CN111235150A - 用于抑制非洲猪瘟病毒复制的shRNA及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一类用于抑制非洲猪瘟病毒复制的shRNA，其包含的两种shRNA的序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示。本发明还提供了前述的一类shRNA在抑制非洲猪瘟病毒复制中的用途。本发明还提供了包含前述shRNA的重组表达载体、腺相关病毒及其制备方法。本发明提供的一类shRNA及重组AAV病毒可以用于制备预防和/或治疗非洲猪瘟病毒感染的药物，例如治疗性疫苗，并能有效抑制非洲猪瘟病毒的复制和感染，且其制备工艺简单，利于规模化生产和推广应用。

Description

用于抑制非洲猪瘟病毒复制的shRNA及其用途

技术领域

本发明涉及一种shRNA(short hairpin RNA)，具体涉及一种用于抑制非洲猪瘟病毒复制的shRNA及其用途，例如在制备非洲猪瘟病毒疫苗中的用途，属于生物工程技术领域。

背景技术

RNA干扰(RNA interference，RNAi)是指双链RNA分子(dsRNA)进人细胞内，特异性降解与之同源的mRNA，从而特异高效抑制相应基因表达活性的现象(Waterhouse，P.M.，Wang，M.B.，Lough，T.，(2001).Gene silencing as an adaptive defence againstviruses.Nature 411:834–842.)。当细胞中导入与内源mRNA编码区的同源dsRNA时，该mRNA发生降解而导致基因表达沉默，是一种特殊的转录后表达沉默(Post transcriptionalgene slience，PTGS)。在治疗上，RNAi通过递送小RNA双链体来起作用，包括微小RNA(miRNA)模拟物、小干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)和Dicer底物RNA (dsiRNA)(Rettig，G.R.，and Behlke，M.A.(2012).Progress toward in vivo use of siRNAs-II.Molecular therapy:the journal of the American Society of GeneTherapy.2012；20(3):483-512.)。RNAi是针对转录后阶段的基因沉默，相对于传统基因治疗对基因水平上的敲除，整个流程设计更简便，作用更迅速，效果更明显，成为研究人员公认的高效特异、经济便捷的研究工具。RNAi技术有以下优势，例如：可以设计特异性的序列靶向任何一个基因，即使对这个基因的功能不是很了解；以及，潜力很大，RNAi是一个固有的生物学反应，是一个很自然的操控基因表达的工具。

RNAi高效而转一的抑制基因表达的特性使其在基因功能研究方面得到了广泛的应用，并且也为一些难以治疗的疾病提供了一种新的治疗手段。最早被提出的一个RNAi的作用就是抑制病毒的感染。有很多针对病毒靶点的基于RNAi的治疗性产品正在研究中。比如针对HIV(Berkhout,B.(2004)RNA interference as an antiviral approach:targeting HIV-1.Curr.Opin.Mol.Ther.6(2),141–145.)以及肝炎病毒(RNAinterferenceas a new strategy against viral hepatitis.Virology323(2),173–181.)

由于使用RNAi具有高度的序列专一性和有效的干扰，可以特异地将特定基因沉默，从而获得基因功能丧失或基因表达量降低，所以该技术已被广泛用于探索基因功能、癌症等疾病以及抗病毒感染的治疗领域。

shRNA是基于质粒的短发夹RNA，由两个互补的(正义和反义)19-29个碱基对序列组成，所述序列由4-11个受损核苷酸的短茎环(loop)分开。通常，表达受RNA聚合酶(Pol)III启动子或修饰的pol II启动子控制。转录shRNA后，通过茎环连接的正义链和反义链成对一起形成特征性发夹结构。该结构类似于细胞天然用于调节基因表达并需要核处理的前miRNA(pre-miRNA)(Dorsett，Y.and Tuschl，T.(2004)siRNAs:applications infunctional genomics and potential as therapeutics.Nat Rev Drug Discov.3，318-329)。在发现启动子驱动的shRNA表达后，病毒RNAi载体的设计成为可能(Brummelkamp，T.R.，Bernards，R.and Agami，R.(2002)A system for stable expression of shortinterfering RNAs in mammalian cells.Science.296，550-553)。用于递送和表达shRNA的病毒的是腺病毒、腺相关病毒、慢病毒和逆转录病毒。

非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fevervirus，ASFV)引起猪的一种急性、热性、高度接触传染性疾病，临床表现为高热、皮肤充血、水肿及脏器广泛性出血以及呼吸系统和神经系统功能的改变等。该病发病过程短，潜伏期5-15天，有很高的发病率和死亡率，死亡率甚至可高达100％。在被该病原感染的国家或地区可造成巨大的经济损失，严重威胁食品安全并且影响养猪产业。世界动物卫生组织(OIE)将其列为A类疫病，我国规定为动物一类疾病。

ASFV是非洲猪瘟病毒科、非洲猪瘟病毒属的唯一成员。病毒粒子直径为200nm的正二十面体双链DNA病毒，DNA核心直径为70～100nm，外周是直径为170～190nm的衣壳和含类脂的囊膜。基因组的两端通过部分碱基配对形成发夹环，中间区域较为保守，两端靠近发夹环部位有末端重复序列和可变区。不同的毒株因基因组可变区长度不同而导致其基因组大小存在差异。ASFV整个基因组含有150多个开放读框(ORF)，可编码多种与调控宿主蛋白的表达、固有免疫系统和细胞周期等相关的蛋白质，这些蛋白可能为病毒的存活、复制及传播造就一定的有利条件(Luisa R A.，Abrams C C.，Goatley L C.，et al.Deletion ofAfrican swine fever virus interferon inhibitors from the genome of a virulentisolate reduces virμl ence in domestic pigs and induces a protectiveresponse.Vaccine，2016，34(39):4698-4705.)。其中A104R基因编码的组氨酸样蛋白能与ASFV抗体阳性血清发生免疫沉淀反应；I215L基因在晚期病毒复制和转录中其关键作用(Ferdinando B.，Freitas.，Goncalo Frouco.，Carlos Martins.，et al.African swinefever virus encodes for an E2-ubiquitin conjugating enzyme that is mono-anddi-ubiquitinated and required for viral replication cycle.Sci Rep，2018，8:3471.)。

疫苗接种是传染病的最佳控制措施之一。然而，当前对于ASFV感染和免疫知识的局限性，阻碍了ASF疫苗的开发。到目前为止，尚未发现ASFV的保护性抗原。传统方法制备的ASFV疫苗，例如纯化以及灭活的病毒、甲醛灭活的感染了病毒的猪肺泡巨噬细胞、感染了猪的外周血白细胞上清都不能诱导保护性免疫。

总的来说，细胞免疫和体液免疫对于防治非洲猪瘟感染和病毒清除的效果都非常有限。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一类用于抑制非洲猪瘟病毒复制的shRNA及其用途，以克服现有技术中的不足。

为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：

本发明实施例的一个方面提供了一类用于抑制非洲猪瘟病毒的shRNA，其包括第一shRNA和/或第二shRNA；所述第一shRNA、第二shRNA的序列分别如SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2所示。

进一步的，所述第一shRNA、第二shRNA的loop结构的序列均为uucaagaga。

本发明实施例的另一个方面提供了一类用于转录所述shRNA的DNA序列，其包括第一DNA序列和/或第二DNA序列；所述第一DNA序列包括序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.4所示的正义链、反义链，所述第二DNA序列包括序列分别如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示的正义链、反义链。

本发明实施例的另一个方面还提供了一类重组表达载体，其包括第一重组表达载体和/或第二重组表达载体；

其中，所述第一重组表达载体携带有第一shRNA或者第一DNA序列以及合适的启动子、终止子，所述第二重组表达载体携带有第二shRNA或者第二DNA序列以及合适的启动子、终止子；

所述第一shRNA、第二shRNA的序列分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2所示，且所述第一shRNA、第二shRNA的loop结构的序列均为uucaagaga；

所述第一DNA序列包括序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示的正义链、反义链，所述第二DNA序列包括序列分别如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示的正义链、反义链。

其中，所述合适的启动子、终止子可以选自本领域常用的类型。在一些较为优选的实施方式中，所述启动子采用U6启动子(其基因序列如SEQ ID NO.7所示)。

在一些较为优选的实施方式中，所述重组表达载体为重组腺相关病毒表达载体(AAV表达载体)。

本发明实施例的另一个方面还提供了含有所述shRNA或所述DNA序列的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

本发明实施例的另一个方面还提供了一种重组腺相关病毒(AAV)，它是将所述的重组表达载体与腺相关病毒的辅助质粒共转染入能够包装出腺相关病毒的包装细胞中获得。

进一步的，所述包装细胞可以选用但不限于HEK293细胞等。

在一些较为优选的实施方式中，其中的一种辅助质粒是将优化的猪巨噬细胞C反应蛋白基因连接到pAAV-RC质粒的BfuA I酶切位点处而得，所述优化的猪巨噬细胞C反应蛋白基因的序列如SEQ ID NO:8所示，另一种辅助质粒为pHelper质粒。

本发明实施例的另一个方面还提供了所述的shRNA、所述的DNA序列、所述的重组表达载体或表达盒或转基因细胞系或重组菌在制备预防或治疗非洲猪瘟病毒感染相关疾病的产品中的用途。

本发明实施例的另一个方面还提供了所述的shRNA、所述的DNA序列、所述的重组表达载体或表达盒或转基因细胞系或重组菌在制备用于抑制非洲猪瘟病毒表达的疫苗中的用途。

本发明实施例的另一个方面还提供了一种重组腺相关病毒的制备方法，其可以是通过本领域已知的AAV病毒包装系统及方法实现。例如，一种较为优选的制备方法可以包括：

1)分别针对非洲猪瘟病毒A104R基因、I215L基因设计第一shRNA，第二shRNA，所述第一shRNA、第二shRNA的序列分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2所示，且所述第一shRNA、第二shRNA的loop结构的序列均为uucaagaga，酶切位点均为Kpn1，而与所述第一shRNA相应的正义链、反义链DNA的序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示，以及，与所述第二shRNA相应的正义链、反义链DNA的序列分别如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示；

2)将与所述第一shRNA相应的正义链、反义链DNA等量混合进行退火形成DNA双链，得到第一shRNA模板，以及，将与所述第二shRNA相应的正义链、反义链DNA等量混合进行退火形成DNA双链，得到第二shRNA模板；

3)对pAAV-CAG载体进行Nde1/Kpn1双酶切，以去除其中的CAG启动子，之后连接U6启动子，得到优化的质粒载体，定义为pAAV-U6载体；

4)将步骤2)所获的第一shRNA模板、第二shRNA模板分别与步骤3)所获的pAAV-U6载体连接，得到两种重组质粒，分别定义为第一重组表达载体、第二重组表达载体；

5)将优化的猪巨噬细胞C反应蛋白基因连接到pAAV-RC质粒的BfuA I酶切位点处，得到优化的腺相关病毒的辅助质粒，定义为pAAV-RCM质粒，其中所述优化的猪巨噬细胞C反应蛋白基因的序列如SEQ ID NO:8所示；

6)将步骤4)所得的第一重组表达载体、第二重组表达载体分别与pAAV-RCM质粒及pHelper质粒按照1:1:1的摩尔比共转染HEK293细胞，之后收获两种重组腺相关病毒。

当然，再一些实施方式中，所述的制备方法还可包括对收集到的AAV病毒颗粒进行纯化等操作的步骤，这些操作均是本领域熟知的。

本发明实施例还提供了由前述任一种方法制备的重组腺相关病毒。

本发明实施例还提供了一类组合物，包含所述的shRNA、所述的DNA序列、所述的重组表达载体或者所述的重组腺相关病毒。

进一步的，所述组合物还可以包含药学上可接受的载剂，例如其可以是溶剂、分散介质、涂覆剂、稳定剂、稀释剂、防腐剂、抗细菌及抗真菌剂、等渗剂、佐剂、免疫攻击剂及其组合，且不限于此。

本发明实施例还提供了所述组合物在制备用于预防和/或治疗非洲猪瘟病毒感染的药物中的用途。例如，预防和/或治疗非洲猪瘟病毒感染的方法包括给有需要的对象施用本发明的组合物。

较之现有技术，本发明设计针对非洲猪瘟A104R和I215L的shRNA，序列特异性强，可以更加稳定、高效地抑制目的基因的表达，从而显著抑制非洲猪瘟病毒的复制，能够更好地抑制非洲猪瘟抗原表达水平；以及，本发明通过改造pAAV-CAG载体，将CAG启动子替换成人细胞U6启动子，获得pAAV-U6载体，转录活性高，能够得到大量的shRNA；而且，本发明还构建了修饰改造后的AAV载体，通过对其Cap结构蛋白进行了改造，在Cap蛋白基因的3’端添加了优化的猪巨噬细胞C反应蛋白，在不影响AAV组装以及稳定性的前提下，改造后的AAV病毒能够和猪巨噬细胞C反应蛋白受体结合，由于巨噬细胞又是非洲猪瘟病毒主要的复制场所，因此可以显著增加其对巨噬细胞的特异性感染。本发明提供的重组AAV病毒能够专一特异地进入巨噬细胞，抑制靶标基因的表达，进而抑制病毒的复制，并可作为治疗性疫苗产品广泛应用于非洲猪瘟病毒的预防和治疗。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施方式的技术方案，下面将对实施方式中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1示出了本发明实施例中pAAV-U6-A104R-shRNA质粒的图谱；

图2示出了本发明实施例中pAAV-U6-I215L-shRNA质粒的图谱；

图3示出了本发明实施例中pAAV-RCM质粒的图谱；

图4示出了本发明实施例中重组AAV病毒的滴度测试结果；

图5示出了本发明实施例中重组AAV病毒对ASFV病毒的体外抑制效果。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本说明书使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。以及，需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。

鉴于现有技术的不足，本发明的发明人经长期研究和大量实践，得以提出本发明的技术方案，其可以被概括为：设计针对非洲猪瘟病毒的shRNA，然后使用AAV病毒作为载体，构建表达特异性shRNA的重组AAV。优选的，该重组AAV是对其Cap结构蛋白进行改造过的，即，在Cap基因的3’端添加了优化后的猪巨噬细胞C反应蛋白，在不影响AAV组装以及稳定性的前提下，改造后的AAV病毒能够和猪巨噬细胞C反应蛋白受体结合，使得该重组AAV能够特异性的感染目标细胞，即猪巨噬细胞。

本发明中述及的shRNA是由两个互补的(正义和反义)19-29个碱基对序列组成，所述序列由4-11个受损核苷酸的短茎环(loop)分开。通常，表达受RNA聚合酶(Pol)III启动子或修饰的pol II启动子控制。转录shRNA后，通过茎环连接的正义链和反义链成对一起形成特征性发夹结构。该结构类似于细胞天然用于调节基因表达并需要核处理的前miRNA(pre-miRNA)(Dorsett，Y.and Tuschl，T.(2004)siRNAs:applications in functionalgenomics and potential as therapeutics.Nat Rev Drug Discov.3，318-329)。在发现启动子驱动的shRNA表达后，病毒RNAi载体的设计成为可能(Brummelkamp，T.R.，Bernards，R.and Agami，R.(2002)A system for stable expression of short interfering RNAsin mammalian cells.Science.296，550-553)。用于递送和表达shRNA的病毒的是腺病毒、腺相关病毒、慢病毒和逆转录病毒。在本发明中，优选采用腺相关病毒(AAV)。

进一步的讲，单纯的shRNA无法高效地进入靶细胞中发挥对目的基因的下调作用，需要借助一定的载体，本发明通过选择AAV载体，并对其进行改造，特别是对其Cap蛋白进行改造，在其3’端添加优化后的C反应蛋白序列，不仅可以充分发挥其安全性好、宿主细胞范围广(分裂细胞和非分裂细胞)、免疫原性低、在体内表达外源基因时间长等特点，而且在不影响AAV组装以及稳定性的前提下，使最终形成的AAV病毒具有更好的感染特异性，具体的，本发明通过对AAV载体的改造，使得AAV病毒能够展示C反应蛋白，进而能够更高效的被猪巨噬细胞表面的特异性C反应蛋白受体捕获，高效专一的感染猪巨噬细胞，而巨噬细胞又是非洲猪瘟病毒主要的复制场所，所以本发明的重组AAV病毒能够专一特异地进入巨噬细胞，抑制靶标基因的表达，进而抑制非洲猪瘟病毒的复制。

本发明的重组AAV病毒仅含有shRNA，不含非洲猪瘟病毒的基因，因此本发明的重组腺相关病毒和非洲猪瘟野毒株之间不会发生重组。

本发明提供的针对非洲猪瘟病毒表达特异性shRNA的AAV病毒，可以有效抑制非洲猪瘟病毒病毒的复制和感染，适用于作为治疗性疫苗产品，并能够呈现出良好治疗效果。

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中所用试剂和原料均市售可得，而其中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。又及，除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORYMANUAL，Second edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989and Thirdedition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；the series METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION，Thirdedition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS IN ENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，Academic Press，San Diego，1999；和METHODSIN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，Chromatin Protocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。

实施例1 shRNA序列的设计与构建

1.分别针对非洲猪瘟病毒A104R基因和I215L基因设计出能够转录出shRNA的DNA序列，其DNA序列如下：

A104R正义链(SEQ ID NO.3):

cgcaagagctttactccttagtagcggcagttcaagagactgccgctactaaggagtaaagctcttgctttttta

A104R反义链(SEQ ID NO.4):

agcttaaaaaagcaagagctttactccttagtagcggcagtctcttgaactgccgctactaaggagtaaagctcttgcggtac

上述正义链及反义链模板包含粘性末端及shRNA序列，所述shRNA的序列为：

5’-gcaagagctttactccttagtagcggcagttcaagagactgccgctactaaggagtaaagctcttgctttttt-3’(SEQ ID NO.1)，

其中uucaagaga为loop结构，酶切位点为Kpn1(ggtacc)。

I215L正义链(SEQ ID NO.5)：

cgacacctgatagagaatccctctgagaatttcaagagaattctcagagggattctctatcaggtgtctttttta

I215L反义链(SEQ ID NO.6)：

agcttaaaaaagacacctgatagagaatccctctgagaattctcttgaaattctcagagggattctctatcaggtgtcggtac

上述正义链及反义链模板包含粘性末端及shRNA序列，所述shRNA的序列为：

5’-gacacctgatagagaatccctctgagaatttcaagagaattctcagagggattctctatcaggtgtctttttt-3’(SEQ ID NO.2)，

其中uucaagaga为loop结构，酶切位点为Kpn1(ggtacc)。

2.参照下表1，分别将等量的正义链(100μM，10μl)与相应的反义链(100μM，10μl)DNA混合，加入NaCl(1M)2.5μl，再加双蒸水27.5μl，总体积50μl(表1)。在PCR仪上94℃处理5min然后自然冷却到室温。退火后的短的双链DNA上游形成KpnⅠ粘性末端，下游形成HindⅢ粘性末端。然后分别得到浓度为10μM的两种shRNA模板(可以分别定义为A104R-shRNA基因、I215L-shRNA基因)。将所得的两种shRNA模板溶液稀释50倍，终浓度为200nM，用于连接反应。

表1 shRNA双链退火体系

实施例2 pAAV-U6-A104R-shRNA质粒和pAAV-U6-I215L-shRNA质粒的构建

南京金斯瑞公司合成了U6启动子基因(SEQ ID NO.7)并构建了pAAV-U6载体，具体操作如下：

将pAAV-CAG载体(购自Addgene)进行改造，使用Nde1/Kpn1双酶切pAAV-CAG载体，去除CAG启动子，然后将合成的U6启动子连接到双酶切的pAAV-CAG载体上，把CAG启动子替换成人细胞U6启动子，得到pAAV-U6。

将载体pAAV-U6使用KpnⅠ和HindⅢ双酶切回收目的载体。

1.将pAAV-U6质粒分别用KpnⅠ和HindⅢ37℃双酶切3小时，具体酶切反应体系见表2。

将酶切产物进行凝胶电泳，使用凝胶回收纯化试剂盒纯化酶切的pAAV-U6质粒。

表2 pAAV质粒酶切反应体系

2.连接

将双酶切纯化后的pAAV-U6质粒和退火的两条引物(即前述的A104R-shRNA基因、I215L-shRNA基因)使用T4 DNA连接酶16℃水浴连接过夜，获得两种连接产物。具体连接反应体系见表3。

表3 质粒pAAV-U6与A104R-shRNA基因(或I215L-shRNA基因)连接体系

3.转化

将10μl前述A104R-shRNA相应的连接产物分别加入100μl的DH5α感受态细胞，混匀，冰浴30分钟，42℃水浴热休克90秒，再冰浴2分钟，加入900μl不含Amp的LB培养基，37℃培养1小时。取1.0ml菌液浓缩成100μl涂布于含有Amp的LB固体培养基上，37℃培养16小时。将长出来的菌落测序，确定正确的克隆。然后抽提正确的pAAV-U6-A104R-shRNA质粒(参阅图1)。再以同样的方法抽提pAAV-U6-I215L-shRNA质粒(参阅图2)。

实施例3 pAAV-RC质粒改造

金斯瑞公司合成优化后的猪巨噬细胞C反应蛋白基因(SEQ ID NO:8)，并连接到pAAV-RC质粒的BfuA I酶切位点处，构建新的质粒pAAV-RCM，其图谱如图3所示。

实施例4 转染细胞

对数生长期的HEK293细胞，消化后重新悬浮于DMEM培养基+10％FBS中，计数细胞浓度，调整细胞密度到5x10⁵ cells/mL；接种于3块6孔板，共18个孔，2mL/孔；取10mL DMEM培养基置于摇瓶中，将摇瓶放于冰箱中，备用。12小时候后在1.5mL无菌EP管中，加入200μL的预热DMEM；分别按三个质粒(pAAV-U6-A104R-shRNA质粒或pAAV-U6-I215L-shRNA质粒和pAAV-RCM质粒，pHelper质粒)的摩尔比是1:1:1，加入质粒3μg，立即旋涡震荡混合；超净台内放置2分钟；然后加入PEI 7.5μg，立即旋涡震荡混合；超净台内放置10分钟；将DNA-PEI加入到对应培养板的孔中，充分混合后将孔板放入培养箱中培养；6小时后，所有的孔都更换培养基为DMEM+10％FBS，继续培养；转染96小时后，用细胞刮把细胞刮下来，使用PBS重悬，反复冻融4次离心取上清，分别收获重组腺相关病毒AAV2M-A104R-shRNA、AAV2M-I215L-shRNA。

实施例5 病毒滴度测定

1.纯化AAV病毒颗粒

AAV滴度的测定根据

Titration Kit(for Real Time PCR)Ver.2(TaKaRa，Cat.#6233)，加入0.5M的EDTA(加入体积为培养基的1/80)，1750g，4℃离心10分钟完全移除上清。旋涡震荡样品并加入250μL

Titration Kit提取液A，旋涡震荡15s重悬细胞，室温放置5分钟后，再旋涡震荡15秒，2000g–14000g、4℃离心10分钟。收集上清到新的离心管中，加入25μL的

Titration Kit提取缓冲液B，用移液器洗吹混匀。

2.提取AAV病毒基因组

用15μL的dH₂O溶解2μL重组AAV病毒样品，并加入2μL l0×DNase I Buffer和1μLDNase I，37℃孵育15分钟后95℃孵育10分钟，加入20μL的裂解缓冲液，70℃孵育10分钟，用EASY稀释溶液将样品稀释50倍。

3.PCR检测

梯度稀释标准品，从2×10⁷copies/μl稀释到2×10²copies/μl，准备50X引物混合物，5μL AAV Forward Titer引物、5μL AAV Reverse Titer引物并加入15μLdH₂O。取12.5μL的TB GreenPremix Ex Taq II(2X conc.)、0.5μL引物混合物、7μL的dH₂O和5μL模板进行RT-PCR反应，95℃预变性2分钟；94℃变性5秒，60℃反应30秒，35个循环。根据标准样品的绘制的标准曲线，计算样品的滴度。根据定量PCR结果绘制标准曲线(具体请参见图4)，R²＝0.9999，表明线性关系很好，通过比对标准曲线计算病毒基因组拷贝数，其平均滴度分别为6.9×10¹³vg/ml和7.4×10¹³vg/ml。

实施例6 改造AAV转导滴度测定

使用原始未改造Cap蛋白基因的pAAV-RC质粒转染制备重组AAV载体，将其命名为pAAV-A104R-shRNA-O载体，同时使用改造了Cap蛋白基因的质粒制备pAAV-A104R-shRNA载体。

第一天 细胞准备

将生长状态良好的猪肺泡巨噬细胞消化计数后稀释至4×10⁵cells/mL，加入96孔板，100μL/孔。放入37℃，5％二氧化碳培养箱中使用MEM+10％FBS培养基培养。

第二天 加病毒

分别将制备的pAAV-A104R-shRNA-O和pAAV-A104R-shRNA病毒分别稀释到1×10¹⁰genome copies/ml，然后在EP管中做10倍梯度稀释，连续10个稀释度。稀释方法如下：每种病毒准备10个1.5mL EP管，每管加入90μl培养液，往第一个管中加入10μl病毒原液，混匀后，吸取10μl加入第二个管混匀。依此类推，做十个稀释度。

首先在铺好的细胞中加入野生腺病毒，MOI＝5。然后分别将稀释的AAV病毒再加入细胞中，每孔100μl。

继续培养5天，然后将培养上清同步的转移到一块新的铺有猪巨噬细胞的96孔板中，继续培养5天，然后分别检测每个孔中AAV的滴度(基因组拷贝数)，当基因组拷贝数大于10000copies/mL为阳性孔，否则为阴性孔。使用Reed-Muench方法计算病毒的转导滴度。

以同样的操作方式改造和测定pAAV-I215L-shRNA载体。

结果如下表所示，改造后的重组AAV病毒对猪肺泡巨噬细胞的转到效率更高：

基因	改造前	改造后
			pAAV-A104R-shRNA	0.24×10<sup>9</sup>TU/ml	6.7×10<sup>9</sup>TU/ml
pAAV-I215L-shRNA	0.29×10<sup>9</sup>TU/ml	7.5×10<sup>9</sup>TU/ml

实施例7 重组AAV病毒对ASFV病毒体外抑制试验

取对数生长期的猪肺泡巨噬细胞，消化后使用MEM+10％FBS培养基重悬到4×10⁶cells/ml，接种到六孔板中，细胞汇合度达到50％。然后接种ASFV病毒，每孔接种50TCID₅₀病毒，5h后按照MOI＝5的比例分别接种AAV2M-A104R-shRNA、AAV2M-I215L-shRNA以及AAV2M-A104R-shRNA和AAV2M-I215L-shRNA混合物，并设空载体对照组。然后分别于24h，48h，72h和96h收集细胞培养上清，测ASFV病毒滴度，结果发现AAV2M-A104R-shRNA、AAV2M-I215L-shRNA以及AAV2M-A104R-shRNA与AAV2M-I215L-shRNA的混合物都能够抑制ASFV的复制，其中AAV2M-A104R-shRNA与AAV2M-I215L-shRNA的混合物的效果更为显著，参阅图5。

应当理解，以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

序列表

<110> 苏州世诺生物技术有限公司

<120> 用于抑制非洲猪瘟病毒复制的shRNA及其用途

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 73

<212> RNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 1

gcaagagcuu uacuccuuag uagcggcagu ucaagagacu gccgcuacua aggaguaaag 60

cucuugcuuu uuu 73

<210> 2

<211> 73

<212> RNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 2

gacaccugau agagaauccc ucugagaauu ucaagagaau ucucagaggg auucucuauc 60

aggugucuuu uuu 73

<210> 3

<211> 75

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 3

cgcaagagct ttactcctta gtagcggcag ttcaagagac tgccgctact aaggagtaaa 60

gctcttgctt tttta 75

<210> 4

<211> 83

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 4

agcttaaaaa agcaagagct ttactcctta gtagcggcag tctcttgaac tgccgctact 60

aaggagtaaa gctcttgcgg tac 83

<210> 5

<211> 75

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 5

cgacacctga tagagaatcc ctctgagaat ttcaagagaa ttctcagagg gattctctat 60

caggtgtctt tttta 75

<210> 6

<211> 83

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 6

agcttaaaaa agacacctga tagagaatcc ctctgagaat tctcttgaaa ttctcagagg 60

gattctctat caggtgtcgg tac 83

<210> 7

<211> 241

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 7

gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag 60

ataattggaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga 120

aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat 180

atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt gtggaaagga 240

c 241

<210> 8

<211> 366

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 8

aggggaaaga ctgctgtgta cagtatatcc gtgggtggtg ccgatgtcgt tttcaagcct 60

catcagagtt ctgaacccat gcacttctgt atgacgtggg agtccacctc agggattaca 120

gagctctggg tggacgggaa gcccatggtg aggagaagtc tgaagagggg ctactctctg 180

gggacacagg caagcatcat cctggggcag gagcaagatg catttgctgg gggctttgag 240

aagaaccagt gtttggtggg agacattgga gatgtgaaca tgtgggacta tgtgttgtca 300

ccggaggaga ttaacactgt ctatgctggt gggaccttca gtcctaatgt ccttaactgg 360

aggtaa 366

Claims (10)

1.一类用于抑制非洲猪瘟病毒的shRNA，其特征在于包括第一shRNA和/或第二shRNA；所述第一shRNA、第二shRNA的序列分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2所示，并且所述第一shRNA、第二shRNA的loop结构的序列均为uucaagaga。

2.一类用于转录权利要求1所述shRNA的DNA序列，其特征在于包括第一DNA序列和/或第二DNA序列；所述第一DNA序列包括序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示的正义链、反义链，所述第二DNA序列包括序列分别如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示的正义链、反义链。

3.一类重组表达载体，其特征在于包括第一重组表达载体和/或第二重组表达载体；

其中，所述第一重组表达载体携带有第一shRNA或者第一DNA序列以及合适的启动子、终止子，所述第二重组表达载体携带有第二shRNA或者第二DNA序列以及合适的启动子、终止子；

所述第一shRNA、第二shRNA的序列分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2所示，且所述第一shRNA、第二shRNA的loop结构的序列均为uucaagaga；

所述第一DNA序列包括序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示的正义链、反义链，所述第二DNA序列包括序列分别如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示的正义链、反义链。

4.根据权利要求3所述的一类重组表达载体，其特征在于：所述启动子采用U6启动子；和/或，所述重组表达载体为重组腺相关病毒表达载体。

5.含有权利要求1所述shRNA或权利要求2所述DNA序列的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

6.一种重组腺相关病毒，其特征在于：它是将权利要求3或4所述的重组表达载体与腺相关病毒的辅助质粒共转染入能够包装出腺相关病毒的包装细胞中获得。

7.根据权利要求6所述的重组腺相关病毒，其特征在于：其中的一种辅助质粒是将优化的猪巨噬细胞C反应蛋白基因连接到pAAV-RC质粒的BfuA I酶切位点处而得，所述优化的猪巨噬细胞C反应蛋白基因的序列如SEQ ID NO:8所示，另一种辅助质粒为pHelper质粒。

8.权利要求1所述的shRNA、权利要求2所述的DNA序列、权利要求3或4所述的重组表达载体、权利要求5所述的重组表达载体或表达盒或转基因细胞系或重组菌在制备预防或治疗非洲猪瘟病毒感染相关疾病的产品中的用途。

9.权利要求1所述的shRNA、权利要求2所述的DNA序列、权利要求3或4所述的重组表达载体、权利要求5所述的重组表达载体或表达盒或转基因细胞系或重组菌在制备用于抑制非洲猪瘟病毒表达的疫苗中的用途。

10.一种重组腺相关病毒的制备方法，其特征在于包括：

1)分别针对非洲猪瘟病毒A104R基因、I215L基因设计第一shRNA，第二shRNA，所述第一shRNA、第二shRNA的序列分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2所示，且所述第一shRNA、第二shRNA的loop结构的序列均为uucaagaga，酶切位点均为Kpn1，而与所述第一shRNA相应的正义链、反义链DNA的序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示，以及，与所述第二shRNA相应的正义链、反义链DNA的序列分别如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示；

2)将与所述第一shRNA相应的正义链、反义链DNA等量混合进行退火形成DNA双链，得到第一shRNA模板，以及，将与所述第二shRNA相应的正义链、反义链DNA等量混合进行退火形成DNA双链，得到第二shRNA模板；

3)对pAAV-CAG载体进行Nde1/Kpn1双酶切，以去除其中的CAG启动子，之后连接U6启动子，得到优化的质粒载体，定义为pAAV-U6载体；

4)将步骤2)所获的第一shRNA模板、第二shRNA模板分别与步骤3)所获的pAAV-U6载体连接，得到两种重组质粒，分别定义为第一重组表达载体、第二重组表达载体；

5)将优化的猪巨噬细胞C反应蛋白基因连接到pAAV-RC质粒的BfuA I酶切位点处，得到优化的腺相关病毒的辅助质粒，定义为pAAV-RCM质粒，其中所述优化的猪巨噬细胞C反应蛋白基因的序列如SEQ ID NO:8所示；

6)将步骤4)所得的第一重组表达载体、第二重组表达载体分别与pAAV-RCM质粒及pHelper质粒按照1:1:1的摩尔比共转染HEK293细胞，之后收获两种重组腺相关病毒。

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