CN110885797B - 一种抗黄瓜花叶病毒的弱毒疫苗、制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及植物抗病毒基因工程领域，公开了一种抗黄瓜花叶病毒的弱毒疫苗、制备方法及其应用。抗黄瓜花叶病毒的弱毒疫苗以TVBMV弱毒突变体为基础，TVBMV弱毒突变体中嵌入了可诱导对黄瓜花叶病毒产生交叉保护的有效基因片段，所述的有效基因片段包括黄瓜花叶病毒的2b基因。所述的2b基因的核苷酸序列如Seq ID No.19所示。本发明的抗黄瓜花叶病毒的弱毒疫苗作用稳定，可以起到有效的交叉保护作用，显著减轻植物受黄瓜花叶病毒强毒株系感染后的伤害，延迟植物发病，大大减少损失。

Description

一种抗黄瓜花叶病毒的弱毒疫苗、制备方法及其应用

技术领域

本发明属于植物抗病毒基因工程领域，具体地说，涉及一种抗黄瓜花叶病毒的弱毒疫苗、制备方法及其应用。

背景技术

病毒病是作物上的重要病害，给农业生产造成巨大损失。由于作物病毒病种类多，传播途径复杂，生产上没有免疫或高抗病毒病的品种，市场上又没有对病毒病特效的药剂，因而病毒病的防治非常困难。

烟草病毒病一直是制约我国烟叶生产的重要因素。目前生产上的烟草主栽品种对病毒病的抗性都不理想，烟草病毒病的防治主要依赖农业防治和化学防治。但生产中没有针对病毒病的特效药剂，通过杀灭传毒昆虫来防治烟草病毒病的效果很差，而且农药的大量应用也不符合烟叶生产可持续发展的要求。利用弱毒株系保护植物免受强毒株系的侵染和危害(交叉保护)是防治病毒病非常有效的手段，在许多作物病毒病的防治中取得了成功。最近几年，交叉保护受到了越来越多的关注。交叉保护是指植株受弱毒株系侵染后，免受后继的病毒强毒株系侵染的现象，已经在许多作物病毒病的防治中取得了成功。而限制交叉保护广泛应用的关键因素是一是目前可用的弱毒株系种类不多，应用不方便，二是已发现的弱毒株系都是自然存在或人工诱变产生的，可能只在个别甚至是一个氨基酸位点发生了突变。这些弱毒株系或突变体在用于防治病毒病时有突变为强毒株系的风险。

黄瓜花叶病毒(CMV)是一种非常严重的病毒病害，病毒可以到达除生长点以外的任何部位。黄瓜花叶病毒是寄主范围最多、分布最广、最具经济重要性的植物病毒之一。全世界所有烟草种植区均有该病毒的分布和危害。在农业生产中，黄瓜花叶病毒会对烟草、辣椒、马铃薯等茄科作物造成严重的损失。因此，急需能够起到有效交叉保护作用的稳定的弱毒疫苗来防治黄瓜花叶病毒。

有鉴于此特提出本发明。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于克服现有技术的不足，提供一种抗黄瓜花叶病毒的弱毒疫苗、制备方法及其应用。本发明的抗黄瓜花叶病毒的弱毒疫苗作用稳定，可以起到有效的交叉保护作用，显著减轻植物受黄瓜花叶病毒强毒株系感染后的伤害，延迟植物发病，大大减少损失。

为解决上述技术问题，本发明采用技术方案的基本构思是：

本发明的第一目的是提供一种抗黄瓜花叶病毒的弱毒疫苗，弱毒疫苗以TVBMV弱毒突变体为基础，TVBMV弱毒突变体中嵌入了可诱导对黄瓜花叶病毒产生交叉保护的有效基因片段，所述的有效基因片段包括黄瓜花叶病毒的2b基因。

本发明以自主构建的烟草脉带花叶病毒(Tobacco vein banding mosaic virus，TVBMV)突变体为基础，该突变体在接种植物后不会引起可见症状，不会由蚜虫传播，使用安全。通过RT-PCR、酶切连接技术将黄瓜花叶病毒(CMV)的不同基因片段连入TVBMV突变体获得嵌合体病毒，也就是弱毒疫苗。然后将弱毒疫苗接种植物，接种15天后再用黄瓜花叶病毒(CMV)强毒株系侵染植物。结果意外地发现CMV的2b基因片段可延迟烟草发病，减轻植株感染病毒病后的损失。

进一步的方案，所述的2b基因的核苷酸序列如Seq ID No.19所示。

进一步的方案，所述的TVBMV弱毒突变体包括烟草脉带花叶病毒HN39的基因组，基因组的5’末端连接有35S启动子；且基因组的HC-Pro氨基酸序列中含有突变，至少第52位的精氨酸突变为谷氨酸。

利用反向遗传学技术，明确了TVBMV中的HC-Pro调控TVBMV致病力、协生和抑制RNA沉默的氨基酸。并在这些位点引入突变，获得了含有多个氨基酸突变、不能蚜传、与CMV无协生作用的TVBMV弱毒突变体。这些突变体不易发生回复突变，使用安全，对野生型TVBMV有良好的交叉保护效果。

进一步的方案，基因组的HC-Pro氨基酸序列中含有的突变还包括：第198位的天冬氨酸突变为赖氨酸。

进一步的方案，基因组的HC-Pro氨基酸序列中含有的突变还包括：第250位的异亮氨酸突变为天冬氨酸。

进一步的方案，基因组的HC-Pro氨基酸序列中含有的突变还包括：251位的谷氨酰胺突变为谷氨酸。

本发明的第二目的是提供一种如上任一方案所述的抗黄瓜花叶病毒的弱毒疫苗的制备方法，包括以下步骤：

(1)构建TVBMV弱毒突变体；

(2)获得可诱导对黄瓜花叶病毒产生交叉保护的2b基因片段；

(3)将得到的2b基因片段插入TVBMV弱毒突变体，获得弱毒疫苗。

进一步的方案，以黄瓜花叶病毒的基因组为模板，利用PCR技术扩增得到2b基因片段，然后插入到TVBMV弱毒突变体的多克隆位点中，获得含有2b基因片段的弱毒疫苗。

进一步的方案，通过农杆菌浸润法将获得的抗黄瓜花叶病毒的弱毒疫苗接种到寄主植物，寄主植物生长正常。

进一步的方案，在接种所述的抗黄瓜花叶病毒的弱毒疫苗到寄主植物后第15天接种黄瓜花叶病毒强毒株系，测定交叉保护效果，保护效率达到75％。

本发明的第三目的是提供一种含有如上任一方案所述的抗黄瓜花叶病毒的弱毒疫苗的重组菌；

优选的，所述的重组菌包括转入了弱毒疫苗的农杆菌。

本发明的第四目的是提供一种如上任一方案所述的抗黄瓜花叶病毒的弱毒疫苗在防治黄瓜花叶病毒强毒株系侵染植物方面的应用；

优选的，所述的植物为双子叶植物；

优选的，所述的植物为烟草。

本发明的弱毒疫苗的制备及应用的具体过程包括：

A.嵌合体病毒的获得：通过PCR技术获得黄瓜花叶病毒的各基因片段，以自主构建烟草脉带花叶病毒TVBMV弱毒突变体为基础，利用其中多克隆位点通过酶切连接技术将病毒各基因片段分别连接到TVBMV弱毒突变体，获得嵌合体病毒，或称为单联弱毒疫苗。

B.有效基因片段的筛选：通过农杆菌浸润法将A中获得的弱毒疫苗接种到寄主植物普通烟NC89，观察这些弱毒疫苗所致症状的变化，筛选能诱导交叉保护效果的基因片段。

C.交叉保护效果测定：预先用单联弱毒疫苗接种烟草，15天后分别接种CMV强毒株系，观察弱毒疫苗对强毒株系的保护效果。

采用上述技术方案后，本发明与现有技术相比具有以下有益效果：

1、本发明的弱毒疫苗可以起到有效的交叉保护作用，显著减轻植物受黄瓜花叶病毒强毒株系感染后的伤害，延迟植物发病，大大减少损失。

2、本发明的带有2b基因片段的弱毒疫苗可以保护烟草免受CMV强毒株的危害，保护效率达到75％。

3、本发明的弱毒疫苗采用自主构建的TVBMV弱毒突变体，并在该TVBMV弱毒突变体基础上插入了可诱导对黄瓜花叶病毒产生交叉保护的有效基因片段，因此弱毒疫苗并非自然存在或人工诱变产生，不容易回复突变，作用稳定，有利于大规模应用。

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的描述。

附图说明

附图作为本发明的一部分，用来提供对本发明的进一步的理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，但不构成对本发明的不当限定。显然，下面描述中的附图仅仅是一些实施例，对于本领域普通技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他附图。在附图中：

图1为TVBMV基因组片段扩增示意图；

图2为pCamTVBMV基因组结构示意图；

图3为接种后第15天，含有不同基因片段的弱毒疫苗对CMV强毒株系的防治保护效果。

需要说明的是，这些附图和文字描述并不旨在以任何方式限制本发明的构思范围，而是通过参考特定实施例为本领域技术人员说明本发明的概念。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例一多位点TVBMV弱毒突变体的构建

1、烟草脉带花叶病毒侵染性克隆的构建

以烟草脉带花叶病毒的RNA为模板，用随机引物进行反转录。根据现有烟草脉带花叶病毒全基因组的限制性酶切图谱，可分三部分扩增，酶切后装配为TVBMV全长cDNA克隆。首先，通过Overlap-PCR将35S启动子融合到TVBMV5′非翻译区到HC-pro基因Nru I酶切位点这一片段的上游，发明人将该片段命名为p35S-HC；PCR扩增HC-pro基因Nru I酶切位点到6K2 Xho I酶切位点之间的这一片段，发明人将该片段命名为pHC-6K2；PCR扩增6K2 Xho I酶切位点到ploy(A)尾巴这一片段，发明人将该片段命名为p6K2-polyA(如图1所示)。

cDNA合成所用反转录酶为Moloney murine leukaemia virus reversetranscriptase(Promega)；以植物总RNA为模板，以随机引物为反转录引物进行反转录。

以所得反转录产物为模板和相应的引物进行PCR扩增。PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳。切胶回收后获得p35S-HC₂₁₁₀，pHC₂₁₁₁-6K2₆₀₇₅和p6K2₆₀₇₆-polyA三个片段，将三个片段连接后用SbfI和Sma I双酶切后0.8％琼脂糖凝胶电泳，回收，连接到农杆菌介导的表达载体pCAMBIA0390，发明人将该策略构建的侵染性克隆命名为pCamTVBMV(如图2所示)。

2、TVBMV弱毒突变体的构建

获得烟草脉带花叶病毒侵染性克隆后，通过在HC-Pro序列中关键位点进行突变，获得TVBMV弱毒突变体，具体方法如下：

设计突变引物，根据Liu等(2008)的方法，对烟草脉带花叶病毒HC-Pro的保守氨基酸位点进行定点突变，突变的引物名称及序列如表1中所示。

表1 TVBMV HC-Pro突变引物名称及序列

其中，引物1和引物2定点突变HC-Pro氨基酸序列的52位氨基酸，由精氨酸突变为谷氨酸；引物3和引物4定点突变HC-Pro氨基酸序列的198位氨基酸，由天冬氨酸突变为赖氨酸；引物5和引物6定点突变HC-Pro氨基酸序列的250位和251位氨基酸，第250位的异亮氨酸突变为天冬氨酸，251位的谷氨酰胺突变为谷氨酸。

用pCamTVBMV为模板，PCR突变体系：5×PCR Buffer 10μL，dNTP(10mM)1μL，突变引物F(10μM)1μL，突变引物R(10μM)1μL，模板质粒10ng，Phusion DNA聚合酶0.3μL，ddH₂O补齐到50μL。

PCR突变程序：98℃/30sec；98℃/10sec，Tmno+3℃/20sec，72℃/5min，20个循环；98℃/10sec；Tmpp/20sec；72℃/15min；4℃保存。

突变PCR结束后，每一个反应体系加入1μL Dpn I，充分混匀后，于37℃消解4h。

PCR反应体系用Dpn I处理完后，加入125μL无水乙醇(2.5×体积)和5μL 3M NaAcpH8.0，混匀后沉淀过夜；12000r/min，10min，弃上清；1mL 75％乙醇洗涤沉淀，弃上清；干燥沉淀，10μL ddH2O溶解沉淀。

突变沉淀产物转化大肠杆菌，将转化后的菌体均匀涂在含有X-gal和IPTG的Amp抗生素的LB平板上，挑选单菌落进行培养，提取质粒进行测序，测序正确则获得四个位点突变的TVBMV弱毒突变体。

3、TVBMV弱毒突变体致病力研究

将获得的突变质粒转入农杆菌中，经菌落PCR验证后，获得重组菌。然后挑单斑接种于含有卡那霉素(50μg/mL)、利福霉素(50μg/mL)、四环素(50μg/mL)的液体LB培养基中。取500μL菌液加至5mL含10mmol/L 2-(N-吗啉)-乙基磺酸(MES)和20μmol/L乙酰丁香酮(AS)及上述三种抗生素的LB培养基中，28℃振荡培养至对数生长期。

离心收集菌体并重新悬浮于10mmol/L MgCl₂，10mmol/L MES，150μmol/L AS中，调整浓度使其OD₆₀₀为0.5左右，室温静置3小时。取5mL一次性注射器，去掉针头吸取农杆菌菌液，从普通烟草(5－6周龄或4－6片真叶)叶片背面浸润。每株浸润2片叶。浸润的植株置于23℃光照培养箱中培养(16小时光照/8小时黑暗交替)。

选取多株6周左右的普通烟NC89，接种TVBMV弱毒突变体，接种15天后发现烟草没有表现出症状。说明该TVBMV弱毒突变体在接种植物后不会引起可见症状，不会由蚜虫传播，使用安全。

实施例二黄瓜花叶病毒相关基因片段的扩增及弱毒疫苗的构建

1、黄瓜花叶病毒相关基因片段的扩增

以CMV-QZ基因组为模板，利用RT-PCR进行扩增各基因片段。本发明所提供的实施例，均按照常规实验条件，其中所采用的引物序列如下表：

表2 CMV基因片段扩增引物序列

其中，引物1和2应用于扩增CMV的1a区域，引物3和4应用于扩增CMV的2a区域，引物5和6应用于扩增CMV的2b区域，引物7和8应用于扩增CMV的MP区域，引物9和10应用于扩增CMV的CP区域。扩增获得的1a基因的核苷酸序列如Seq ID No.17所示，2a基因的核苷酸序列如Seq ID No.18所示，2b基因的核苷酸序列如Seq ID No.19所示，MP基因的核苷酸序列如Seq ID No.20所示，CP基因的核苷酸序列如Seq ID No.21所示。

以CMV-QZ为模板，利用RT-PCR进行扩增其各基因片段，所用聚合酶为Phusion高保真聚合酶(Finnzymes)。

PCR反应体系如下：

2、弱毒疫苗的构建

回收的各基因的目的片段和TVBMV弱毒突变体，分别用Xba I和Pac I进行双酶切。酶切体系及程序为：

反应组份加入体积为：

TVBMV弱毒突变体和基因片段的连接，酶切产物经凝胶回收后，按照载体与片段分子数的比例(1：3-1：10)进行连接。

连接体系和方法如下：

各组分混匀后16℃连接过夜。转化大肠杆菌DH5α，连接后质粒经测序验证，获得嵌合体病毒。

实施例三：嵌合体病毒接种植物

将实施例二中获得的嵌合体病毒转化农杆菌GV3101。经菌落PCR验证后，获得重组菌。然后挑单斑接种于含有卡那霉素(50μg/mL)、利福霉素(50μg/mL)、四环素(50μg/mL)的液体LB培养基中。取500μL菌液加至5mL含10mmol/L 2-(N-吗啉)-乙基磺酸(MES)和20μmol/L乙酰丁香酮(AS)及上述三种抗生素的LB培养基中，28℃振荡培养至对数生长期。

离心收集菌体并重新悬浮于10mmol/L MgCl₂，10mmol/L MES，150μmol/L AS中，调整浓度使其OD₆₀₀为0.5左右，室温静置3小时。取5mL一次性注射器，去掉针头吸取农杆菌菌液，从普通烟草(5－6周龄或4－6片真叶)叶片背面浸润。每株浸润2片叶。浸润的植株置于23℃光照培养箱中培养(16小时光照/8小时黑暗交替)。

试验例交叉保护效果测定

将弱毒疫苗预先接种普通烟15天后，摩擦接种CMV的病汁液，比较不同片段介导的交叉保护效果。

具体方法包括：

选取6周左右的普通烟NC89，分为6组，每组6棵。第一组为Mock组，仅接种TVBMV弱毒突变体，不携带基因片段。从第二组到第六组分别依次接种携带黄瓜花叶病毒的1a基因、2a基因、2b基因、MP基因和CP基因的单联弱毒疫苗。

接种15天后，6个组的普通烟NC89分别接种黄瓜花叶病毒的强毒株系。

攻毒后15天观察，结果如图3所示：

1、预先接种不连接其它病毒片段TVBMV弱毒突变体的植株(Mock组)，上部叶片表现为明显的畸形症状，接种的20棵植株全部发病。

2、预先接种了带有黄瓜花叶病毒(CMV)的1a、2a、MP和CP基因片段的弱毒疫苗的烟草的上部叶片均不同程度表现出叶片狭长畸形的症状。

3、预先接种了带有黄瓜花叶病毒(CMV)的2b基因片段的弱毒疫苗的烟草长势正常或发病较轻，未出现明显叶片畸形的现象。

将以上试验重复三次，分别观察，记录结果。

将三次重复实验烟草发病率结果进行汇总，结果表明：

预先接种了带有黄瓜花叶病毒(CMV)的1a、2a、MP和CP基因片段的弱毒疫苗的烟草表现出较高的发病率，发病率达到70％-90％，保护效率在10％-30％。

预先接种了带有黄瓜花叶病毒(CMV)的2b基因片段的弱毒疫苗的烟草发病率仅为25％，保护效率达到75％。

以上结果表明，携带CMV的2b基因片段的弱毒疫苗可延迟烟草发病，对CMV强毒株系具有较好的交叉保护效果。

以上所述仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专利的技术人员在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述提示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明方案的范围内。

Claims (10)

1.一种抗黄瓜花叶病毒的弱毒疫苗，其特征在于，弱毒疫苗以TVBMV弱毒突变体为基础，TVBMV弱毒突变体中嵌入了可诱导对黄瓜花叶病毒产生交叉保护的有效基因片段，所述的有效基因片段包括黄瓜花叶病毒的2b基因；所述的2b基因的核苷酸序列如Seq ID No.19所示；

所述的TVBMV弱毒突变体由pCamTVBMV在HC-Pro 序列中进行四个位点突变获得，所述的位点突变为：52位的精氨酸突变为谷氨酸，198位的天冬氨酸突变为赖氨酸；第250位的异亮氨酸突变为天冬氨酸，251位的谷氨酰胺突变为谷氨酸。

2.一种如权利要求1所述的抗黄瓜花叶病毒的弱毒疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）构建TVBMV弱毒突变体；

（2）获得可诱导对黄瓜花叶病毒产生交叉保护的2b基因片段；

（3）将得到的2b基因片段插入TVBMV弱毒突变体，获得抗黄瓜花叶病毒的弱毒疫苗。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，以黄瓜花叶病毒的基因组为模板，利用PCR技术扩增得到2b基因片段，然后插入到TVBMV弱毒突变体的多克隆位点中，获得含有2b基因片段的弱毒疫苗。

4.一种含有如权利要求1所述的抗黄瓜花叶病毒的弱毒疫苗的重组菌。

5.根据权利要求4所述的重组菌，其特征在于，所述的重组菌包括转入了弱毒疫苗的农杆菌。

6.一种如权利要求1所述的抗黄瓜花叶病毒的弱毒疫苗在防治黄瓜花叶病毒强毒株系侵染植物方面的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，通过农杆菌浸润法将获得的抗黄瓜花叶病毒的弱毒疫苗接种到寄主植物，寄主植物生长正常。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，在接种所述的抗黄瓜花叶病毒的弱毒疫苗到寄主植物后第15天接种黄瓜花叶病毒强毒株系，测定交叉保护效果，保护效率达到75％。

9.根据权利要求6所述的应用，其特征为，所述的植物为双子叶植物。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的植物为烟草。

Images