JP2013511973A - 新規7β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼおよびその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
CA→CAメチルエステル→3,7−ジアセチル−CAメチルエステル→12−ケト−3,7−ジアセチル−CAメチルエステル→CDCA→7−ケト−LCA→UDCA
重大な欠点は、化学的酸化は選択的でないため、カルボキシ基と、3αおよび7α−ヒドロキシ基をエステル化によって保護しなければならないことである。
CA→12−ケトCDCA→CDCA→7−ケト−LCA→UDCA
ここで12α−HSDHはCAを12−ケトCDCAへ選択的に酸化する。古典的な化学的方法により必要な二つの保護ステップはこれによって不必要になる。
CA→7,12−ジケトLCA→12−ケトUDCA→UDCA
CA→DHCA→12−ケトUDCA→UDCA
ここでCAの酸化は古典的な化学的方法で簡単に実施される。DHCAは7β−HSDHおよび3α−HSDHにより個々にまたは順次または同時に12−ケトUDCAへ還元される。Wolff−Kishner還元と組合わせて、UDCAはこのようにCAからたった3工程で合成することができる。
1.好気性バクテリア、特にCollinsella aerofaciens DSM3979(ATCC25986)株のようなCollinsella属から得ることができる7β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ(7β−HSDH)およびそれから誘導される機能性均等物:
本発明に従ってCollinsella aerofaciens DSM3979から得ることができる7β−HSDHは、特に以下の性質の少なくとも一つ、例えば2,3,4,5,6または7、またはこれら性質のすべてによって特徴化される。
a)分子量(SDSゲル電気泳動)約28−32kDa、特に約29〜31kDaまたは約30kDa。
b)分子量(特にSDSなしのような非変性条件下でのゲル濾過)約53ないし60kDa,特に約55ないし57kDa,例えば約56.1kDa:これによって本発明に従った酵素は、Hirano et al.(前出)によって記載されたC.aerofaciens ATCC25986からの45kDaの7β−HSDHと明らかに異なる。これはCollinsella aerofaciens DSM3979からの7β−HSDHのダイマー性格(4重構造)を確認する。
c)7−ケトLCAの7−カルボニル基の7β−ヒドロキシ基への立体選択的還元:
d)pH8.5ないし10.5、特に9ないし10の範囲のUDCAの酸化のためのpH最適条件。
e)pH3.5ないし6.5、特にpH4ないし6の範囲のDHCAおよび7−ケトLCAの還元のためのpH最適条件、これによりpHの選択により酸化プロセス(特徴d)の)および還元プロセスに影響を与える驚くべき可能性がある。
f)下表に特定的に示したそれぞれの値を中心にして±20%、特に±10%、±5%、±3%、±2%または±1%の範囲内の下表に示した物質/助因子の少なくとも一つに対する下表からの少なくとも一つの動力学的パラメータ。
b)1U=1μmol/min
c)これにより本発明に従った酵素は、明らかに低いKmおよびVmax値(それぞれ0.4および0.2)が記載され、そしてNADPHに対する活性が測定されなかったHirano et al.によるC.aerofaciens ATCC25986からの7β−HSDH酵素(前出)とは明らかに異なる。
g)Cavia porcellus,Homo sapiensおよびMus musulusを含む動物11β−HSDHに対するCollinsella aerofaciens DSM3979からの原核性7β−HSDHの系統学的類縁性。
本発明に従った7β−HSDHは、例えば以下の性質または性質の組合わせを示す。
a);b);a)とb);a)および/またはb)およびc);a)および/またはb)およびc)およびd);a)および/またはb)およびc)およびd)およびe);a)および/またはb)およびc)およびd)およびe)およびf)。
a)7−ケトステロイドを対応する7β−ヒドロキシステロイドへの立体特異的還元(水素化)、および/または
b)7位にケト基と、そしてステロイド骨格上に少なくとも一つのさらなるケト基を含んでいるケトステロイドの対応する7β−ヒドロキシステロイドへの位置特異性水素化(還元)、特にデヒドロコール酸(DHCA)において例えばNADPH依存性である7位のケト基の対応する3,12−ジケト−7β−コラン酸への位置特異性還元を触媒する、具体例1で述べた7β−HSDHまたはその機能的均等物。
デヒドロコール酸(DHCA),
7−ケト−リトコール酸(7−ケトLCA).
7,12−ジケトリトコール酸(7,12−ジケトLCA)、および特に酸の塩、アミドまたはアルキルエステルのようなそれらの誘導体から選ばれる、具体例9に述べた方法。
7−ケトLCAまたはその誘導体がウルソデオキシコール酸または対応する誘導体へ変換される、または
7,12−ジケトLCAまたはその誘導体が12−ケト−ウルソデオキシコール酸(12−ケトUDCA)へ変換される、具体例10に述べた方法。
a)アルコールデヒドロゲナーゼ(ADH;EC1.1.1.2)および
b)その機能的均等物(特に機能性ドメイン)から選ばれる、具体例17で述べた方法。
a)任意に式(2)のコール酸を、
b)具体例1ないし3の一つの定義に従った7β−HSDHの少なくとも一つの存在下、DHCAを式(4)の3,12−ジケト−7β−コラン酸(3,12−ジケト−7β−CA)
c)3α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ(3α−HSDH)の存在下、3,12−ジケト−7β−CAを式(5)の対応する12−ケト−ウルソデオキシコール酸(12−ケト−UDCA)
d)式(5)の12−ケト−UDCAをUDCAへ化学的に還元し;そして次に
e)反応生成物を任意にさらに精製する;
方法。
本発明のさらなる具体例
1.一般的定義および使用した略号
下表に、表の形で構造式、その化学名および使用した略号を要約する。
本発明は、7β−HSDH活性または3α−HSDH活性を有する特定的に記載したタンパク質または酵素に制限されず、むしろその機能的均等物にも及ぶ。
3.1 核酸
本発明はまた、7β−HSDHまたは3α−HSDH活性を有する酵素をコードする核酸配列に関する。
ギャップオープニングペナルティ 10
ギャップエキステンションペナルティ 10
ギャップセパレーションペナルティ範囲 8
ギャップセパレーションペナルティ オフ
アライメント遅延のための%アイデンティティ 40
残基特異性ギャップ オフ
親水性残基ギャップ オフ
トランジション計量 0
対アライメントパラメータ:
FAST アルゴリズム オン
K−tuple サイズ 1
ギャップペナルティ 3
ウインドウサイズ 5
ベストダイアゴナルの数 5
DNAギャップエキステンションペナルティ 6.66
DNAマトリックス アイデンティティ
タンパクギャップオープンペナルティ 10.0
タンパクギャップエキステンションペナルティ 0.2
タンパクマトリックス Gonnet
タンパク/DNA ENDGAP −1
タンパク/DNA GAPDIST 4
−どんな所望アミノ酸のためのコドンも遺伝子のどんな部位に置換または付加されることができる飽和突然変異生成(Kelgler−Edo DM Docktor CM,Dimaio D(1994)Nucleic Acids Res 22:1593;Barettino D,Feigenbutz M.Valcarel R,Stunnenberg HG(1994)Nucleic Acids Res 22:541;Barik S(1995)Mol Biotechnol 3:1);
−ヌクレオシド配列が誤作動DNAポリメラーゼによって突然変異されるエラー発生ポリメラーゼ連鎖反応(エラー発生PCR)(Eckert KA,Kunkel TA(1990)Nucleic Acids Res 18:3739);
−例えば、ヌクレオチド配列の増加した突然変異率が欠陥DNA修復メカニズムのために発生する突然変異化株への遺伝子の通過(Greener A,Callahan M.Jerpseth B(1996)An efficient random mutagenesis Technique using an E.coli mutator strain.In:Trower MK(editor)In vitro mutagenis protocols.Humana Press,New Jersey);または
−密接に関連した遺伝子のプールが生成され、そして消化され、そしてフラグメントがポリメラーゼ連鎖反応において鋳型として使用され、その中で全長さのモザイク遺伝子が繰り返した鎖分離および再接近によって最終的に調製されるDNAシャッフリング(Stemmer WPC(1994)Nature370:389;Stemmer WPC(1994)Proc Natl Acad Sci USA 91:10747)
本発明はさらに、調節核酸配列の遺伝子コントロールのもとに本発明に従ったポリペプチドをコードする核酸配列を含む発現構造体、および少なくとも一つのこれらの発現構造体を含むベクターに関する。
文脈に応じて、用語“微生物”は出発微生物(野生タイプ)、または遺伝子的に修飾された組換え微生物、または両者を意味するとして理解できる。
本発明に従った宿主生物は、好ましくは上の定義に従った7β−HSDH活性を有する酵素をコードする本発明の核酸配列、核酸構造体またはベクターの少なくとも一つを含んでいる。
第1工程:CAのDHCAへの化学変換
CAのヒドロキシ基がそれ自体公知の態様で古典的化学ルートによりクロム酸または酸性溶液(例えばH2SO4)中のクロム酸塩でカルボニル基へ酸化される。
水溶液中、DHCAがそれぞれNADPHまたはNADHの存在下、3α−HSDHおよび7β−HSDHによって12−ケト−UDACへ特異的に還元される。助因子NADPHまたはNADHは、ADHまたはFDHによってそれぞれイソプロパノールまたはギ酸ナトリウムから再生することができる。反応は緩和な条件のもとで進行する。例えば、反応はpH=4ないし9,6ないし9,または7ないし9,特にpH=8において、そして約10ないし30℃、15ないし25℃、または約23℃において実施することができる。
12−ケト−UDCAの12−カルボニル基がそれ自体公知の態様においてWolff−Kishner還元によって除去され、そしてそれによって12−ケト−UDCAからUDCAが生成する。この反応において、カルボニル基は最初ヒドラジンによってヒドラゾンへ変換される。次にヒドラゾンは塩基(例えばKOH)の存在下200℃へ加熱され、それによって窒素が分解除去され、UDCAが生成する。
さらに本発明は、ポリペプチド生産微生物が、培養され、ポリペプチドの発現が任意に誘発され、そして培養物からそれらが単離される、本発明に従ったポリペプチド、または機能的な、生物学的に活性なそのフラグメントの組換え生産方法に関する。このようにポリペプチドは、もし望むならば、工業的スケールで生産することもできる。
本発明に従った酵素は、ここに記載したプロセスにおいて遊離または固定形で使用することができる。固定化酵素とは、不活性担体へ固定される酵素の意味であると理解される。好適な担体材料およびその上に固定化された酵素は、EP−A−1149849,EP−A−1069183およびDE−OS−100193773およびそれらに引用された参照から知られている。この点に関し、これら明細書の開示全体が参照される。好適な担体材料は、例えばカオリナイト、ケイ藻土、パーライトのような粘土、粘土鉱物、シリカ、アルミナ、炭酸ナトリウム、炭酸カルシウム、セルロース粉、アニオン交換材料、ポリスチレン、アクリル樹脂、フェノールホルムアルデヒド樹脂、ポリウレタンおよびポリエチレンおよびポリプロピレンのような合成高分子を含む。担体材料は慣例的に固定された酵素のために微粉砕された粒子の形で使用され、多孔質形が好ましい。担体材料の粒子寸法は5mm以下、特に2mm以下(分布カーブ)である。同様に、全細胞触媒としてデヒドロゲナーゼの使用において、遊離または固定化形を選ぶことができる。担体材料は、例えばアルギン酸カルシウムおよびカラギーナンである。酵素それに細胞は、グルタルアルデヒドを用いて直接架橋する(CLEAへの架橋)ことができる。対応してそしてさらなる固定化プロセスは、例えば、J.Lalonde and A.Margolin“Immobilization of Enzymes”in K.Drauz and H.Waldmann,Enzyme Catalysis in Organic Synthesis 2002,vol.III,991−1032,Wiley−VCH,Weinheimに記載されている。
他の情報が与えられなければ、例えば制限切断、アガロースゲル電気泳動、DNAフラグメントの精製、ニトロセルロースおよびナイロンメンブレンへのDNAの移動、DNAフラグメントの連結、微生物の形質転換、微生物の伝播、ファージの複製、および組換えDNAの配列分析のような、本発明の文脈において実施されるクローニングステップは、Sambrook et al.(1988)前出に記載されているように実施することができる。
材料
Collinsella aerofaciens DSM3979(ATCC25986,以前の名称Eubacterium aerofaciens)からのゲノムDNAは、German Collection for Microorganisms and Cell Culture(DSMZ)から得た。UDCAおよび7−ケト−LCAはそれ自体既知の出発化合物であり、文献に記載されている。すべての他の薬品はSigma−AldrichおよびFluka(ドイツ)から得た。すべての制限エンドヌクレアーゼ、T4DNAリガーゼ、TaqDNAポリメラーゼおよびイソプロピル−β−D−1−チオガラクトピラノシド(IPTG)はqermentas(ドイツ)から得た。
培地
培地リットル当りトリプトン10g、イースト抽出物5gおよびNaCl 5gを含有するLB培地
発現ベクター
pET22b(+)およびpET28a(+)(Novagen,Madison,Wisconsin,USA)
微生物
Escherichia coli株DH5a(Novagen,Madison,Wisconsin,USA)を37℃において適当な抗生物質を含んでいるLB培地中で増殖させた。
Escherichia coli株BL21(DE3)(Novagen,Madison,Wisconsin,USA)を37℃において適当な抗生物質を含んでいるLB培地中で増殖させ、インキュベーション後0.5mM IPTGでOD600=0.8を25℃および140RPMにおいて維持した。
1.7β−HSDH活性決定のための標準条件
反応混合物は全容積1ml中以下を含む。
50mMリン酸カリウム緩衝液、pH8.0 880μl
10mM UDCA(水に溶解、pH8) 10μl
酵素溶液(上の緩衝液中1ないし10U/mlの範囲) 10μl
1mM NADP+(上の緩衝液中) 100μl
340nmにおける吸光の増加が測定され、そして活性は6.22mM−1×cm−1のモル吸光係数を用いて酵素単位(U,すなわちμmol/min)として計算される。
2.BCAアッセイによるタンパク質測定
サンプルはBCA試薬(Interchimから)と混合され、そして37℃において45分間インキュベートされた。タンパク質含量は使用したアッセイの濃度範囲において較正曲線(BSA)に対して562nmにおいて決定された。
3.薄層クロマトグラフィー
サンプル5ないし10μgをTLCフィルムKieselgel60(Merck)へ適用した。参照として基準サンプルも適用された。TLCフィルムの一端を移動相がトップに到達するまで溶出液中に浸漬した。TLCフィルムを乾燥し、リンモリブデン酸で発色させた。
製造実施例1:7β−HSDH活性の同定
Collinsella aerofaciens ATCC 25986のゲノムDNA配列は、Washington University Genome Sequence Centerにより、ヒト消化管マイクロバイオーム計画のために2007年ジーンバンクにおいて発表された。HSDHは短鎖デヒドロゲナーゼに入る。Collinsella aerofaciensからの短鎖デヒドロゲナーゼの生化学的機能はジーンバンクに注釈されていなかったので、9つの候補がベクターpET22b+中にクローンされ、そしてE.coliBL21(DE3)中に発現された。
7β−HSDHの生化学的機能を調べるため、7β−HSDHによる7−ケト−LCAの変換を実施した。20mlの変換混合物は、7−ケト−LCA50mM(約0.4g)と、7β−HSDH 5U/mlと、そしてNADP+0.05mMを含有する。NADPHの再生のため、ADH
4U/mlと、イソプロパノール1%を使用した(スキーム1を見よ)。反応はフューム戸棚中攪拌下pH8および24℃において実施された。アセトンはイソプロパノールより速く蒸発するので、反応はUDCAの生成へ向ってシフトする。1%イソプロパノールが24時間後、48時間後および72時間後に再び添加された。生成物は、TLCによって分析された(Kieselgel60,Merck,移動相石油エーテル:酢酸エチル=1:10 vol:vol)。TLC上で生成物は真正参照7−ケト−LCA,UDCAおよびCDCAと比較された。TLC分析はUDCAが7β−HSDHによって7−ケト−LCAから生成したことを示した。エナンチオマーUDCAはTLC上で検出できなかった。
DHCAから12−ケト−UDCAの生産のため7β−HSDHの使用可能性をテストするため、7β−HSDHによるDHCAの変換を実施した。変換混合物50mlは、50mM DHCA(1g)、5U/ml 7β−HSDHおよび0.05mM NADP+を含有する。NADPHの再生のため、4U/ml ADHと1%イソプロパノールが使用された(スキーム2を見よ)。反応はフューム戸棚中攪拌下pH8および24℃において実施された。アセトンはイソプロパノールより速く蒸発するので、反応は12−ケト−7β−CAの生成へ向ってシフトする。1%イソプロパノールが24時間後、48時間後および72時間後に再び添加された。中間体3,12−ジケト−7β−CAはTLCによって分析された。DHCAはもはやTLC上で検出できなかった(Kieselgel 60,Merck,移動相クロロホルム:メタノール:酢酸=10:1:0.08容積比)
スキーム2:7β−HSDHによるDHCAの還元の概略的表現。ADHが助因子NADPHを再生する。
中間体3,12−ジケト−7β−CA(変換実施例2に従って製造された)がさらに12−ケト−UDCAへComamonas testosteroniからの3α−HSDH(配列同定No.5および6)(Mobus,E and E.Maser,Molecular cloning,overexpression,and characterization of steroid−inducible 3alpha−hydroxysteroid dehydrogenase/carbonyl reductase from Comamonas testosteroni;A novel member of the short−chain dehydrogenase/reductase superfamily,J.Biol Chem,1998,273(47):p.30888−96)によって変換された。この3α−HSDHは助因子NADHを必要とし、これはFDHによって再生される(図3を見よ)。3α−HSDH 4U/mlと、FDH(NADH依存性、Codexis)1U/mlと、ギ酸ナトリウム200mMと、そしてNAD+0.05mMとが反応へ加えられた。40時間後、生成物は2M HClでpH2へ酸性化され、酢酸エチル10mlで6回抽出された。蒸発後、生成物1.07gが得られた。生成物12−ケト−UDCAが分析され、TLCおよびNMRによって確認された。3α−HSDHは7β−HSDHの生産と同様に生産されたが、しかしプラスミドpET22b+が使用され、それ以上精製することなく使用された。
氷酢酸1320Lを2000L攪拌容器に入れ、コール酸(CA)110kg(260モル)をその中に溶解した。次亜塩素酸ナトリウム溶液(2.3モル濃度)422Lを20ないし40℃においてこの溶液中へ計量し、反応溶液を反応完結まで少なくとも1時間さらに攪拌した。デヒドロコール酸(DHCA)を遠心によって100kg(90%)の収量で単離する。
12−ケト−UDCA105g(0.258モル)をトリエチレングリコール384mlに溶かし、水酸化ナトリウム52.2g(1.304モル)とヒドラジンヒドラート75.95ml(1.563モル)を加え、180℃へゆっくり加熱する。この時ヒドラゾンが生成するが、160℃を越えると窒素を放出してUDCAへ転位する。変換完了のため反応混合物を180℃に8時間維持する。反応混合物を100℃以下に冷却し、水1500mlで処理する。次に塩酸で酸性することによってUDCAを沈澱させる。生成物は、96.2gないし99.2g(95%から98%まで)の収量で得られる。
7β−HSDHコーディング遺伝子をコードする遺伝子がPCRにより、そして製造実施例1において記載したプライマーを使用したゲノムDNAから再び増幅された。
PCR生成物が前に記載したように再び精製され、制限エンドヌクレアーゼHdeIとHindIIIで消化された。消化されたPCR生成物は再び精製され、発現ベクターを作製するためT4リガーゼを用いてpET−28a(+)ベクター中にクローンされた。得られた発現構造体は次にE.Coli DH5a細胞中に形質転換された。予期されるタンパク質は、信号ペプチドとN−末端6×His−Tagとトロンビン開裂部位を含んでいる20アミノ酸残基を持つに違いない。挿入したDNAの配列がシーケンシングによってチェックされた。
E.coli BL21(DE3)が発現構造体で形質転換された。このため発現構造体を含んでいるE.coli BL21(DE3)株がカナマイシン30μg/mlを含んでいるLB培地中で(2Lシェーカーボトル中2×400ml)増殖された。遠心(10,000×g、5分、4℃)によって細胞が収穫された。ペレットをリン酸緩衝液(50mM,pH8,PMSF0.1mMを含有)20ml中に再懸濁した。細胞はSonifier 250超音波デバイス(Branson,ドイツ)を使ってコンスタントな冷却のもと1分間の超音波処理(40Wパワー、40%間隔および1分休止)によって粉砕された。粉砕は3回繰り返された。細胞抽出物は遠心された(22,000×g、20分、4℃)。上清が負荷緩衝液(50mMリン酸カリウム、300mM NaCl、pH8)で平衡化したTalonカラム(Clontech、USA)に負荷された。このプロセスは24℃で実施された。非結合物質はカラムを負荷緩衝液(3カラム容積)で洗浄することによって洗い流した。弱く結合しているタンパク質は洗浄緩衝液(負荷緩衝液中20mMイミダゾール、3カラム容積)で洗うことによって除去された。His−Tag−7β−HSDHタンパク質は溶出緩衝液(負荷緩衝液中イミダゾール200mM)で溶出された。溶出液は分子排除限界5kDaの透析チューブ(Sigma,USA)中リン酸カリウム緩衝液(50mM,pH8)2L中で4℃で一夜透析された。最後にサンプルを新しいチューブへ移し、さらなる透析のため−20℃で貯蔵された。タンパク濃度は製造者の指示書に従ってBCAテストキット(Thermo,USA)を使用して決定された。加えて、サンプルは12.5%SDS−PAGEと、そしてCoomassieブリリアンドブルーによる染色によって分析された。たんぱく質の純度はScion Image Beta 4.0.2(Scion,USA)を使用してデンシトメトリーによって決定された。
ゲル濾過は、7β−HSDHの分子量を決定するためにPharmacia AKTAタンパク質精製システム上で実施された。200mM塩化ナトリウムを含んでいる50mM Tris−HCl(pH8)であらかじめ平衡化したSephadex G−200カラム上に精製した酵素が適用された。タンパク質は1ml/minの流量で同じ緩衝液で溶出された。7β−HSDHの分子量は、タンパク質標準(血清アルブミン(66kDa)、Aspergillus oryzaeからのα−アミラーゼ(52kDa)、ブタ膵臓からのトリプシン(24kDa),およびニワトリ卵からのリゾチーム(14.4kDa))との溶出容積の比較によって決定された。
酵素テストのための反応混合物は、全容積1ml中50μmolリン酸カリウム(pH8)、0.1μmol NAD(P)HまたはNAD(P)+、基質およびタンパク質を含んでいた。この反応混合物を光路長1cmのクベットに入れた。7β−HSDH活性は分光光度計(Ultraspec 3000、Pharmacia Biotech,イギリス)を使用して340nmの吸光度におけるNAD(P)H濃度の変化を記録することによって決定された。酵素活性は25℃における6.22mM−1×cm−1のモル吸光係数を使用して酵素単位(U,すなわちμmol/min)として決定された。可変基質、補酵素、濃度、pH、緩衝液およびインキュベーション温度を使用していくつかの異なる測定が実施された。動力学的定数は標準方法を使用して決定された。
7β−HSDHの生化学的機能を検証するため、7β−HSDHによる7−ケト−LCAの変換を実施した。0.4gの7−ケト−LCAをリン酸カリウム緩衝液(50mM,pH8)の10ml中に懸濁し、2M水酸化ナトリウムの添加によってpH8へ調節した。イソプロパノール0.2ml、7β−HSDH100単位、およびThemoanaerobacter ethanolicusからのアルコールデビドロゲナーゼ(ADH−TE)80単位(Dr.K.Momoi、ITB大学、シュトゥットガルトからの寄贈)、およびNADP+1μmolを加えた。20mlの全反応容積を得るため同じ緩衝液を加えた。反応混合物を24℃でインキュベートし、そして24時間攪拌した。この間NADPHはADHにより2−プロパノールの酸化を介して再生された。生成物を2M塩酸1mlで酸性化し、酢酸エチル5×5mlで抽出した。有機溶液は次に蒸留された。
LC20AD HPLCシステム(島津、日本)上にLiChroCARTTMSTAR RP18タイプ(エンドキャップした、Merck、ドイツ)のプレカラムを備えたPurospherTMSTAR RP−18タイプのカラム(HitbarTMRT125−4 プレパックしたカラム、PurospherTMSTAR RP−18 エンドキャップした、Merck、ドイツ)上で1ml/minの流速においてHPLC分析が実施された。移動相は2種の溶出液からなっていた。溶出液Aはアセトニトリルを含有し、溶出液Bは蒸留水(pH2.6、オルトリン酸85%で調節)であった。以下の勾配が使用された:A35%(8分)−35%−43%(1%min−1)−43%−70%(1%min−1)−70%(5min)−70%−35%(17.5%min−1)−35%(5min);溶出液A65%(8min)−65%−57%(1%min−1)−57%−30%(1%min−1)−30%(5min)−30%−65%(17.5%min−1)−65%(5min)。サンプル20μl(1mg/ml)が分析された。標準として真正UDCA,7−ケト−LCAおよびCDCAが同じ濃度で使用された。記録は200nmにおけるUV検出によって実行された。
Clastal X ソフトウエア(Thompson et al.,1997,Nucleic Acid Research25:4876−82)を使用して多数配列アラインメントが創出され、Jalview ソフトウエア(Clamp et al.,2004,Bioinformatics 20:426−7)を用いて修飾された。分子進化系統樹はプログラムTreeView1.6.6(Roderic 2001,http://taxonomy.zoology.gla.ac.uk./rod.html)を使用してつくられた。
1.調製用バイオ変換における7β−HSDH活性の同定
酵素の機能を確認するため、10mlスケールにおいて7−ケト−LCAのバイオ変換を実施した。ここでは既に記載したように、NADPHの再生のためADHと2−プロパノールを組合わせて単離した酵素が使用された。HPLC分析は、UDCAだけがこの酵素によって生産される反応生成物(90%変換)であることを示した。CDCA(保持時間19.4分)は反応混合物中に検出されなかった。この結果はNADPH依存性7β−HSDHであり、そして7−ケト−LCAの7−カルボニル基の7β−ヒドロキシル基への選択的還元ができることを示す。
UDCA保持時間 :15.5分
7−ケト−LCA保持時間 :18.3分
Collinsella aerofaciens DSM3979からの7β−HSDH遺伝子を発現ベクターpET28a(+)にクローニングし、その後の過発現の後、N−末端にHis−Tagを備えた融合タンパク質が培養物1hあたり332.5mg(5828U)の7β−HSDH収率で得られた。His−Tagを備えた7β−HSDHは固定化した金属イオンアフィニティクロマトグラフィーによる1工程で精製された(純度>90%、収率76%、図2を見よ)。トラック1および2の主要バンドは、この遺伝子のアミノ酸配列から誘導される予知された分子量に相当する、30kDaの期待した発現生成物を代表する。しかしながら、ゲル濾過によって7β−HSDHに対し56.1kDaの分子量が決定された。このことはCollinsella aerofaciens DSM3979からの7β−HSDHのダイマー性格を確認する。
本発明に従った7β−HSDHのアミノ酸配列が既知のHSDS配列と比較された(図3を見よ)。観察された配列類似性は、本発明に従った酵素は短鎖デヒドロゲナーゼ(SDR)のファミリーに属することを指示する。SDRは非常に低い相同性および配列同一性を示すことが知られている(Jornval,H.,B.Persson,M.Krook,S.Atrian,R.Gonzalez−Duarte,J.Jeffrey,and D.Ghosh;Short−Chain dehydrogenases/reductases(SDR),Biochemistry 34:6003−13 and Persson,B.,M.Krook,and H.Jornvall,1991;Characeristics of Short−chain alcohol dehydrogenases and related enzymes, Eur.J.BioChem 200:537−43)。しかしながら、配列アラインメントはSDR一次構造中の保存されたドメインを明瞭に示している。N−末端モチーフGly−X−X−X−Gly−X―Gly(Gly−41,Gly−45およびGly−47に対応、アラインメントに対応するナンバリング)は、SDRスーパーファミリーの特徴的なジヌクレオチド結合モチーフに相当する。加えて、3つの強い保存された残基Ser−177,Tri−190およびLys−194(アラインメントに従ったナンバリング)を識別することができ、これはSDR酵素の触媒性の3組に相当する。
図3のアラインメントに基づいた進化樹が図4に示されている。Clostridium sordellii,Brucella melitensisおよびEscherichia coliからの7α−HSDHは同じグループに属する。3α−HSDHの両方は他のHSDHよりももっと目立った関係を示す。興味あることに、原核7β−HSDHは、Cavia porcellus,Homo sapiensおよびMus musulusを含む動物11β−HSDHサブグループに関係している。
UDCA,7−ケト−LCA、DHCA,NADP+およびNADPHのためのLineweaver−Burkプロットを使ったVmaxおよびKmの絶対値を決定するため、動力学的平衡分析が実施された。以下の表において、基質飽和曲線および逆数プロットから得た、テストした基質および補酵素のためのすべての動力学データが要約されている。すべての基質および補酵素のVmax,KMおよびkcat値は同じ範囲にあるが、しかしDHCAのKM値は、多分低い水中溶解度のため他の基質よりも有意に高い。酵素はNADPH依存性であり、そしてNAD+およびNADHの動力学定数は非常に低い活性のため決定できなかった。
さらに、精製した酵素を用いて、pHの関数としての種々の基質に対する7β−HSDH活性が決定された(図5を見よ)。7β−HSDHによるUDCAの酸化については、最適活性はpH9ないし10の範囲にあり、酸性側で徐々に低下することが観察された。これと対照的に、7β−HSDHによるDHCAおよび7−ケト−LCAの還元に対しては、最適活性はpH4ないし6の範囲にあり、酸性側でシャープな下降およびアルカリ側で徐々に低下することが見られた。異なる緩衝液は、同じpHにおいて7β−HSDHの活性に少ししか影響しなかった。
本発明に従ったNADP依存性7β−HSDHは以下の安定性挙動を示す。400分後30℃での活性は23℃より約30%低い。この酵素は30℃で1500分後完全に失活するが、しかし23℃で1500分後では残存活性は20%であった。リン酸カリウム緩衝液(50mM、pH8)中−20℃において多数回冷凍および解凍後数ヶ月にわたっての貯蔵中有意な活性損失は観察されなかった。
Claims (16)
- ゲル濾過によって決定して約53ないし60kDaの分子量を有し、バクテリア、特にCollinsella aerofaciens DSM3979(ATCC25986)のようなCollinsella属のバクテリアから得られる、7β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ(7β−HSDH)およびこの7β−HSDHから誘導される機能的均等物。
- a)7−ケトステロイドの対応する7β−ヒドロキシステロイドへの立体特異性還元、および/または
b)7位にある7−ケトステロイドの対応する7β−ヒドロキシステロイドへの位置特異性水素化
を触媒する、請求項1の7β−HSDHまたはそれから誘導される機能的均等物。 - ゲル濾過によって決定して約53ないし60kDaの分子量を有し、そして特に少なくとも7−ケトステロイドの対応する7β−ヒドロキシステロイドへの立体特異性還元を触媒する、配列同定No.2に従ったアミノ酸配列、またはこの配列に対し少なくとも80%の同一度を有するそれから誘導された配列を含む、7β−HSDH。
- 請求項1ないし3のいずれに従った7β−HSDHの存在下、対応する7−ケトステロイドが変換され、そして少なくとも一つの還元生成物が任意に反応系から単離される、7β−ヒドロキシステロイドの酵素合成方法。
- 還元されるケトステロイドが、
デヒドロコール酸(DHCA),
7−ケト−リトコール酸(7−ケト−LCA),
7,12−ジケト−リトコール酸(7,12−ジケト−LCA)、および
特に前記酸の塩、アミドまたはアルキルエステルのようなその誘導体から選ばれる、請求項4の方法。 - 還元はNAD(P)Hの存在下(そして消費を伴って)実施される請求項4または5の方法。
- 請求項1ないし3のいずれかに従った7β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼの存在下、ヒドロキシステロイドが変換され、そして生成した酸化生成物が任意に反応系から単離される、7β−ヒドロキシステロイドの酵素酸化方法。
- 7β−ヒドロキシステロイドは3,12―ジケト−7β−CAまたは塩、アミドまたはアルキルエステルのようなその誘導体である請求項7の方法。
- 酸化はNAD(P)+の存在下(そして消費を伴って)実施される請求項7または8の方法。
- 消費されたレドックス均等物が電気化学的にまたは酵素的に再生される請求項6または9の方法。
- 消費されたNAD(P)Hが、NAD(P)デヒドロゲナーゼおよび特にアルコールデヒドロゲナーゼ(ADH)から選ばれるNAD(D)H−再生酵素とカップリングすることによって再生される請求項10の方法。
- NAD(P)H−再生酵素は、単離または富化された、天然または組換えられた、
a)アルコールデヒドロゲナーゼ(EC1.1.1.2)および
b)それから誘導された機能的均等物
から選ばれる請求項11の方法。 - 式(1)
のウルソデオキシコール酸(UDCA)の製造方法であって;
a)式(2)
b)DHCAが請求項1ないし3のいずれかに従った少なくとも一つの7β−HSDHの存在下、式(4)
c)3,12−ジケト−7β−CAが少なくとも一つの3α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ(3α−HSDH)の存在下、式(5)
d)式(5)の12−ケト−UDCAがUDCAへ化学的に還元され;そして
e)反応生成物が任意にさらに精製される、ことを特徴とする方法。 - ステップb)および/またはステップc)は(特に酵素的)助因子再生ステップと組合わされる請求項13の方法。
- ステップb)はNADPHが犠牲的アルコール消費を伴うアルコールデヒドロゲナーゼ(ADH)により再生される助因子再生ステップと組合わされる請求項14の方法。
- ステップc)は、NADHがホルメートの消費を伴うホルメートデヒドロゲナーゼ(FDH)により再生される、またはNADPHが犠牲的にアルコール消費を伴うアルコールデヒドロゲナーゼ(ADH)により再生される、助因子再生ステップと組合わされる請求項14または15の方法。
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