CN105219800A

CN105219800A - 辣椒轻斑驳病毒的侵染性克隆载体和农杆菌菌株及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN105219800A
Application number: CN201510480826.7A
Authority: CN
Inventors: 燕飞; 郑红英; 韩科雷; 肖彩利; 彭杰军; 鲁宇文; 林林; 陈剑平
Original assignee: Zhejiang Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Zhejiang Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2015-08-03
Filing date: 2015-08-03
Publication date: 2016-01-06

Abstract

本发明涉及基因工程领域，具体的说，本发明涉及一种RNA植物病毒-烟草花叶病毒属的辣椒轻斑驳病毒(Pepper？mild？mottle？virus,PMMoV)侵染性克隆载体制备，携带辣椒轻斑驳病毒侵染性克隆的农杆菌菌株的致病性分析及利用PMMoV侵染性克隆表达外源蛋白。本发明通过基因重组的方法将辣椒轻斑驳病毒上海海湾分离物的基因组构建到高效植物表达载体pCB301-CH上，重组载体通过电击转化转入农杆菌菌株，获得了具有侵染能力的病毒载体。利用该侵染性克隆可以构建植物表达载体，在寄主植物体内高效、稳定的表达外源蛋白。本发明为研究该病毒基因组结构和功能及病毒与寄主之间的相互作用研究提供了成熟的体系。

Description

辣椒轻斑驳病毒的侵染性克隆载体和农杆菌菌株及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体的说，本发明涉及一种RNA植物病毒-烟草花叶病毒属的辣椒轻斑驳病毒(Peppermildmottlevirus,PMMoV)侵染性克隆载体制备，携带辣椒轻斑驳病毒侵染性克隆的农杆菌菌株的致病性分析及利用PMMoV侵染性克隆表达外源蛋白。

背景技术

辣椒轻斑驳病毒属于芜菁花叶病毒科(Tymoviridae)烟草花叶病毒属(genusTobamovirus)成员，其病毒粒子形态为杆状，病毒基因组约为6.4kb，包括5’及3’端非编码区和4个开放性的阅读框，分别编码126kDa和183kDa复制相关蛋白、28.3kDa的移动蛋白及17.1kDa的外壳蛋白。该病毒严重威胁着甜椒、辣椒、番茄等茄科作物的生产，植株被侵染后叶部症状严重时会出现斑驳或黄绿相间的花叶症状，侵染果实后可导致果实畸形、斑驳，有时出现凹凸斑点。由于该病毒在叶部的症状一般比较轻微，只有当果实显症时才被发现，因此病害极易传播，从而造成较严重的经济损失。该病毒主要通过种子传播和汁液摩擦传毒。目前在我国新疆、北京、山东、河北、宁夏等多个地区均检测到PMMoV的发生，并呈扩展蔓延趋势，对辣椒生产造成重大经济损失。

植物病毒的侵染性cDNA克隆是研究植物病毒致病机理的重要工具。运用构建的侵染性克隆，通过基因交换、突变、缺失、插入、重组等实验来分析病毒基因的功能以及鉴定病毒基因在侵染植株中产生的效应，这已成为病毒编码蛋白功能研究的重要手段。此外植物病毒侵染性cDNA克隆可以改造为表达载体，用来生产抗病毒蛋白、医用兽用疫苗和抗体。目前构建策略主要有携带T7、SP6或T3等原核启动子控制的侵染性克隆和由花椰菜花叶病毒(Cauliflowermosaicvirus,CaMV)35S启动子控制的侵染性克隆两种。本发明在获得辣椒轻斑驳病毒基因组全序列的基础上，构建了该病毒的侵染性克隆。将包含35S启动子的辣椒轻斑驳病毒cDNA序列构建入双元载体pCB301-CH中，通过农杆菌介导转化后在寄主体内转录、复制、侵染，以用于病毒的功能基因组研究。同时将PMMoV侵染性cDNA克隆改造为表达载体，进行了外源GFP蛋白的表达。

发明内容

本发明的第一个目的是提供辣椒轻斑驳病毒(Peppermildmottlevirus,PMMoV)的侵染性克隆载体及其制备方法，本发明的第二个目的是提供携带辣椒轻斑驳病毒侵染性克隆的农杆菌菌株及其应用，本发明的第三个目的是提供能够表达外源蛋白的辣椒轻斑驳病毒侵染性克隆的农杆菌菌株及其应用。

为了实现上述的第一个目的，本发明采用了以下的技术方案：

辣椒轻斑驳病毒的侵染性克隆载体，该侵染性克隆载体由辣椒轻斑驳病毒PMMoV全序列融合到带35S启动子和核酶Rz的载体pCB301-CH制备得到，所述的辣椒轻斑驳病毒PMMoV全序列如SeqIDNo:16所示。

上述的辣椒轻斑驳病毒侵染性克隆载体的制备方法，该方法包括以下的步骤：

1)获得辣椒轻斑驳病毒PMMoV全序列；

2)设计引物pCass-CH-PMMoV(+)，pCass-CH-PMMoV(-)，PMMoV3369(+)和引物PMMoV3369(-)；分别以引物对pCass-CH-PMMoV(+)/PMMoV3369(-)和引物对PMMoV3369(+)/pCass-CH-PMMoV(-)分两段扩增PMMOV全序列；所述的引物pCass-CH-PMMoV(+)，pCass-CH-PMMoV(-)，PMMoV3369(+)和引物PMMoV3369(-)的基因序列分别为SeqIDNo:5，SeqIDNo:6，SeqIDNo:2，SeqIDNo:3；

3)将纯化的扩增目的片段与经StuI和SmaI双酶切的pCB301-CH载体进行重组反应，然后将连接产物转入大肠杆菌，挑选具有全长插入的克隆，测序筛选出具有正确PMMoV基因组全序列的克隆；

4)提取包含PMMoV全长质粒的克隆，获得PMMoV的侵染性克隆载体pCB-PMMoV。

作为优选，所述的步骤1)中辣椒轻斑驳病毒PMMoV全序列获得包括以下的步骤：

1.1)植物总RNA的提取：采用Trizol法提取病叶的总RNA；

1.2)PMMoV全序列的扩增：根据GenBank上发表的PMMoV基因组全序列，GenBank登录号AB126003，设计引物PMMoV1(+)、PMMoV3369(+)、引物PMMoV3369(-)和PMMoVCOM(-)，引物分别为SeqIDNo:1、SeqIDNo:2、SeqIDNo:3和SeqIDNo:4。分别以引物对PMMoV1(+)/PMMoV3369(-)和引物对PMMoV3369(+)/PMMoVCOM(-)分两段扩增PMMoV全序列；扩增的PCR产物纯化后经测序拼接获得PMMoV的全序列。

作为优选，所述的步骤1.2)PCR扩增体系为：9μLDEPC水、25μL2×PCRBufferforKODFXNeo、10μL2mMdNTPs、上下游引物10μMeach各1.5μL、2μLcDNA模板、1μLKODFXNeo聚合酶，总反应体系为50μL；各片段的反应条件为：94℃2min；94℃15s，60℃30s，68℃3.5min，35个循环；68℃10min。

作为优选，所述的步骤3)中重组反应采用10μL体系，其中5×CEMultiSBuffer2μL，StuI和SmaI双酶切线性化克隆载体pCB301-CH120ng，片段p35SPMMoV1-336968ng，片段pPMMoV3369-RZ60ng，ExnaseTMMultiS1μL，最后用ddH2O调整体系至10μL。

作为优选，所述的步骤5)中pCB-PMMoV-GFP序列获得包括以下的步骤：以获得的PMMoV侵染性克隆载体pCB-PMMoV模板，引物PMMoV-5348NcoI(+)，SeqIDNo:7和PMMoV-MP-TMVGFP(-)，SeqIDNo:8为引物，扩增一条330bp的条带；以p35S-GFP为模板，PMMoV-MP-TMVGFP(+)，SeqIDNo:9和TMGMV-PMMoVCP(-)，SeqIDNo:10进行TMGMV启动子及外源GFP基因的扩增，产物大小约1200bp；以获得的PMMoV侵染性克隆载体pCB-PMMoV为模板，TMGMV-PMMoVCP(+)，SeqIDNo:11和PCASS-CH-PMMoV(-)，SeqIDNo:6为引物，扩增包含PMMoVCP区段及3’-UTR区域，约700bp；然后通过overlapPCR，将这三个片段拼接成1577bp大小的条带；以获得的PMMoV侵染性克隆载体pCB-PMMoV模板，引物P301-PM(+)，SeqIDNo:12和P301-PM(-)，SeqIDNo:13为引物，扩增包含PCB-301-CH载体及部分PMMoV病毒序列的条带；然后通过重组反应将这两个片段拼接形成携带表达外源GFP基因的PMMoV表达载体pCB-PMMoV-GFP。

为了实现上述的第二个目的，本发明采用了以下的技术方案：

携带辣椒轻斑驳病毒侵染性克隆的农杆菌菌株，该农杆菌菌株由上述的辣椒轻斑驳病毒侵染性克隆载体导入到农杆菌菌株EHA105获得。

为了实现上述的第三个目的，本发明采用了以下的技术方案：

携带外源GFP基因的辣椒轻斑驳病毒的侵染性克隆载体，该侵染性克隆载体为在获得的PMMoV侵染性克隆载体pCB-PMMoV改造而成，即在辣椒轻斑驳病毒编码的运动蛋白与外壳蛋白之间插入烟草轻绿花叶病毒(Tobaccomildgreenmosaicvirus,TMGMV)的外壳蛋白基因启动子及外源GFP基因，获得可表达外源基因且具有侵染性的PMMoV侵染性克隆载体pCB-PMMoV-GFP。所述的可表达外源GFP蛋白的辣椒轻斑驳病毒PMMoV全序列如SeqIDNo:17所示。

携带外源GFP基因的辣椒轻斑驳病毒的侵染性克隆载体的制备方法，具体设计方案为以获得的PMMoV侵染性克隆载体pCB-PMMoV模板，引物PMMoV-5348NcoI(+)，SeqIDNo:7和PMMoV-MP-TMVGFP(-)，SeqIDNo:8为引物，扩增一条330bp的条带；以p35S-GFP为模板，PMMoV-MP-TMVGFP(+)，SeqIDNo:9和TMGMV-PMMoVCP(-)，SeqIDNo:10进行TMGMV启动子及外源GFP基因的扩增，产物大小约1200bp.以获得的PMMoV侵染性克隆载体pCB-PMMoV为模板，TMGMV-PMMoVCP(+)，SeqIDNo:11和PCASS-CH-PMMoV(-)，SeqIDNo:6为引物，扩增包含PMMoVCP区段及3’-UTR区域，约700bp。然后通过overlapPCR，将这三个片段拼接成1577bp大小的条带。以获得的PMMoV侵染性克隆载体pCB-PMMoV模板，引物P301-PM(+)，SeqIDNo:12和P301-PM(-)，SeqIDNo:13为引物，扩增包含PCB-301-CH载体及部分PMMoV病毒序列的条带；然后通过重组反应将这两个片段拼接形成携带表达外源GFP基因的PMMoV表达载体pCB-PMMoV-GFP。

携带表达外源GFP基因的辣椒轻斑驳病毒侵染性克隆pCB-PMMoV-GFP的农杆菌菌株，该农杆菌菌株由上述的携带外源GFP基因的辣椒轻斑驳病毒的侵染性克隆载体导入到农杆菌菌株EHA105获得。

上述的携带辣椒轻斑驳病毒侵染性克隆及表达外源蛋白的辣椒轻斑驳病毒侵染性克隆的农杆菌菌株的应用，该应用用于辣椒轻斑驳病毒的致病性分析、病毒基因功能研究。

本发明与现有技术比较具有以下优势：

1、提供的农杆菌菌株可以大量产生辣椒轻斑驳病毒的侵染性克隆；

2、利用发明提供的侵染性克隆能高效侵染茄科植物本氏烟和辣椒，操作简单，重复性好；

3、利用本发明提供的侵染性克隆可有效用于辣椒轻斑驳病毒的致病性分析；

4、利用本发明提供的侵染性克隆可高效表达外源GFP基因，作为病毒侵染、复制、运动的指示。

附图说明

图1侵染性克隆载体pCB-PMMoV和pCB-PMMoV-GFP扩增构建示意图。

图2pCB-PMMoV接种本氏烟、辣椒后的症状表现；

A:健康本氏烟对照；a:pCB-PMMoV接种本氏烟7天后症状；B:健康辣椒对照；b:pCB-PMMoV接种辣椒10天后症状。

图3pCB-PMMoV-GFP接种本氏烟、辣椒后症状表现；

A:pCB-PMMoV-GFP农杆菌浸润接种本氏烟10天后症状(白光)；a:pCB-PMMoV-GFP农杆菌浸润接种接种本氏烟10天后症状(紫外光)；B:pCB-PMMoV-GFP本氏烟病汁液摩擦接种辣椒28天后症状(白光)；b:pCB-PMMoV-GFP本氏烟病汁液摩擦接种辣椒28天后症状(紫外光)。

图4pCB-PMMoV及pCB-PMMoV-GFP接种本氏烟、辣椒后的Western-blot检测结果；

M:PageRuler^TMPrestainedProteinLadder；1：健康本氏烟对照；2:pCB-PMMoV接种本氏烟；3：pCB-PMMoV-GFP接种本氏烟；4：健康辣椒对照；5：pCB-PMMoV接种辣椒；6：pCB-PMMoV-GFP接种辣椒。

图5pCB-PMMoV及pCB-PMMoV-GFP接种本氏烟、辣椒后的RT-PCR检测结果；

M：Trans2KPlusDNAMarker；1：健康本氏烟对照；2:pCB-PMMoV接种本氏烟；3：pCB-PMMoV-GFP接种本氏烟；4：健康辣椒对照；5：pCB-PMMoV接种辣椒；6：pCB-PMMoV-GFP接种辣椒。

具体实施方式

本发明所提供的实施例均按照常规实验条件，其中所采用的引物序列如表1。

表1PMMoV全序列扩增及载体构建引物

实施例1：辣椒轻斑驳病毒基因组全序列的克隆和测定

1.植物总RNA的提取

采用Trizol法提取病叶的总RNA，具体操作如下：将约100㎎新鲜辣椒病叶样品在液氮中研磨成粉末，然后迅速加入1mlTrizol。转到2ml无菌离心管中，剧烈震荡混匀，使其充分裂解，室温放置5min。4℃，132000rpm离心5min。取上清，加入1/5体积氯仿，用力震荡15s，冰上放置2～3min。4℃，132000rpm离心30min。底层为氯仿相，中层为蛋白相，上层为含RNA的无色水相。将上清转入新一轮的离心管中(注意不要吸入蛋白层)，加入1/5体积氯仿于上清，震荡混匀，冰上放置2～3min。4℃，132000rpm离心30min。将上清转入到1.5ml的离心管中，加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，﹣70℃放置1h。4℃，132000rpm离心20min。去上清，加入预冷的75％的乙醇，洗涤沉淀。4℃，132000rpm离心5min。重复一次，已彻底洗干净盐分。去上清，倒扣干燥10min，用30～50μLRNase-Free水溶解。-70℃保存。

2.PMMoV全序列扩增及全基因组序列测定

以引物对PMMoV1(+)/PMMoV3369(-)和PMMoV3369(+)/PMMoVCOM(-)分两段扩增PMMoV序列，PCR扩增体系为：9μLDEPC水、25μL2×PCRBufferforKODFXNeo、10μL2mMdNTPs、上下游引物((10μMeach)各1.5μL、2μLcDNA模板、1μLKODFXNeo聚合酶。总反应体系为50μL。各片段的反应条件为:94℃2min；94℃15s,60℃30s,68℃3.5min,35个循环；68℃10min。扩增的PCR产物纯化后经测序拼接获得PMMoV的全序列。获得辣椒轻斑驳病毒的全长基因组序列6355bp。

实施例2：辣椒轻斑驳病毒侵染性克隆pCB-PMMoV的构建

根据实施例1获得的全序列，设计引物pCass-CH-PMMoV(+)，pCass-CH-PMMoV(-)，PMMoV3369(+)和引物PMMoV3369(-)。以实施例1中做3’-RACE合成的cDNA为模板，分别以引物对pCass-CH-PMMoV(+)/PMMoV3369(-)和引物对PMMoV3369(+)/pCass-CH-PMMoV(-)分两段扩增PMMOV全序列。采用ClonExpress^TMMultiS重组克隆试剂盒(南京诺唯赞生物科技有限公司)将纯化的扩增目的片段与经StuI和SmaI双酶切的pCB301-CH载体进行重组，采用10μL体系反应，其中5×CEMultiSBuffer2μL，StuI和SmaI双酶切线性化克隆载体pCB301-CH120ng，片段p35SPMMoV1-336968ng，片段pPMMoV3369-RZ60ng，Exnase^TMMultiS1μl，最后用ddH2O调整体系至10μL。使用移液器上下吹打数次，轻轻混匀各组分。置于37℃反应30min。反应完成后立即将反应管置于冰水浴中，冷却5min。然后将连接产物转入大肠杆菌，挑选具有全长插入的克隆，测序筛选出1个具有正确PMMoV基因组全序列的克隆(SeqIDNo:16)。提取包含PMMoV全长质粒的克隆，将该策略构建的侵染性克隆命名为pCB-PMMoV(图1)。通过电击法将其导入到农杆菌菌株EHA105，获得具有侵染能力的pCB-PMMoV(EHA105)菌株。

实施例3：携带外源基因GFP的辣椒轻斑驳病毒侵染性克隆pCB-PMMoV-GFP的构建

将烟草轻绿花叶病毒(Tobaccomildgreenmosaicvirus,TMGMV)的外壳蛋白基因启动子及外源GFP基因插入已经获得的PMMoV侵染性克隆载体pCB-PMMoV中，获得可表达外源基因且具有侵染性的PMMoV侵染性克隆载体pCB-PMMoV-GFP。以获得的PMMoV侵染性克隆载体pCB-PMMoV模板，引物PMMoV-5348NcoI(+)，SeqIDNo:7和PMMoV-MP-TMVGFP(-)，SeqIDNo:8为引物，扩增一条330bp的条带；以p35S-GFP为模板，PMMoV-MP-TMVGFP(+)，SeqIDNo:9和TMGMV-PMMoVCP(-)，SeqIDNo:10进行TMGMV启动子及外源GFP基因的扩增，产物大小约1200bp.以获得的PMMoV侵染性克隆载体pCB-PMMoV为模板，TMGMV-PMMoVCP(+)，SeqIDNo:11和PCASS-CH-PMMoV(-)，SeqIDNo:6为引物，扩增包含PMMoVCP区段及3’-UTR区域，约700bp。然后通过overlapPCR，将这三个片段拼接成1577bp大小的条带。以获得的PMMoV侵染性克隆载体pCB-PMMoV模板，引物P301-PM(+)，SeqIDNo:12和P301-PM(-)，SeqIDNo:13为引物，扩增包含PCB-301-CH载体及部分PMMoV病毒序列的条带；然后通过重组反应将这两个片段拼接形成携带表达外源GFP基因的PMMoV表达载体pCB-PMMoV-GFP。

实施例4：pCB-PMMoV和pCB-PMMoV-GFP侵染性克隆接种

将pCB-PMMoV及pCB-PMMoV-GFP分别电击转化导入农杆菌菌株EHA105，经菌落PCR验证后，挑取单斑接种于含有Kan(50mg/L)和Rif(50mg/L)抗性的YEP培养基中28℃过夜振荡培养；然后1：100转接到相同抗性的LB培养基中(含10mmol/LMES和20μmol/L乙酰丁香酮)，生长至对数生长期(A600值约为0.6-0.8)，经6000r/min离心5min收集菌体；用含终浓度为10mMMgCl₂，10mMMES(pH5.6)，200uM乙酰丁香酮(Ace)的无菌水重悬浮，调整菌液浓度至A600为1.0；在室温下放置3小时以上。用2ml注射器(无针头)吸取农杆菌菌液待用。选取4～6片真叶的本氏烟，在叶片背面缓慢将菌液渗透注射到组织间隙中。每个处理注射6～8株，将浸润好的植株在暗处放置3～6小时后移到25℃温室中培养(16小时光照/8小时黑暗交替)。

实施例5：pCB-PMMoV侵染性克隆的侵染性测定

定期对接种植株进行症状观察，监测在不同植物上引起的变化。对出现症状或未出现症状的植株都进行Western-blot和PCR检测。症状观察表明，农杆菌浸润接种本氏烟pCB-PMMoV7天后系统叶表现明显顶叶下卷，叶片皱缩卷曲畸形症状(图2)。将该表现症状的本氏烟病汁液对辣椒品种“浙椒一号”进行摩擦接种，辣椒叶片10天左右出现轻微斑驳花叶症状(图2)。利用PMMoV的外壳蛋白抗血清进行Western-blot检测，在接种pCB-PMMoV的本氏烟和辣椒的样品中均能在17KDa处检测到特异的条带，这与该分离物编码的外壳蛋白大小为17.2KDa一致，而健康对照中未检测到该特异性条带(图4)。利用病毒的特异性引物进行RT-PCR检测，接种pCB-PMMoV的本氏烟和辣椒均能扩增到575bp大小的特异性病毒条带(图5)。这些结果表明构建的pCB-PMMoV侵染性克隆具有生物学活性，能成功侵染本氏烟、辣椒。

实施例6：pCB-PMMoV-GFP侵染性克隆的侵染性及外源GFP表达的测定

症状观察表明，pCB-PMMoV-GFP接种本氏烟和浙椒1号症状表现与pCB-PMMoV类似。农杆菌浸润接种本氏烟7天后系统叶表现明显的皱缩卷曲畸形(图3)。将该表现症状的本氏烟病汁液对辣椒品种浙椒一号进行摩擦接种，摩擦接种后28天观察可见辣椒叶片表现轻微斑驳花叶花叶症状(图3)。利用长波紫外灯观察，可以在本氏烟和辣椒系统叶片观察到明显的绿色荧光(图3)，说明外源蛋白在植物体内得到了稳定高效的表达。利用PMMoV的外壳蛋白抗血清进行Western-blot检测，在接种pCB-PMMoV的本氏烟和辣椒的样品中均能在17KDa处检测到特异的条带，这与该分离物编码的外壳蛋白大小为17.2KDa一致，而健康对照中未检测到该特异性条带(图4)。利用病毒的特异性引物进行RT-PCR检测，接种pCB-PMMoV-GFP的本氏烟、辣椒均能扩增到575bp大小的特异性病毒条带(图5)。这些结果表明构建的pCB-PMMoV-GFP侵染性克隆具有生物学活性，能成功侵染本氏烟、辣椒，并可以成功表达外源蛋白。

序列表

<110>浙江省农业科学院

<120>辣椒轻斑驳病毒的侵染性克隆载体和农杆菌菌株及其制备方法和应用

<160>17

<210>1

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

GTAAATTTTTCACAATTTAACAACAACAAC30

<210>2

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

GTGTGTGAGTAGTTACCTGTTAG23

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

CTAACAGGTAACTACTCACACAC23

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

TGGGCCGCTACCCGCGGTTC20

<210>5

<211>50

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

GTTCATTTCATTTGGAGAGGGTAAATTTTTCACAATTTAACAACAACAAC50

<210>6

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

GTGGAGATGCCATGCCGACCCTGGGCCGCTACCCGCGGTTC41

<210>7

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

TAATATTAGAGGTGTTGCCATGGAAAAGGGTTTCTGTCCTTTATC45

<210>8

<211>51

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

GAGAAAGAGAAAAAGATTAGTCTTCATAGTTAAAACGAAGAAGACTCGGCG51

<210>9

<211>51

<212>DNA

<213>人工序列

<400>9

CGCCGAGTCTTCTTCGTTTTAACTATGAAGACTAATCTTTTTCTCTTTCTC51

<210>10

<211>56

<212>DNA

<213>人工序列

<400>10

TTGGCACTGGAAACTGTGTAAGCCATAGTTAAAACGTACTCGATGACGCGATAGAC56

<210>11

<211>56

<212>DNA

<213>人工序列

<400>11

GTCTATCGCGTCATCGAGTACGTTTTAACTATGGCTTACACAGTTTCCAGTGCCAA56

<210>12

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>12

GGGTCGGCATGGCATCTCCAC21

<210>13

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>13

CCATGGCAACACCTCTAATATTA23

<210>14

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>14

AATGCCGGTACTGGACGTTA20

<210>15

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>15

TGTCCTTGATTATCTTCTTCA21

<210>16

<211>6355

<212>DNA

<213>辣椒轻斑驳病毒

<400>16

1GTAAATTTTTCACAATTTAACAACAACAACACAAACAACAAACAACATTACAAACAAATT

61ACAACTACAATGGCTTACACACAACAAGCTACCAACGCCGCATTAGCAAGTACTCTCCGA

121GGGAACAACCCCTTGGTGAACGATCTTGCTAATCGGAGACTGTACGAATCAGCGGTCGAA

181CAATGCAATGCACATGACCGCAGGCCCAAGGTTAATTTTTTAAGGTCGATAAGCGAAGAG

241CAGACGCTTATCGCAACTAAGGCCTACCCTGAGTTCCAAATTACGTTCTACAACACGCAG

301AACGCTGTGCACAGTCTCGCAGGTGGACTTCGGTCTTTGGAACTAGAATACTTGATGATG

361CAGATCCCCTATGGTTCAACGACATACGATATCGGGGGAAATTTTGCTGCTCACATGTTT

421AAAGGTCGTGACTACGTTCATTGTTGCATGCCTAATATGGACTTACGTGACGTCATGCGT

481CACAATGCTCAAAAGGATAGCATTGAACTGTACCTTTCAAAGCTTGCGCAAAAGAAAAAG

541GTAATACCGCCATATCAAAAGCCAGTCTTTGATAAATACACGGACGATCCGCAATCGGTA

601GTGTGCTCGAAACCTTTCCAGCACTGCGAAGGCGTTTCGCACTGCACGGATAAAGTATAC

661GCTGTCGCTTTGCACAGTTTATACGACATTCCAGCAGATGAATTTGGTGCAGCACTTCTG

721AGGAGAAATGTTCATGTCTGTTATGCTGCCTTCCACTTTTCTGAGAATCTTCTTTTAGAA

781GATTCGTATGTTAGTCTTGACGACATAGGCGCTTTCTTCTCGAGAGAGGGTGATATGTTG

841AACTTTTCCTTTGTAGCAGAGAGTACTTTAAATTATACTCATTCCTATAGTAATGTGCTT

901AAGTATGTGTGTAAGACTTACTTCCCCGCTTCTAGTAGAGAAGTGTACATGAAGGAGTTT

961TTGGTAACTAGGGTAAATACTTGGTTTTGTAAGTTTTCAAGGTTAGATACCTTTGTACTA

1021TATAGAGGTGTGTACCACAGAGGTGTAGACAAGGAGCAATTTTATAGTGCAATGGAAGAT

1081GCTTGGCATTACAAAAAGACTTTGGCGATGATGAATAGCGAAAGGATCCTCTTGGAGGAT

1141TCATCGTCTGTTAATTATTGGTTTCCAAAGATGAAAGATATGGTGATAGTACCTTTGTTC

1201GACGTATCTTTACAGAACGAGGGGAAAAGGTTAGCAAGAAAGGAGGTTATGGTCAGCAAG

1261GACTTCGTTTATACTGTGCTTAATCATATTCGCACATACCAGTCGAAAGCGCTTACTTAC

1321GCCAATGTATTATCGTTCGTTGAGTCGATAAGATCAAGAGTGATAATTAATGGGGTGACT

1381GCTCGCTCAGAGTGGGATGTGGACAAGGCTTTGTTGCAGTCTCTGTCAATGACCTTTTTC

1441TTGCAGACCAAATTGGCCATGCTCAAAGATGACCTCGTGGTTCAAAAATTTCAAGTGCAT

1501TCTAAATCGCTCACTGAATATGTCTGGGATGAGATTACTGCCGCTTTTCACAACTGTTTT

1561CCTACAATCAAGGAGAGGTTGATTAACAAGAAACTCATAACTGTTTCGGAAAAGGCTCTT

1621GAAATTAAAGTACCTGACTTATATGTGACTTTCCACGACAGATTAGTTAAAGAGTACAAG

1681TCTTCAGTGGAAATGCCGGTACTGGACGTTAAAAAGAGCTTGGAAGAAGCGGAAGTGATG

1741TACAATGCTTTGTCAGAAATCTCAATTCTTAAGGATAGTGACAAGTTTGATGTTGATGTT

1801TTTTCCCGAATGTGTAATACTTTAGGCGTAGATCCATTGGTGGCAGCAAAGGTAATGGTA

1861GCCGTGGTTTCAAATGAGAGTGGTTTGACCTTAACGTTTGAGCGGCCTACCGAAGCAAAT

1921GTCGCACTTGCATTGCAACCGACAATTGCATCAAAGGAGGAAGGTTCATTAAAGATTGTG

1981TCGTCAGACGTAGGTGAGTCCTCAATCAAGGAAGTGGTCCGAAAATCGGAGATTTCTATG

2041CTAGGTCTAACAGGCAGCACAGTGTCCGATGAGTTCCAAAGAAGTACAGAAATCGAGTCG

2101TTGCAGCAGTTCCATATGGTATCCACAGAGACGATTATCCGTAAACAGATGCATGCGATG

2161GTGTATACTGGTCCGCTAAAAGTTCAACAATGCAAGAACTATTTAGACAGCCTAGTAGCC

2221TCGCTCTCTGCTGCGGTATCAAACCTGAAGAAGATAATCAAGGACACAGCTGCGATAGAT

2281CTCGAGACTAAGGAAAAATTTGGAGTCTACGACGTGTGCCTTAAGAAATGGTTGGTGAAA

2341CCTCAATCGAAAGGACATGCTTGGGGTGTGGTGATGGACTCAGACTATAAGTGCTTTGTA

2401GCGCTTCTCACATACGATGGCGAGAACATTGTGTGCGGAGAGACATGGCGTAGAGTCGCA

2461GTGAGCTCCGAATCTTTGGTGTATTCAGATATGGGGAAGATAAGAGCTATACGCTCAGTG

2521CTTAAAGACGGTGAACCCCATATAAGTAGTGCAAAGGTTACACTTGTTGATGGTGTTCCA

2581GGTTGCGGGAAGACAAAGGAGATTCTTTCGAGGGTCAACTTTGACGAAGATCTGGTTCTA

2641GTACCAGGAAAACAGGCTGCCGAAATGATAAAAAGAAGAGCAAACAGTTCTGGTTTAATC

2701GTGGCGACCAAGGAGAACGTAAGGACGGTAGACTCTTTCTTAATGAATTACGGTCGAGGT

2761CCGTGCCAATACAAAAGGCTGTTTCTGGATGAAGGTCTAATGTTACACCCCGGTTGTGTT

2821AATTTTCTGGTTGGCATGTCTCTATGCTCCGAGGCTTTTGTTTATGGAGACACCCAGCAG

2881ATTCCTTACATCAACAGAGTTGCAACTTTTCCCTATCCTAAGCATTTGAGTCAACTCGAG

2941GTCGATGCTGTTGAGACTCGCAGAACAACATTGCGGTGTCCGGCTGATATCACCTTCTTC

3001TTGAATCAGAAGTACGAAGGGCAAGTTATGTGCACATCAAGTGTTACACGCTCGGTGTCA

3061CACGAGGTCATCCAAGGTGCAGCAGTAATGAATCCAGTGTCTAAACCACTTAAAGGGAAG

3121GTGATTACATTCACTCAATCAGACAAGTCATTGCTGCTCTCAAGGGGTTACGAAGATGTG

3181CATACCGTTCATGAGGTGCAAGGGGAAACGTTTGAAGACGTCTCATTAGTGAGATTGACG

3241CCTACACCCGTGGGAATAATTTCAAAGCAGAGTCCGCACCTGTTGGTCTCGTTGTCTAGG

3301CATACAAGGTCAATCAAATATTACACTGTTGTACTAGATGCAGTCGTTTCAGTGCTTAGA

3361GATTTGGAGTGTGTGAGTAGTTACCTGTTAGATATGTACAAAGTTGATGTGTCGACTCAA

3421TAGCAATTACAGATAGAATCGGTGTACAAAGGTGTTAACCTTTTCGTCGCAGCCCCGAAA

3481ACAGGAGATGTTTCTGACATGCAATATTACTATGACAAGTGTTTGCCGGGAAACAGTACT

3541ATACTTAATGAGTATGATGCTGTAACTATGCAAATACGAGAAAATAATTTGAATGTCAAG

3601GATTGTGTGTTGGATATGTCGAAGTCGGTGCCTCTTCCGAGAGAATCTGAGACGACATTG

3661AAACCTGTGATCAGGACTGCTGCTGAAAAACCTCGAAAACCTGGATTGTTGGAAAACTTG

3721GTCGCGATGATCAAAAGAAATTTCAACTCTCCCGAATTAATAGGGGTCGTCGACATCGAA

3781GACACCGCTTCTCTAGTAGTAGATAAGTTTTTTGATGCATACTTTATTAAAGAAAAGAAA

3841AAACCTAAAAATATACCTCTGCTTTCAAGGGCGAGTTTGGAAAGATGGATAGAAAAGCAA

3901GAAAAGTCGACGATTGGCCAGTTGGCTGATTTTGACTTTATTGATCTTCCAGCCGTTGAT

3961CAATATAGGCACATGATCAAGCAGCAGCCGAAACAGCGTCTAGATCTTAGTATTCAAACT

4021GAATACCCGGCTTTGCAAACTATTGTGTATCATAGCAAGAAAATCAATGCGCTTTTTGGT

4081CCTGTATTTTCAGAATTAACAAGACAACTGCTAGAGTCAATTGACAGTTCGAGATTCATG

4141TTTTATACAAGGAAAACGCCTACACAGATCGAAGAGTTTTTCTCAGATCTGGACTCTAAT

4201GTTCCTATGGACATATTAGAGCTGGACATTTCCAAGTATGACAAATCACAGAACGAATTT

4261CATTGTGCAGTTGAGTATGAGATTTGGAAAAGGTTAGGCTTAGACGATTTCTTGGCCGAA

4321GTTTGGAAACACGGGCATCGGAAGACAACGTTGAAAGACTACACAGCCGGAATAAAAACG

4381TGTTTGTGGTATCAAAGGAAAAGTGGTGATGTCACCACATTCATTGGAAACACGATCATT

4441ATTGCTGCATGTCTGTCCTCTATGCTACCGATGGAGAGATTGATTAAAGGTGCCTTTTGT

4501GGTGATGATAGTATACTATACTTTCCAAAGGGCACTGATTTCCCTGATATTCAACAGGGT

4561GCAAATCTTCTCTGGAATTTTGAAGCCAAGTTGTTCAGGAAGAGATATGGTTACTTTTGC

4621GGTAGGTACATAATCCACCATGACAGAGGTTGTATTGTATATTATGACCCTCTAAAATTG

4681ATCTCGAAACTCGGTGCTAAACACATCAAGAATAGAGAACATTTAGAGGAATTTAGAACC

4741TCTCTTTGTGATGTTGCTGGGTCGTTGAACAATTGTGCGTACTATACACATTTGGACGAC

4801GCTGTCGGTGAGGTTATTAAAACCGCACCTCCTGGTTCGTTTGTTTATAGAGCATTAGTT

4861AAGTACTTGTGTGATAAAAGGTTGTTTCAAACATTGTTTCTGGAATAAATGGCGTTAGTA

4921GTCAAGGATGACGTTAAGATTTCTGAGTTCATCAATTTGTCTACCGCTGAGAAATTCTTA

4981CCTGCTGTTATGACTTCGGTCAAGACGGTACGAATTTCGAAAGTTGACAAAGTGATTGCA

5041ATGGAAAACGATTCGTTATCCGATGTAGATTTGCTTAAAGGTGTTAAGCTTGTTAAAGAT

5101GGTTATGTGTGTTTGGCAGGGTTAGTTGTGTCCGGGGAGTGGAACCTACCGGACAACTGC

5161AGAGGTGGAGTAAGCGTTTGTTTGGTTGACAAGAGAATGCAAAGAGATGACGAAGCAACA

5221CTTGGATCTTATAGAACCAGTGCGGCTAAGAAACGATTTGCCTTCAAATTGATCCCGAAT

5281TATAGCATTACTACCGCCGATGCTGAGAGAAATGTTTGGCAAGTTTTAGTTAATATTAGA

5341GGTGTTGCCATGGAAAAGGGTTTCTGTCCTTTATCTTTGGAGTTTGTCTCAGTTTGTATT

5401GTACACAAATCCAATATAAAATTAGGCTTGAGAGAGAAAATTACTAGTGTGTCGGAAGGA

5461GGACCCGTTGAACTTACAGAAGCAGTTGTTGATGAGTTCATCGAATCAGTTCCAATGGCT

5521GACAGATTACGTAAATTTCGCAATCAATCCAAGAAAAGAAGTAATAAGTATGTAGGTAAG

5581AGAAATGATAATAAGGGTGTGAATAAGGAAAGGAAGCTGTTTGATAAGGTTAGAATTGGG

5641CAGAACTCGGAGTCATCGGACGCCGAGTCTTCTTCGTTTTAACTATGGCTTACACAGTTT

5701CCAGTGCCAATCAATTAGTGTATTTAGGTTCTGTATGGGCCGATCCATTAGAGTTACAAA

5761ATCTATGTACTTCGGCGTTAGGTAATCAGTTTCAAACACAGCAGGCTAGAACTACGGTTC

5821AACAGCAGTTCTCTGATGTGTGGAAGACTATACCGACCGCTACAGTTAGATTTCCCGCTA

5881CTGGTTTCAAAGTTTTCCGATATAATGCCGTGCTAGATTCTCTAGTGTCGGCACTTCTCG

5941GAGCCTTTGATACTAGGAATAGGATAATAGAAGTAGAAAATCCGCAAAATCCTACAACTG

6001CCGAGACGCTTGATGCGACGAGGCGGGTAGATGATGCGACGGTGGCCATTAGGGCCAGTA

6061TAAGTAACCTCATGAATGAGTTAGTTCGTGGCACGGGAATGTACAATCAAGCTCTGTTCG

6121AGAGCGCGAGTGGACTCACCTGGGCTACAACTCCTTAGACATGATGGTGTAAATAAGTTG

6181GACGAACGTTAAACGTCCGTGGCGAGTACGATAACTCGTAGTGTTTTTCCCTCCACTTAA

6241ATCGAAGGGTTGTCGTTAGGATGGAACGCAATTAAATACATGTGTGACGTGTATTTGCGA

6301ACGACGTAATTATTTTCAGGGGTTCGAATCCCCCCCGAACCGCGGGTAGCGGCCC

<210>17

<211>7504

<212>DNA

<213>烟草轻绿花叶病毒

<400>17

1GTAAATTTTTCACAATTTAACAACAACAACACAAACAACAAACAACATTACAAACAAATT

61ACAACTACAATGGCTTACACACAACAAGCTACCAACGCCGCATTAGCAAGTACTCTCCGA

121GGGAACAACCCCTTGGTGAACGATCTTGCTAATCGGAGACTGTACGAATCAGCGGTCGAA

181CAATGCAATGCACATGACCGCAGGCCCAAGGTTAATTTTTTAAGGTCGATAAGCGAAGAG

241CAGACGCTTATCGCAACTAAGGCCTACCCTGAGTTCCAAATTACGTTCTACAACACGCAG

301AACGCTGTGCACAGTCTCGCAGGTGGACTTCGGTCTTTGGAACTAGAATACTTGATGATG

361CAGATCCCCTATGGTTCAACGACATACGATATCGGGGGAAATTTTGCTGCTCACATGTTT

421AAAGGTCGTGACTACGTTCATTGTTGCATGCCTAATATGGACTTACGTGACGTCATGCGT

481CACAATGCTCAAAAGGATAGCATTGAACTGTACCTTTCAAAGCTTGCGCAAAAGAAAAAG

541GTAATACCGCCATATCAAAAGCCAGTCTTTGATAAATACACGGACGATCCGCAATCGGTA

601GTGTGCTCGAAACCTTTCCAGCACTGCGAAGGCGTTTCGCACTGCACGGATAAAGTATAC

661GCTGTCGCTTTGCACAGTTTATACGACATTCCAGCAGATGAATTTGGTGCAGCACTTCTG

721AGGAGAAATGTTCATGTCTGTTATGCTGCCTTCCACTTTTCTGAGAATCTTCTTTTAGAA

781GATTCGTATGTTAGTCTTGACGACATAGGCGCTTTCTTCTCGAGAGAGGGTGATATGTTG

841AACTTTTCCTTTGTAGCAGAGAGTACTTTAAATTATACTCATTCCTATAGTAATGTGCTT

901AAGTATGTGTGTAAGACTTACTTCCCCGCTTCTAGTAGAGAAGTGTACATGAAGGAGTTT

961TTGGTAACTAGGGTAAATACTTGGTTTTGTAAGTTTTCAAGGTTAGATACCTTTGTACTA

1021TATAGAGGTGTGTACCACAGAGGTGTAGACAAGGAGCAATTTTATAGTGCAATGGAAGAT

1081GCTTGGCATTACAAAAAGACTTTGGCGATGATGAATAGCGAAAGGATCCTCTTGGAGGAT

1141TCATCGTCTGTTAATTATTGGTTTCCAAAGATGAAAGATATGGTGATAGTACCTTTGTTC

1201GACGTATCTTTACAGAACGAGGGGAAAAGGTTAGCAAGAAAGGAGGTTATGGTCAGCAAG

1261GACTTCGTTTATACTGTGCTTAATCATATTCGCACATACCAGTCGAAAGCGCTTACTTAC

1321GCCAATGTATTATCGTTCGTTGAGTCGATAAGATCAAGAGTGATAATTAATGGGGTGACT

1381GCTCGCTCAGAGTGGGATGTGGACAAGGCTTTGTTGCAGTCTCTGTCAATGACCTTTTTC

1441TTGCAGACCAAATTGGCCATGCTCAAAGATGACCTCGTGGTTCAAAAATTTCAAGTGCAT

1501TCTAAATCGCTCACTGAATATGTCTGGGATGAGATTACTGCCGCTTTTCACAACTGTTTT

1561CCTACAATCAAGGAGAGGTTGATTAACAAGAAACTCATAACTGTTTCGGAAAAGGCTCTT

1621GAAATTAAAGTACCTGACTTATATGTGACTTTCCACGACAGATTAGTTAAAGAGTACAAG

1681TCTTCAGTGGAAATGCCGGTACTGGACGTTAAAAAGAGCTTGGAAGAAGCGGAAGTGATG

1741TACAATGCTTTGTCAGAAATCTCAATTCTTAAGGATAGTGACAAGTTTGATGTTGATGTT

1801TTTTCCCGAATGTGTAATACTTTAGGCGTAGATCCATTGGTGGCAGCAAAGGTAATGGTA

1861GCCGTGGTTTCAAATGAGAGTGGTTTGACCTTAACGTTTGAGCGGCCTACCGAAGCAAAT

1921GTCGCACTTGCATTGCAACCGACAATTGCATCAAAGGAGGAAGGTTCATTAAAGATTGTG

1981TCGTCAGACGTAGGTGAGTCCTCAATCAAGGAAGTGGTCCGAAAATCGGAGATTTCTATG

2041CTAGGTCTAACAGGCAGCACAGTGTCCGATGAGTTCCAAAGAAGTACAGAAATCGAGTCG

2101TTGCAGCAGTTCCATATGGTATCCACAGAGACGATTATCCGTAAACAGATGCATGCGATG

2161GTGTATACTGGTCCGCTAAAAGTTCAACAATGCAAGAACTATTTAGACAGCCTAGTAGCC

2221TCGCTCTCTGCTGCGGTATCAAACCTGAAGAAGATAATCAAGGACACAGCTGCGATAGAT

2281CTCGAGACTAAGGAAAAATTTGGAGTCTACGACGTGTGCCTTAAGAAATGGTTGGTGAAA

2341CCTCAATCGAAAGGACATGCTTGGGGTGTGGTGATGGACTCAGACTATAAGTGCTTTGTA

2401GCGCTTCTCACATACGATGGCGAGAACATTGTGTGCGGAGAGACATGGCGTAGAGTCGCA

2461GTGAGCTCCGAATCTTTGGTGTATTCAGATATGGGGAAGATAAGAGCTATACGCTCAGTG

2521CTTAAAGACGGTGAACCCCATATAAGTAGTGCAAAGGTTACACTTGTTGATGGTGTTCCA

2581GGTTGCGGGAAGACAAAGGAGATTCTTTCGAGGGTCAACTTTGACGAAGATCTGGTTCTA

2641GTACCAGGAAAACAGGCTGCCGAAATGATAAAAAGAAGAGCAAACAGTTCTGGTTTAATC

2701GTGGCGACCAAGGAGAACGTAAGGACGGTAGACTCTTTCTTAATGAATTACGGTCGAGGT

2761CCGTGCCAATACAAAAGGCTGTTTCTGGATGAAGGTCTAATGTTACACCCCGGTTGTGTT

2821AATTTTCTGGTTGGCATGTCTCTATGCTCCGAGGCTTTTGTTTATGGAGACACCCAGCAG

2881ATTCCTTACATCAACAGAGTTGCAACTTTTCCCTATCCTAAGCATTTGAGTCAACTCGAG

2941GTCGATGCTGTTGAGACTCGCAGAACAACATTGCGGTGTCCGGCTGATATCACCTTCTTC

3001TTGAATCAGAAGTACGAAGGGCAAGTTATGTGCACATCAAGTGTTACACGCTCGGTGTCA

3061CACGAGGTCATCCAAGGTGCAGCAGTAATGAATCCAGTGTCTAAACCACTTAAAGGGAAG

3121GTGATTACATTCACTCAATCAGACAAGTCATTGCTGCTCTCAAGGGGTTACGAAGATGTG

3181CATACCGTTCATGAGGTGCAAGGGGAAACGTTTGAAGACGTCTCATTAGTGAGATTGACG

3241CCTACACCCGTGGGAATAATTTCAAAGCAGAGTCCGCACCTGTTGGTCTCGTTGTCTAGG

3301CATACAAGGTCAATCAAATATTACACTGTTGTACTAGATGCAGTCGTTTCAGTGCTTAGA

3361GATTTGGAGTGTGTGAGTAGTTACCTGTTAGATATGTACAAAGTTGATGTGTCGACTCAA

3421TAGCAATTACAGATAGAATCGGTGTACAAAGGTGTTAACCTTTTCGTCGCAGCCCCGAAA

3481ACAGGAGATGTTTCTGACATGCAATATTACTATGACAAGTGTTTGCCGGGAAACAGTACT

3541ATACTTAATGAGTATGATGCTGTAACTATGCAAATACGAGAAAATAATTTGAATGTCAAG

3601GATTGTGTGTTGGATATGTCGAAGTCGGTGCCTCTTCCGAGAGAATCTGAGACGACATTG

3661AAACCTGTGATCAGGACTGCTGCTGAAAAACCTCGAAAACCTGGATTGTTGGAAAACTTG

3721GTCGCGATGATCAAAAGAAATTTCAACTCTCCCGAATTAATAGGGGTCGTCGACATCGAA

3781GACACCGCTTCTCTAGTAGTAGATAAGTTTTTTGATGCATACTTTATTAAAGAAAAGAAA

3841AAACCTAAAAATATACCTCTGCTTTCAAGGGCGAGTTTGGAAAGATGGATAGAAAAGCAA

3901GAAAAGTCGACGATTGGCCAGTTGGCTGATTTTGACTTTATTGATCTTCCAGCCGTTGAT

3961CAATATAGGCACATGATCAAGCAGCAGCCGAAACAGCGTCTAGATCTTAGTATTCAAACT

4021GAATACCCGGCTTTGCAAACTATTGTGTATCATAGCAAGAAAATCAATGCGCTTTTTGGT

4081CCTGTATTTTCAGAATTAACAAGACAACTGCTAGAGTCAATTGACAGTTCGAGATTCATG

4141TTTTATACAAGGAAAACGCCTACACAGATCGAAGAGTTTTTCTCAGATCTGGACTCTAAT

4201GTTCCTATGGACATATTAGAGCTGGACATTTCCAAGTATGACAAATCACAGAACGAATTT

4261CATTGTGCAGTTGAGTATGAGATTTGGAAAAGGTTAGGCTTAGACGATTTCTTGGCCGAA

4321GTTTGGAAACACGGGCATCGGAAGACAACGTTGAAAGACTACACAGCCGGAATAAAAACG

4381TGTTTGTGGTATCAAAGGAAAAGTGGTGATGTCACCACATTCATTGGAAACACGATCATT

4441ATTGCTGCATGTCTGTCCTCTATGCTACCGATGGAGAGATTGATTAAAGGTGCCTTTTGT

4501GGTGATGATAGTATACTATACTTTCCAAAGGGCACTGATTTCCCTGATATTCAACAGGGT

4561GCAAATCTTCTCTGGAATTTTGAAGCCAAGTTGTTCAGGAAGAGATATGGTTACTTTTGC

4621GGTAGGTACATAATCCACCATGACAGAGGTTGTATTGTATATTATGACCCTCTAAAATTG

4681ATCTCGAAACTCGGTGCTAAACACATCAAGAATAGAGAACATTTAGAGGAATTTAGAACC

4741TCTCTTTGTGATGTTGCTGGGTCGTTGAACAATTGTGCGTACTATACACATTTGGACGAC

4801GCTGTCGGTGAGGTTATTAAAACCGCACCTCCTGGTTCGTTTGTTTATAGAGCATTAGTT

4861AAGTACTTGTGTGATAAAAGGTTGTTTCAAACATTGTTTCTGGAATAAATGGCGTTAGTA

4921GTCAAGGATGACGTTAAGATTTCTGAGTTCATCAATTTGTCTACCGCTGAGAAATTCTTA

4981CCTGCTGTTATGACTTCGGTCAAGACGGTACGAATTTCGAAAGTTGACAAAGTGATTGCA

5041ATGGAAAACGATTCGTTATCCGATGTAGATTTGCTTAAAGGTGTTAAGCTTGTTAAAGAT

5101GGTTATGTGTGTTTGGCAGGGTTAGTTGTGTCCGGGGAGTGGAACCTACCGGACAACTGC

5161AGAGGTGGAGTAAGCGTTTGTTTGGTTGACAAGAGAATGCAAAGAGATGACGAAGCAACA

5221CTTGGATCTTATAGAACCAGTGCGGCTAAGAAACGATTTGCCTTCAAATTGATCCCGAAT

5281TATAGCATTACTACCGCCGATGCTGAGAGAAATGTTTGGCAAGTTTTAGTTAATATTAGA

5341GGTGTTGCCATGGAAAAGGGTTTCTGTCCTTTATCTTTGGAGTTTGTCTCAGTTTGTATT

5401GTACACAAATCCAATATAAAATTAGGCTTGAGAGAGAAAATTACTAGTGTGTCGGAAGGA

5461GGACCCGTTGAACTTACAGAAGCAGTTGTTGATGAGTTCATCGAATCAGTTCCAATGGCT

5521GACAGATTACGTAAATTTCGCAATCAATCCAAGAAAAGAAGTAATAAGTATGTAGGTAAG

5581AGAAATGATAATAAGGGTGTGAATAAGGAAAGGAAGCTGTTTGATAAGGTTAGAATTGGG

5641CAGAACTCGGAGTCATCGGACGCCGAGTCTTCTTCGTTTTAACTATGAAGACTAATCTTT

5701TTCTCTTTCTCATCTTTTCACTTCTCCTATCATTATCCTCGGCCGAATTCAGTAAAGGAG

5761AAGAACTTTTCACTGGAGTTGTCCCAATTCTTGTTGAATTAGATGGTGATGTTAATGGGC

5821ACAAATTTTCTGTCAGTGGAGAGGGTGAAGGTGATGCAACATACGGAAAACTTACCCTTA

5881AATTTATTTGCACTACTGGAAAACTACCTGTTCCATGGCCAACACTTGTCACTACTTTCT

5941CTTATGGTGTTCAATGCTTTTCAAGATACCCAGATCATATGAAGCGGCACGACTTCTTCA

6001AGAGCGCCATGCCTGAGGGATACGTGCAGGAGAGGACCATCTTCTTCAAGGACGACGGGA

6061ACTACAAGACACGTGCTGAAGTCAAGTTTGAGGGAGACACCCTCGTCAACAGGATCGAGC

6121TTAAGGGAATCGATTTCAAGGAGGACGGAAACATCCTCGGCCACAAGTTGGAATACAACT

6181ACAACTCCCACAACGTATACATCATGGCCGACAAGCAAAAGAACGGCATCAAAGCCAACT

6241TCAAGACCCGCCACAACATCGAAGACGGCGGCGTGCAACTCGCTGATCATTATCAACAAA

6301ATACTCCAATTGGCGATGGCCCTGTCCTTTTACCAGACAACCATTACCTGTCCACACAAT

6361CTGCCCTTTCGAAAGATCCCAACGAAAAGAGAGACCACATGGTCCTTCTTGAGTTTGTAA

6421CAGCTGCTGGGATTACACATGGCATGGATGAACTATACAAACATGATGAGCTTTAACTCG

6481AGGGGTAGTCAAGATGCATAATAAATAACGGATTGTGTCCGTAATCACACGTGGTGCGTA

6541CGATAACGCATAGTGTTTTTCCCTCCACTTAAATCGAAGGGTTGTGTCTTGGATCGCGCG

6601GGTCAAATGTATATGGTTCATATACATCCGCAGGCACGTAATAAAGCGAGGGGTTCGGGT

6661CGAGGTCGGCTGTGAAACTCGAAAAGGTTCCGGAAAACAAAAAAGAGAGTGGTAGGTAAT

6721AGTGTTAATAATAAGAAAATAAATAATAGTGGTAAGAAAGGTTTGAAAGTTGAGGAAATT

6781GAGGATAATGTAAGTGATGACGAGTCTATCGCGTCATCGAGTACGTTTTAACTATGGCTT

6841ACACAGTTTCCAGTGCCAATCAATTAGTGTATTTAGGTTCTGTATGGGCCGATCCATTAG

6901AGTTACAAAATCTATGTACTTCGGCGTTAGGTAATCAGTTTCAAACACAGCAGGCTAGAA

6961CTACGGTTCAACAGCAGTTCTCTGATGTGTGGAAGACTATACCGACCGCTACAGTTAGAT

7021TTCCCGCTACTGGTTTCAAAGTTTTCCGATATAATGCCGTGCTAGATTCTCTAGTGTCGG

7081CACTTCTCGGAGCCTTTGATACTAGGAATAGGATAATAGAAGTAGAAAATCCGCAAAATC

7141CTACAACTGCCGAGACGCTTGATGCGACGAGGCGGGTAGATGATGCGACGGTGGCCATTA

7201GGGCCAGTATAAGTAACCTCATGAATGAGTTAGTTCGTGGCACGGGAATGTACAATCAAG

7261CTCTGTTCGAGAGCGCGAGTGGACTCACCTGGGCTACAACTCCTTAGACATGATGGTGTA

7321AATAAGTTGGACGAACGTTAAACGTCCGTGGCGAGTACGATAACTCGTAGTGTTTTTCCC

7381TCCACTTAAATCGAAGGGTTGTCGTTAGGATGGAACGCAATTAAATACATGTGTGACGTG

7441TATTTGCGAACGACGTAATTATTTTCAGGGGTTCGAATCCCCCCCGAACCGCGGGTAGCG

7501GCCC

Claims

1.辣椒轻斑驳病毒(Peppermildmottlevirus，PMMoV)的侵染性克隆载体，其特征在于：该侵染性克隆载体由辣椒轻斑驳病毒PMMoV核苷酸全序列融合到带35S启动子和核酶Rz的载体pCB301-CH制备得到，所述的辣椒轻斑驳病毒PMMoV核苷酸全序列如SeqIDNo:16所示。

2.携带辣椒轻斑驳病毒侵染性克隆的农杆菌菌株，其特征在于：该农杆菌菌株由权利要求1所述的导入到农杆菌菌株EHA105获得。

3.根据权利要求1所述的辣椒轻斑驳病毒的侵染性克隆载体的制备方法，其特征在于该方法包括以下的步骤：

1)获得辣椒轻斑驳病毒PMMoV核苷酸全序列；

2)设计引物pCass-CH-PMMoV(+)，pCass-CH-PMMoV(-)，PMMoV3369(+)和引物PMMoV3369(-)；分别以引物对pCass-CH-PMMoV(+)/PMMoV3369(+)和引物对PMMoV3369(-)/pCass-CH-PMMoV(-)分两段扩增PMMoV核苷酸全序列；所述的引物pCass-CH-PMMoV(+)，pCass-CH-PMMoV(-)，PMMoV3369(+)和引物PMMoV3369(-)的基因序列分别为SeqIDNo:5，SeqIDNo:6，SeqIDNo:2，SeqIDNo:3；

3)将纯化的扩增目的片段与经StuI和SmaI双酶切的pCB301-CH载体进行重组反应，然后将连接产物转入大肠杆菌，挑选具有全长插入的克隆，测序筛选出具有正确PMMoV基因组核苷酸全序列的克隆；

4)提取包含PMMoV全长质粒的克隆，获得辣椒轻斑驳病毒的侵染性克隆载体pCB-PMMoV；

5)在成功构建pCB-PMMoV侵染性克隆载体基础上，在PMMoV编码的运动蛋白与外壳蛋白之间插入烟草轻绿花叶病毒(Tobaccomildgreenmosaicvirus，TMGMV)的外壳蛋白基因启动子及外源GFP基因，获得可表达外源基因且具有侵染性的PMMoV侵染性克隆载体pCB-PMMoV-GFP。

4.根据权利要求3所述的辣椒轻斑驳病毒的侵染性克隆载体的制备方法，其特征在于：步骤1)中PMMoV核苷酸全序列获得包括以下的步骤：

1.1)植物总RNA的提取：采用Trizol法提取病叶的总RNA；

1.2)PMMoV核苷酸全序列的扩增：根据GenBank上发表的PMMoV基因组核苷酸全序列，GenBank登录号AB126003，设计引物PMMoV1(+)、PMMoV3369(+)、引物PMMoV3369(-)和PMMoVCOM(-)，引物分别为SeqIDNo:1、SeqIDNo:2、SeqIDNo:3和SeqIDNo:4；分别以引物对PMMoV1(+)/PMMoV3369(-)和引物对PMMoV3369(+)/PMMoVCOM(-)分两段扩增PMMoV核苷酸全序列；扩增的PCR产物纯化后经测序拼接获得PMMoV的核苷酸全序列。

5.根据权利要求4所述的辣椒轻斑驳病毒的侵染性克隆载体的制备方法，其特征在于：步骤1.2)PCR扩增体系为：9μLDEPC水、25μL2×PCRBufferforKODFXNeo、10μL2mMdNTPs、上下游引物(10μM)各1.5μL、2μLcDNA模板、1μLKODFXNeo聚合酶，总反应体系为50μL；各片段的反应条件为:94℃2min；94℃15s，60℃30s，68℃3.5min，35个循环；68℃10min。

6.根据权利要求3所述的辣椒轻斑驳病毒的侵染性克隆载体的制备方法，其特征在于：步骤3)中重组反采用10μL体系反应，其中5×CEMultiSBuffer2μL，StuI和SmaI双酶切线性化克隆载体pCB301-CH120ng，片段p35SPMMoV1-336968ng，片段pPMMoV3369-RZ60ng，Exnase^TMMultiS1μl，最后用ddH₂O调整体系至10μL。

7.根据权利要求3所述的辣椒轻斑驳病毒的侵染性克隆载体的制备方法，其特征在于：步骤5)中pCB-PMMoV-GFP序列获得包括以下的步骤：以获得的PMMoV侵染性克隆载体pCB-PMMoV模板，引物PMMoV-5348NcoI(+)，SeqIDNo:7和PMMoV-MP-TMVGFP(-)，SeqIDNo:8为引物，扩增一条330bp的条带；以p35S-GFP为模板，PMMoV-MP-TMVGFP(+)，SeqIDNo:9和TMGMV-PMMoVCP(-)，SeqIDNo:10进行TMGMV启动子及外源GFP基因的扩增，产物大小约1200bp；以获得的PMMoV侵染性克隆载体pCB-PMMoV为模板，TMGMV-PMMoVCP(+)，SeqIDNo:11和PCASS-CH-PMMoV(-)，SeqIDNo:6为引物，扩增包含PMMoVCP区段及3’-UTR区域，约700bp；然后通过overlapPCR，将这三个片段拼接成1577bp大小的条带；以获得的PMMoV侵染性克隆载体pCB-PMMoV模板，引物P301-PM(+)，SeqIDNo:12和P301-PM(-)，SeqIDNo:13为引物，扩增包含PCB-301-CH载体及部分PMMoV病毒序列的条带；然后通过重组反应将这两个片段拼接形成携带表达外源GFP基因的PMMoV表达载体pCB-PMMoV-GFP。

8.携带外源GFP基因的辣椒轻斑驳病毒的侵染性克隆载体，其特征在于该侵染性克隆载体在辣椒轻斑驳病毒编码的运动蛋白与外壳蛋白之间插入烟草轻绿花叶病毒(Tobaccomildgreenmosaicvirus,TMGMV)的外壳蛋白基因启动子及外源GFP基因，获得可表达外源基因且具有侵染性的PMMoV侵染性克隆载体pCB-PMMoV-GFP；所述的可表达外源GFP蛋白的辣椒轻斑驳病毒PMMoV核苷酸全序列如SeqIDNo:17所示。

9.根据权利要求8所述的携带外源GFP基因的辣椒轻斑驳病毒的侵染性克隆载体的制备方法，其特征在于该方法以获得的PMMoV侵染性克隆载体pCB-PMMoV模板，引物PMMoV-5348NcoI(+)，SeqIDNo:7和PMMoV-MP-TMVGFP(-)，SeqIDNo:8为引物，扩增一条330bp的条带；以p35S-GFP为模板，PMMoV-MP-TMVGFP(+)，SeqIDNo:9和TMGMV-PMMoVCP(-)，SeqIDNo:10进行TMGMV启动子及外源GFP基因的扩增，产物大小约1200bp；以获得的PMMoV侵染性克隆载体pCB-PMMoV为模板，TMGMV-PMMoVCP(+)，SeqIDNo:11和PCASS-CH-PMMoV(-)，SeqIDNo:6为引物，扩增包含PMMoVCP区段及3’-UTR区域，约700bp；然后通过overlapPCR，将这三个片段拼接成1577bp大小的条带；以获得的PMMoV侵染性克隆载体pCB-PMMoV模板，引物P301-PM(+)，SeqIDNo:12和P301-PM(-)，SeqIDNo:13为引物，扩增包含PCB-301-CH载体及部分PMMoV病毒序列的条带；然后通过重组反应将这两个片段拼接形成携带表达外源GFP基因的PMMoV表达载体pCB-PMMoV-GFP。

10.携带表达外源GFP基因的辣椒轻斑驳病毒侵染性克隆pCB-PMMoV-GFP的农杆菌菌株，该农杆菌菌株由权利要求8所述的导入到农杆菌菌株EHA105获得。