CN109234221A - 一种马铃薯x病毒弱毒疫苗及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

一种马铃薯X病毒弱毒疫苗及其制备方法与应用,植物病毒疫苗技术领域。本发明针对目前马铃薯X病毒属病毒弱毒疫苗存在的保护品种受限，易回复突变的问题，通过分子生物学技术手段完全敲除马铃薯X病毒中编码“GGXYXDGTK”氨基酸基序(其中，X为任意一种氨基酸)的核苷酸序列，获得一种改造的弱毒疫苗，缺失该段多肽的改造病毒具有系统侵染植物的能力，且不会引起和健康对照植物相比可分辨的病毒症状。本发明适用于植物弱毒疫苗的开发和利用。

Description

一种马铃薯X病毒弱毒疫苗及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及植物病毒疫苗技术领域，提供了一种马铃薯X病毒弱毒疫苗及其制备方法与应用。

背景技术

利用低致病力(弱毒)的植物病毒来防治高致病力株系在农业上具有重要的应用价值。目前，弱毒株系主要通过以下几种方式获得：

1)从自然环境中筛选获得弱毒株系；例如：REGULES Miguel ARANDASempereRaquel Pedro Jesús Use of twoisolates of pepino mosaic virus to protectagainst infection by the same virus(EP3309256A1)；Schenk MF,Hamelink R,van derVlugt RAA,Vermunt AMW,Kaarsenmaker RC,Stijger,ICCMM.2010,The use ofattenuated isolates of pepino mosaic virus for cross-protection.Europeanjournal of plant pathology,127:249-261。

2)人工改造病毒氨基酸获得弱毒株系。例如：李向东，丛倩倩，王莹，郭兆奎，李现道，马铃薯X病毒弱毒株系的筛选及在交叉保护中的应用(CN 103820400B)；ChewachongGM,Miller SA,Blakeslee JJ,Francis DM,Morris TJ,Qu F.2015.Generation of anattenuated,cross-protective pepino mosaic virus variantthrough alignment-guided mutagenesis of the viral capsid protein.Phytopathology 105:126-134.

上述方法中，从自然界分离的弱毒系可能仅在少数作物品种上具有保护功能，而在其它品种或作物上并不是弱毒株系，而且存在逃逸的风险；人工改造病毒氨基酸获得弱毒株系存在回复突变为强毒株系的可能。

发明内容

针对现有技术制备的马铃薯X病毒属病毒(potexviruses)弱毒疫苗存在的保护品种受限，易回复突变的问题，本发明提供了一种马铃薯X病毒弱毒疫苗及其制备方法与应用。

本发明提供了一种通过敲除马铃薯X病毒中编码“GGXYXDGTK”的核苷酸序列，获得低复制能力、弱毒性的马铃薯X病毒弱毒疫苗的方法。

本发明所述马铃薯X病毒弱毒疫苗为含有改造后的马铃薯X病毒cDNA的侵染性克隆或重组菌，所述改造后的马铃薯X病毒cDNA中编码三基因盒蛋白2的GGXYXDGTK基序的核苷酸序列全部被敲除，所述GGXYXDGTK基序中X为任意一种氨基酸，所述重组菌的宿主菌为农杆菌。

进一步地限定，所述改造后的马铃薯X病毒cDNA序列如SEQ ID NO：1所示。

进一步地限定，所述农杆菌为带有pSOUP辅助质粒的农杆菌GV3101。

进一步地限定，所述侵染性克隆所用的表达载体为pGR107。

本发明还提供了所述马铃薯X病毒弱毒疫苗的制备方法，包括如下步骤：

1)获取马铃薯X病毒基因组全长cDNA；

2)构建马铃薯X病毒弱毒疫苗：对上述全长cDNA中编码三基因盒蛋白2的GGXYXDGTK基序的核苷酸序列进行敲除，构建到表达载体中获得改造后的马铃薯X病毒侵染性克隆；或者将改造后的马铃薯X病毒侵染性克隆转化宿主菌，获得重组菌，即为马铃薯X病毒疫苗，所述宿主菌为农杆菌。

进一步地限定，步骤2)中所述改造后的马铃薯X病毒侵染性克隆的构建方法如下：

a.以带有马铃薯X病毒基因组cDNA的pGR107侵染性克隆为模板，经PCR扩增获得马铃薯X病毒基因组cDNA的3919-5350nt，记为序列A，核苷酸序列如SEQ ID No：2所示；经PCR扩增获得马铃薯X病毒基因组cDNA的5276-6158nt片段，记为序列B，核苷酸序列如SEQ IDNo：3所示；其中，序列A和序列B均全部缺失编码GGXYXDGTK基序的核苷酸，即缺失马铃薯X病毒基因组cDNA 5300-5326nt片段，序列A的3′末端和序列B的5′末端存在48nt的重复序列；

b.将序列A和序列B通过线性PCR反应进行连接；以线性PCR产物为模板，PCR扩增获得序列C，核苷酸序列如SEQ ID No：4所示；

c.用限制性内切酶AvrII和HpaI对带有马铃薯X病毒基因组cDNA的pGR107侵染性克隆进行酶切，回收大小为8892nt的片段，记为序列D；

d.将序列C插入至序列D中，构建完全敲除三基因盒蛋白2中编码GGXYXDGTK基序的核苷酸的马铃薯X病毒突变体，命名为pGR107-TGBp2Δ_52-60，即为侵染性克隆。

更进一步地限定，步骤a中所述序列A扩增用的引物对如SEQ ID No:5和SEQ IDNO：6所示；所述序列B扩增用的引物对如SEQ ID No:7和SEQ ID NO：8所示；步骤b)所述序列C扩增用的引物如SEQ IDNo:5和SEQ ID NO：8所示。

更进一步地限定，步骤d中所述序列C通过Gibson组装的方法插入至序列D中。

本发明还提供了上述马铃薯X病毒弱毒疫苗在交叉保护中的应用，将所述含有改造后的马铃薯X病毒cDNA的重组菌导入植物，使植物接种马铃薯X病毒弱毒疫苗，所述植物为马铃薯X病毒的寄主植物，包括马铃薯、番茄、辣椒、烟草、黄瓜和西瓜。

有益效果

本发明利用一段来自于马铃薯X病毒的9个氨基酸长度的多肽序列，位于马铃薯X病毒属病毒编码的三基因盒蛋白2(Triple-gene-block protein 2，TGB2或TGBp2)中，氨基酸序列为“GGXYXDGTK”(其中，X为任意一种天然氨基酸)，该多肽具有以下特征：1)由马铃薯X病毒的TGBp2基因编码；2)在马铃薯X病毒的TGBp2蛋白中的一致氨基酸序列为“GGXYXDGTK”(其中，X为任意一种天然氨基酸)。

本发明通过分子生物学技术手段完全敲除马铃薯X病毒中编码该段多肽的核苷酸序列而获得的改造病毒具有较未改造前病毒显著低的复制能力；缺失该段多肽的改造病毒具有系统侵染植物的能力，但不能引起和健康对照植物相比可分辨的病毒症状，即可正常侵染植物但不能造成任何病毒症状，并且感染缺失该段多肽的马铃薯X病毒的植物对原始高致病力的病毒具有保护作用，说明缺失该段多肽的马铃薯X病毒具有弱毒疫苗的应用价值。

综上，本发明取得的有益效果如下：

1.本方法采用缺失TGBp2蛋白中的一段氨基酸序列构建马铃薯X病毒弱毒株，相对于过去仅改变1或少数几个氨基酸的方法更加稳定，不会出现回复突变。

2.和自然界筛选的弱毒株相比，本方法构建的马铃薯X病毒弱毒株在本氏烟上不引起任何病毒的症状，也不影响本氏烟的生长、发育、开花以及种子量，因此具有更好的应用潜力。

3.采用相同的策略，本方法可应用于所有现已知的马铃薯X病毒属病毒的弱毒株构建。

附图说明

图1 37种马铃薯X病毒属病毒编码的TGBp2蛋白的“GGXYXDGTK”序列比较。

图2野生型和马铃薯X病毒弱毒疫苗(PVX-TGBp2_Δ52-60)感染本氏烟草6天时的症状比较，左一所示Mock为阴性对照组，左二所示pGR107为阳性对照组，左三所示PVX-TGBp2_Δ52-60为实验组。

图3野生型和马铃薯X病毒弱毒疫苗(PVX-TGBp2_Δ52-60)感染本氏烟草6天时的RT-PCR检测。其中，M为DL5000DNA分子量标准(诺维赞公司)；P为质粒阳性对照；N为健康本氏烟草对照；W为野生型马铃薯X病毒感染叶片，PVX-TGBp2_Δ52-60为本发明制备的弱毒疫苗感染叶片。

图4马铃薯X病毒弱毒疫苗(PVX-TGBp2_Δ52-60)的交叉保护作用。左边是感染马铃薯X病毒弱毒疫苗18天的本氏烟；中间是感染野生型马铃薯X病毒8天的本氏烟；最右边是感染马铃薯X病毒弱毒疫苗8天后再接种野生型马铃薯X病毒8天的本氏烟，图中PVX-TGBp_Δ52-60+：表示感染马铃薯X病毒弱毒疫苗；PVX-TGBp_Δ52-60-：表示未感染马铃薯X病毒弱毒疫苗；PVX+：表示感染野生型马铃薯X病毒；PVX-：表示未感染野生型马铃薯X病毒。

具体实施方式

本发明所述的马铃薯X病毒弱毒疫苗的制备方法是基于马铃薯X病毒编码的TGBp2蛋白中一段9个氨基酸长度多肽的功能，所述的9个氨基酸长度多肽位于马铃薯X病毒属病毒编码的TGBp2蛋白中，一致氨基酸序列为GGXYXDGTK(其中X为任意一种天然氨基酸)。

本发明所述的马铃薯X病毒弱毒疫苗，全部缺失TGBp2蛋白中编码“GGXYXDGTK”(其中，X为任意一种天然氨基酸)的核苷酸序列并造成“GGXYXDGTK”全部缺失，获得的马铃薯X病毒弱毒疫苗复制能力较野生型显著降低，具有系统侵染植物的能力，但不能引起和健康对照植物相比可分辨的病毒症状。

本发明所述的核苷酸敲除采用常用的DNA操作技术，包括但不限于QuickChange快速突变技术、重叠PCR、限制性内切酶酶切、基因片段连接、Gibson组装等常见DNA操作技术，由上述中的一种或多种技术手段联合使用均能够实现马铃薯X病毒全长cDNA中编码TGBp2蛋白GGXYXDGTK基序的核苷酸序列全部敲除。

本发明中所述马铃薯X病毒全长cDNA包括位于3′端的polyA序列，可以先将cDNA序列分段扩增后，克隆到植物真核表达载体pGreen-35S载体上，转化大肠杆菌宿主菌中获得阳性转化子。其中，马铃薯X病毒属全长cDNA位于植物真核启动子下游，全长cDNA的第一个核苷酸处于表达载体中启动子的转录启动位置；全长cDNA的polyA序列与真核终止子序列直接连接。如此，利用启动子定位全长cDNA，重新合成病毒的全长基因组RNA。

本发明交叉保护应用是指利用本发明构建的马铃薯X病毒弱毒疫苗保护植物免受同种的高致病性马铃薯X病毒的感染。

本发明所述的弱毒疫苗接种植物的方法：将获得的真核表达载体构建的弱毒疫苗导入农杆菌，然后通过农杆菌接种法向植物注入具有马铃薯X病毒弱毒疫苗的农杆菌，使植物感染马铃薯X病毒弱毒疫苗。也可利用基因枪法将真核表达载体构建的弱毒疫苗导入植物中，使植物感染马铃薯X病毒弱毒疫苗。

下述实施例中所用材料：

Gent：硫酸庆大霉素(Gentamycin Sulfate)购买自上海生工，货号：A100304。

Tetra：盐酸四环素(Tetracycline hydrochloride)购买自上海生工，货号：A100422。

Rif：利发霉素(Rifampicin)购买自上海生工，货号：A600812。

Kana：硫酸卡那霉素(Kanamycin sulfate)购买自上海生工，货号：A100408。

LB培养基：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L，PH7.5。

LB固体培养基：每升LB液体培养基加15g～20g琼脂粉。

所述引物采用PAGE纯化的高纯度DNA引物，引物为上海生工合成。

Gibson Assembly Master Mix试剂盒购买自NEB Biolabs公司，货号：E2611。

大肠杆菌Trans10感受态细胞购买自全式金生物技术有限公司，货号：CD101。

带pSOUP辅助质粒的农杆菌GV3101购买自南京赛泓瑞生物科技有限公司，货号：WR11485。

所述PCR采用高保真DNA聚合酶，Phanta高保真DNA聚合酶购买自南京诺唯赞生物科技有限公司，货号：P515。

普通TaqDNA聚合酶购买自南京诺唯赞生物科技有限公司，货号：P112。

EasyPure Plasmid MiniPrep Kit试剂盒提取购买自全式金生物技术有限公司，货号：EM101。

EasyPure PCR Purification Kit试剂盒提取购买自全式金生物技术有限公司，货号：EP101。

植物总RNA提取试剂盒购买自天根生化科技(北京)有限公司，货号：DP432。

植物生长箱购买自武汉瑞华仪器设备有限责任公司，货号：AR1200。

其他试剂或仪器如无特殊说明，均可通过现有的商业化途径购买获得。

本发明所述的构建马铃薯X病毒弱毒疫苗的技术方案如下：

1)马铃薯X病毒全长cDNA的获得：马铃薯X病毒是单链正义RNA病毒，必须通过构建全长cDNA侵染性克隆才能进行分子水平的操作，例如插入、缺失或改变指定位置的核苷酸或氨基酸序列。本发明根据目的马铃薯X病毒的全基因组序列，分段克隆马铃薯X病毒的全长cDNA(包括多聚A尾巴，即为polyA)，并插入表达载体中。所述的表达载体可以为原核表达载体或真核植物表达载体。所述的原核表达载体包含原核生物启动子、多克隆位点和大肠杆菌复制必需元件和抗性筛选基因，如原核表达载体pMD20-T载体。所述的植物表达载体包含农杆菌T-DNA左边界序列、农杆菌T-DNA右边界序列、植物真核启动子、马铃薯X病毒全长cDNA、植物真核转录终止子、大肠杆菌和农杆菌复制必需元件和抗性筛选基因，如pGreen-35S载体。本发明采用植物表达载体，pGreen-35S。其中，马铃薯X病毒全长cDNA位于真核启动子之后，更详细地，马铃薯X病毒全长cDNA的第一个核苷酸处于启动子的转录启动位置，马铃薯X病毒全长cDNA的最后的多聚A尾巴与真核终止子序列直接连接。所述的植物表达载体中，农杆菌T-DNA右边界序列位于启动子上游，农杆菌T-DNA左边界序列位于转录终止子下游；获得的马铃薯X病毒侵染克隆转化大肠杆菌宿主菌中，获得阳性转化子，提取的质粒即为含有马铃薯X病毒cDNA侵染性克隆，可作为获取马铃薯X病毒cDNA的模板；

所述：植物表达载体为pGreen-35S载体，由pGreenII(GenBank登录号:EF590266)载体改造而来，其序列记载在含有马铃薯X病毒全长cDNA的侵染性克隆pGR107中(GenBank登录号:AY297842)，该侵染性克隆记载在(Jones L,Hamilton AJ,Voinnet V,Thomas CL,Maule AJ,and Baulcombe DC.(1999)RNA–DNAInteractions and DNAMethylation inPost-Transcriptional Gene Silencing.Plant Cell.11,2291-2301)以及网站：https://www.plantsci.cam.ac.uk/research/davidbaulcombe/methods/vigs。其中，所述的农杆菌T-DNA左边界序列位于2963-2987nt；所述的农杆菌T-DNA右边界序列位于1623-1648nt；所述的真核启动子为花椰菜花叶病毒(Cauliflower mosaic virus，CaMV)35S启动子，位于2055-2489nt；所述的植物真核终止子为NOS终止子，位于2532-2785nt；所述的大肠杆菌和农杆菌复制必需元件的序列，位于1-1622和2988-4588nt。

本发明通过带有马铃薯X病毒PVX基因组cDNA的pGR107侵染性克隆获得马铃薯X病毒cDNA。

2)马铃薯X病毒弱毒疫苗构建：根据步骤1)获得的马铃薯X病毒侵染性克隆序列，用常用DNA操作技术敲除编码TGBp2蛋白GGXYXDGTK基序的核苷酸序列，获得改造后的马铃薯X病毒弱毒侵染性克隆，即为马铃薯X病毒弱毒疫苗，或者将改造后的马铃薯X病毒弱毒侵染性克隆导入农杆菌中，获得阳性转化子，也能够作为马铃薯X病毒弱毒疫苗。所述的该改造采用常用的DNA操作技术，包括但不限于QuickChange快速突变技术，重叠PCR、限制性内切酶酶切、基因片段连接、Gibson组装等常见DNA操作技术，由上述中的一种或多种技术手段联合使用均能够实现对编码“GGXYXDGTK”的核苷酸序列进行改造。所述马铃薯X病毒弱毒疫苗为以编码TGBp2蛋白中“GGXYXDGTK”基序的核苷酸序列全部敲除的马铃薯X病毒的全长cDNA构建的侵染性克隆或含有该侵染性克隆的重组农杆菌。

下文中关于基因核苷酸位置的描述如：马铃薯X病毒基因组3919-3941nt，表示马铃薯X病毒全长cDNA第3919-3941位核苷酸；其他关于某一核苷酸片段位置的描述均以此方式进行描述。

所述的侵染性克隆是指带有目的基因(如本发明所述的改造后的cDNA序列)表达载体或质粒。

实施例1：马铃薯X病毒弱毒疫苗制备。

本实施例所述的马铃薯X病毒弱毒疫苗为含有改造后的马铃薯X病毒cDNA的侵染性克隆或重组菌，所述改造后的马铃薯X病毒cDNA中编码三基因盒蛋白2的GGXYXDGTK基序的核苷酸序列全部被敲除，所述GGXYXDGTK基序中X为任意一种氨基酸，所述重组菌的宿主菌为农杆菌。

具体制备方法如下：

1.获取马铃薯X病毒基因组全长cDNA；本实施例中马铃薯X病毒基因组全长cDNA来自于含有马铃薯X病毒全长cDNA的侵染性克隆pGR107(GenBank登录号:AY297842)。

2.构建马铃薯X病毒弱毒疫苗：

a.根据马铃薯X病毒侵染性克隆pGR107的序列，设计引物如下：

引物1：5′-AAGACTAATGCACAGATTTTCCT-3′(即为马铃薯X病毒基因组3919-3941nt)；

引物2：5′-atttggggagttgtacaagattgcGTGTGGCAAGCTGTGAATGTTGTC-3′(大写部分与马铃薯X病毒基因组5276-5299nt反向互补，小写部分与马铃薯X病毒基因组5327-5350nt反向互补)；

引物3：5′-GACAACATTCACAGCTTGCCACACgcaatcttgtacaactccccaaat-3′(大写部分与马铃薯X病毒基因组5276-5299nt一致，小写部分与马铃薯X病毒基因组5327-5350nt一致)；

引物4：5′-AGGTGGACTGTTGTTAGTTAAC-3′(马铃薯X病毒基因组6137-6158nt反向互补)；

分别用引物1和引物2，引物3和引物4，以pGR107为模版，PCR扩增马铃薯X病毒基因组的3919-5350和5276-6158nt的片段，分别记为序列A(序列如SEQ ID NO：2所示)和序列B(序列如SEQ ID NO：3所示)，其中，序列A和序列B，都全部缺失编码“GGXYXDGTK”基序的核苷酸(即缺失马铃薯X病毒基因组5300-5326nt)，并且序列A的3′末端和序列B的5′末端存在48nt的重复序列。

以上PCR体系均为50μL，包括2×Phanta Max Master Mix 25μL，正反向引物各1μL(10mM)，模版质粒0.5μL(10ng/μL)，其余为灭菌水。以上PCR反应条件均为：95℃预变性3min，进入PCR循环：95℃变性10sec，65℃退火10sec，72℃延伸1min，30个循环；最后72℃延伸7min。

PCR反应后用1％的琼脂糖凝胶电泳检测并回收PCR产物。

b.回收的序列A和序列B用Nanodrop测定浓度后，用灭菌水调节浓度至50ng/μL，进行线性PCR反应，PCR反应体系为20μL，包括2×Phanta Max Master Mix 12.5μL，序列A和序列B各1μL(50ng/μL),其余为灭菌水。线性PCR反应条件为：95℃预变性3min，进入PCR循环：95℃变性10sec，65℃退火10sec，72℃延伸2min，5个循环；最后72℃延伸7min。PCR反应后用1％的琼脂糖凝胶电泳检测并回收PCR产物。

用引物1和引物4，以线性PCR反应产物为模版进行PCR扩增，PCR反应体系为50μL，包括2×PhantaMax Master Mix 25μL，正反向引物各1μL(10mM)，线性PCR产物2μL,其余为灭菌水。PCR反应条件为：95℃预变性3min，进入PCR循环：95℃变性10sec，65℃退火10sec，72℃延伸1.5min，30个循环；最后72℃延伸7min。PCR反应后用1％的琼脂糖凝胶电泳检测并回收PCR产物，扩增的片段记为序列C，序列如SEQ ID NO：4。

以上PCR反应所述PCR反应采用南京诺唯赞生物科技有限公司Phanta高保真DNA聚合酶。

以上PCR反应所述PCR产物回收采用全式金生物技术有限公司的EasyPure PCRPurification Kit试剂盒。

c.用限制性内切酶AvrII和HpaI对pGR107载体进行酶切，酶切采用20μL体系，其中，含有10×CutSmart酶切缓冲液2μL，pGR107质粒10μL(100ng/μL)，AvrII和HpaI各1μL，加灭菌水至20μL。反应条件为37℃，3小时。酶切反应结束后用1％的琼脂糖凝胶电泳检测并回收大小约为8892nt的片段，记为序列D。

d.将序列C用Gibson组装的方法插入至序列D中，构建完全敲除TGBp2蛋白中编码“GGXYXDGTK”基序的核苷酸(马铃薯X病毒基因组5300-5326nt)的马铃薯X病毒突变体，命名为PVX-TGBp2_Δ52-60，该侵染性克隆即为马铃薯X病毒弱毒疫苗。所述的Gibson组装采用NEBBiolabs公司的Gibson AssemblyMaster Mix试剂盒购，并完全按照说明书进行。

或者将构建获得的PVX-TGBp2_Δ52-60侵染性克隆转化带有pSOUP辅助质粒的农杆菌GV3101中，获得重组菌，即为马铃薯X病毒弱毒疫苗。

实施例2：马铃薯X病毒弱毒疫苗侵染效果检测。

对于植物而言，弱毒性通常是指不造成或仅造成轻微的病毒症状，对植物的产量没有或仅有非常小的影响。下面通过实验考察本发明制备的马铃薯X病毒弱毒疫苗的侵染效果。

步骤1：马铃薯X病毒弱毒疫苗接种

用电击转化法将马铃薯X病毒突变体PVX-TGBp2_Δ52-60导入转化带有pSOUP辅助质粒的农杆菌GV3101中，用含有Tetra(终浓度5mg/L)、Rif(终浓度10mg/L)和Kana(终浓度50mg/L)3种抗生素的LB固体培养基在28度培养，再用引物1和引物5：5′-GTTGGTCTCGAAATCGAAGC-3′(马铃薯X病毒基因组4883-4902nt反向互补)进行PCR反应，筛选阳性克隆。

PCR体系为50μL，包括2×Taq Master Mix 25μL，正反向引物各1μL(10mM)，农杆菌0.5μL(10ng/μL)，其余为灭菌水。以上PCR反应条件均为：94℃预变性3min，进入PCR循环：94℃变性30sec，60℃退火20sec，72℃延伸1min，30个循环；最后72℃延伸5min。PCR反应后用1％的琼脂糖凝胶电泳检测，筛选阳性克隆。

上述获得的菌体阳性克隆用至含有Tetra(终浓度5mg/L)、Rif(终浓度10mg/L)和Kana(终浓度50mg/L)3种抗生素的LB液体培养基中培养至O.D.₆₀₀＝1.0，在室温下6000rpm离心1分钟收集菌体，用浸润缓冲液(10mM MES，pH 5.6；10mM MgCl₂；10μM乙酰丁香酮，各浓度均为终浓度)悬浮，再在室温下6000rpm离心1分钟收集菌体，后再次悬浮于浸润缓冲液中，并调节O.D.₆₀₀至0.1，然后用1mL无针头注射器将菌液注射至本氏烟叶片中。

阳性对照组：采用含有野生型马铃薯X病毒侵染性克隆pGR107的农杆菌GV3101，具体接种操作完全同PVX-TGBp2_Δ52-60。

阴性对照组：采用浸润缓冲液，具体接种操作完全同PVX-TGBp2_Δ52-60。

注射后，将本氏烟放回植物生长箱直至阳性对照组发病。本氏烟培养条件为：光周期为18小时光照，6小时黑暗；温度为25℃。

步骤2：马铃薯X病毒弱毒疫苗致病效果分析

注射8天后的弱毒疫苗致病效果(图2)：阳性对照组(左二)，即注射马铃薯X病毒侵染性克隆pGR107的本氏烟，后5天后出现马铃薯X病毒症状，包括植株矮化、叶片皱缩、叶脉明脉等。阴性对照组(左一)，即注射浸润缓冲液的本氏烟，不会出现病毒症状。实验组(左三)，即注射马铃薯X病毒弱毒疫苗PVX-TGBp2_Δ52-60的本氏烟，没有出现病毒症状，本氏烟和阴性对照组生长情况完全一致。

步骤3：马铃薯X病毒弱毒疫苗感染效果分析

浸润8天时，取实验组、阴性对照组和阳性对照组的本氏烟顶部系统叶(各0.1g)，用RNA提取试剂盒提取总RNA，提取步骤完全根据试剂盒提供的说明书进行。各取实验组、阴性对照组和阳性对照组本氏烟提取的1000ng总RNA，用反转录试剂盒以Oligo dT为引物反转成cDNA，实验操作完全根据反转录试剂盒的说明书进行。用引物1和引物5：5′-GCGTTGAGATATGTATTTACTTCC-3′(马铃薯X病毒基因组5429-5452nt反向互补)进行PCR扩增检测马铃薯X病毒弱毒疫苗的侵染效果。PCR体系为50μL，包括2×Phanta Max Master Mix25μL，正反向引物各1μL(10mM)，cDNA 2μL，其余为灭菌水；PCR反应条件为：95℃预变性3min，进入PCR循环：95℃变性10sec，62℃退火10sec，72℃延伸1min，30个循环；最后72℃延伸7min。PCR反应后用1％的琼脂糖凝胶电泳检测，其中被野生型马铃薯X病毒或马铃薯X病毒弱毒疫苗感染的植物可以扩增出一条1500bp左右大小的条带，而健康植物没有(图3)。

实施例3：马铃薯X病毒弱毒疫苗交叉保护验证。

步骤1：接种野生型强毒马铃薯X病毒。

于接种pGR107后有病毒症状的本氏烟叶片，用接种缓冲液(0.01M磷酸钠，pH7.0)以1g植物组织加1mL接种缓冲液的比例在研钵中研磨成组织匀浆，将组织匀浆用机械接种法接种至实例1接种马铃薯X病毒弱毒疫苗并且可在系统叶中检测到马铃薯X病毒弱毒疫苗的本氏烟叶片上，接种后将本氏烟放回植物生长箱观察症状。本氏烟培养条件为：光周期为18小时光照，6小时黑暗；温度为25℃。

步骤2：分析交叉保护效果。

未经弱毒疫苗处理的本氏烟接种野生型强毒马铃薯X病毒本氏烟7天后出现典型的病毒症状(图4中的中间植株)，而接种马铃薯X病毒弱毒疫苗的本氏烟再次接种野生型强毒马铃薯X病毒后都未出现病毒感染的症状，说明马铃薯X病毒弱毒疫苗具有非常高的保护作用(图4中最右边的植株)。

核苷酸序列表

<110> 东北农业大学

<120> 一种马铃薯X病毒弱毒疫苗及其制备方法与应用

<130>

<160> 9

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 6508

<212> DNA

<213> 改造后的马铃薯X病毒cDNA

<400> 1

aaaactaaac catacaccac caacacaacc aaacccacca cgcccaattg ttacacaccc 60

gcttgaaaaa gaaagtttaa caaatggcca aggtgcgcga ggtttaccaa tcttttacag 120

actccaccac aaaaactctc atccaagatg aggcttatag aaacattcgc cccatcatgg 180

aaaaacacaa actagctaac ccttacgctc aaacggttga agcggctaat gatctagagg 240

ggttcggcat agccaccaat ccctatagca ttgaattgca tacacatgca gccgctaaga 300

ccatagagaa taaacttcta gaggtgcttg gttccatcct accacaagaa cctgttacat 360

ttatgtttct taaacccaga aagctaaact acatgagaag aaacccgcgg atcaaggaca 420

ttttccaaaa tgttgccatt gaaccaagag acgtagccag gtaccccaag gaaacaataa 480

ttgacaaact cacagagatc acaacggaaa cagcatacat tagtgacact ctgcacttct 540

tggatccgag ctacatagtg gagacattcc aaaactgccc aaaattgcaa acattgtatg 600

cgaccttagt tctccccgtt gaggcagcct ttaaaatgga aagcactcac ccgaacatat 660

acagcctcaa atacttcgga gatggtttcc agtatatacc aggcaaccat ggtggcgggg 720

cataccatca tgaattcgct catctacaat ggctcaaagt gggaaagatc aagtggaggg 780

accccaagga tagctttctc ggacatctca attacacgac tgagcaggtt gagatgcaca 840

cagtgacagt acagttgcag gaatcgttcg cggcaaacca cttgtactgc atcaggagag 900

gagacttgct cacaccggag gtgcgcactt tcggccaacc tgacaggtac gtgattccac 960

cacagatctt cctcccaaaa gttcacaact gcaagaagcc gattctcaag aaaactatga 1020

tgcagctctt cttgtatgtt aggacagtca aggtcgcaaa aaattgtgac atttttgcca 1080

aagtcagaca attaattaaa tcatctgact tggacaaata ctctgctgtg gaactggttt 1140

acttagtaag ctacatggag ttccttgccg atttacaagc taccacctgc ttctcagaca 1200

cactttctgg tggcttgcta acaaagaccc ttgcaccggt gagggcttgg atacaagaga 1260

aaaagatgca gctgtttggt cttgaggact acgcgaagtt agtcaaagca gttgatttcc 1320

acccggtgga tttttctttc aaagtggaaa cttgggactt cagattccac cccttgcaag 1380

cgtggaaagc cttccgacca agggaagtgt cggatgtaga ggaaatggaa agtttgttct 1440

cagatgggga cttgcttgat tgcttcacaa gaatgccagc ttatgcggta aacgcagagg 1500

aagatttagc tgcaatcagg aaaacgcccg agatggatgt cggtcaagaa gttaaagaac 1560

ctgcaggaga cagaaatcaa tactcaaacc ctgcagaaac tttcctcaac aagctccaca 1620

ggaaacacag tagggaggtg aaacaccagg ccgcaaagaa agctaaacgc ctagctgaaa 1680

tccaggagtc aatgagagct gaaggtgatg ccgaaccaaa tgaaataagc gggggcatgg 1740

gggcaatacc cagcaacgcc gaacttcctg gcacgaatga tgccagacaa gaactcacac 1800

tcccaaccac taaacctgtc cctgcaaggt gggaagatgc ttcattcaca gattctagtg 1860

tggaagagga gcaggttaaa ccccttggaa aagaaaccgt tgaaacagcg acgcaacaag 1920

tcatcgaagg acttccttgg aaacactgga ttcctcaatt aaatgctgtt ggattcaagg 1980

cgctggaaat tcagagggat aggagtggaa caatgatcat gcccatcaca gaaatggtct 2040

ccgggctgga aaaagaggac ttccctgaag gaactccaaa agagttggca cgagaattgt 2100

tcgctatgaa cagaagccct gccaccatcc ctttggacct gcttagagcc agagactacg 2160

gcagtgatgt aaagaacaag agaattggtg ccatcacaaa gacacaggca acgagttggg 2220

gcgaatactt gacaggaaag atagaaagct tgactgagag gaaagttgcg acttgtgtca 2280

ttcatggagc tggaggttct ggaaaaagtc atgccatcca gaaggcattg agagaaattg 2340

gcaagggctc ggacatcact gtagtcctgc cgaccaatga actgcggcta gattggagta 2400

agaaagtgcc taacactgag ccctatatgt tcaagaccta tgaaaaggcg ttaattgggg 2460

gaacaggcag catagtcatc tttgacgatt actcaaaact tcctcccggt tacatagaag 2520

ccttagtctg tttctactct aaaatcaagc taatcattct aacaggagat agcagacaaa 2580

gcgtctacca tgaaactgct gaggacgcct ccatcaggca tttgggacca gcaacagagt 2640

acttctcaaa atactgccga tactatctca atgccacaca ccgcaacaag aaagatcttg 2700

cgaacatgct tggtgtctac agtgagagaa cgggagtcac cgaaatcagc atgagcgccg 2760

agttcttaga aggaatccca actttggtac cctcggatga gaagagaaag ctgtacatgg 2820

gcaccgggag gaatgacacg ttcacatacg ctggatgcca ggggctaact aagccgaagg 2880

tacaaatagt gttggaccac aacacccaag tgtgtagcgc gaatgtgatg tacacggcac 2940

tttctagagc caccgatagg attcacttcg tgaacacaag tgcaaattcc tcggccttct 3000

gggaaaagtt ggacagcacc ccttacctca agactttcct atcagtggtg agagaacaag 3060

cactcaggga gtacgagccg gcagaggcag agccaattca agagcctgag ccccagacac 3120

acatgtgtgt cgagaatgag gagtccgtgc tagaagagta caaagaggaa ctcttggaaa 3180

agtttgacag agagatccac tctgaatccc atggtcattc aaactgtgtc caaactgaag 3240

acacaaccat tcagttgttt tcgcatcaac aagcaaaaga tgagaccctc ctctgggcga 3300

ctatagatgc gcggctcaag accagcaatc aagagacaaa cttccgagaa ttcctgagca 3360

agaaggacat tggggacgtt ctgtttttaa actaccaaaa agctatgggt ttacccaaag 3420

agcgtattcc tttttcccaa gaggtctggg aagcttgtgc ccacgaagta caaagcaagt 3480

acctcagcaa gtcaaagtgc aacttgatca atgggactgt gagacagagc ccagacttcg 3540

atgaaaataa gattatggta ttcctcaagt cgcagtgggt cacaaaggtg gaaaaactag 3600

gtctacccaa gattaagcca ggtcaaacca tagcagcctt ttaccagcag actgtgatgc 3660

tttttggaac tatggctagg tacatgcgat ggttcagaca ggctttccag ccaaaagaag 3720

tcttcataaa ctgtgagacc acgccagatg acatgtctgc atgggccttg aacaactgga 3780

atttcagcag acctagcttg gctaatgact acacagcttt cgaccagtct caggatggag 3840

ccatgttgca atttgaggtg ctcaaagcca aacaccactg cataccagag gaaatcattc 3900

aggcatacat agatattaag actaatgcac agattttcct aggcacgtta tcaattatgc 3960

gcctgactgg tgaaggtccc acttttgatg caaacactga gtgcaacata gcttacaccc 4020

atacaaagtt tgacatccca gccggaactg ctcaagttta tgcaggagac gactccgcac 4080

tggactgtgt tccagaagtg aagcatagtt tccacaggct tgaggacaaa ttactcctaa 4140

agtcaaagcc tgtaatcacg cagcaaaaga agggcagttg gcctgagttt tgtggttggc 4200

tgatcacacc aaaaggggtg atgaaagacc caattaagct ccatgttagc ttaaaattgg 4260

ctgaagctaa gggtgaactc aagaaatgtc aagattccta tgaaattgat ctgagttatg 4320

cctatgacca caaggactct ctgcatgact tgttcgatga gaaacagtgt caggcacaca 4380

cactcacttg cagaacacta atcaagtcag ggagaggcac tgtctcactt tcccgcctca 4440

gaaactttct ttaaccgtta agttacctta gagatttgaa taagatggat attctcatca 4500

gtagtttgaa aagtttaggt tattctagga cttccaaatc tttagattca ggacctttgg 4560

tagtacatgc agtagccgga gccggtaagt ccacagccct aaggaagttg atcctcagac 4620

acccaacatt caccgtgcat acactcggtg tccctgacaa ggtgagtatc agaactagag 4680

gcatacagaa gccaggacct attcctgagg gcaacttcgc aatcctcgat gagtatactt 4740

tggacaacac cacaaggaac tcataccagg cactttttgc tgacccttat caggcaccgg 4800

agtttagcct agagccccac ttctacttgg aaacatcatt tcgagttccg aggaaagtgg 4860

cagatttgat agctggctgt ggcttcgatt tcgagaccaa ctcaccggaa gaagggcact 4920

tagagatcac tggcatattc aaagggcccc tactcggaaa ggtgatagcc attgatgagg 4980

agtctgagac aacactgtcc aggcatggtg ttgagtttgt taagccctgc caagtgacgg 5040

gacttgagtt caaagtagtc actattgtgt ctgccgcacc aatagaggaa attggccagt 5100

ccacagcttt ctacaacgct atcaccaggt caaagggatt gacatatgtc cgcgcagggc 5160

cataggctga ccgctccggt caattctgaa aaagtgtaca tagtattagg tctatcattt 5220

gctttagttt caattacctt tctgctttct agaaatagct taccccacgt cggtgacaac 5280

attcacagct tgccacacgc aatcttgtac aactccccaa atctagggtc acgagtgagt 5340

ctacacaacg gaaagaacgc agcatttgct gccgttttgc tactgacttt gctgatctat 5400

ggaagtaaat acatatctca acgcaatcat acttgtgctt gtggtaacaa tcatagcagt 5460

cattagcact tccttagtga ggactgaacc ttgtgtcatc aagattactg gggaatcaat 5520

cacagtgttg gcttgcaaac tagatgcaga aaccataagg gccattgccg atctcaagcc 5580

actctccgtt gaacggttaa gtttccattg atactcgaaa gaggtcagca ccagctagca 5640

tcgattggcg cgcctggagc ggccgcgtcg accgccgatg aacggttaag tttccattga 5700

tactcgaaag atgtcagcac cagctagcac aacacagccc atagggtcaa ctacctcaac 5760

taccacaaaa actgcaggcg caactcctgc cacagcttca ggcctgttca ctatcccgga 5820

tggggatttc tttagtacag cccgtgccat agtagccagc aatgctgtcg caacaaatga 5880

ggacctcagc aagattgagg ctatttggaa ggacatgaag gtgcccacag acactatggc 5940

acaggctgct tgggacttag tcagacactg tgctgatgta ggatcatccg ctcaaacaga 6000

aatgatagat acaggtccct attccaacgg catcagcaga gctagactgg cagcagcaat 6060

taaagaggtg tgcacactta ggcaattttg catgaagtat gccccagtgg tatggaactg 6120

gatgttaact aacaacagtc cacctgctaa ctggcaagca caaggtttca agcctgagca 6180

caaattcgct gcattcgact tcttcaatgg agtcaccaac ccagctgcca tcatgcccaa 6240

agaggggctc atccggccac cgtctgaagc tgaaatgaat gctgcccaaa ctgctgcctt 6300

tgtgaagatt acaaaggcca gggcacaatc caacgacttt gccagcctag atgcagctgt 6360

cactcgaggt cgtatcactg gaacaacaac cgctgaggct gttgtcactc taccaccacc 6420

ataactacgt ctacataacc gacgcctacc ccagtttcat agtattttct ggtttgattg 6480

tatgaataat ataaataaaa aaaaaaaa 6508

<210> 2

<211> 1405

<212> DNA

<213> 序列A

<400> 2

aagactaatg cacagatttt cctaggcacg ttatcaatta tgcgcctgac tggtgaaggt 60

cccacttttg atgcaaacac tgagtgcaac atagcttaca cccatacaaa gtttgacatc 120

ccagccggaa ctgctcaagt ttatgcagga gacgactccg cactggactg tgttccagaa 180

gtgaagcata gtttccacag gcttgaggac aaattactcc taaagtcaaa gcctgtaatc 240

acgcagcaaa agaagggcag ttggcctgag ttttgtggtt ggctgatcac accaaaaggg 300

gtgatgaaag acccaattaa gctccatgtt agcttaaaat tggctgaagc taagggtgaa 360

ctcaagaaat gtcaagattc ctatgaaatt gatctgagtt atgcctatga ccacaaggac 420

tctctgcatg acttgttcga tgagaaacag tgtcaggcac acacactcac ttgcagaaca 480

ctaatcaagt cagggagagg cactgtctca ctttcccgcc tcagaaactt tctttaaccg 540

ttaagttacc ttagagattt gaataagatg gatattctca tcagtagttt gaaaagttta 600

ggttattcta ggacttccaa atctttagat tcaggacctt tggtagtaca tgcagtagcc 660

ggagccggta agtccacagc cctaaggaag ttgatcctca gacacccaac attcaccgtg 720

catacactcg gtgtccctga caaggtgagt atcagaacta gaggcataca gaagccagga 780

cctattcctg agggcaactt cgcaatcctc gatgagtata ctttggacaa caccacaagg 840

aactcatacc aggcactttt tgctgaccct tatcaggcac cggagtttag cctagagccc 900

cacttctact tggaaacatc atttcgagtt ccgaggaaag tggcagattt gatagctggc 960

tgtggcttcg atttcgagac caactcaccg gaagaagggc acttagagat cactggcata 1020

ttcaaagggc ccctactcgg aaaggtgata gccattgatg aggagtctga gacaacactg 1080

tccaggcatg gtgttgagtt tgttaagccc tgccaagtga cgggacttga gttcaaagta 1140

gtcactattg tgtctgccgc accaatagag gaaattggcc agtccacagc tttctacaac 1200

gctatcacca ggtcaaaggg attgacatat gtccgcgcag ggccataggc tgaccgctcc 1260

ggtcaattct gaaaaagtgt acatagtatt aggtctatca tttgctttag tttcaattac 1320

ctttctgctt tctagaaata gcttacccca cgtcggtgac aacattcaca gcttgccaca 1380

cgcaatcttg tacaactccc caaat 1405

<210> 3

<211> 856

<212> DNA

<213> 序列B

<400> 3

gacaacattc acagcttgcc acacgcaatc ttgtacaact ccccaaatct agggtcacga 60

gtgagtctac acaacggaaa gaacgcagca tttgctgccg ttttgctact gactttgctg 120

atctatggaa gtaaatacat atctcaacgc aatcatactt gtgcttgtgg taacaatcat 180

agcagtcatt agcacttcct tagtgaggac tgaaccttgt gtcatcaaga ttactgggga 240

atcaatcaca gtgttggctt gcaaactaga tgcagaaacc ataagggcca ttgccgatct 300

caagccactc tccgttgaac ggttaagttt ccattgatac tcgaaagagg tcagcaccag 360

ctagcatcga ttcccgggtc gaccgccgat gaacggttaa gtttccattg atactcgaaa 420

gatgtcagca ccagctagca caacacagcc catagggtca actacctcaa ctaccacaaa 480

aactgcaggc gcaactcctg ccacagcttc aggcctgttc actatcccgg atggggattt 540

ctttagtaca gcccgtgcca tagtagccag caatgctgtc gcaacaaatg aggacctcag 600

caagattgag gctatttgga aggacatgaa ggtgcccaca gacactatgg cacaggctgc 660

ttgggactta gtcagacact gtgctgatgt aggatcatcc gctcaaacag aaatgataga 720

tacaggtccc tattccaacg gcatcagcag agctagactg gcagcagcaa ttaaagaggt 780

gtgcacactt aggcaatttt gcatgaagta tgccccagtg gtatggaact ggatgttaac 840

taacaacagt ccacct 856

<210> 4

<211> 2213

<212> DNA

<213> 序列C

<400> 4

aagactaatg cacagatttt cctaggcacg ttatcaatta tgcgcctgac tggtgaaggt 60

cccacttttg atgcaaacac tgagtgcaac atagcttaca cccatacaaa gtttgacatc 120

ccagccggaa ctgctcaagt ttatgcagga gacgactccg cactggactg tgttccagaa 180

gtgaagcata gtttccacag gcttgaggac aaattactcc taaagtcaaa gcctgtaatc 240

acgcagcaaa agaagggcag ttggcctgag ttttgtggtt ggctgatcac accaaaaggg 300

gtgatgaaag acccaattaa gctccatgtt agcttaaaat tggctgaagc taagggtgaa 360

ctcaagaaat gtcaagattc ctatgaaatt gatctgagtt atgcctatga ccacaaggac 420

tctctgcatg acttgttcga tgagaaacag tgtcaggcac acacactcac ttgcagaaca 480

ctaatcaagt cagggagagg cactgtctca ctttcccgcc tcagaaactt tctttaaccg 540

ttaagttacc ttagagattt gaataagatg gatattctca tcagtagttt gaaaagttta 600

ggttattcta ggacttccaa atctttagat tcaggacctt tggtagtaca tgcagtagcc 660

ggagccggta agtccacagc cctaaggaag ttgatcctca gacacccaac attcaccgtg 720

catacactcg gtgtccctga caaggtgagt atcagaacta gaggcataca gaagccagga 780

cctattcctg agggcaactt cgcaatcctc gatgagtata ctttggacaa caccacaagg 840

aactcatacc aggcactttt tgctgaccct tatcaggcac cggagtttag cctagagccc 900

cacttctact tggaaacatc atttcgagtt ccgaggaaag tggcagattt gatagctggc 960

tgtggcttcg atttcgagac caactcaccg gaagaagggc acttagagat cactggcata 1020

ttcaaagggc ccctactcgg aaaggtgata gccattgatg aggagtctga gacaacactg 1080

tccaggcatg gtgttgagtt tgttaagccc tgccaagtga cgggacttga gttcaaagta 1140

gtcactattg tgtctgccgc accaatagag gaaattggcc agtccacagc tttctacaac 1200

gctatcacca ggtcaaaggg attgacatat gtccgcgcag ggccataggc tgaccgctcc 1260

ggtcaattct gaaaaagtgt acatagtatt aggtctatca tttgctttag tttcaattac 1320

ctttctgctt tctagaaata gcttacccca cgtcggtgac aacattcaca gcttgccaca 1380

cgcaatcttg tacaactccc caaatctagg gtcacgagtg agtctacaca acggaaagaa 1440

cgcagcattt gctgccgttt tgctactgac tttgctgatc tatggaagta aatacatatc 1500

tcaacgcaat catacttgtg cttgtggtaa caatcatagc agtcattagc acttccttag 1560

tgaggactga accttgtgtc atcaagatta ctggggaatc aatcacagtg ttggcttgca 1620

aactagatgc agaaaccata agggccattg ccgatctcaa gccactctcc gttgaacggt 1680

taagtttcca ttgatactcg aaagaggtca gcaccagcta gcatcgattc ccgggtcgac 1740

cgccgatgaa cggttaagtt tccattgata ctcgaaagat gtcagcacca gctagcacaa 1800

cacagcccat agggtcaact acctcaacta ccacaaaaac tgcaggcgca actcctgcca 1860

cagcttcagg cctgttcact atcccggatg gggatttctt tagtacagcc cgtgccatag 1920

tagccagcaa tgctgtcgca acaaatgagg acctcagcaa gattgaggct atttggaagg 1980

acatgaaggt gcccacagac actatggcac aggctgcttg ggacttagtc agacactgtg 2040

ctgatgtagg atcatccgct caaacagaaa tgatagatac aggtccctat tccaacggca 2100

tcagcagagc tagactggca gcagcaatta aagaggtgtg cacacttagg caattttgca 2160

tgaagtatgc cccagtggta tggaactgga tgttaactaa caacagtcca cct 2213

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 引物1

<400> 5

aagactaatg cacagatttt cct 23

<210> 6

<211> 48

<212> DNA

<213> 引物2

<400> 6

atttggggag ttgtacaaga ttgcgtgtgg caagctgtga atgttgtc 48

<210> 7

<211> 48

<212> DNA

<213> 引物3

<400> 7

gacaacattc acagcttgcc acacgcaatc ttgtacaact ccccaaat 48

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 引物4

<400> 8

aggtggactg ttgttagtta ac 22

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 引物5

<400> 9

gcgttgagat atgtatttac ttcc 24

Claims (10)

1.一种马铃薯X病毒弱毒疫苗，其特征在于，为含有改造后的马铃薯X病毒cDNA的侵染性克隆或重组菌，所述改造后的马铃薯X病毒cDNA中编码三基因盒蛋白2的GGXYXDGTK基序的核苷酸序列全部被敲除，所述GGXYXDGTK基序中X为任意一种氨基酸，所述重组菌的宿主菌为农杆菌。

2.根据权利要求1所述的马铃薯X病毒弱毒疫苗，其特征在于，所述改造后的马铃薯X病毒cDNA序列如SEQ ID NO：1所示。

3.根据权利要求1所述的马铃薯X病毒弱毒疫苗，其特征在于，所述农杆菌为带有pSOUP辅助质粒的农杆菌GV3101。

4.根据权利要求1所述的马铃薯X病毒弱毒疫苗，其特征在于，所述侵染性克隆所用的表达载体为pGR107。

5.权利要求1-4任意一项所述的马铃薯X病毒弱毒疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)获取马铃薯X病毒基因组全长cDNA；

2)构建马铃薯X病毒弱毒疫苗：对上述全长cDNA中编码三基因盒蛋白2的GGXYXDGTK基序的核苷酸序列进行敲除，构建到表达载体中获得改造后的马铃薯X病毒侵染性克隆；或者将改造后的马铃薯X病毒侵染性克隆转化宿主菌，获得重组菌，即为马铃薯X病毒疫苗；所述宿主菌为农杆菌。

6.根据权利要求5所述的马铃薯X病毒弱毒疫苗的制备方法，其特征在于，步骤2)中所述改造后的马铃薯X病毒侵染性克隆的构建方法如下：

a.以带有马铃薯X病毒基因组cDNA的pGR107侵染性克隆为模板，经PCR扩增获得马铃薯X病毒基因组cDNA的3919-5350nt，记为序列A，核苷酸序列如SEQ ID No：2所示；经PCR扩增获得马铃薯X病毒基因组cDNA的5276-6158nt片段，记为序列B，核苷酸序列如SEQ ID No：3所示；其中，序列A和序列B均全部缺失编码GGXYXDGTK基序的核苷酸，即缺失马铃薯X病毒基因组cDNA 5300-5326 nt片段，序列A的3′末端和序列B的5′末端存在48nt的重复序列；

b.将序列A和序列B通过线性PCR反应进行连接；以线性PCR产物为模板，PCR扩增获得序列C，核苷酸序列如SEQ ID No：4所示；

c.用限制性内切酶AvrII和HpaI对带有马铃薯X病毒基因组cDNA的pGR107侵染性克隆进行酶切，回收大小为8892nt的片段，记为序列D；

d.将序列C插入至序列D中，构建完全敲除三基因盒蛋白2中编码GGXYXDGTK基序的核苷酸的马铃薯X病毒突变体，命名为PVX-TGBp2Δ_52-60，即为侵染性克隆。

7.根据权利要求6所述的马铃薯X病毒弱毒疫苗的制备方法，其特征在于，步骤a中所述序列A扩增用的引物对如SEQ ID No:5和SEQ ID NO：6所示；所述序列B扩增用的引物对如SEQ ID No:7和SEQ ID NO：8所示；步骤b)所述序列C扩增用的引物如SEQ ID No:5和SEQ IDNO：8所示。

8.根据权利要求6所述的马铃薯X病毒弱毒疫苗的制备方法，其特征在于，步骤d中所述序列C通过Gibson组装的方法插入至序列D中。

9.权利要求1-4任意一项所述的马铃薯X病毒弱毒疫苗在交叉保护中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，将所述含有改造后的马铃薯X病毒cDNA的重组菌导入植物，使植物接种马铃薯X病毒弱毒疫苗，所述植物为马铃薯X病毒的寄主植物，包括马铃薯、番茄、辣椒、烟草、黄瓜和西瓜。