III
の化合物に対して、前記同一の反応バッチ内において、少なくとも1つの酸化反応および少なくとも1つの還元反応をそれぞれ行うために使用される、請求項1〜5のいずれか1項に記載のプロセスであって、
ここで、R4は、水素、メチル基、ヒドロキシ基またはオキソ基を示し、
R5は、水素、ヒドロキシ基、オキソ基またはメチル基を示し、
R6は、水素またはヒドロキシ基を示し、
R7は、水素、−COR13(ここで、R13は、非置換であるかまたはヒドロキシ基で置換されているC1−C4アルキル基、あるいは、非置換であるかまたは置換されているC1−C4カルボキシアルキル基である。)を示し、
または、R6およびR7は一緒になってオキソ基を示し、
R8は、水素、メチル基、ヒドロキシ基またはオキソ基を示し、
R9は、水素、メチル基、ヒドロキシ基またはオキソ基を示し、
R10は、水素、メチル基、またはハロゲンを示し、
R11は、水素、メチル基、ヒドロキシ基、オキソ基またはハロゲンを示し、そして
R12は、水素、ヒドロキシ基、オキソ基またはメチル基を示し、
ここで、下記構造要素
は、ベンゼン環、あるいは6個の炭素原子および0〜2個のC−C二重結合を含んでいる環を示す、プロセス。 - R7は−COR13を示し、ここで、R13はヒドロキシ基で置換されているC1−C4カルボキシアルキル基である、請求項7に記載のプロセス。
- 前記酸化反応が、E.coli由来の7α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼによって触媒されるか、および/または、前記還元反応が、Ruminococcus torques由来の7β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼによって触媒される、請求項10に記載のプロセス。
- 3つの立体特異性のヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼを用い、該3つのうちの2つが対称性の立体特異体である、請求項7に記載のプロセスであって、
一般式IX
の3α,7α,12α−トリヒドロキシ−5β−コラン酸(コラン酸)の、下記(A)〜(C)のいずれかの反応を介する酵素的なエピマー化に使用される、プロセス:
(A)酸化によって、一般式X
の3α,7β−ジヒドロキシ−12−オキソ−5β−コラン酸(12−オキソ−CDC)を得、上記12−オキソ−CDCが、さらに反応されて一般式XI
の3α−ヒドロキシ−7,12−ジオキソ−5β−コラン酸(12−オキソ−KLC)を得、そして、引き続く還元によって一般式XII
の立体異性体ヒドロキシ化合物3α,7β−ジヒドロキシ−12−オキソ−5β−コラン酸(12−ケト−ウルソデオキシコラン酸)を得る、反応;
(B)酸化によって、一般式XIII
の3α,12α−ジヒドロキシ−7−オキソ−5β−コラン酸を得、引き続く酵素的な酸化によって、一般式XI
の3α−ヒドロキシ−7,12−ジオキソ−5β−コラン酸(12−オキソ−KLC)を得、そして、引き続く還元によって一般式XIIの立体異性体ヒドロキシ化合物3α,7β−ジヒドロキシ−12−オキソ−5β−コラン酸(12−ケト−ウルソデオキシコラン酸)を得る、反応;
(C)酸化によって、一般式XIIIの3α,12α−ジヒドロキシ−7−オキソ−5β−コラン酸を得、引き続く酵素的な還元によって、一般式XIV
の3α,7α,12α−トリヒドロキシ−5β−コラン酸を得、そして、引き続く酸化によって一般式XIIの立体異性体ヒドロキシ化合物3α,7β−ジヒドロキシ−12−オキソ−5β−コラン酸(12−ケト−ウルソデオキシコラン酸)を得る、反応。 - C5糖またはC6糖の異性化に使用される、請求項1〜6のいずれか1項に記載のプロセス。
- ソルビトールへの還元、引き続くフルクトースへの酸化を介したグルコースの異性化に使用される、請求項13に記載のプロセス。
- 生成物の形成に関与する前記酸化反応の基質が、前記反応バッチにおいて、少なくとも5%(w/v)またはそれよりも多い濃度で提供される、請求項1〜14のいずれか1項に記載のプロセス。
- 生成物の形成に関与する前記酸化反応の基質が、前記反応バッチにおいて、少なくとも7%(w/v)またはそれよりも多い濃度で提供される、請求項15に記載のプロセス。
- 生成物の形成に関与する前記酸化反応の基質が、前記反応バッチにおいて、少なくとも9%(w/v)またはそれよりも多い濃度で提供される、請求項16に記載のプロセス。
- 前記生成物形成反応において、70%以上のターンオーバーが達成される、請求項1〜17のいずれか1項に記載のプロセス。
- 前記生成物形成反応において、90%以上のターンオーバーが達成される、請求項18に記載のプロセス。
Applications Claiming Priority (7)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP12450007.5 | 2012-02-07 | ||
EP12450007 | 2012-02-07 | ||
PCT/EP2012/067781 WO2013117251A1 (de) | 2012-02-07 | 2012-09-12 | Verfahren zur enzymatischen regenerierung von redoxkofaktoren |
EPPCT/EP2012/067781 | 2012-09-12 | ||
ATA1284/2012 | 2012-12-10 | ||
AT12842012A AT513721B1 (de) | 2012-12-10 | 2012-12-10 | Verfahren zur enzymatischen Regenerierung von Redoxkofaktoren |
PCT/EP2013/052313 WO2013117584A1 (de) | 2012-02-07 | 2013-02-06 | Verfahren zur enzymatischen regenerierung von redoxkofaktoren |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2015506707A JP2015506707A (ja) | 2015-03-05 |
JP6329086B2 true JP6329086B2 (ja) | 2018-05-23 |
Family
ID=48946925
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2014556034A Active JP6329086B2 (ja) | 2012-02-07 | 2013-02-06 | 酸化還元補因子の酵素的な再生のためのプロセス |
Country Status (29)
Country | Link |
---|---|
US (3) | US9644227B2 (ja) |
EP (1) | EP2812439B1 (ja) |
JP (1) | JP6329086B2 (ja) |
KR (1) | KR102022137B1 (ja) |
CN (2) | CN104136620A (ja) |
AR (1) | AR089841A1 (ja) |
AU (1) | AU2013218042B2 (ja) |
BR (1) | BR112014019287B1 (ja) |
CA (1) | CA2862384C (ja) |
ES (1) | ES2742381T3 (ja) |
HK (1) | HK1204010A1 (ja) |
HR (1) | HRP20191514T1 (ja) |
HU (1) | HUE044690T2 (ja) |
IN (1) | IN2014DN07015A (ja) |
LT (1) | LT2812439T (ja) |
MX (1) | MX358771B (ja) |
MY (1) | MY172493A (ja) |
NZ (1) | NZ627477A (ja) |
PH (1) | PH12014501770B1 (ja) |
PL (1) | PL2812439T3 (ja) |
PT (1) | PT2812439T (ja) |
RS (1) | RS59114B1 (ja) |
RU (1) | RU2635087C2 (ja) |
SA (1) | SA113340270B1 (ja) |
SG (1) | SG11201404614XA (ja) |
SI (1) | SI2812439T1 (ja) |
TW (1) | TW201343623A (ja) |
UA (1) | UA117453C2 (ja) |
WO (1) | WO2013117584A1 (ja) |
Families Citing this family (24)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
TW201343623A (zh) | 2012-02-07 | 2013-11-01 | Annikki Gmbh | 使氧化還原輔因子經酶催化再生之方法 |
AT513928B1 (de) | 2013-02-06 | 2015-06-15 | Annikki Gmbh | Verfahren zur Herstellung von Fructose |
WO2014154676A1 (de) * | 2013-03-27 | 2014-10-02 | Annikki Gmbh | Verfahren zur isomerisierung von glucose |
EP3636743A1 (en) * | 2014-04-02 | 2020-04-15 | The Regents of The University of California | A synthetic biochemistry molecular purge valve module that maintains co-factor balance |
US9890397B1 (en) | 2015-07-15 | 2018-02-13 | Gaurab Chakrabarti | Hydrogen peroxide production method, system, and apparatus |
US20180216142A1 (en) * | 2015-07-24 | 2018-08-02 | Annikki Gmbh | Process for enzymatic production of oxidation and reduction products of mixed sugars |
CN105861613B (zh) * | 2016-03-30 | 2019-12-13 | 中山百灵生物技术有限公司 | 一种熊去氧胆酸制备方法 |
WO2017202686A1 (de) | 2016-05-23 | 2017-11-30 | Annikki Gmbh | Verfahren zur enzymatischen umwandlung von d-glucose in d-fructose via d-sorbitol |
WO2018036982A1 (de) * | 2016-08-22 | 2018-03-01 | Pharmazell Gmbh | Chemisch-biokatalytisches verfahren zur herstellung von ursodesoxycholsäure |
US11203769B1 (en) | 2017-02-13 | 2021-12-21 | Solugen, Inc. | Hydrogen peroxide and gluconic acid production |
CN106957886A (zh) * | 2017-03-01 | 2017-07-18 | 南京远淑医药科技有限公司 | 一种熊去氧胆酸的制备方法 |
CN107315038B (zh) * | 2017-07-06 | 2019-06-18 | 江南大学 | 一种批量化对酒类样品中氨基甲酸乙酯快速测定的方法 |
JP6559745B2 (ja) | 2017-08-23 | 2019-08-14 | 株式会社東芝 | 半導体デバイス検査装置、半導体デバイス検査方法、そのプログラム、半導体装置およびその製造方法 |
CN108251491A (zh) * | 2018-03-09 | 2018-07-06 | 中山百灵生物技术有限公司 | 一种酶促法合成熊去氧胆酸的方法 |
EP3775178A4 (en) * | 2018-04-06 | 2022-01-05 | Braskem S.A. | NEW NADH-DEPENDENT ENZYMMUTANTS FOR THE CONVERSION OF ACETONE INTO ISOPROPANOL |
CN109055473A (zh) * | 2018-08-21 | 2018-12-21 | 湖南宝利士生物技术有限公司 | 一种基于酶法偶联技术合成熊去氧胆酸和高手性纯度d-氨基酸的方法 |
CN111217744A (zh) * | 2018-11-26 | 2020-06-02 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一种d-氨基酸基nad+类似物及其合成和应用 |
CN109486896A (zh) * | 2018-12-04 | 2019-03-19 | 南京工业大学 | 一种催化拆分制备异甘草酸的方法 |
CN109486895A (zh) * | 2018-12-04 | 2019-03-19 | 南京工业大学 | 一种催化拆分制备异甘草酸的方法 |
CN110387360B (zh) * | 2019-06-18 | 2021-12-28 | 华东理工大学 | 羟基类固醇脱氢酶及其在合成熊去氧胆酸前体中的应用 |
CN111593085A (zh) * | 2020-05-26 | 2020-08-28 | 四川澄华生物科技有限公司 | 一种12-酮基胆酸的制备方法 |
CN112813128A (zh) * | 2021-01-12 | 2021-05-18 | 中山百灵生物技术股份有限公司 | 一种别熊去氧胆酸的合成方法 |
KR102504343B1 (ko) | 2021-02-22 | 2023-02-28 | 전남대학교산학협력단 | 단량체 이소시트레이트 디하이드로게나아제에 기반한 nadph 재생 시스템 및 이의 용도 |
CN116536279B (zh) * | 2022-01-25 | 2023-11-14 | 杭州馨海酶源生物科技有限公司 | 一种基因工程菌及在制备去氢表雄酮上的应用 |
Family Cites Families (14)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE3502141A1 (de) * | 1985-01-23 | 1986-10-16 | Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V., 8000 München | Verfahren zur intrasequentiellen cofaktor-regeneration bei enzymatischen synthesen, insbesondere bei der herstellung von vitamin c |
CZ20012792A3 (cs) | 1999-12-03 | 2002-03-13 | Kaneka Corporation | Polypeptid, polynukleotid kódující polypeptid, expresní vektor, transformant a způsob přípravy |
DE10140088A1 (de) | 2001-08-16 | 2003-03-13 | Degussa | NADH-Oxidase aus Lactobacillus |
AU2003257986A1 (en) | 2002-07-31 | 2004-02-16 | Georgia Tech Research Corporation | Methods and compositions for nad(p)(h) oxidases |
DE10240603A1 (de) | 2002-09-03 | 2004-03-11 | Degussa Ag | Verwendung von Malat-Dehydrogenase zur NADH-Regenerierung |
EP1731618A1 (en) | 2005-06-07 | 2006-12-13 | Prodotti Chimici E Alimentari Spa | Process for the selective oxydation of colic acid |
AT503486B1 (de) * | 2006-04-11 | 2008-05-15 | Iep Gmbh | Verfahren zur enantioselektiven reduktion von steroiden |
EP1925674A1 (en) | 2006-11-27 | 2008-05-28 | Universiteit van Amsterdam | Regeneration of NADPH and/or NADH cofactors |
AT506639A1 (de) | 2008-04-01 | 2009-10-15 | Kroutil Wolfgang Dipl Ing Dr T | Verfahren zur deracemisierung von enantiomerengemischen unter verwendung von enzymsystemen |
IT1398729B1 (it) | 2009-07-01 | 2013-03-18 | F S I Fabbrica Italiana Sint | Processo per la preparazione di testosterone |
JP2013511973A (ja) * | 2009-11-30 | 2013-04-11 | ファルマツェル、ゲーエムベーハー | 新規7β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼおよびその使用 |
US8530213B2 (en) | 2009-12-02 | 2013-09-10 | Georgia Tech Research Corporation | Compositions and methods for using NADH oxidases |
WO2013117251A1 (de) | 2012-02-07 | 2013-08-15 | Annikki Gmbh | Verfahren zur enzymatischen regenerierung von redoxkofaktoren |
TW201343623A (zh) | 2012-02-07 | 2013-11-01 | Annikki Gmbh | 使氧化還原輔因子經酶催化再生之方法 |
-
2013
- 2013-01-28 TW TW102103119A patent/TW201343623A/zh unknown
- 2013-01-29 AR ARP130100266A patent/AR089841A1/es active IP Right Grant
- 2013-02-05 SA SA113340270A patent/SA113340270B1/ar unknown
- 2013-02-06 SI SI201331563T patent/SI2812439T1/sl unknown
- 2013-02-06 US US14/376,512 patent/US9644227B2/en active Active
- 2013-02-06 AU AU2013218042A patent/AU2013218042B2/en active Active
- 2013-02-06 IN IN7015DEN2014 patent/IN2014DN07015A/en unknown
- 2013-02-06 CN CN201380008572.8A patent/CN104136620A/zh active Pending
- 2013-02-06 CN CN202110638003.8A patent/CN113337568A/zh active Pending
- 2013-02-06 LT LTEP13703568.9T patent/LT2812439T/lt unknown
- 2013-02-06 KR KR1020147023136A patent/KR102022137B1/ko active IP Right Grant
- 2013-02-06 RU RU2014136162A patent/RU2635087C2/ru active
- 2013-02-06 PT PT13703568T patent/PT2812439T/pt unknown
- 2013-02-06 BR BR112014019287-1A patent/BR112014019287B1/pt active IP Right Grant
- 2013-02-06 SG SG11201404614XA patent/SG11201404614XA/en unknown
- 2013-02-06 PL PL13703568T patent/PL2812439T3/pl unknown
- 2013-02-06 HU HUE13703568 patent/HUE044690T2/hu unknown
- 2013-02-06 MY MYPI2014702060A patent/MY172493A/en unknown
- 2013-02-06 JP JP2014556034A patent/JP6329086B2/ja active Active
- 2013-02-06 UA UAA201409679A patent/UA117453C2/uk unknown
- 2013-02-06 EP EP13703568.9A patent/EP2812439B1/de active Active
- 2013-02-06 NZ NZ627477A patent/NZ627477A/en unknown
- 2013-02-06 ES ES13703568T patent/ES2742381T3/es active Active
- 2013-02-06 CA CA2862384A patent/CA2862384C/en active Active
- 2013-02-06 RS RS20191065A patent/RS59114B1/sr unknown
- 2013-02-06 WO PCT/EP2013/052313 patent/WO2013117584A1/de active Application Filing
- 2013-02-06 MX MX2014009455A patent/MX358771B/es active IP Right Grant
-
2014
- 2014-08-06 PH PH12014501770A patent/PH12014501770B1/en unknown
-
2015
- 2015-05-06 HK HK15104308.2A patent/HK1204010A1/xx unknown
-
2017
- 2017-04-18 US US15/490,416 patent/US10370691B2/en active Active
-
2019
- 2019-06-25 US US16/451,838 patent/US11339415B2/en active Active
- 2019-08-22 HR HRP20191514 patent/HRP20191514T1/hr unknown
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6329086B2 (ja) | 酸化還元補因子の酵素的な再生のためのプロセス | |
Hummel et al. | Strategies for regeneration of nicotinamide coenzymes emphasizing self-sufficient closed-loop recycling systems | |
Rehn et al. | Application of NAD (P) H oxidase for cofactor regeneration in dehydrogenase catalyzed oxidations | |
CA2633736C (en) | Process for the enantioselective reduction of oxidation, respectively, of steroids | |
JP2006340718A (ja) | コール酸の選択的酸化のための方法 | |
Knaus et al. | Ene‐reductases and their Applications | |
WO2013117251A1 (de) | Verfahren zur enzymatischen regenerierung von redoxkofaktoren | |
KR101948948B1 (ko) | 담즙산, 이들의 염 또는 유도체의 선택적 산화를 위한 신규한 공정 | |
US20110070630A1 (en) | Method for deracemization of enantiomer mixtures | |
CA2900310C (en) | Method for producing fructose | |
Ferrandi et al. | New trends in the in situ enzymatic recycling of NAD (P)(H) cofactors | |
AT513721B1 (de) | Verfahren zur enzymatischen Regenerierung von Redoxkofaktoren | |
Ferrandi | New microbial hydroxysteroid dehydrogenases and their synthetic application for the selective modification of bile acids. | |
JP2000224984A (ja) | 新規な2級アルコール脱水素酵素、この酵素の製造方法、およびアルコール、アルデヒド、ケトンの製造方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20160113 |
|
A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20161027 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20161122 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20170221 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20170419 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20170905 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20171228 |
|
RD02 | Notification of acceptance of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7422 Effective date: 20171228 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20171228 |
|
A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20180123 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20180327 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20180419 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6329086 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |