CN103952410B - 一种有效抑制大鼠FoxO3a基因表达的shRNA及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种shRNA，特别涉及一种有效抑制大鼠FoxO3a基因表达的shRNA及其应用。编码所述shRNA的DNA序列，如下所示：5’-GGAACTTCACTGGTGCTAAGCGCAAGAGGCTTAGCACCAGTGAAGTTC？C-3’，所述的GCAAGAG为loop序列。所述的有效抑制大鼠FoxO3a基因表达的shRNA的应用包括将所述的shRNA构建于慢病毒载体上，得到含有所述shRNA的重组载体；将含有所述shRNA的重组载体作用于大鼠细胞，达到抑制大鼠FoxO3a基因表达的目的。该shRNA能有效抑制大鼠FoxO3a基因在mRNA及蛋白水平的表达。
Description
技术领域
本发明涉及一种shRNA，特别涉及一种有效抑制大鼠FoxO3a基因表达的shRNA及其应用。
背景技术
FoxO3a是属于Forkheadbox(Fox)蛋白家族的一个核转录因子，可通过调节Bim、Fasligand(FasL)、TNFR2、p27、p53、抗氧化物酶等多种下游靶基因的转录而发挥促细胞凋亡、细胞周期阻滞及抗氧化等不同的生物学功能。目前研究认为，FoxO3a广泛分布于哺乳动物的多种组织和细胞中，并参与糖代谢、骨骼肌的分化发育、血管发生、抑制细胞增殖、抑制心肌肥厚等生理和病理过程。因此，研究不同病理及生理条件下FoxO3a转录因子的功能越来越受到人们的广泛关注。
随着RNA干扰技术的不断深入发展，将设计合成的shRNA构建到慢病毒表达系统，进而感染特定的靶细胞，特异性沉默相关基因表达，已经成为研究基因功能的最有效的手段之一，也是靶向基因治疗的有效途径。shRNA慢病毒表达系统有效克服了以往人工合成的siRNA转染效率低、持续时间短等不足，已经逐步发展成为在原代细胞及体内研究基因功能的有效途径之一。针对大鼠FoxO3a基因设计特异性的shRNA序列，构建相应的慢病毒表达系统，为今后深入研究大鼠FoxO3a基因的功能奠定了基础，可广泛应用于FoxO3a基因相关的大鼠细胞及动物模型，具有重要的应用前景和经济价值。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种有效抑制大鼠FoxO3a基因表达的shRNA。
本发明的另一目的在于提供上述有效抑制大鼠FoxO3a基因表达的shRNA的应用。
本发明的再一目的在于提供一种含有上述shRNA的重组载体。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种有效抑制大鼠FoxO3a基因表达的shRNA，其靶向大鼠FoxO3a基因的序列如下所示：5’-GGAACTTCACTGGTGCTAAGC-3’，位于大鼠FoxO3a基因mRNA(NM-001106395.1)的2296位点开始的21个碱基序列；
编码所述的抑制大鼠FoxO3a基因表达的shRNA的DNA序列，如下所示：
5’-GGAACTTCACTGGTGCTAAGCGCTTAGCACCAGTGAAGTTCC-3’，斜体加下划线为loop序列；
所述的有效抑制大鼠FoxO3a基因表达的shRNA的应用，该应用包括将所述的shRNA构建于慢病毒载体上，得到含有所述shRNA的重组载体；将含有所述shRNA的重组载体作用于大鼠细胞，达到抑制大鼠FoxO3a基因表达的目的；
所述慢病毒载体为pGLV3/H1/GFP+Puro(pGLV3)慢病毒穿梭载体；
所述的含有所述shRNA的重组载体的制备方法，包含以下步骤：
(1)设计含有抑制大鼠FoxO3a基因表达的shRNA的DNA序列，如下所示：
5’-GGAACTTCACTGGTGCTAAGCGCTTAGCACCAGTGAAGTTCC-3’，斜体加下划线为loop序列；
为将其克隆到pGLV3慢病毒穿梭载体上，合成以下正义链(F)及反义链(R)DNA序列：
FoxO3a-shRNA-2296正义链：
5’-GATCC TTTTTTG-3’；
FoxO3a-shRNA-2296反义链：
3’-G AAAAAACTTAA-5’；
上述正义链模板的5’端添加了GATCC，与BamHI酶切后形成的粘端互补；反义链模板的5’端添加了AATTC，与EcoRI酶切后形成的粘端互补；
(2)将等量的正义链和反义链DNA混合，进行退火，以形成DNA双链，得到shRNA模板；
(3)将pGLV3载体用BamHI和EcoRI双酶切，得到线性化的pGLV3载体；
(4)将步骤(2)中的shRNA模版和步骤(3)中线性化的pGLV3载体进行连接，得到重组载体pGLV3-FoxO3a-shRNA；
步骤(2)中所述的shRNA模板的终浓度优选为200nM；
步骤(3)中所述的线性化的pGLV3载体的终浓度优选为50ng/μL；
将重组载体pGLV3-FoxO3a-shRNA与包装载体pGag/Pol、pRev、pVSV-G一起倒入293T细胞，收集培养上清获得含有目的shRNA的病毒颗粒，可用于转染目的细胞。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
本发明所述抑制大鼠FoxO3a基因表达的shRNA能有效抑制大鼠FoxO3a基因在mRNA及蛋白水平的表达。将所述抑制大鼠FoxO3a基因表达的shRNA构建于慢病毒载体上，不仅可有效作用于分裂及非分裂状态的细胞，也适用于体内及体外研究。同时，对于深入研究大鼠FoxO3a基因的功能及其相关疾病的治疗均具有重要的科学意义及应用前景。
附图说明
图1是本发明所设计的靶向抑制大鼠FoxO3a基因表达的shRNA的设计位点对比图。
图2是用荧光显微镜检测将重组载体导入原代大鼠心脏微血管内皮细胞的效率图。
图3是利用Westernblotting技术检测转染4种重组慢病毒载体后大鼠细胞中内源性FoxO3a蛋白表达水平分析图，其中，A为所设计的4种shRNA对FoxO3a蛋白表达抑制的WesternBlotting分析；B为FoxO3a蛋白的相对表达量统计分析；C为4种shRNA对FoxO3a蛋白表达的抑制率统计分析。
图4是用RT-PCR技术检测大鼠细胞中内源性FoxO3a基因mRNA被抑制情况分析图，其中，A为电泳检测FoxO3a的mRNA表达；B为FoxO3a-shRNA-2296抑制FoxO3a的mRNA表达的统计分析。
图5是利用Westernblotting技术检测大鼠心脏微血管内皮细胞导入重组质粒后FoxO3a下游靶基因p27的表达分析图，其中，A为本发明所述的shRNA对p27蛋白表达抑制的WesternBlotting分析；B为FoxO3a-shRNA-2296抑制p27蛋白表达的统计分析。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1shRNA序列的设计与合成
(1)通过GeneBank数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank)查询大鼠FoxO3a基因的mRNA信息，根据shRNA设计原则，设计了4条针对大鼠FoxO3a基因的FoxO3a-shRNA序列，并将上述设计完成的shRNA序列送生工生物(上海)有限公司合成。其中4条shRNA分别为靶向大鼠FoxO3a基因(NM_001106395.1)的1012位点、1765位点、1903位点及2296位点，长为21个碱基(图1)。
其中，本发明所涉及的FoxO3a-shRNA-1012的作用位点序列为：5‘-GCAAGAGCTCTTGGTGGATCA-3’；FoxO3a-shRNA-1765的作用位点序列为：5‘-GCCACAGCGATGTCATGATGA-3’；FoxO3a-shRNA-1903的作用位点序列为：5‘-GGAGTTTGGTCAATCAGAACT-3’；FoxO3a-shRNA-2296的作用位点序列为：5‘-GGAACTTCACTGGTGCTAAGC-3’。
根据上述4中shRNA的作用位点序列设计合成相应的shRNA的正义与反义链DNA序列：
FoxO3a-shRNA-1012正义链：
5’-GATCC TTTTTTG-3’；
FoxO3a-shRNA-1012反义链：
3’-GAAAAACTTAA-5’；
FoxO3a-shRNA-1765正义链：
5’-GATCC TTTTTTG-3’；
FoxO3a-shRNA-1765反义链：
3’-GAAAAACTTAA-5’；
FoxO3a-shRNA-1903正义链：
5’-GATCC TTTTTTG-3’；
FoxO3a-shRNA-1903反义链：
3’-GAAAAACTTAA-5’；
FoxO3a-shRNA-2296正义链：
5’-GATCC TTTTTTG-3’；
FoxO3a-shRNA-2296反义链：
3’-GAAAAACTTAA-5’；
上述正义链模板的5’端添加了GATCC，与BamHI酶切后形成的粘端互补；反义链模板的5’端添加了AATTC，与EcoRI酶切后形成的粘端互补。
(2)将等量的正义链(100μM，5μL)和反义链(100μM，5μL)DNA混合，加入5倍的AnnealingBufferforDNAOligos(10μL,Beyotime)，然后用去离子水补充到50μL。在PCR仪上按照如下程序进行退火处理：95℃5min，然后以每8秒下降0.1℃的速率降至25℃进行退火，最后4℃保存备用。将退火后所得shRNA模板溶液稀释50倍，使其终浓度为200nM，用于连接反应。
(3)将pGLV3载体(吉玛基因股份有限公司)用BamHI和EcoRI双酶切，进行载体的线性化处理，酶切条件如下所述：将pGLV3载体(10μg)、BamHI内切酶(5μL，TOYOBO)、EcoRI内切酶(5μL，TOYOBO)、Hbuffer(80μL，TOYOBO)混匀，置于37℃反应1小时，用凝胶回试剂盒(Qiagen)回收线性载体片段，将其浓度稀释至50ng/μL。
(4)将线性化的pGLV3载体1μL、经退火处理的shRNA模版1μL、T4DNA连接酶(Fermentas)1μL、10×T4连接缓冲液(Fermentas)2μL、去离子水15μL混匀，于22℃连接1小时。取连接产物2μL转化大肠杆菌Top10感受态细胞(TIANGEN)，在含有100μg/mL氨苄青霉素的LB平板上于30℃培养过夜。挑选长出的单克隆在含有100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中于30℃培养过夜，用质粒抽提试剂盒(Qiagen)纯化质粒，经测序验证后大量制备重组质粒pGLV3-FoxO3a-shRNA。
(5)将重组载体pGLV3-FoxO3a-shRNA与包装载体pGag/Pol、pRev、pVSV-G(吉玛基因股份有限公司)一起倒入293T细胞(ATCC，美国)，收集培养上清，获得含有目的shRNA的病毒颗粒。
实施例2重组慢病毒载体感染原代大鼠心脏微血管内皮细胞的效率
将表达上述4种shRNA的慢病毒颗粒转染SD大鼠(购买于广东省医学实验动物中心)心脏微血管内皮细胞(CaoL,ZhangL,ChenS,YuanZ,LiuS,ShenX,ZhengX,QiX,LeeKK,ChanJY,CaiD.BDNF-mediatedmigrationofcardiacmicrovascularendothelialcellsisimpairedduringageing.JCellMolMed,2012,16(12):3105-15)，利用荧光显微镜技术检测不同shRNA的感染效率。
(1)实验分组：实验分为空白对照组、FoxO3a-shRNA-1012感染组、FoxO3a-shRNA-1765感染组、FoxO3a-shRNA-1903感染组、FoxO3a-shRNA-2296感染组等共5组，所有组别的细胞数量及培养条件一致；
(2)具体感染方法：将1×105个细胞与5×106TU病毒颗粒混合于500μL的EGM-2(LONZA)完全培养基中(内含5％的FBS+双抗+5μg/mL的polybrene)，并接种于24孔板，于37℃的培养箱中培养12小时，去除原有培养基，并加入新鲜的EGM-2完全培养基继续培养；
(3)荧光显微镜检测：细胞感染72小时后进行荧光显微镜观察并进行拍照。结果表明，与对照组相比，所设计合成的4种shRNA慢病毒载体均能有效感染原代的大鼠心脏微血管内皮细胞，感染率均在80％以上，其中FoxO3a-shRNA-2296的感染效率最高，感染效率依次为：FoxO3a-shRNA-2296>FoxO3a-shRNA-1012>FoxO3a-shRNA-1765>FoxO3a-shRNA-1903(图2)。
实施例3重组慢病毒载体对大鼠心脏微血管内皮细胞中内源性FoxO3a蛋白表达的抑制作用
利用Westernblooting技术检测4种shRNA对大鼠心脏微血管内皮细胞内源性FoxO3a蛋白表达水平的影响。
(1)实验分组：实验分为空白对照组、FoxO3a-shRNA-1012感染组、FoxO3a-shRNA-1765感染组、FoxO3a-shRNA-1903感染组、FoxO3a-shRNA-2296感染组等共5组。所有组别的细胞数量及培养条件一致，感染组均用同样的病毒量(MOI＝50)进行处理。
(2)Westernblooting检测：细胞感染72小时后，利用蛋白质裂解液(碧云天)提取总蛋白质，利用Bio-Rad公司生产的蛋白质浓度测定试剂测定其蛋白浓度。具体实验方法请参照文献(Xu-FengQi,Dong-HeuiKim,Yang-SukYoon,Jian-HongLi,Soon-BongSong,DanJin,Xue-ZhuHuang,Yung-ChienTeng,Kyu-JaeLee.Theadenylylcyclase-cAMPsystemsuppressesTARC/CCL17andMDC/CCL22productionthroughp38MAPKandNF-кBinHaCaTkeratinocytes.MolImmunol,2009,46(10):1925-1934.)执行，使用anti-FoxO3a抗体(CellSignalingTechnology)及β-actin抗体(CellSignalingTechnology)进行检测，并用IPP软件对蛋白条带进行灰度分析。结果表明，FoxO3a-shRNA-1012及FoxO3a-shRNA-2296均对内源性大鼠FoxO3a基因的表达具有较强的抑制作用，FoxO3a-shRNA-2296的抑制效率最高，达99％；FoxO3a-shRNA-1012的抑制效率也达到97％；FoxO3a-shRNA-1765的抑制效率达到80％，而FoxO3a-shRNA-1903几乎没有任何抑制效果(图3)。
实施例4FoxO3a-shRNA-2296对大鼠心脏微血管内皮细胞FoxO3a基因mRNA表达的影响
利用FoxO3a-shRNA-2296对SD大鼠(购买于广东省医学实验动物中心)心脏微血管内皮细胞(CaoL,ZhangL,ChenS,YuanZ,LiuS,ShenX,ZhengX,QiX,LeeKK,ChanJY,CaiD.BDNF-mediatedmigrationofcardiacmicrovascularendothelialcellsisimpairedduringageing.JCellMolMed,2012,16(12):3105-15)进行感染(MOI＝50)，48小时后收集总RNA样品。以未进行任何处理的细胞作为空白对照。通过RT-PCR技术检测了大鼠心脏微血管内皮细胞中FoxO3a的mRNA表达情况。具体实验方法为：用TRIreagent(MolecularResearchCenterInc.,Cincinnati,USA)提取细胞的总RNA，用A260与A280检测其质量，用PrimeRTPremixkit(GeNetBio,Chungnam,Korea)合成cDNA。所用RT-PCR引物序列为：
FoxO3a上游引物：5’-TCGCGCACCAATTCCAAC-3’；
FoxO3a下游引物：5’-TCGCTGTGGCTGAGTGAGTC-3’；
β-actin上游引物：5’-GCACCACACCTTCTACAATGAG-3’；
β-actin下游引物：5’-TTGGCATAGAGGTCTTTACGGA-3’；
PCR反应用PrimeTaqPremixkit(GeNetBio,Chungnam,Korea)试剂盒完成，反应程序为：94℃预变性5分钟；94℃变性30秒、56～65℃退火30秒、72℃延伸30秒，30个循环；72℃延伸7分钟。PCR产物用质量百分比2％的琼脂糖凝胶进行电泳并拍照。结果表明，大鼠心脏微血管内皮细胞中存在FoxO3a基因的内源性表达，而FoxO3a-shRNA-2296感染可有效抑制FoxO3a基因的mRNA表达水平，说明本发明所述shRNA可在mRNA水平上有效抑制靶基因FoxO3a的表达(图4)。
实施例5FoxO3a-shRNA-2296感染对大鼠心脏微血管内皮细胞中FoxO3a下游靶基因p27表达的影响
p27蛋白是转录因子FoxO3a下游的经典靶基因之一，FoxO3a的活性升高可导致其靶基因p27的表达升高、活性增强。为进一步验证本发明所述shRNA对FoxO3a基因的靶向抑制作用，同时利用Westernblooting技术检测了FoxO3a-shRNA-2296感染对大鼠心脏微血管内皮细胞中p27蛋白表达的影响。所用p27及β-actin抗体均购置于CellSignaling公司。Westernblooting技术的具体实验方法参照实施例3。结果表明，FoxO3a-shRNA-2296感染可有效抑制FoxO3a下游靶基因p27蛋白的表达水平(图5)。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种有效抑制大鼠FoxO3a基因表达的shRNA，其特征在于：编码所述shRNA的DNA序列如下所示：
5’-GGAACTTCACTGGTGCTAAGCGCAAGAGGCTTAGCACCAGTGAAGTTCC-3’，其中，GCAAGAG为loop序列。
2.权利要求1所述的shRNA在制备FoxO3a基因功能研究的产品以及在制备FoxO3a基因有关疾病的靶向治疗药物中的应用。
3.根据权利要求2所述的shRNA在制备FoxO3a基因功能研究的产品以及在制备FoxO3a基因有关疾病的靶向治疗药物中的应用，其特征在于该应用包括将权利要求1中所述的DNA序列构建于慢病毒载体上，得到含有权利要求1中所述DNA序列的重组载体；将含有权利要求1中所述DNA序列的重组载体作用于大鼠细胞，达到抑制大鼠FoxO3a基因表达的目的。
4.根据权利要求3所述的shRNA在制备FoxO3a基因功能研究的产品以及在制备FoxO3a基因有关疾病的靶向治疗药物中的应用，其特征在于：
所述慢病毒载体为pGLV3慢病毒穿梭载体。
5.根据权利要求4所述的shRNA在制备FoxO3a基因功能研究的产品以及在制备FoxO3a基因有关疾病的靶向治疗药物中的应用，其特征在于：
所述的含有权利要求1中所述DNA序列的重组载体的制备方法，包含以下步骤：
(1)设计含有抑制大鼠FoxO3a基因表达的shRNA的DNA序列，如下所示：
5’-GGAACTTCACTGGTGCTAAGCGCAAGAGGCTTAGCACCAGTGAAGTTCC-3’，斜体加下划线为loop序列；
为将其克隆到pGLV3慢病毒穿梭载体上，合成以下正义链及反义链DNA序列：
FoxO3a-shRNA-2296正义链：
5’-GATCCGGAACTTCACTGGTGCTAAGCGCAAGAGGCTTAGCACCAGTGAAGTTCCTTTTTTG-3’；
FoxO3a-shRNA-2296反义链：
3’-GCCTTGAAGTGACCACGATTCGCGTTCTCCGAATCGTGGTCACTTCAAGGAAAAAACTTAA-5’；
上述正义链模板的5’端添加了GATCC，与BamHI酶切后形成的粘端互补；反义链模板的5’端添加了AATTC，与EcoRI酶切后形成的粘端互补；
(2)将等量的正义链和反义链DNA混合，进行退火，以形成DNA双链，得到shRNA模板；
(3)将pGLV3载体用BamHI和EcoRI双酶切，得到线性化的pGLV3载体；
(4)将步骤(2)中的shRNA模版和步骤(3)中线性化的pGLV3载体进行连接，得到重组载体pGLV3-FoxO3a-shRNA。
6.根据权利要求5所述的shRNA在制备FoxO3a基因功能研究的产品以及在制备FoxO3a基因有关疾病的靶向治疗药物中的应用，其特征在于：
步骤(2)中所述的shRNA模板的终浓度为200nM。
7.根据权利要求5所述的shRNA在制备FoxO3a基因功能研究的产品以及在制备FoxO3a基因有关疾病的靶向治疗药物中的应用，其特征在于：
步骤(3)中所述的线性化的pGLV3载体的终浓度为50ng/μL。
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| Date | Code | Title | Description |
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| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant |