CN102827848A - 密码子优化的7α-羟基类固醇脱氢酶基因 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了密码子优化的7α-羟基类固醇脱氢酶基因、含所述优化基因的重组表达载体pGEX-6p-1-7α-HSDH和含所述重组表达载体的大肠杆菌。本发明采用密码子优化的7α-羟基类固醇脱氢酶基因与原核表达载体pGEX-6p-1在大肠杆菌中GST融合表达，在短时间内可以生成大量有活性、结构完整的目的蛋白，而且GST融合蛋白纯化方法简单快速，从而能够快速得到有活性的目的蛋白。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种按大肠杆菌密码子偏爱性优化的的7α-羟基类固醇脱氢酶（7α-HSDH）基因。
背景技术
熊胆是名贵的中药材，用于治疗胆结石疾病以及各种急性、慢性肝病，具有良好的治疗效果。熊去氧胆酸(3α-7β-二羟基-5β-胆烷酸，以下简称UDCA)以及牛磺/甘氨熊去氧胆酸（T/GUDCA）是中药材熊胆的主要有效成份。然而，由于中药熊胆粉主要的获取方式为“活熊引流取胆”，这有违野生动物保护法。并且被认为是非常不人道的获取方式。另外，化学合成法过程复杂、得率较低。然而动物胆汁中存在众多胆酸类物质，如牛、羊胆酸、鹅去氧胆酸、熊胆酸、猪胆酸、猪去氧胆酸等，这些物质可以通过适当的生物培育转化成UDCA及其衍生物，其中在鸡胆汁中鹅去氧胆酸（CDCA）以及牛磺/甘氨鹅去氧胆酸（T/GCDCA）含量丰富。CDCA与UDCA的差别仅在于7位羟基的差向异构，利用7α、7β-羟基类固醇脱氢酶（7α、7β-HSDH）可以将CDCA、T/GCDCA转化为UDCA、T/GUDCA。来自撒丁岛梭菌（Clostridium sardiniense，DSM599/ATCC27555）的7α、7β-HSDH酶可以实现上述转化过程。
因此，为了快速获取大量的和高纯度的7α-HSDH酶，本发明提出通过密码子优化的7α-HSDH酶基因在大肠杆菌中进行原核表达。原核表达在短时间内可以得到大量产物，而为了得到有活性、结构完整的目的蛋白，分析基因中使用频率较低的密码子并进行替换从而得到优化的基因序列是十分必要的。另外，原核表达时采用原核表达载体pGEX-6p-1与目的基因进行GST融合表达，得到的融合表达蛋白往往具有正确的空间结构和相应的酶活，并且GST融合蛋白纯化方法简单快速，从而能够快速得到有活性的目的蛋白。
发明内容
鉴于此，本发明的目的之一是提供密码子经过改造且mRNA二级结构稳定的密码子优化的7α-羟基类固醇脱氢酶基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。该优化基因在不改变蛋白质氨基酸序列的前提下，综合考虑密码子使用频率，按照大肠杆菌的偏爱性进行优化，使其在宿主细胞中的表达量和纯度显著提高；
本发明的目的之二是提供含密码子优化的7α-羟基类固醇脱氢酶基因的重组表达载体pGEX-6p-1-7α-HSDH；
本发明的目的之三是提供含密码子优化的7α-羟基类固醇脱氢酶基因的重组表达载体的大肠杆菌。
本发明采用密码子优化的7α-羟基类固醇脱氢酶基因与原核表达载体pGEX-6p-1在大肠杆菌中GST融合表达，在短时间内可以生成大量有活性、结构完整的目的蛋白，而且GST融合蛋白纯化方法简单快速，从而能够快速得到有活性的目的蛋白。
附图说明
图1为本发明优化前后7α-HSDH基因序列比较
图2A为本发明7α-HSDH基因优化前表达的7α-羟基类固醇脱氢酶的聚丙烯酰胺凝胶电泳图
图2B为本发明7α-HSDH基因优化后表达的7α-羟基类固醇脱氢酶的聚丙烯酰胺凝胶电泳图
图3为本发明不同pH条件下优化的7α-HSDH催化CDCA氧化的酶活比较
具体实施方式
下面将结合实施例和附图来详细说明本发明，这些实施例和附图仅起说明性作用，并不局限于本发明的应用范围。本发明不限于下述实施方式或实施例，凡不违背本发明精神所做出的修改及变形，均应包括在本发明范围之内。
实施例1：7α-羟基类固醇脱氢酶基因的优化设计和合成
稀有密码子的分析：稀有密码子主要通过软件E.coli Codon Usage Analysis2.0（Morris Maduro，参考：Analysis and Predictions from Escherichia coli sequencesin:Escherichia coli and Salmonella,Vol.2,Ch.114:2047-2066,1996,Neidhardt FCed.,ASM press,Washington,D.C.）分析得到在大肠杆菌中的使用相对频率低于阈值（10‰）的密码子。
优化稀有密码子：根据不同密码子在大肠杆菌中的使用频率将使用频率低于阈值的密码子进行优化。优化结果如下：
本发明所用的优化密码子
| 优化前 | 优化后 | 氨基酸 | 优化前 | 优化后 | 氨基酸 |
| AAG | AAA | Lys | CTA | CTG | Leu |
| ACA | ACC | Thr | CTC | CTG | Leu |
| AGA | CGC | Arg | GGA | GGC | Gly |
| AGG | CGC | Arg | GTA | GTG | Val |
| AGT | AGC | Ser | TCA | AGC | Ser |
| ATA | ATT | Ile | TCC | AGC | Ser |
| CAA | CAG | Gln | TGT | TGC | Cys |
| CCA | CCG | Pro | TTA | CTG | Leu |
| CCT | CCG | Pro |
优化前后的7α-HSDH基因序列如图1所示，红色部分为优化前后变化的核苷酸序列，点“......”表示优化前后未改变的核苷酸序列。优化后的7α-HSDH的序列与优化前的序列的同源性为81%。优化后的7α-HSDH基因序列如SEQ IDNO.1所示。
密码子优化后7α-HSDH基因进行全基因合成，且在基因前后两端分别添加了BamHΙ和NotΙ酶切位点。由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。
实施例2：优化的7α-羟基类固醇脱氢酶基因的重组表达载体pGEX-6p-1-7α-HSDH的构建和含该重组表达载体的大肠杆菌的获得
⑴菌株和质粒
大肠杆菌：BL21菌株，购自天津博美科生物技术有限公司。
表达载体pGEX-6p-1：购自GE公司（GE Healthcare）。
⑵重组表达载体的构建和含该重组表达载体的大肠杆菌的获得
利用限制性内切酶BamHΙ/NotΙ双酶切优化后的基因并回收目的基因片段；用限制性内切酶BamHΙ/NotΙ双酶切原核表达载体pGEX-6p-1并回收目的载体片段；连接，利用热击法转化大肠杆菌；PCR筛选阳性克隆，再进行测序验证，得到序列完全正确的重组表达载体pGEX-6p-1-7α-HSDH及含该重组表达载体的大肠杆菌。
实施例3：优化的7α-羟基类固醇脱氢酶基因在大肠杆菌中的表达
将转入成功的大肠杆菌重组菌株按5%的添加量加入LB液体培养基中，220rpm、37℃培养。待OD600为0.5时，16℃IPTG诱导12小时，使大肠杆菌产生GST融合蛋白。
将诱导完成的大肠杆菌10000rpm离心3min收集菌体，300W超声破壁菌液5min至澄清；4℃14000rpm离心15min收集上清液；上清液与谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B（Glutathione Sepharose 4B medium，购自GE healthcare公司）4℃结合2h使GST融合蛋白结合于谷胱甘肽琼脂糖凝胶中，再利用预冷的五倍体积0.25%吐温20的PBS（100mM）溶液冲洗三次，利用预冷的五倍体积PBS（100mM）冲洗三次。再利用PreScission Protease酶4℃直接酶切含GST融合蛋白的谷胱甘肽琼脂糖凝胶12h，离心得到目的蛋白。10%聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）鉴定。
优化前后表达的7α-羟基类固醇脱氢酶的聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定结果如图2A和图2B所示，图2A为优化前的电泳图，图2B为优化后的电泳图，图中“酶切前”的电泳条带为直接将含有GST融合蛋白的谷胱甘肽琼脂糖凝胶切取小部分电泳获得，图中“酶切后”的电泳条带为用PreScission Protease酶酶切GST融合蛋白且离心得到的目的蛋白进行电泳而获得，图中箭头所指为7α-羟基类固醇脱氢酶的蛋白条带，大小约26kDa，与理论值一致。通过BandScan软件分析凝胶图中箭头所指的目的蛋白条带的灰度，计算目的蛋白7α-羟基类固醇脱氢酶的含量，结果显示优化后7α-HSDH的纯度由89.4%提高到了95.6%。
实施例4：不同pH条件下优化的7α-HSDH催化CDCA氧化酶活的测定
将PreScission Protease酶酶切后离心得到的优化的目的蛋白通过二喹啉甲酸（Bicinchoninic acid,BCA）（Thermo Scientific公司）法测定蛋白浓度为2mg/mL。按1:1加入无菌甘油，混匀并分装。-80℃保存。
酶活测定原理：7α-HSDH可以催化CDCA氧化生成7-酮石胆酸（7-KLCA），同时将氧化型辅酶Ⅱ（NADP+）转化成为还原型辅酶Ⅱ（NADPH），后者在340nm处有特异的光吸收，所以通过测定反应体系在340nm处光吸收在单位时间内的增加量可以计算出7-KLCA在单位时间内的生成量，进而得到7α-HSDH催化CDCA的酶活力。
NADPH标准曲线的测定：取0.1M NADPH母液稀释得到浓度为0.005、0.01、0.1、0.2、0.3、0.4mM NADPH标准溶液，检测340nm处的光吸收值。以NADPH浓度为X轴、340nm处的光吸收值为Y轴绘制NADPH的标准曲线。
酶活测定具体步骤：室温条件下，向比色皿中加入196μL 10mg/mL CDCA甲醇溶液，将甲醇挥发完全；加入2mL磷酸盐缓冲液（PBS），充分吹打混匀（CDCA终浓度为2.5mM）；加入4μL 0.1M NADP+溶液（NADP+终浓度为0.2mM）；加入10μL上述保存的7α-HSDH。混匀后立即置于分光光度计中调零。开始计时，每分钟读取一次340nm处光吸收的变化值。光吸收的变化值通过NADPH的标准曲线方程换算成底物在单位时间内的增加量。进而计算出酶的活力。
酶活力单位（U）定义：在上述反应条件下，催化每分钟生成1μmol7-酮石胆酸（7-KLCA）所需的酶量定义为一个酶活单位。
不同pH（6.5-9）环境下，优化的7α-HSDH的相对活性比较如图3所示，横坐标为PH值，纵坐标为7α-HSDH催化CDCA氧化的相对活性，则PH为8.0时7α-HSDH的活性最高，PH为7.5时次之。
上述实施例说明通过密码子优化的7α-HSDH基因在大肠杆菌中经融合表达和酶切得到了纯度更高的且有活性的目的蛋白，纯度高相应地说明了有活性的目的蛋白的量的提高。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
附：本发明设计的DNA序列：
SEQ ID NO.1密码子优化的7α-羟基类固醇脱氢酶基因核苷酸序列
ATGAAACGCCTGGAAGGCAAAGTGGCAATTGTGACCAGCTCTACTCGTGG
CATTGGCCGTGCATCTGCAGAAGCACTGGCAAAAGAAGGTGCTCTGGTGT
ATCTGGCAGCACGTAGCGAGGAACTGGCTAATGAAGTTATTGCAGATATTA
AAAAACAGGGTGGCGTGGCTAAATTTGTTTACTTTAATGCTCGTGAAGAAG
AAACTTACACTAGCATGGTGGAAAAAGTTGCTGAAGCTGAAGGCCGCATT
GATATTCTGGTTAATAACTACGGTGGCACCAATGTTAATCTGGATAAAAACC
TGACTGCTGGCGATACCGATGAATTCTTTCGCATTCTGAAAGATAACGTTC
AGAGCGTGTACCTGCCGGCAAAAGCTGCTATTCCGCATATGGAAAAAGTG
GGCGGTGGCAGCATTGTTAATATCAGCACTATTGGCAGCGTTGTTCCGGATA
TTAGCCGCATTGCTTACTGCGTGAGCAAAAGCGCTATTAACTCTCTGACTC
AGAACATTGCACTGCAGTATGCACGCAAAAATATCCGCTGCAATGCAGTGC
TGCCGGGTCTGATTGGCACTCGCGCAGCACTGGAAAATATGACTGATGAAT
TTCGCGACAGCTTCCTGGGCCATGTTCCGCTGAATCGCGTGGGCCGCCCGG
AAGATATTGCAAATGCAGTTCTGTACTATGCCTCTGATGATAGCGGTTATGT
GACCGGCATGATTCATGAAGTTGCAGGCGGTTTTGCACTGGGCACTCCGC
AGTATAGCGAATACTGCCCGCGCTAA
Claims (3)
1.密码子优化的7α-羟基类固醇脱氢酶基因，其特征在于：其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。
2.含权利要求1所述密码子优化的7α-羟基类固醇脱氢酶基因的重组表达载体pGEX-6p-1-7α-HSDH。
3.含权利要求2所述重组表达载体的大肠杆菌。
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