CN106318976A - 一种人类circRNA过表达载体框架、过表达载体及其制备方法 - Google Patents

一种人类circRNA过表达载体框架、过表达载体及其制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN106318976A
CN106318976A CN201610826732.5A CN201610826732A CN106318976A CN 106318976 A CN106318976 A CN 106318976A CN 201610826732 A CN201610826732 A CN 201610826732A CN 106318976 A CN106318976 A CN 106318976A
Authority
CN
China
Prior art keywords
circrna
mankind
restriction enzyme
express vector
over
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201610826732.5A
Other languages
English (en)
Inventor
王晓香
董先辉
张娟
曾健
周剑
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
GUANGZHOU BIOSENSE BIOSCIENCE Co Ltd
Original Assignee
GUANGZHOU BIOSENSE BIOSCIENCE Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by GUANGZHOU BIOSENSE BIOSCIENCE Co Ltd filed Critical GUANGZHOU BIOSENSE BIOSCIENCE Co Ltd
Priority to CN201610826732.5A priority Critical patent/CN106318976A/zh
Publication of CN106318976A publication Critical patent/CN106318976A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/66—General methods for inserting a gene into a vector to form a recombinant vector using cleavage and ligation; Use of non-functional linkers or adaptors, e.g. linkers containing the sequence for a restriction endonuclease
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
    • C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian

Landscapes

  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及一种人类circRNA过表达载体框架、过表达载体及其制备方法。所述人类circRNA过表达载体框架，包含启动子‑反向互补反应上游元件‑多克隆位点‑反向互补反应下游元件‑终止子，所述反向互补反应上游元件的序列如SEQ ID NO：1所示，所述反向互补反应下游元件的序列如SEQ ID NO：2所示。以目的circRNA的基因序列替换上述人类circRNA过表达载体中的填充序列，即得人类circRNA过表达载体。本发明中构建的人类circRNA过表达载体，可以通用表达所有人类circRNA，反向互补上、反向互补反应下游元件各有多个ALU序列，更能保证环化效率，提高circRNA表达效率。

Description

一种人类circRNA过表达载体框架、过表达载体及其制备方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种人类circRNA过表达载体框架、过表达载体及其制备方法。
背景技术
环状RNA(circRNA)广泛且多样地存在于多种生物细胞中，是具有调控基因表达作用的一类内源性ncRNA分子。最早于20世纪70年代在RNA病毒中被发现。之后几十年，人们在一些转录本中也发现了一些由外显子构成的circRNA，如结肠直肠癌缺失基因转录本、人类Ets-1基因转录本等，但当时它们被认为是转录的“噪音”，未引起人们太多的关注。而近年来，随着生物信息学技术的快速发展，Salzman等、Jeck等、Memczak等及Guo等分别在人类和小鼠的多种细胞中发现了成千上万种circRNA。目前发现的circRNA，根据其在基因组中的来源及其构成序列的不同，可以分为3类：外显子来源的环形RNA分子，内含子来源的环形RNA分子和由外显子和内含子共同组成的环形RNA分子。
CircRNA具有以下特征：表达水平差异较大；具有序列保守性；偏好于细胞浆中；不易被核酸外切酶RNase R降解；外显子来源为主；属于ncRNA；可充当ceRNA的角色调控靶基因的表达；在转录或转录后水平发挥调控作用。这些特征使得circRNA在研究疾病发生机制、干预靶点和生物学标志物等方面显示显著优势。
研究表明，circRNA在转录及转录后水平具有以下非常重要的基因表达调控作用。(1)miRNA海绵作用：小脑变性相关蛋白1反义转录物(antisense to the cerebellardegeneration-related protin 1transcript，CDR1as)是一种circRNA，拥有至少60个与微小RNA-7(microRNA-7，miR-7)相结合的保守结合位点，从而充当miR-7海绵，有效影响miR-7靶基因活性。此外，研究发现，睾丸特异性基因Sry的circRNA具有16个微小RNA-138的靶位点，可与miR-138相互作用，充当miR-138海绵。(2)调控基因转录：Zhang等鉴定出一种来源于基因内含子区域的circRNA，发现这种circRNA分子在细胞核内含量丰富，可参与基因转录调控。(3)调控RNA结合蛋白：Bohjanen等设计了一种能够特异地结合反式激活调控蛋白(transactivating regulatory protein，Tat)的circRNA分子，从而抑制I型人类免疫缺陷病毒1(HIV-1)基因的表达。(4)参与部分蛋白质翻译：丁型肝炎病毒(hepatitis D virusantigen，HDAg)在疾病发展中起到重要的作用。另外，研究发现，人头骨瘤细胞U2OS中，circRNA具有翻译功能，尽管其翻译效率非常低。
近年来，随着高通量测序技术及基因芯片技术的高速发展，研究者们在真核生物体内发现了越来越多的circRNA。如Salzman等发现了数以百计的与人类基因表达相关的circRNA。Jeck等在人类成纤维细胞中检测到了高达25000多种circRNA。Danan等又发现了生物体内circRNA的各种特性。同时，人们在认识circRNA的结构时候，发现它们在疾病的发生和发展中发挥了重要作用。如circRNA与肿瘤、神经系统疾病、动脉粥样硬化、糖尿病及病毒性肝炎等有关，因此，circRNA作为分子标记物的诊断价值在疾病的发现和治疗中发挥着巨大作用。然而，circRNA在生物体内发挥的功能及分子作用机制的研究却非常少。目前的研究中，仅仅明确了circRNA具有吸附miRNA的海绵作用、调控基因转录等作用。
研究发现，在敲除或干扰调控circRNA相关基因时，机体内circRNA的表达水平受到不同程度的抑制。Agnieszka等(2015)研究发现，随着人和小鼠大脑神经元的分化，机体内circRNA水平均能上调。同时，敲除了circRNA负调控基因ADAR1能提高circRNA的表达量。Xu等(2015)利用毛喉素和PMA较长时间诱导处理人和小鼠胰岛细胞，发现Cdr1as呈现不同程度的高表达，相反，用高糖溶液处理却使Cdr1as表达水平降低。同时，在机体内加入pCDNA3-CIRS-7重组载体过表达Cdr1as能显著提高胰岛素的含量及分泌水平。Kramer等(2015)研究发现，内含子重复序列和反式拼接因子能提高果蝇laccase2环化水平，同时在人和小鼠细胞内也发现laccase 2侧翼内含子序列能够增加不同外显子的环化效率。虽然pCDNA3-CIRS-7外源表达载体已成功地运用到科学研究中，且Kramer等(2015)也初步阐述了circRNA环化的分子机制，但是想要进一步明确circRNA在生物体内的形成机制及发挥的功能仍需要更多的其他circRNA相关数据来佐证。
因此，circRNA过表达载体是研究circRNA功能机制的必不可少的工具。现有pCDNA3-CIRS-7过表达载体、laccase 2基因的过表达载体等，仅能用于一种circRNA的过表达，现有技术中并没有一个通用载体能表达人类的所有circRNA。因此，提供一种能过表达人类circRNA的通用载体有利于circRNA功能机制的研究。
发明内容
有鉴于此，有必要针对上述的问题，提供一种人类circRNA过表达载体框架、过表达载体及其制备方法。
一种人类circRNA过表达载体框架，包含启动子-反向互补反应上游元件-多克隆位点-反向互补反应下游元件-终止子，所述反向互补反应上游元件的序列如SEQ ID NO：1所示，所述反向互补反应下游元件的序列如SEQ ID NO：2所示。
优选地，所述启动子为pCMV，所述终止子为BGH pA。
优选地，所述多克隆位点依次包含第一酶切位点、填充序列和第二酶切位点。
优选地，第一酶切位点为BamHⅠ，第二酶切位点为EcoRⅠ。
一种人类circRNA过表达载体，以目的circRNA的基因序列替换上述人类circRNA过表达载体中的填充序列。
优选地，所述目的circRNA的基因序列的长度为100-5000bp。
所述人类circRNA过表达载体框架的制备方法，包含以下步骤：
S1、采用基因合成的方式直接合成反向互补反应上游元件-含第一、第二酶切位点的多克隆位点-反向互补反应下游元件，得到核心元件，在其上游添加第三酶切位点，在其下游添加第四酶切位点；
S2、双酶切pCDA 3.1载体和含有第三、四酶切位点的核心元件，用连接酶将核心元件连入pCDA 3.1载体中CMV启动子下游，测序验证正确得到人类circRNA过表达载体框架。
优选地，所述第三酶切位点为HindIII，所述第四酶切位点为Xhol。
所述人类circRNA过表达载体的制备方法，包含以下步骤：使用含有第一酶切位点、内含子AG受体的上游引物以及含有第二酶切位点、内含子GT供体的下游引物，PCR扩增目的circRNA的基因序列，双酶切人类circRNA过表达载体框架和目的circRNA的基因序列，用连接酶将目的circRNA的基因序列连入人类circRNA过表达载体框架。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明中构建的人类circRNA过表达载体，可以通用表达所有人类circRNA。本发明中通过反向互补反应上、下游元件的反向互补环化，反向互补上、反向互补反应下游元件各有多个ALU序列，更能保证环化效率，提高circRNA表达效率。
附图说明
图1为circRNA过表达载体框架模式图。
图2为circRNA_100146基因结构模式图。
图3为circRNA_100146基因上下游ALU重复序列的系统发育树。
图4为实施例2中扩增后circRNA_2371的PCR产物电泳图。其中，maker采用1kbPlus DNA marker；a为circRNA_2371。
图5为实施例2中菌落PCR鉴定电泳图。其中，maker为DL500maker，a、b、c、d均为pcircRNA 1.1-circRNA_2371。
图6为实施例2中pcircRNA 1.1-circRNA_2371的qPCR相对定量图。
图7为实施例2中pcircRNA 1.1-circRNA_2371表达的circRNA_2371测序结果图。
图8为实施例3中扩增后circRNA_2373的PCR产物电泳图。其中，maker采用DL2000DNA marker；a为circRNA_2373。
图9为实施例3中菌落PCR鉴定电泳图。其中，maker为DL500maker，a、b、c、d均为pcircRNA 1.1-circRNA_2373。
图10为实施例3中pcircRNA 1.1-circRNA_2373的qPCR相对定量图。
图11为实施例3中pcircRNA 1.1-circRNA_2373表达的circRNA_2373测序结果图。
图12为实施例4中扩增后circRNA T的PCR产物电泳图。其中，maker采用DL5000DNAmarker；a为circRNA_T。
图13为实施例4中菌落PCR鉴定电泳图。其中，maker为DL5000maker，a、b、c、d、e均为pcircRNA 1.1-circRNA_T。
图14为实施例4中pcircRNA 1.1-circRNA_T的qPCR相对定量图。
图15为实施例4中pcircRNA 1.1-circRNA_T表达的circRNA_T测序结果图。
具体实施方式
为了更好的说明本发明，下面结合附图和具体实施方式做进一步说明。本发明中所用试剂或仪器均可由市场购得，使用的检测方法等都是本领域所熟知的，在此不再赘述。
实施例1、人类circRNA过表达载体框架及其制备方法
一种人类circRNA过表达载体框架，以pcDNA3.1为骨架构建，其结构如图1所示，包含pCMV(启动子)-反向互补反应上游元件-多克隆位点-反向互补反应下游元件-BGH pA(终止子)。所述反向互补反应上游元件的序列如SEQ ID NO：1所示，所述反向互补反应下游元件的序列如SEQ ID NO：2所示。
本实施例中反向互补反应上、下游元件是以hsa_circRNA_100146为研究目标开展，该circRNA宿主基因为Eukaryotic translation initiation factor 3subunit I(EIF3I)；EIF3I是EIF3复合物的一种亚基。EIF3是最大的真核起始因子，也是最复杂的起始因子。在哺乳动物细胞中，EIF3是一个多亚基复合物，哺乳动物中存在13种不同的亚基(a、b、c、d、e、f、g、h、i、j、k、l和m)，其分子量超过了600KDa，真核翻译起始进程中起着核心作用。
circRNA_100146是一个双外显子circRNA，对其两翼内含子序列分析共发现9个ALU重复序列(上游5个，下游4个)，如图2所示。对9个ALU重复序列(上游5个，下游4个)开展序列比对分析发现ALU上游-2、-1与下游+1、+2序列(具体序列分别如SEQ ID NO：3-6所示)同源性较高，具备RNA前体并形成circRNA环化反应元件，系统发育树如图3所示。因此，本实施例在circRNA_100146ALU上游-1、-2与下游+1、+2序列的基础上设计得到本发明SEQ IDNO：1和SEQ ID NO：2所示的序列作为反向互补反应上、下游元件。
所述多克隆位点依次包含第一酶切位点、填充序列和第二酶切位点。第一酶切位点和第二酶切位点为pcDNA3.1中不含有的酶切位点。优选地，本实施例中第一酶切位点为BamHⅠ，第二酶切位点为EcoRⅠ。所示填充序列由任意核苷酸组成，后续被目的circRNA的基因序列所替换。所述填充序列不宜过短或过长，过短不利于酶切，过长会增加扩增时间。因此，本实施例中多克隆位点的具体序列如SEQ ID NO：7所示，具体为GGATCC(BamH I)GCGCAGGA CCG GAATTC(EcoR I)。
本实施例中circRNA过表达载体框架的制备方法，包含以下步骤：
S1、采用基因合成的方式直接合成反向互补反应上游元件-多克隆位点(含BamHI、EcoR I)-反向互补反应下游元件，得到核心元件，在其上游添加第三酶切位点，在其下游添加第四酶切位点；所述第三、四酶切位点为pCDA 3.1载体含有的多克隆位点，本实施例中优选为HindIII和Xhol；
S2、双酶切pCDA 3.1载体和含有第三、四酶切位点的核心元件，用连接酶将核心元件连入pCDA 3.1载体中CMV启动子下游，经测序鉴定成功，将构建的过表达载体框架命名为pcircRNA1.1。制得的pcircRNA1.1于大肠杆菌中保藏并扩增。
实施例2、pcircRNA1.1-circRNA_2371过表达载体及其制备方法
CircRNA_2371对应的基因序列如SEQ ID NO：8所示，采用传统酶切结合连接的方式将circRNA片段连接入pcircRNA1.1过表达载体中，即使用含有第一酶切位点(GCATCC)、内含子AG受体(TCCAG)、特异性基因序列的上游引物以及含有第二酶切位点(GAATTC)、内含子GT供体(GTAAGT)、特异性基因序列的下游引物，PCR扩增目的circRNA的基因序列，双酶切人类circRNA过表达载体框架和目的circRNA的基因序列，用连接酶将目的circRNA的基因序列连入人类circRNA过表达载体框架，便可得到pcircRNA1.1-circRNA_2371过表达载体。
具体制备方法如下：
(1)设计合成circRNA引物，扩增circRNA_2371
扩增体系如表1所示。
表1、扩增体系
扩增程序为：
预变性：94℃5min。变性：94℃10sec；退火：根据引物设定温度，30sec；延伸：72℃1kb/1min；共35循环。延伸：72℃10min。保存：12℃。
扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，目标条带约360bp，结果如图4所示。扩增产物回收、纯化按照上海美吉生物医药有限公司胶中DNA回收试剂盒(AE-HSCH)操作说明回收PCR产物。
(2)提取pcircRNA1.1过表达载体
按照生工生物工程有限公司SanPrep无内毒素质粒DNA小量提取试剂盒(B518161)操作说明从大肠杆菌提取pcircRNA1.1过表达载体。
(3)将扩增产物连接入pcircRNA1.1过表达载体中
将扩增产物连接入pcircRNA1.1过表达载体分别双酶切，酶切体系如表2所示。
表2、酶切体系
按照上海美吉生物医药有限公司胶中DNA回收试剂盒(AE-HSCH)操作说明回收双酶切产物。
连接扩增产物酶切片段及pcircRNA1.1-circRNA表达载体酶切片段，16℃连接1小时，连接体系如表3所示。
表3、连接体系
连接产物与50μL感受态细胞混合，冰上孵育30分钟；42℃热激45秒；瞬间转移至冰上孵育5分钟；将感受态细胞与1mL SOC培养基混合后37℃震荡培养1小时；涂板。挑取培养板上的单菌落(5个)，溶于20μL的无菌水中，取4μL作为模板进行PCR。此外，分别设置一个阴性对照(加入感受态细胞)和阳性对照(加入目的基因片段)。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，目标条带约360bp，电泳结果如图5所示。按照生工生物工程有限公司SanPrep无内毒素质粒DNA小量提取试剂盒(B518161)操作说明提取阳性克隆菌内的过表达载体，得到pcircRNA1.1-circRNA_2371过表达载体(pCMV启动子-反向互补反应上游元件-circRNA_2371-反向互补反应下游元件-BGH pA)。
将构建成功的过表达载体转染293T细胞，48h后使用qPCR技术以GAPDH为内参，以空载转染组为空白对照检测circRNA_2371表达上调比例。CircRNA qPCR引物为：上游引物AAACCTCGGACTTTGCTGAA(SEQ ID NO：9)，下游引物ACAGTTTTGGTGCTGCTGTG(SEQ ID NO：10)；内参基因GAPDH qPCR引物为：上游引物AACGGATTTGGTCGTATTGGG(SEQ ID NO：11)，下游引物CCTGGAAGATGGTGATGGGAT(SEQ ID NO：12)。然后对qPCR扩增片段结果测序验证circRNA_2371表达定量分析及序列拼接定性分析的正确性，结果如图6和图7所示。由图6和图7可知，pcircRNA 1.1-circRNA_2371可以过表达circRNA，上调倍数为19.6，测序验证序列拼接定性分析正确。
实施例3、pcircRNA1.1-circRNA_2373过表达载体及其制备方法
CircRNA_2373对应的基因序列如SEQ ID NO：13所示，采用传统酶切结合连接的方式将circRNA片段连接入pcircRNA1.1过表达载体中，便可得到pcircRNA1.1-circRNA_2373过表达载体，具体方法与实施例2相同。扩增后及菌落鉴定的PCR产物琼脂糖凝胶电泳图如图8和图9所示，目的片段约129bp。
将构建成功的过表达载体转染293T细胞，48h后使用qPCR技术以GAPDH为内参，以空载转染组为空白对照检测circRNA_2373表达上调比例。CircRNA qPCR引物为：上游引物CCACCATCCCAGCTCAG(SEQ ID NO：14)，下游引物ACAGTGCTGGTATCCGGTTC(SEQ ID NO：15)；内参基因GAPDH qPCR引物为：上游引物AACGGATTTGGTCGTATTGGG(SEQ ID NO：11)，下游引物CCTGGAAGATGGTGATGGGAT(SEQ ID NO：12)。然后对qPCR扩增片段结果测序验证circRNA_2373表达定量分析及序列拼接定性分析的正确性，结果如图10和图11所示。由图10和图11可知，pcircRNA 1.1-circRNA_2373可以过表达circRNA，上调倍数为32.2，测序验证序列拼接定性分析正确。
实施例4、pcircRNA1.1-circRNA_T过表达载体及其制备方法
CircRNA_T对应的基因序列如SEQ ID NO：16所示，采用传统酶切结合连接的方式将circRNA片段连接入pcircRNA1.1过表达载体中，便可得到pcircRNA1.1-circRNA_T过表达载体，具体方法与实施例2相同。扩增后及菌落鉴定的PCR产物琼脂糖凝胶电泳图如图12和图13所示，目的片段约766bp，其中含有载体344bp。
将构建成功的表达载体转染293T细胞，48h后使用qPCR技术以GAPDH为内参，以空载转染组为空白对照检测circRNA_T表达上调比例。然后对qPCR扩增片段结果测序验证circRNA_T表达定量分析及序列拼接定性分析的正确性，结果如图14和图15所示。由图14和图15可知，pcircRNA 1.1-circRNA_T可以过表达circRNA，上调倍数为29.3，测序验证序列拼接定性分析正确。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (9)

1.一种人类circRNA过表达载体框架，其特征在于，包含启动子-反向互补反应上游元件-多克隆位点-反向互补反应下游元件-终止子，所述反向互补反应上游元件的序列如SEQID NO：1所示，所述反向互补反应下游元件的序列如SEQ ID NO：2所示。
2.根据权利要求1所述的人类circRNA过表达载体框架，其特征在于，所述启动子为pCMV，所述终止子为BGH pA。
3.根据权利要求1所述的人类circRNA过表达载体框架，其特征在于，所述多克隆位点依次包含第一酶切位点、填充序列和第二酶切位点。
4.根据权利要求1所述的人类circRNA过表达载体框架，其特征在于，第一酶切位点为BamH Ⅰ，第二酶切位点为EcoR Ⅰ。
5.一种人类circRNA过表达载体，其特征在于，以目的circRNA的基因序列替换上述人类circRNA过表达载体中的填充序列。
6.根据权利要求1所述的人类circRNA过表达载体，其特征在于，所述目的circRNA的基因序列的长度为100-5000bp。
7.一种人类circRNA过表达载体框架的制备方法，其特征在于，包含以下步骤：
S1、采用基因合成的方式直接合成反向互补反应上游元件-含第一、第二酶切位点的多克隆位点-反向互补反应下游元件，得到核心元件，在其上游添加第三酶切位点，在其下游添加第四酶切位点；
S2、双酶切pCDA 3.1载体和含有第三、四酶切位点的核心元件，用连接酶将核心元件连入pCDA 3.1载体中CMV启动子下游，测序验证正确得到人类circRNA过表达载体框架。
8.根据权利要求7所述的人类circRNA过表达载体框架的制备方法，其特征在于，所述第三酶切位点为HindIII，所述第四酶切位点为Xhol。
9.一种人类circRNA过表达载体的制备方法，包含以下步骤：使用含有第一酶切位点、内含子AG受体的上游引物以及含有第二酶切位点、内含子GT供体的下游引物，PCR扩增目的circRNA的基因序列，双酶切人类circRNA过表达载体框架和目的circRNA的基因序列，用连接酶将目的circRNA的基因序列连入人类circRNA过表达载体框架。
CN201610826732.5A 2016-09-14 2016-09-14 一种人类circRNA过表达载体框架、过表达载体及其制备方法 Pending CN106318976A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610826732.5A CN106318976A (zh) 2016-09-14 2016-09-14 一种人类circRNA过表达载体框架、过表达载体及其制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610826732.5A CN106318976A (zh) 2016-09-14 2016-09-14 一种人类circRNA过表达载体框架、过表达载体及其制备方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN106318976A true CN106318976A (zh) 2017-01-11

Family

ID=57788057

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610826732.5A Pending CN106318976A (zh) 2016-09-14 2016-09-14 一种人类circRNA过表达载体框架、过表达载体及其制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106318976A (zh)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108103100A (zh) * 2018-02-28 2018-06-01 中南大学 一种表达环状rna的真核表达载体
CN108165549A (zh) * 2017-12-26 2018-06-15 上海锐赛生物技术有限公司 人工环状rna的通用表达框架及其应用
CN109082441A (zh) * 2018-08-29 2018-12-25 广州伯信生物科技有限公司 一种环状rna表达载体及使用所述表达载体的trap方法
CN109097395A (zh) * 2018-09-05 2018-12-28 广州伯信生物科技有限公司 一种人类环状rna过表达载体框架、过表达载体及其制备方法
CN109355290A (zh) * 2018-09-27 2019-02-19 四川农业大学 一种植物环状rna表达框架及其应用
CN114480499A (zh) * 2022-03-04 2022-05-13 中国人民解放军陆军军医大学 环状RNA分子表达元件以及环状RNA分子的表达载体circEXPRO

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105087570A (zh) * 2015-09-07 2015-11-25 广州吉赛生物科技有限公司 一种环状rna人工过表达框架及其表达载体及构建方法
CN105176981A (zh) * 2015-09-17 2015-12-23 广州永诺生物科技有限公司 用于环状rna表达的dna序列和表达载体及其应用
CN105755042A (zh) * 2016-03-25 2016-07-13 广州吉赛生物科技有限公司 筛选鉴定环状rna翻译蛋白质的荧光报告系统及其构建方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105087570A (zh) * 2015-09-07 2015-11-25 广州吉赛生物科技有限公司 一种环状rna人工过表达框架及其表达载体及构建方法
CN105176981A (zh) * 2015-09-17 2015-12-23 广州永诺生物科技有限公司 用于环状rna表达的dna序列和表达载体及其应用
CN105755042A (zh) * 2016-03-25 2016-07-13 广州吉赛生物科技有限公司 筛选鉴定环状rna翻译蛋白质的荧光报告系统及其构建方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
STEVEN P. BARRETT ET AL.: "Circular RNAs: analysis, expression and potential functions", 《DEVELOPMENT》 *
THOMAS B. HANSEN ET AL.: "Natural RNA circles function as efficient microRNA sponges", 《NATURE》 *

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108165549A (zh) * 2017-12-26 2018-06-15 上海锐赛生物技术有限公司 人工环状rna的通用表达框架及其应用
CN108165549B (zh) * 2017-12-26 2021-06-29 浙江自贸区锐赛生物医药科技有限公司 人工环状rna的通用表达框架及其应用
CN108103100A (zh) * 2018-02-28 2018-06-01 中南大学 一种表达环状rna的真核表达载体
CN108103100B (zh) * 2018-02-28 2020-07-03 中南大学 一种表达环状rna的真核表达载体
CN109082441A (zh) * 2018-08-29 2018-12-25 广州伯信生物科技有限公司 一种环状rna表达载体及使用所述表达载体的trap方法
CN109097395A (zh) * 2018-09-05 2018-12-28 广州伯信生物科技有限公司 一种人类环状rna过表达载体框架、过表达载体及其制备方法
CN109355290A (zh) * 2018-09-27 2019-02-19 四川农业大学 一种植物环状rna表达框架及其应用
CN109355290B (zh) * 2018-09-27 2021-12-14 四川农业大学 一种植物环状rna表达框架及其应用
CN114480499A (zh) * 2022-03-04 2022-05-13 中国人民解放军陆军军医大学 环状RNA分子表达元件以及环状RNA分子的表达载体circEXPRO

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106318976A (zh) 一种人类circRNA过表达载体框架、过表达载体及其制备方法
CN108715850B (zh) 表皮干细胞中采用CRISPR-Cas系统进行GING2基因敲除
JP5655947B2 (ja) 成葉特異的プロモーター
CN107236741A (zh) 一种敲除野生型T细胞TCR alpha链的gRNA及方法
CN105960413A (zh) 人工dna-结合蛋白及其用途
RU2012125253A (ru) Система для увеличения экспрессии генов и вектор, содержащий указанную систему
CN109097395A (zh) 一种人类环状rna过表达载体框架、过表达载体及其制备方法
CN108359692B (zh) 一种特异性靶向hDGKθ基因的荧光素酶报告系统
CN107955067B (zh) 参与桃黄酮醇生物合成调控的两个myb转录因子及其应用
Wei et al. Adenovirus-mediated interference of FABP4 regulates mRNA expression of ADIPOQ, LEP and LEPR in bovine adipocytes
CN111440826A (zh) 靶向RNA的6-甲基腺嘌呤修饰CasRx载体系统及制备方法和应用
CN109355290A (zh) 一种植物环状rna表达框架及其应用
CN109082441A (zh) 一种环状rna表达载体及使用所述表达载体的trap方法
CN112680443A (zh) 一种启动子pCalm1及其应用
Tan et al. Expression of MicroRNA‐29a Regulated by Yes‐Associated Protein Modulates the Neurite Outgrowth in N2a Cells
CN112574992A (zh) 一种circRNA过表达成环载体DNA序列及其构建方法与应用
Cheng et al. The effect of light intensity on the expression of leucoanthocyanidin reductase in grapevine calluses and analysis of its promoter activity
CN103952410B (zh) 一种有效抑制大鼠FoxO3a基因表达的shRNA及其应用
CN108893473B (zh) 表皮干细胞中采用CRISPR-Cas系统进行Rab23基因敲除
CN101934069B (zh) 脑红蛋白在促进神经元突起生长中的应用
CN106520766A (zh) 一种海藻内源组成型启动子及其应用
CN109504679A (zh) 用于基因在禽类骨骼肌中特异性表达的启动子以及应用
CN106868006B (zh) 一种e2f1蛋白可结合dna片段及在e2f1活性检测中的应用
CN112126645B (zh) 一种环形rna敲低方法及其应用
CN117187249B (zh) 一种牦牛Lnc-MEG8基因及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20170111

RJ01 Rejection of invention patent application after publication