CN110218726A - 一种用于抑制大鼠Cacna1c基因表达的shRNA及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于抑制大鼠Cacna1c基因表达的shRNA，其基因序列如SEQ ID NO.1所示，其中ttcaagaga为loop结构。本发明还提供了上述shRNA在抑制大鼠Cacna1c基因表达中的用途。本发明还提供了一种重组载体，含有上述的shRNA。本发明还提供了腺相关病毒的制备方法。本发明的shRNA，其作用靶点位于大鼠Cacna1c基因mRNA的第314个位点。本发明将所述的shRNA构建于AAV载体上，得到含有所述shRNA的AAV病毒颗粒；将含有所述shRNA的AAV病毒颗粒用于在体内注射大鼠组织，可以达到抑制大鼠Cacna1c基因表达的目的。

Description

一种用于抑制大鼠Cacna1c基因表达的shRNA及其用途

技术领域

本发明属于生物工程领域，涉及一种shRNA，具体来说是一种用于抑制大鼠Cacna1c基因表达的shRNA及其用途。

背景技术

Cacna1c基因编码L型高电压门控钙通道的Cav1.2α₁亚基。L型通道是高电压门控钙通道的其中一种亚型，由α₁、α₂/δ、β和γ亚基以1:1:1的比例组成。其中α₁亚基由24个跨膜段组成，形成离子进入细胞的孔，决定了钙通道的类型。L型通道家族又包括四种成员，分别为Cav1.1-1.4，这四种成员药理性质类似，但在组织分布及生物物理特性上存在差异。Cacna1c基因编码的L型通道Cav1.2主要表达在可兴奋性细胞上，如神经元、肾上腺嗜铬细胞、窦房结及心房心肌细胞，参与心肌收缩、疼痛传导、情绪控制及内分泌调节等生命活动。L型通道Cav1.2的活动可被钙通道阻滞剂（CCBs）抑制，但由于Cav1.1-1.4均对CCBs敏感，无法特异性抑制Cav1.2的活动，且Cav1.2组织分布广泛，运用CCBs易导致心血管副作用，特异性抑制某类细胞的Cav1.2存在困难。

RNA干扰（RNAi）是有效沉默或抑制目标基因表达的过程，该过程通过双链RNA（dsRNA）使得目标基因相应的mRNA选择性失活来实现的。RNA干扰由转运到细胞细胞质中的双链RNA激活。沉默机制可导致由小干扰RNA（siRNA）或短发夹RNA（shRNA）诱导实现靶mRNA的降解，或者通过小RNA（miRNA）诱导特定mRNA翻译的抑制。随着RNA干扰技术的不断深入发展，将设计合成的shRNA构建到慢病毒表达系统，进而感染特定的靶细胞，特异性沉默相关基因表达，已经成为研究基因功能的最有效的手段之一，也是靶向基因治疗的有效途径。shRNA慢病毒表达系统有效克服了以往人工合成的siRNA转染效率低、持续时间短等不足，已经逐步发展成为在原代细胞及体内研究基因功能的有效途径之一。针对大鼠Cacna1c基因设计特异性的shRNA序列，构建相应的慢病毒表达系统，为今后深入研究大鼠Cacna1c基因的功能奠定了基础，可广泛应用于Cacna1c基因相关的大鼠细胞及动物模型，具有重要的应用前景和经济价值。

腺相关病毒（AAV）是一种复制缺陷型细小病毒，其增殖复制需要腺病毒或疱疹病毒的辅助。AAV无辅助病毒系统（AAV Helper-Free System）可以在无辅助病毒的条件下生产出重组人腺相关病毒。AAV-293细胞是经过改良HEK293腺相关病毒生产能力而衍生出的亚克隆细胞系。由于不再需要活的辅助病毒，AAV Helper-Free System提供一个更安全，更便利的替代逆转录病毒和腺病毒的基因传递系统。AAV具有广泛的宿主范围，高滴度病毒生产能力和长期的基因转染潜力的特征。AAV具有广泛的细胞和组织感染能力，并且不依赖于宿主细胞活跃的分裂能力。

另外，由于这种系统不包含任何野生型病毒产品，宿主细胞免疫反应被降至最低，从而允许对具有免疫能力的宿主细胞进行基因传递。对于哺乳动物细胞基因传递策略，高滴度的重组病毒生产能力是必须要顾及的。AAV Helper-Free System可以生产出重组病毒滴度≥10⁷病毒颗粒/毫升的病毒原液（浓缩后可以获得更高的滴度，浓缩后滴度最高可达≥10¹²病毒颗粒/毫升）。AAV是基因传递和表达的一个重要工具。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于抑制大鼠Cacna1c基因表达的shRNA及其用途，所述的这种用于抑制大鼠Cacna1c基因表达的shRNA及其用途要解决现有技术中的特异性抑制Cacna1c基因存在困难的技术问题。

本发明提供了一种用于抑制大鼠Cacna1c基因表达的shRNA，其序列为：5’-cattttcaccattgaaattttcaagagaatttcaatggtgaaaatgg-3’（如SEQ ID NO.1所示），其中ttcaagaga为loop结构。

本发明还提供了上述的shRNA在制备用于抑制大鼠Cacna1c基因表达的药物中的用途。

本发明还提供了一种重组载体，其含有上述的用于抑制大鼠Cacna1c基因表达的shRNA。

进一步的，所述载体为含ITR/MCS的载体。

本发明还提供了上述的重组载体在制备用于抑制大鼠Cacna1c基因表达的药物中的用途。

本发明还提供了一种腺相关病毒，其含有上述的用于抑制大鼠Cacna1c基因表达的shRNA。

进一步的，所述腺相关病毒的载体为含ITR/MCS的载体。

本发明还提供了上述的腺相关病毒在制备用于抑制大鼠Cacna1c基因表达的药物中的用途。

本发明还提供了上述腺相关病毒的制备方法，包括如下步骤：

1）根据大鼠Cacna1c基因的mRNA信息，

先设计针对大鼠Cacna1c基因的shRNA序列，其正义链及反义链DNA序列如下所示：

正义链：5’-tccccgccattttcaccattgaaattttcaagagaaatttcaatggtgaaaatggcttttt-3’

反义链：5 'tctaaaaaagccattttcaccattgaaatttctcttgaaaatttcaatggtgaaaatggcg-3’

上述正义链及反义链模板包含粘性末端及shRNA序列，所述的shRNA的序列为：5’-cattttcaccattgaaattttcaagagaatttcaatggtgaaaatgg-3’，其中ttcaagaga为loop结构，克隆位点为Esp3I；

2）将等量的正义链和反义链DNA混合，进行退火，形成DNA双链，得到shRNA模板；

3）将含ITR/MCS的载体进行酶切，得到线性化载体；

4）将步骤2）中的shRNA模板和步骤3）中线性化的载体进行连接，得到重组质粒；

5）上述重组质粒同携带腺病毒来源的基因和携带AAV复制和衣壳基因共转染进AAV-293细胞，转染2到3天后重组腺相关病毒在包装细胞中组装完成，得到腺相关病毒颗粒；

6）从被感染AAV-293细胞中收集AAV病毒颗粒；

7）浓缩并纯化步骤6）的病毒上清液，通过CsCl密度梯度离心和超滤去除细胞蛋白和残留的CsCl离子。

本发明提供的一种有效抑制大鼠Cacna1c基因表达的shRNA，其作用靶点位于大鼠Cacna1c基因mRNA(NM_000719.6)的第314个位点。本发明的有效抑制大鼠Cacna1c基因表达的shRNA的应用包括将所述的shRNA 构建于AAV载体上，得到含有所述shRNA的AAV病毒颗粒；将含有所述shRNA的AAV病毒颗粒用于在体内注射大鼠组织（如背根神经节、脊髓等），达到抑制大鼠Cacna1c基因表达的目的。

本发明所述AAV载体为含ITR/MCS的载体（pAOV.SYN.GFP或类似载体，实施例以pAOV.SYN.GFP载体为例）。这些载体中反向末端重复（ITR）序列提供所有AAV复制和包装必须的顺式作用元件。

本发明和已有技术相比，其技术效果是积极和明显的。本发明的shRNA能有效抑制大鼠Cacna1c基因在mRNA及蛋白水平的表达。将所述抑制大鼠Cacna1c基因表达的shRNA构建于AAV病毒载体上，不仅可有效作用于分裂及非分裂状态的细胞，也适用于体内研究。同时，对于深入研究大鼠Cacna1c基因的功能及其相关疾病的治疗均具有重要的科学意义及应用前景。

附图说明

图1为SDS-PAGE纯度测定结果，将病毒裂解后在PAGE胶上展开，纯的AAV病毒应当只有病毒特征条带，同时与标准品比较可确定AAV所用外壳正确。

图2为用荧光显微镜检测将重组AAV病毒注射入大鼠DRG的感染效果。

图3为用Western blot检测大鼠DRG注射入重组AAV病毒后Cacna1c的表达水平结果，其中，A为本发明所述的shRNA对Cav1.2蛋白表达抑制的Western Blot分析；B为该shRNA抑制Cav1.2蛋白表达的统计分析。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1：shRNA序列的设计与合成。

（1）通过GeneBank数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank)查询大鼠Cacna1c基因的mRNA信息（NM_012517.2），根据shRNA设计原则，设计了针对大鼠Cacna1c基因的shRNA序列，

其正义链为：

5’- tccccgccattttcaccattgaaattttcaagagaaatttcaatggtgaaaatggcttttt-3’；其基因序列如SEQ ID NO.2所示；

反义链为：

5 ' tctaaaaaagccattttcaccattgaaatttctcttgaaaatttcaatggtgaaaatggcg-3’，其基因序列如SEQ ID NO.3所示。

同时设计了无关的对照shRNA序列，作为对照组(Control)，

其正义链为：5’-tccccgatattgctgcgattagtcttcaagagagactaatcgcagcaatatcttttttcttttt-3'；其基因序列如SEQ ID NO.4所示；

反义链:

5'-tctaaaaaaggatattgctgcgattagtctctcttgaagactaatcgcagcaatatcg-3'，其基因序列如SEQ ID NO.5所示。

上述正义链及反义链模板包含粘性末端及shRNA序列，所述的shRNA的序列为：5’-cattttcaccattgaaattttcaagagaatttcaatggtgaaaatgg-3’，其中ttcaagaga为loop结构，克隆位点为Esp3I。

（2）将等量的正义链(100μM，5μl)和反义链(100μM，5μl)DNA混合，加入5×的Annealing Buffer for DNA Oligos(10μL)，再加双蒸水30μl，总体积50μl。

在PCR仪上按照如下程序进行退火处理：95℃5min；85℃5min；75℃5min；70℃5min；4℃保存。退火处理形成DNA双链，然后后得到浓度为10μM的shRNA模板。将所得模板溶液稀释50倍，终浓度为200nM，用于连接反应。

（3）将pAOV.SYN.GFP载体进行Esp3I酶切，进行载体的线性化处理，酶切条件如下所述：取10μg的pAOV.SYN.GFP载体、5μl的Esp3I内切酶、10μl的2×Buffer Tango，加双蒸水至100μl，混匀，置于37℃酶切1小时，琼脂糖电泳，使用Agarose Gel DNA PurificationKit Ver2 .0回收线性载体片段，稀释浓度至50ng/μl。

（4）将线性化的pAOV.SYN.GFP载体1μl、经退火处理的shRNA模板1μl(100nM)、T4DNA连接酶(5 weissU/μl)1μl、10×T4连接缓冲液2μl、双蒸水15μl，共20μl，混匀，于22℃连接1小时，形成连接产物。取10μl连接产物转化大肠杆菌Top10感受态细胞，将细胞均匀涂布于含50μg/ml Ampicillin的LB培养基平板上，平板倒置于37℃培养箱中，培养16小时。从每块平板上分别挑取5个菌落，接种到含50μg/ml Ampicillin的LB培养基中，37℃培养16小时。使用碱裂解法提取质粒，所得质粒用SmaI进行单酶切鉴定，同时进行测序鉴定后大量制备重组质粒。

（5）上述重组质粒同pHelper（携带腺病毒来源的基因）和pAAV-RC（携带AAV复制和衣壳基因）共转染进AAV-293细胞（从上海泰尔图生物科技有限公司处采购）（提供AAV复制和包装所需的反式作用因子），轻轻地前后摇晃培养皿以混匀复合物。放置37℃、5％CO₂、饱和湿度培养箱中过夜培养。转染后24h，更换10ml含10％血清DMEM培养液，放置37℃、5％CO₂、饱和湿度培养箱中继续培养；转染后48h收集培养上清进行浓缩，加入10ml新鲜的培养液继续培养；转染后72h再次收集培养上清浓缩；获得含有目的shRNA的AAV病毒颗粒pAAV2-H1-shRNA(Cacna1c)-CAG-eGFP。对AAV病毒颗粒进行SDS-PAGE纯度测定，将病毒裂解后在PAGE胶上展开，纯的AAV病毒应当只有病毒特征条带，同时与标准品比较可确定AAV所用外壳正确。其中AAV2/5 WX963 标准品从上海泰尔图生物科技有限公司处采购，是用于检测AAV所用外壳是否正确的标准品。

图1左图为标准品条带，右图为检测样本，结果显示检测AAV病毒颗粒样本病毒有明显特征条带，同时与标准品条带相近，确定AAV所用外壳正确且纯度较高。

（6）从被感染AAV-293细胞中收集AAV病毒颗粒。这一步得到的病毒上清液随后用于感染各种哺乳动物类细胞系的感染实验。同时上清中的病毒也可以浓缩保留。

（7）浓缩并纯化步骤（6）的病毒上清液，通过2次CsCl密度梯度离心和1次超滤可以去除绝大部分的细胞蛋白和残留的CsCl离子。动物实验都需要纯化后的病毒才能够进行，否则会达不到所需剂量并引起副作用。感染宿主细胞后，基因表达前，单链病毒必须变成双链病毒。这个转变是重组基因表达的限制步骤，可以通过腺病毒双重感染或依托泊苷（喜树碱或丁酸钠）来加速。然而，加速基因表达的试剂对目标细胞是有毒的，如果残留到细胞上会杀死目标细胞。因此依托泊苷只能短期使用或为了提高病毒滴度时使用。

（8）用定量PCR法测定所得到病毒的滴度，这种方法可以得到被包装到颗粒中的AAV基因组的物理滴度值。AAV的感染滴度值因为感染细胞、AAV外壳蛋白和测试条件不同有很大差异，并且体外的实验数据不能反映体内的感染情况，所以在比较AAV时，定量PCR得到的物理滴度值是一个更客观的数值。

将上述获得的AAV病毒颗粒pAAV2-H1-shRNA(Cacna1c)-CAG-eGFP用于体外转染大鼠细胞或在体内注射大鼠组织达到抑制Cacna1c基因表达的目的。

实施例2：重组AAV病毒颗粒对大鼠背根神经节（DRG）神经元的感染效果。

将实施例1表达上述shRNA的AAV病毒注射入SD大鼠背根神经节（DRG）中，利用荧光显微镜技术检测AAV的感染效果。

（1）实验分组：实验分为对照组和AAV病毒感染组，对照组注射对照AAV病毒。每组大鼠饲养条件一致。

（2）具体感染方法：将2μl病毒（1.62×10¹³v.g./ml）通过微量注射泵分别注射入大鼠DRG（L4、L5）中，注射时间10min，留针5min以确保病毒完全注射进入DRG。注射完成后，大鼠回笼休息。

（3）荧光显微镜检测：3周后，大鼠多聚甲醛灌流取材，取材后DRG用多聚甲醛后固定，采用质量 百分比浓度为30%的蔗糖沉糖1天，待DRG沉底后，进行冰冻切片。贴片后1×PBS洗3次，封片剂封片。对制作的冰冻切片观察并拍照。图2分别为DRG注射对照组病毒，及该重组AAV病毒在荧光显微镜下放大20倍（左列）及40倍（右列）的结果，可以看到大部分DRG神经元表达绿色荧光蛋白，表明重组AAV病毒颗粒能够有效感染DRG神经元。

实施例3：重组AAV病毒颗粒对小鼠前鼠背根神经节（DRG）神经元中Cacna1c基因的沉默效果（蛋白水平）。

将实施例1表达上述shRNA的AAV病毒注射入SD大鼠背根神经节（DRG）中，利用Western Blot技术检测Cacna1c基因的沉默效果。

（1）实验分组：实验分为对照组和AAV病毒感染组，对照组注射对照AAV病毒。每组大鼠饲养条件一致。

（2）具体感染方法：将2μl病毒（1.62×10¹³v.g./ml）通过微量注射泵分别注射入大鼠DRG（L4、L5）中，注射时间10min，留针5min以确保病毒完全注射进入DRG。注射完成后，大鼠回笼休息。

（3）westernblot检测：3周后，大鼠取材，用SDS裂解液提取DRG总蛋白质，并测定其浓度。

提取的蛋白质样品进行SDS-PAGE电泳，电泳完毕后进行转膜，转膜结束后，小心取出凝胶和膜，将膜的一角剪去以作标记，可在膜上观察到预染Marker的条带，可将凝胶再用考马斯亮蓝染色以判断转移情况；将膜放入TBST洗一次；将膜放入盛有封闭液(3％BSA)的容器中，室温摇床封闭1h。封闭后进行一抗孵育，抗体采用Anti-Cav1.2抗体（即Cacna1c表达产物的抗体）及tubulin抗体，4℃过夜孵育；把膜取出，用TBST摇床洗膜3 次，每次15min，以去除残留的一抗。之后室温摇床孵育二抗1h；孵育后将膜取出，用TBST摇床洗膜3次，每次15min；洗膜后，加入发光液A、B曝光。图3A为本发明所述的shRNA对Cacna1c表达产物Cav1.2蛋白表达抑制的Western Blot分析，可以看到注射了该重组AAV病毒的DRG中Cav1.2表达明显下降；图3B为Cav1.2蛋白表达的统计分析结果，显示结果显示重组AAV病毒能够有效抑制Cacna1c的表达，抑制效率可达到33.67%。

序列表

<110> 上海交通大学医学院附属仁济医院

<120> 一种用于抑制大鼠Cacna1c基因表达的shRNA及其用途

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 47

<212> DNA

<213> 鼠(Murine)

<400> 1

cattttcacc attgaaattt tcaagagaat ttcaatggtg aaaatgg 47

<210> 2

<211> 61

<212> DNA

<213> 鼠(Murine)

<400> 2

tccccgccat tttcaccatt gaaattttca agagaaattt caatggtgaa aatggctttt 60

t 61

<210> 3

<211> 61

<212> DNA

<213> 鼠(Murine)

<400> 3

tctaaaaaag ccattttcac cattgaaatt tctcttgaaa atttcaatgg tgaaaatggc 60

g 61

<210> 4

<211> 64

<212> DNA

<213> 鼠(Murine)

<400> 4

tccccgatat tgctgcgatt agtcttcaag agagactaat cgcagcaata tcttttttct 60

tttt 64

<210> 5

<211> 58

<212> DNA

<213> 鼠(Murine)

<400> 5

tctaaaaaag gatattgctg cgattagtct ctcttgaaga ctaatcgcag caatatcg 58

Claims (9)

1.一种用于抑制大鼠Cacna1c基因表达的shRNA，其特征在于其序列为：

5’-cattttcaccattgaaattttcaagagaatttcaatggtgaaaatgg-3’，其中ttcaagaga为loop结构。

2.权利要求1所述的shRNA在制备用于抑制大鼠Cacna1c基因表达的药物中的用途。

3.一种重组载体，其特征在于:其含有权利要求1所述的用于抑制大鼠Cacna1c基因表达的shRNA。

4.根据权利要求3所述的一种重组载体，其特征在于:所述载体为含ITR/MCS的载体。

5.权利要求3所述的重组载体在制备用于抑制大鼠Cacna1c基因表达的药物中的用途。

6.一种腺相关病毒，其特征在于:含有权利要求1所述的用于抑制大鼠Cacna1c基因表达的shRNA。

7.根据权利要求6所述的一种腺相关病毒，其特征在于:其载体为含ITR/MCS的载体。

8.权利要求6所述的腺相关病毒在制备用于抑制大鼠Cacna1c基因表达的药物中的用途。

9.权利要求6所述的腺相关病毒的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

1)根据大鼠Cacna1c基因的mRNA信息，

先设计针对大鼠Cacna1c基因的shRNA序列，其正义链及反义链DNA序列如下所示：

正义链：5’-tccccgccattttcaccattgaaattttcaagagaaatttcaatggtgaaaatggcttttt-3’

反义链：5'tctaaaaaagccattttcaccattgaaatttctcttgaaaatttcaatggtgaaaatggcg-3’

上述正义链及反义链模板包含粘性末端及shRNA序列，所述的shRNA的序列为：5’-cattttcaccattgaaattttcaagagaatttcaatggtgaaaatgg-3’，其中ttcaagaga为loop结构，克隆位点为Esp3I；

2)将等量的正义链和反义链DNA混合，进行退火，形成DNA双链，得到shRNA模板；

3)将含ITR/MCS的载体进行酶切，得到线性化载体；

4)将步骤2)中的shRNA模板和步骤3)中线性化的载体进行连接，得到重组质粒；

5)上述重组质粒同携带腺病毒来源的基因和携带AAV复制和衣壳基因共转染进AAV-293细胞，转染2到3天后重组腺相关病毒在包装细胞中组装完成，得到腺相关病毒颗粒；

6)从被感染AAV-293细胞中收集AAV病毒颗粒；

7)浓缩并纯化步骤6)的病毒上清液，通过CsCl密度梯度离心和超滤去除细胞蛋白和残留的CsCl离子。