CN112424344A - 黄瓜花叶病毒弱毒株 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及能够防治葫芦科植物所发生的来自植物病毒的植物病的新型的黄瓜花叶病毒弱毒株、含有上述CMV弱毒株的葫芦科植物用的花叶病抗病性诱导剂、使用了上述CMV弱毒株的葫芦科植物的花叶病防治方法、和葫芦科植物。具体而言，涉及一种黄瓜花叶病毒弱毒株，在基因组中，具有从编码2b蛋白的序列编号1所示的RNA的5′侧算起第279位～第282位的碱基序列中缺失了1个或2个碱基的RNA，或者具有在上述第279位～第282位的碱基序列中插入了1个或2个碱基的RNA，该黄瓜花叶病毒弱毒株具有2b蛋白，编码2b蛋白的RNA包含序列编号2所示的碱基序列，或者该2b蛋白由序列编号3所示的氨基酸序列构成。
Description
技术领域
本发明涉及一种预防植物病毒感染的新型的黄瓜花叶病毒弱毒株。另外，本发明还涉及含有上述黄瓜花叶病毒弱毒株的葫芦科植物用的花叶病抗病性诱导剂、使用上述黄瓜花叶病毒弱毒株的葫芦科植物的花叶病防治方法和花叶病抗病性葫芦科植物。
背景技术
目前，关于室外栽培的蔬菜等作物中发现的植物病，已知通过昆虫传播的植物病毒感染是原因之一。
例如，已知在葫芦科植物中发现的花叶病中，在蚜虫等从葫芦科植物中吸汁时感染黄瓜花叶病毒(cucumber mosaic virus：CMV)、西瓜花叶病毒(watermelon mosaicvirus：WMV)等植物病毒，由此该植物的叶和果实形成环斑、花叶病或畸形，从而植物体发生枯萎等。
黄瓜花叶病毒(CMV)是发生于世界各地的宿主范围非常广的植物病毒之一，感染1000种以上的植物。CMV是雀麦花叶病毒(Bromoviridae)科黄瓜花叶病毒(Cucumovirus)属所属的直径约30nm的球状病毒。病毒基因组为三分体的单链的(+)链RNA，分别被称为RNA1、RNA2或RNA3。RNA1编码1a蛋白，RNA2编码2a蛋白和由亚基因组RNA的4A翻译的2b蛋白，RNA3编码3a蛋白质和由亚基因组RNA的4翻译的外壳蛋白质(coat protein：CP，结构蛋白质)。CMV的2b蛋白已被鉴定为对黄瓜和烟草的全身感染、细胞内分布、各植物的病原性重要的多功能因子。
但是，植物具有分解自身不需要的双链RNA的RNA沉默机制，其已被用作针对植物病毒的防御机制。然而，考虑是由于CMV所具有的2b蛋白作为用于避免以植物病毒为目标的RNA沉默机制所引起的分解的抑制因子(抑制基因)而发挥功能，因此CMV完成感染，作物产生病毒病。
另外，西瓜花叶病毒(WMV)所属的马铃薯Y病毒(Potyviridae)科马铃薯Y病毒(Potyvirus)属的病毒虽然各自的宿主范围非常窄，但在世界各地已从各种植物中分离得到。WMV除了世界各地的葫芦科植物以外，还确认了感染豆科等23科植物。WMV是12～13×700～800nm的线状、病毒基因组为单链的(+)链RNA(约10,000个碱基)病毒。首先，翻译1种多蛋白，再利用自身所具有的蛋白酶产生10种蛋白质。马铃薯Y病毒的辅助成分蛋白酶(HC－Pro)已被鉴定为RNA沉默机制的抑制基因，也参与RNA结合、病毒增殖性和病原性等。它们的多功能性与抑制RNA沉默机制的功能密切相关。
目前，针对上述那样的植物病毒，还没有有效的抗病毒剂，因此在作物的栽培现场，作为应对方法，为了驱除向作物传播植物病毒的昆虫，依赖于杀虫剂等化学农药，但这样的方法有化学农药造成环境污染的担忧。
因此，近年来作为植物病毒病防治方法，利用接种弱毒病毒的防治技术受到了关注。其是利用感染了某种病毒(一次病毒)的植物不会再感染近缘的病毒(二次病毒)这样的干扰效应的防治方法。即，是一种如果将病原性非常弱的弱毒株作为一次病毒进行接种，则能够阻止病原性强的强毒株所产生的二次感染这样的所谓疫苗的作用。
本申请人以前使用弱毒西葫芦黄花叶病毒(ZYMV)开发了具有病毒病防治作用的弱毒西葫芦黄花叶病毒(专利文献1)。近年来，本发明的发明人还开发了能够接种植物疫苗的植物苗的固定化装置和植物疫苗接种方法(专利文献2)。
另外，作为其它的弱毒化病毒，已知有被卫星RNA弱毒化的黄瓜花叶病毒(CMV)，已被利用于西红柿、青椒和龙胆等。报告了卫星RNA这么短的RNA与寄生于CMV而抑制其基因组RNA的增殖的作用相关联，由此CMV被弱毒化(非专利文献1)。
然而，迄今未知在葫芦科植物中实用的弱毒病毒株。
例如报告了许多在黄瓜等葫芦科露天产地因CMV、WMV的慢性爆发以及CMV和WMV的重复感染而导致的病征激化，其危害甚大。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本专利第4045358号公报
专利文献2：日本专利第5938798号公报
非专利文献
非专利文献1：佐山春树，《植物疫苗》，化学和生物41(7)(2003)(454～459页)
发明内容
发明所要解决的技术问题
本发明的目的在于提供一种能够防治葫芦科植物所发生的来自植物病毒的植物病的新型的黄瓜花叶病毒(CMV)弱毒株。
另外，本发明的目的在于提供含有上述CMV弱毒株的葫芦科植物用的花叶病抗病性诱导剂、使用了上述CMV弱毒株的葫芦科植物的花叶病防治方法、和葫芦科植物。
用于解决技术问题的技术方案
为了解决上述技术问题，本发明的发明人进行了深入研究，结果首次发现，通过从黄瓜田圃里分离CMV强毒株并反复弱毒化，成功制造出对黄瓜等葫芦科植物的病原性极低的CMV弱毒株，并且通过将该CMV弱毒株接种在葫芦科植物中，能够在葫芦科植物中诱导花叶病抗病性。
本发明是本发明的发明人基于上述的见解而完成的发明。
即，本发明的要旨涉及：
〔1〕一种黄瓜花叶病毒弱毒株，在基因组中，具有从编码2b蛋白的序列编号1所示的RNA的5′侧算起第279位～第282位的碱基序列中缺失了1个或2个碱基的RNA，或者具有在上述第279位～第282位的碱基序列中插入了1个或2个碱基的RNA。
〔2〕如上述〔1〕所述的黄瓜花叶病毒弱毒株，其中，编码2b蛋白的RNA包含序列编号2所示的碱基序列。
〔3〕如上述〔1〕或〔2〕所述的黄瓜花叶病毒弱毒株，其具有由序列编号3所示的氨基酸序列构成的2b蛋白。
〔4〕一种葫芦科植物用的花叶病抗病性诱导剂，其含有上述〔1〕～〔3〕中任一项所述的黄瓜花叶病毒弱毒株作为有效成分。
〔5〕如上述〔4〕所述的葫芦科植物用的花叶病抗病性诱导剂，其还含有在基因组中具有编码辅助成分蛋白酶的序列编号4所示的RNA的西瓜花叶病毒弱毒株。
〔6〕如上述〔5〕所述的葫芦科植物用的花叶病抗病性诱导剂，其中，上述西瓜花叶病毒弱毒株具有由序列编号5所示的氨基酸序列构成的辅助成分蛋白酶。
〔7〕一种葫芦科植物的花叶病防治方法，其特征在于：对葫芦科植物接种上述〔1〕～〔3〕中任一项所述的黄瓜花叶病毒弱毒株。
〔8〕如上述〔7〕所述的葫芦科植物的花叶病防治方法，其中，对葫芦科植物还接种在基因组中具有编码辅助成分蛋白酶的序列编号4所示的RNA的西瓜花叶病毒弱毒株。
〔9〕如上述〔7〕或〔8〕所述的葫芦科植物的花叶病防治方法，其中，上述西瓜花叶病毒弱毒株具有由序列编号5所示的氨基酸序列构成的辅助成分蛋白酶。
〔10〕一种葫芦科植物，其接种了上述〔1〕～〔3〕中任一项所述的黄瓜花叶病毒弱毒株，该葫芦科植物具有花叶病抗病性。
〔11〕如上述〔10〕所述的葫芦科植物，其还接种了在基因组中具有编码辅助成分蛋白酶的序列编号4所示的RNA的西瓜花叶病毒弱毒株。
〔12〕如上述〔11〕所述的葫芦科植物，其中，上述西瓜花叶病毒弱毒株具有由序列编号5所示的氨基酸序列构成的辅助成分蛋白酶。
〔13〕一种花叶病毒弱毒株的提取方法，其中，使用包含聚(氧乙烯)辛基苯基醚的添加有非离子系表面活性剂的提取缓冲液，从花叶病毒弱毒株感染叶进行提取。
〔14〕如上述〔13〕所述的提取方法，其中，上述提取方法得到的是花叶病毒弱毒株感染叶的磨碎物离心沉淀后的上清液与使用上述添加非离子系表面活性剂的提取缓冲液从沉渣得到的提取物的混合液，或者是使用上述添加有非离子系表面活性剂的提取缓冲液而得到的磨碎物的离心沉淀上清液。
〔15〕如上述〔13〕或〔14〕所述的提取方法，其中，上述花叶病毒为黄瓜花叶病毒或西瓜花叶病毒。
发明效果
本发明的CMV弱毒株在基因的碱基序列或氨基酸序列中新颖性极高，通过对黄瓜、或者CMV或WMV的危害大的葫芦科植物接种，能够成为对花叶病有效的防治方法。
另外，如果将本发明与已经实用化的ZYMV疫苗等配合使用，则能够全面防治由于蚜虫等昆虫媒介混发的主要病毒，并能够提高作物的生产率、降低防治成本和作业、实现省力化，从而能够对室外栽培葫芦科植物的各产地的持续发展做出贡献。
附图说明
图1是表示CMV的基因组结构的概略图。
图2是表示作为CMV弱毒株的CM14株的2b蛋白的碱基序列与强毒株H23的比较的概略图。
图3是表示作为CMV弱毒株的CM14株的2b蛋白的氨基酸序列与强毒株H23的比较的概略图。
图4是表示CMV弱毒株的2b蛋白的概略图。
图5－1～图5－3是表示作为WMV弱毒株的WM14株的HC－Pro的碱基序列与强毒株MIYA的比较的概略图。
图5－2是接续图5－1的图。
图5－3是接续图5－2的图。
图6是表示作为WMV弱毒株的WM14株的HC－Pro的氨基酸序列与强毒株MIYA的比较的概略图。
具体实施方式
1.黄瓜花叶病毒(CMV)弱毒株
本发明的CMV弱毒株的特征在于：在基因组中，具有从编码2b蛋白的序列编号1所示的RNA的5′侧算起第279位～第282位的碱基序列中缺失了1个或2个碱基的RNA，或者具有在上述第279位～第282位的碱基序列中插入了1个或2个碱基的RNA(以下，也称为弱毒化2bRNA)。
序列编号1所示的RNA是编码CMV强毒株所具有的2b蛋白的碱基序列，全长为333bp。
本发明的CMV弱毒株通过具有如上所述的弱毒化2bRNA，产生从序列编号1所示的RNA的5′侧算起第279位～第282位以后的碱基序列所编码的氨基酸序列被改变了的弱毒化2b蛋白。该弱毒化2b蛋白与正常的2b蛋白相比，虽然分子量等类似，但由于2b蛋白的特别是作为病原性因子的功能受损，因此弱毒性优异，即，接种了本发明的CMV弱毒株的葫芦科植物不显示花叶病的病征，或者只显示极轻微的病征。
另外，接种了本发明的CMV弱毒株的葫芦科植物由于在植物体内存在CMV弱毒株和/或弱毒化2b蛋白，因此，通过葫芦科植物所具有的干扰效应的功能，对于来自存在于室外的蚜虫传播的其它的CMV强毒株的感染也发挥优异的花叶病抗病性。
其中，在本发明中，花叶病抗病性是指抵抗作为花叶病的原因的植物病毒对葫芦科植物的感染的性质，具体是指即使受到CMV强毒株的攻击也不感染、感染CMV强毒株后的葫芦科植物不显示花叶病的病征、只显示极轻微的病征、或者即使产生花叶病也不抑制生长这样的性质。
作为本发明的CMV弱毒株所具有的弱毒化2bRNA，可以列举：在上述序列编号1所示的RNA的碱基序列中，在从5′侧算起第279位～第282位的4个胸腺嘧啶(T)连续的序列中缺失了1个或2个碱基的RNA；在上述第279位～第282位的4个胸腺嘧啶连续的序列中插入了1个或2个碱基的RNA等。
上述缺失或插入只要使得由第279位～第282位以后的碱基序列翻译的氨基酸序列与正常的2b蛋白不同即可，对于缺失或插入的碱基的个数、插入的碱基的种类，没有特别限定。
例如，作为上述弱毒化2bRNA，可以列举具有序列编号2所示的碱基序列的RNA。
序列编号2是在从碱基序列1所示的2b蛋白基因的5′侧算起第279位～第282位的碱基中，相对于强毒株时胸腺嘧啶(T)4个连续，胸腺嘧啶(T)成为3个连续而缺失了1个碱基的胸腺嘧啶(T)的碱基序列。其中，在序列编号2中，相当于从碱基序列1所示的2b蛋白基因的5′侧算起第319位的碱基的腺嘌呤(A)变成了胸腺嘧啶(T)。
作为上述弱毒化2bRNA，并不限于序列编号2的碱基序列本身，具有与上述序列编号2所示的碱基序列80％以上的相同性、优选90％以上、更优选95％以上的相同性的碱基序列并且表现与上述弱毒化2bRNA同等程度的弱毒性和花叶病抗病性的RNA也包含在本发明中。
本发明的CMV弱毒株具有通过由上述弱毒化2bRNA翻译而产生的弱毒化2b蛋白。
弱毒化2b蛋白与正常的2b蛋白相比，分子量等基本相同，是在N末端至第93位附近相同性高、而第94位以后的氨基酸序列不同的氨基酸序列。另外，构成弱毒化2b蛋白的氨基酸的数量与正常的2b蛋白相比，也可以缺失或添加1个或多个氨基酸序列。
作为上述弱毒化2b蛋白，例如可以列举由序列编号3所示的氨基酸序列构成的蛋白质。序列编号3所示的弱毒化2b蛋白是由106个氨基酸构成的序列，与作为强毒株的H23强毒株的2b蛋白的氨基酸序列(全长110个氨基酸序列)相比，第94位以后的氨基酸序列不同。
其中，具有与上述序列编号3所示的氨基酸序列80％以上的相同性、优选90％以上、更优选95％以上的相同性的氨基酸序列并且实现与上述弱毒化2b蛋白同等程度的弱毒性和花叶病抗病性的蛋白质也包含在本发明中。
例如，也可以是由从上述序列编号3所示的氨基酸序列中缺失、置换或者添加1个或多个氨基酸序列而成的氨基酸序列构成的蛋白质。
作为如上所述的具有序列编号2所示的弱毒化RNA的本发明的CMV弱毒株，例如可以列举后述的实施例所记载的作为CMV弱毒株的CM14株。
上述CM14株是在基因组RNA中具有编码由序列编号3所示的氨基酸序列构成的2b蛋白的RNA的病毒，是具有在从2b蛋白基因的5′侧算起第279位～第282位的碱基中，相对于强毒株时胸腺嘧啶(T)4个连续(图4的“强毒株”)，胸腺嘧啶(T)只3个连续而缺失了1个碱基的胸腺嘧啶(T)这样的特征的碱基序列的弱毒株(图4的“弱毒株”)。
在上述CM14株中，如上所述，随着胸腺嘧啶(T)1个碱基缺失，向氨基酸翻译的阅读框发生移位。也就是说，从2b蛋白基因的5′侧算起第280位～第282位的碱基以后的蛋白质的合成具有与原来的2b蛋白不同的特征。
本发明的CMV弱毒株的制作可以通过利用作为公知技术的定点诱变法向天然分离或市售的CMV强毒株、CMV弱毒株中导入碱基序列或氨基酸序列的缺失、置换或者添加来实施。
另外，本发明的CMV弱毒株可以是天然存在的CMV弱毒株，也可以是利用基因重组技术等人为弱毒化后的CMV弱毒株。
另外，本发明的CMV弱毒株可以利用从低温处理后的植物体中将花叶病叶的绿色部分磨碎并分离的方法进行制作。
作为该方法，可以列举Kosaka and Fukunishi(1997)Plant disease81(7)733～738、Kobori et al.(2005)Plant disease 89(8)(879～882)等所记载的方法。
其中，缺失或添加氨基酸时CMV弱毒株的碱基序列编号的计算也考虑这样的缺失或添加的碱基的个数，缺失时增加缺失部分的编号，添加时减少添加部分的编号来确定。例如对于序列编号1的相当于碱基序列编号279的碱基，在比其更靠上游添加2个碱基时，作为对象的碱基胸腺嘧啶(T)实际上为第281位的碱基，但通过减去相当于所添加的碱基数的2，使该第281位的碱基成为碱基序列编号279。
2.葫芦科植物用的花叶病抗病性诱导剂
本发明所涉及的葫芦科植物用的花叶病抗病性诱导剂(以下，称为本发明的诱导剂)含有上述的本发明的CMV弱毒株作为有效成分。
在本发明中，葫芦科植物可以列举黄瓜、甜瓜、西瓜、西葫芦、冬瓜、白瓜、丝瓜、苦瓜、匏瓜等食用的植物、罗汉果、王瓜等用作生药的植物等，没有特别限定。
如上所述，本发明的诱导剂具有通过对葫芦科植物接种而引起对CMV的抗病性(花叶病抗病性)的作用。
作为本发明的诱导剂所含的本发明的CMV弱毒株的量，只要是能够在所接种的葫芦科植物中引起所希望的花叶病抗病性的量即可，没有特别限定。
另外，本发明的诱导剂还可以含有在基因组中具有编码辅助成分蛋白酶(HC－Pro)的序列编号4所示的RNA的西瓜花叶病毒(WMV)弱毒株。
上述WMV弱毒株是编码HC－Pro的序列编号4所示的RNA，与筛选源的WMV强毒株相比，突变成具有从HC－Pro基因的5′侧算起第434位和第1048位的碱基序列突变成胸腺嘧啶(T)和腺嘌呤(A)这样的特征的碱基序列(以下，弱毒化HC－Pro RNA)的弱毒株。
作为上述弱毒化HC－Pro RNA，并不限于序列编号4的碱基序列本身，具有与上述序列编号4所示的碱基序列80％以上的相同性、优选90％以上、更优选95％以上的相同性的碱基序列并且实现与上述弱毒化HC－Pro RNA同等程度的弱毒性的RNA也包含在本发明中。
另外，作为上述WMV弱毒株，可以具有由序列编号5所示的氨基酸序列构成的HC－Pro。
上述序列编号5所示的氨基酸序列是由上述序列编号4所示的弱毒化HC－Pro RNA编码的氨基酸序列，与WMV强毒株相比，是从HC－Pro的N末端算起第145位和第350位的氨基酸序列突变成亮氨酸(L)和苏氨酸(T)的氨基酸序列。上述序列编号5所示的氨基酸序列通过在上述部位发生突变，与正常化的HC－Pro相比，虽然分子量等相同，但推测由于作为抑制基因的功能受损，因此弱毒性优异，即接种了上述WMV弱毒株的葫芦科植物不显示花叶病的病征，或者只显示极轻微的病征，另外，通过葫芦科植物所具有的干扰效应的功能，对于来自存在于室外的各种昆虫传播的其它的WMV强毒株的感染也发挥优异的花叶病抗病性。
其中，具有与上述序列编号5所示的氨基酸序列80％以上的相同性、优选90％以上、更优选95％以上的相同性的氨基酸序列并且实现与上述弱毒化HC－Pro同等程度的弱毒性和花叶病抗病性的蛋白质也包含在本发明中。
例如，也可以是由从上述序列编号5所示的氨基酸序列中缺失、置换或者添加1个或多个氨基酸序列而成的氨基酸序列构成的蛋白质。
上述WMV弱毒株与上述CMV弱毒株同样，也可以通过利用作为公知技术的定点诱变法向天然分离或市售的WMV强毒株、WMV弱毒株中导入碱基序列或者氨基酸序列的缺失、置换或者添加来实施。
另外，本发明的WMV弱毒株可以是天然存在的WMV弱毒株，也可以是利用基因重组技术等人为弱毒化后的WMV弱毒株。
另外，本发明的WMV弱毒株可以利用从低温处理后的植物体中将花叶病叶的绿色部磨碎并分离的方法进行制作。
作为该方法，可以列举Kosaka and Fukunishi(1997)Plant disease81(7)p733～738、Kobori et al.(2005)Plant disease 89(8)p879～882等所记载的方法。
作为本发明的诱导剂所含的本发明的WMV弱毒株的量，只要是能够在所接种的葫芦科植物中引起所希望的花叶病抗病性的量即可，没有特别限定。
通过将本发明的CMV弱毒株和WMV弱毒株在水、磷酸钠缓冲液、磷酸钾缓冲液或柠檬酸缓冲液等中混合，根据需要进一步混合表面活性剂、糖类、螯合剂或还原剂等，能够制备本发明的诱导剂。
另外，可以使用从接种了本发明的CMV弱毒株的葫芦科植物的植物体叶部等的磨碎物中得到的汁液或者将该汁液浓缩或稀释而得到的液体作为本发明的诱导剂。也可以向从接种了CMV弱毒株的葫芦科植物的植物体中得到的汁液中混合从接种了WMV弱毒株的葫芦科植物的植物体中得到的汁液或者将该汁液浓缩或稀释而得到的液体作为本发明的诱导剂。
上述磨碎是指细细地粉碎、研碎，例如可以通过向研钵、石磨、均质机、高速混合机等公知的破碎机提供植物体和水等介质进行磨碎处理而得到。其中，磨碎只要能够将植物体粉碎或研碎至能够提取存在于上述植物体的CMV弱毒株、WMV弱毒株的程度即可，没有特别限定。
从叶部的磨碎物中得到汁液时，作为提取液，可以将水、磷酸钠缓冲液、磷酸钾缓冲液或柠檬酸缓冲液等各种提取缓冲液、各种表面活性剂溶液、正丁醇、氯仿和四氯化碳等有机溶剂单独使用或者以它们的混合液的形式使用。
作为表面活性剂，可以列举阳离子系表面活性剂溶液、阴离子系表面活性剂溶液、非离子系表面活性剂溶液。
其中，从提取效率的观点考虑，优选包含聚(氧乙烯)辛基苯基醚的非离子系表面活性剂。优选使用Triton(注册商标)X-100。
3.葫芦科植物的花叶病防治方法
通过对葫芦科植物接种本发明的CMV弱毒株，能够预防(防治)葫芦科植物的花叶病。
在本发明中，“花叶病防治”是指防止葫芦科植物的花叶病症状的产生、缓和发病的程度或者延迟症状的产生。
通过对葫芦科植物进行花叶病防治，能够促使顺利生长，提高葫芦科植物的产量和商品价值。
另外，通过除了本发明的CMV弱毒株以外还对葫芦科植物接种上述WMV弱毒株，能够进行与CMV和WMV这样的2种植物病毒关联的花叶病的防治。
上述接种使用含有CMV弱毒株的本发明的诱导剂即可。另外，本发明的诱导剂还可以含有上述WMV弱毒株。
作为上述接种的方法，例如可以没有特别限定地采用公知的方法。例如可以列举利用金刚砂法的摩擦接种、使用喷枪(spray gun)和气刷(air brush)等的高压喷雾接种。
另外，使用WMV弱毒株时，接种可以分别单独接种CMV弱毒株、WMV弱毒株，或者将CMV弱毒株或WMV弱毒株混合后进行接种，或者在接种CMV弱毒株后接种WMV弱毒株，或者在接种WMV弱毒株后接种CMV弱毒株。
其中，关于接种的次数，考虑所接种的CMV弱毒株的浓度、葫芦科植物的大小等来确定即可，例如可以为1次，在初次接种后无法确认弱毒株感染时，也可以为2次以上。
4.具有花叶病毒病抗病性的葫芦科植物
如上所述，接种有本发明的CMV弱毒株的葫芦科植物对CMV具有花叶病抗病性。
本发明所涉及的葫芦科植物通过在植物体中含有本发明的CMV弱毒株、序列编号4所示的RNA或序列编号5所示的氨基酸序列，能够与非接种的葫芦科植物区分。
作为接种本发明的CMV弱毒株的时期，没有特别限定。例如通过在育苗阶段接种CMV弱毒株，能够制作具有花叶病抗病性的葫芦科植物的苗。另外，通过对在比较洁净的环境中生长的葫芦科植物接种CMV弱毒株，在露天等田圃中定植，或者在为了售卖而装运之前进行接种，由此即使在不特定的各种环境下也能够实现安全的生长。
另外，通过利用与CMV弱毒株相同的方法进一步接种WMV弱毒株，能够进一步提高葫芦科植物的花叶病抗病性。
因此，作为具有花叶病抗病性的葫芦科植物的状态，包括苗和成长的植物体等，没有限定。
实施例
以下，列举实施例对本发明进行更具体地说明，但本发明的范围并不限定于这些实施例。
实施例1
CMV弱毒株CM14株的制作
选择在福岛县内栽培的已引起严重的花叶病症状的黄瓜，使用利用DAS-ELISA法的CMV检验和向黄花烟草(Nicotiana rustica)的接种检验，分离了在黄瓜中引起严重的花叶病症状的CMV的强毒株(以下，称为“H23株”)。
接着，对烟草属的黄花烟草接种H23株，对其使用低温处理和分离花叶病叶(能够通过目测确认花叶病症状的叶)的绿色部分的方法。上述的低温处理和绿色部分的分离中，作为筛选存在于植物体中的植物病毒的弱毒株的方法，已有报告(Kosaka and Fukunishi(1997)Plant disease 81(7)733～738、Kobori et al.(2005)Plant disease 89(8)879～882)。
具体而言，首先，将接种了作为CMV强毒株的H23株的黄花烟草的幼苗立刻以15℃在人工气候箱内培育2个月(低温处理)。
之后，切出上述苗的花叶病叶的绿色部分，加入叶重量的10～50倍量的0.1M磷酸钾缓冲液(pH7.0)，将磨碎得到的汁液作为接种源，对其它的黄花烟草的幼苗接种。接种病毒后，在25℃的玻璃温室内培育11～25天。
之后，对培育的各黄花烟草进行病征调査。从认为症状已变轻的黄花烟草中再切出绿色部，加入叶重量的10～50倍量的0.1M磷酸钾缓冲液(pH7.0)，将磨碎得到的汁液作为接种源，以15～18℃重复14天～2个月的低温处理或绿色部分的分离共计10次，从而分离1株即使接种也仅出现轻微的花叶病症状的弱毒株。
接着，对于上述弱毒株感染叶，加入叶重量的10倍量的0.1M磷酸钾缓冲液(pH7.0)，将磨碎得到的汁液作为接种源，对藜麦(Chenopodium quinoa)接种后，在2～3天后的接种叶上一个个切出病毒感染所产生的多个局部病斑，加入叶重量的50倍量的0.1M磷酸钾缓冲液(pH7.0)，将磨碎得到的汁液作为接种源，对黄花烟草的幼苗接种(单病斑分离)。将该单病斑分离重复4次后，得到在对黄瓜和西葫芦接种时病征轻微的CM14株。
然后，对黄瓜或西葫芦的幼苗的子叶利用金刚砂法摩擦接种H23株或CM14株的病毒感染叶的粗提汁液，H23株引起了严重的花叶病症状，相对于此，CM14株在黄瓜和西葫芦中只是短暂的退绿斑。将其结果示于表1。
[表1]
使用黄瓜品种：エクセレント节成2号或西葫芦品种：ラベン。
实施例2
CMV弱毒株的2b蛋白基因的分析
分析实施例1所得到的CM14株的2b蛋白基因，研究与作为筛选源的H23株的差异。
从感染了CM14株的黄花烟草叶中提取RNA，利用RT－PCR法合成2b蛋白基因。
引物使用PeR2-2367F：TAGTACAGAGTTCAGAGTTGAGCG(序列编号6)和PeR2-2967R：GTCCTTCCGAAGAAACCTAGG(序列编号7)，酶使用“Onestep RT－PCR kit”(QIAGEN公司)。
DNA的分析利用Eurofins Genomics公司的DNA测序服务，汇总其结果，确定2b蛋白基因的碱基序列。
对于序列编号2、3表示碱基序列和氨基酸序列，在图1表示CMV的基因组构成，在图2表示与2b蛋白相关的弱毒株与强毒株的碱基序列的比较，在图3同样表示氨基酸序列的比较，在图4表示2b蛋白的示意图。
实施例3
WMV弱毒株WM14的制作
选择在宫崎县内栽培的已引起花叶病症状的黄瓜，使用利用DAS-ELISA法的WMV检验以及向南瓜和黄瓜的接种检验，分离在黄瓜中引起花叶病症状的WMV的强毒株(以下，称为“MIYA株”)。
接着，对南瓜接种MIYA株，对其使用上述的低温处理和从花叶病叶绿色部分中分离病毒的方法。另外，在WMV弱毒株的筛选中，组合了单株分离(single plant isolation(SPI))。SPI是从感染叶制作加入相对于叶重量为100～500倍量的0.1M磷酸钾缓冲液(pH7.0)而磨碎得到的汁液即高稀释倍率液后，对筛选植物接种的公知的方法。
具体而言，首先，将接种了作为WMV强毒株的MIYA株的南瓜幼苗立刻以15℃在人工气候箱内培育2个月(低温处理)。
之后，切出上述苗的花叶病叶的绿色部分，将所制作的磨碎汁液作为SPI的接种源对其它的南瓜幼苗接种。接种病毒后，在25℃的玻璃温室内培育14～21天。
之后，对培育的各南瓜进行病征调査。从认为症状已变轻的南瓜中再切出绿色部，将所制作的磨碎汁液作为SPI的接种源，以18～20℃重复2～3个月的低温处理或绿色部的分离和SPI共计7次，从而分离1株即使接种也仅出现轻微的花叶病症状的弱毒株。
接着，对于上述弱毒株感染叶，加入叶重量的10倍量的0.1M磷酸钾缓冲液(pH7.0)，将磨碎得到的汁液作为接种源，对墙藜(Chenopodium murale)接种后，在12～26天后的接种叶上一个个切出病毒感染所产生的多个局部病斑，加入叶重量的50倍量的0.1M磷酸钾缓冲液(pH7.0)，将磨碎得到的汁液作为接种源，对南瓜幼苗接种。将该单病斑分离重复7次后，得到在对南瓜和西葫芦分别接种时病征均轻微的WM14株。
然后，对黄瓜、西葫芦或南瓜的幼苗的子叶利用金刚砂法摩擦接种MIYA株或WM14株的病毒感染叶的粗提汁液，MIYA株引起严重的花叶病症状，相对于此，WM14株在黄瓜、西葫芦或南瓜中为轻微的退绿斑或极轻微的花叶病。将其结果示于表2。
[表2]
使用黄瓜品种：エクセレント节成2号、西葫芦品种：ラベン或南瓜品种：EBISU。
实施例4
WMV弱毒株的HC－Pro基因的分析
分析实施例3所得到的WM14株的HC－Pro基因，研究与作为筛选源的MIYA株的差异。
从感染了WM14株的南瓜叶中提取RNA，利用RT－PCR法合成HC－Pro基因。
引物使用WMV-1389F：TGTGCGAGGTAGAGAGAATGG(序列编号8)和WMV-2865R：TTCACACTTCATCCTTTGTTG(序列编号9)，酶使用“Onestep RT－PCR kit”(QIAGEN公司)。
DNA的分析利用Eurofins Genomics公司的DNA测序服务，汇总其结果，确定HC－Pro基因的碱基序列。对于序列编号4、5表示碱基序列和氨基酸序列，在图5－1～图5－3表示与HC－Pro相关的弱毒株与强毒株的碱基序列的比较，在图6同样表示氨基酸序列的比较。
实施例5
已知CMV和WMV的重复感染所产生的病征在黄瓜等葫芦科作物中激化。对黄瓜苗(品种：エクセレント节成2号)混合接种CMV弱毒株和WMV弱毒株后，如表3所示，可知与各单独感染相比，病征没有加强。
[表3]
| 所接种的植物病毒 | 各病毒所产生的病征 |
| CM14株 | 短暂的退绿斑 |
| WM14株 | 极轻微的花叶病 |
| CM14株+WM14株 | 短暂的退绿斑 |
| H23株+MIYA株 | 严重的花叶病 |
根据实施例1、3和5的结果可知，在对葫芦科植物单独接种CM14株的情况下显示弱毒性，即使在并用WM14株的情况下，也显示优异的弱毒性，因此是安全性优异的弱毒株。
实施例6
通过接种CM14株而产生的黄瓜苗的干扰效应
利用向温室内盆栽的黄瓜苗(品种：大望(おおのぞみ))接种的试验，验证接种了CM14株和WM14株的葫芦科植物对CMV强毒株和WMV强毒株的发病抑制的效果、即干扰效应。
将预先感染了CM14株的黄花烟草的叶汁液或感染了WM14株的南瓜的叶汁液单独或混合，利用金刚砂法对试验用黄瓜苗的子叶摩擦接种。
接着，18天后，将感染了作为CMV强毒株的H23株的黄花烟草的叶汁液或者感染了作为WMV强毒株的MIYA株的南瓜的叶汁液对试验用黄瓜苗的第一真叶摩擦接种。
之后，根据试验用黄瓜苗的上位叶是否显现强毒病毒特有的花叶病症状，对干扰效应进行判定。将对CMV强毒株的干扰效应示于表4，将对WMV强毒株的干扰效应示于表5。
其结果如表4所示，在无接种区内，在接种了CMV强毒株的11天后，在所有的试验株中都显现出严重的花叶病症状，因此确认了CMV强毒株的感染。
与之相对，在CM14株单独接种或与WM14株的混合接种中，即使在接种31天后，CMV强毒株的发病株数在10株中也少至5株或2株，确认了通过接种作为CMV弱毒株的CM14株，在试验用黄瓜苗产生了高的干扰效应。
[表4]
在WMV的干扰效应试验中，如表5所示，在无接种区内，在接种WMV强毒株的11天后，在所有的试验株中都显现出严重的花叶病症状，因此确认了WMV强毒株的感染。
与之相对，在WM14株单独接种或与CM14株的混合接种中，即使在接种31天后，WMV强毒株的发病株数在10株中也少至3株或2株，确认了通过接种作为WMV弱毒株的WM14株，试验用黄瓜产生了高的干扰效应。
[表5]
实施例7
通过接种CM14株而产生的黄瓜嫁接苗的干扰效应
利用向温室内盆栽的嫁接黄瓜苗(接穗品种：パイロット2号，砧木品种：GT－II)接种的试验，验证接种了CM14株和WM14株的葫芦科植物对CMV强毒株和WMV强毒株的干扰效应。
将预先感染了CM14株的黄花烟草的叶汁液和感染了WM14株的南瓜的叶汁液混合，利用金刚砂法对试验用嫁接黄瓜苗的子叶摩擦接种。
接着，实施与砧木南瓜的嫁接和育苗，在接种CM14株和WM14株的16天后，将感染了作为CMV强毒株的H23株的黄花烟草的叶汁液和感染了作为WMV强毒株的MIYA株的南瓜的叶汁液的混合液对试验用嫁接黄瓜苗的第一真叶摩擦接种。
之后，根据试验用嫁接黄瓜苗的上位叶是否显现强毒病毒特有的花叶病，对干扰效应进行判定。将结果示于表6。
其结果如表6所示，在无接种区内，在接种了CMV强毒株和WMV强毒株的12天后，在所有的试验株中都显现出严重的花叶病的症状，因此确认了强毒株的感染。
与之相对，在接种了CM14株和WM14株的试验用嫁接黄瓜苗中，看不到花叶病，因此确认了通过接种CM14株和WM14株，在嫁接黄瓜苗产生了非常高的干扰效应。
[表6]
实施例8
在塑料大棚中弱毒株对花叶病的防治效果
在塑料大棚田圃中定植黄瓜苗(品种：エクセレント节成2号)，验证CM14株和WM14株对花叶病的防治效果。
将预先感染了CM14株的黄花烟草的叶汁液和感染了WM14株的南瓜的叶汁液彼此混合，利用金刚砂法对试验用黄瓜苗的子叶摩擦接种该混合液，在温室内培育至真叶达到4片左右。
之后，将试验用黄瓜苗定植于塑料大棚田圃进行栽培。
至定植24～37天后，在感染作为CMV强毒株的H23株和作为WMV强毒株的MIYA株后的黄瓜苗上放置蚜虫，将该苗作为传染源，置于垄间，诱发花叶病。
之后，根据是否显现强毒株所导致的花叶病和枯萎症，对防治效果进行判定。将发生了花叶病的株的比例示于表7，将确认了枯萎症的株的比例示于表8，将果实的产量调査的结果示于表9。其中，表9所记载的商品果实率利用(优良品果实数+良品果实数)/全部收获果实数×100进行计算。
另外，发病果实率利用发病果实数/全部收获果实数×100进行计算。
根据表7、8的结果可知，在定植60天后，在无接种区内，花叶病在12株中确认了10株，枯萎症在12株中确认了3株，但在接种区内，花叶病变化为在12株中低至5株，并且完全看不到枯萎症。
[表7]
根据CMV和WMV各源株，将发病的株数合计而算出。
[表8]
另外，根据表9的结果，无接种区的商品果实率为60.6％，发病果实率为35.6％，相对于此，接种区的商品果实率为90.7％，并且发病果实率为8.9％。
因此，可知：通过接种CM14株和WM14株，相对于无接种区，能够作为商品使用的果实数显著提高为1.56倍，另外，发病果实数也显著降低。根据该结果可知，CM14株和WM14株大大有助于葫芦科植物生产率的提高，另外，如果接种在定植于田圃之前的苗中，在之后的生长中也能够防治花叶病，因此能够降低在田圃中进行防治的成本，实现作业的省力化。
[表9]
实施例9
CMV弱毒株的提取
在CMV弱毒株的提取中，将预先感染了CM14株的黄花烟草接种叶以－80℃冷冻保存后使用。
对冷冻感染叶加入叶重量的3倍量的提取缓冲液(0.1M柠檬酸缓冲液、0.01M乙二胺四乙酸二钠(以下EDTA)、pH7.2、0.1％巯基乙醇酸钠)，利用均质机磨碎(15,000rpm、5分钟、4℃)。之后，对于磨碎汁液，等量添加氯仿并磨碎、搅拌后，离心分离(7,000rpm、15分钟、4℃)，得到上清液。对于加入磨碎汁液的5％量的作为氯仿的代用的丁醇而得到的汁液或未添加有机溶剂的汁液，也同样进行离心分离，得到上清液。按照以下操作，测定各含CM14株上清液的病毒含量。
从感染了CMV弱毒株的植物感染叶中提取病毒时，将50％感染值(ID50)作为指标，表示其含量(浓度)。对含有病毒的试样进行稀释，对每1株植物接种0.3mL，考察每个所接种的稀释试样的感染率，将各感染率(实测值)代入Behrens-Karber法的计算式，求出50％感染值(ID50)(病毒实验学总论(修订二版)23.病毒学所需的数值的操作方法，国立预防卫生研究所学友会编，丸善株式会社发行，1973年6月)。
如此操作，求出引起感染的极限稀释度。极限稀释度是所接种的50％的个体被确认感染的稀释倍率(对数)，病毒含量(浓度)以此时的稀释倍率的倒数表示，使用称为50％感染值(ID50)的单位。将其作为每0.3mL试样的病毒含量。
Behrens-Karber法的计算式
50％感染值(对数的指数)＝χK－(h1+h2+…+hK－1)×d－0.5×d
χK：显示感染率100％的试样的稀释度(对数指数)
h1+h2+…+hK－1：各稀释的感染率之和
0.5：常数
d：稀释间隔的对数指数(10倍分段稀释时d＝1)
50％感染值的计算例
对需要测定病毒含量的试样进行10倍分段稀释，对于各感染率，将表10的情况的计算例表示如下。将表10的结果代入Behrens-Karber法的计算式时，
ID50＝－1－(0.8+0.2+0)×1－0.5×1＝－(1+1+0.5)＝－2.5
即，该试样显示50％感染的稀释度为10-2.5，因此，该病毒液的病毒含量(浓度)成为稀释度的倒数的每0.3mL 102.5ID50。换言之，该试样在进行102.5(约316)倍稀释时，具有50％感染的感染量。
[表10]
阳性率表示对含有病毒的被检测体进行稀释，每1株植物接种0.3mL，考察每个所接种的稀释试样得到的感染率，在该表中，接种苗各提供10株进行试验。
接着，为了测定各含CM14株上清液的病毒含量，利用0.1M磷酸钾缓冲液(pH7.0)调整10倍分段稀释后的试样，将各试样的0.3mL吸入棉棒中，利用金刚砂法对黄花烟草幼苗摩擦接种。对各试样中的4株实施接种。接种后立刻向接种叶洒水，在10,000～18,000勒克斯(照射14小时)的人工光或自然光下以20～30℃进行栽培。在接种14～21天后，观察病征，求出各试样的感染率。将结果示于表11。
[表11]
根据表11的结果，CM14株的含量有未添加有机溶剂的试样最低至102.0ID50/0.3mL、添加氯仿或5％丁醇的含量高至102.50ID50/0.3mL或102.75ID50/0.3mL的倾向。
实施例10
从离心沉渣中提取CMV弱毒株
在实施例9中，CM14株的含量是未添加有机溶剂的离心上清液低至102.0ID50/0.3mL的值。这里，对从离心沉渣中提取CMV弱毒株的条件进行验证。向冷冻感染叶中添加叶重量的2.5倍量的与实施例9相同的提取缓冲液(0.1M柠檬酸缓冲液、0.01M EDTA、pH7.2、0.1％巯基乙醇酸钠)，利用高速混合机进行磨碎(15分钟、4℃)。之后，离心分离(7,000rpm、25分钟、4℃)，得到上清液和离心沉渣。向该离心沉渣中添加沉渣容量的3倍量的提取缓冲液，再利用高速混合机再悬浊10分钟，离心分离(7,000rpm、25分钟、4℃)，得到再悬浊上清液。此时，提取缓冲液使用未添加Triton(注册商标)X-100的溶液、添加Triton(注册商标)X-100至最终浓度0.12％或0.5％的溶液。与实施例9同样操作，测定所得到的各含CM14株液的病毒含量。
将结果示于表12。离心沉渣中的CM14株的含量在未添加Triton(注册商标)X-100时为102.00ID50/0.3mL，在Triton(注册商标)X-100为0.12％或0.5％时分别为103.50ID50/0.3mL或103.25ID50/0.3mL，因此，明确了CM14株不向离心上清液浮游而大量残留在离心沉渣中。还确认了通过添加Triton(注册商标)X-100，能够从离心沉渣中高效地提取CM14株。
[表12]
实施例11：CMV弱毒株的高提取条件的确立
对提高CMV弱毒株的提取效率的条件进行验证。向冷冻感染叶中添加叶重量的2.5倍量的与实施例9相同的提取缓冲液(0.1M柠檬酸缓冲液、0.01M EDTA、pH7.2、0.1％巯基乙醇酸钠)，利用高速混合机磨碎(15分钟、4℃)。之后，离心分离(7,000rpm、25分钟、4℃)，得到上清液(1)和沉渣。向上述提取缓冲液中添加Triton(注册商标)X-100至最终浓度0.5％，向所得到的沉渣中添加沉渣容量的3倍量，再利用高速混合机再悬浊10分钟，离心分离(7,000rpm、25分钟、4℃)，得到上清液(再悬浊上清液(2))。之后，将(1)与(2)液混合。与实施例9同样操作，测定所得到的各含CM14株液的病毒含量。
将结果示于表13。关于CM14株的含量，离心上清液为低至102.0ID50/0.3mL的值，而再悬浊上清液为高至102.75ID50/0.3mL的值。另外，离心上清液(1)与所得到的沉渣的再悬浊上清液(2)的混合液是高至102.50ID50/0.3mL的值。根据以上的说明，明确了通过添加Triton(注册商标)X-100而进行的离心沉渣的再悬浊在CM14株的提取中是有效的。
[表13]
使用添加Triton(注册商标)X-100后的提取缓冲液，进行CM14株的提取试验。在感染叶的磨碎中，向与实施例10相同的缓冲液(0.1M柠檬酸缓冲液、0.01MEDTA、pH7.2、0.1％巯基乙醇酸钠)中添加Triton(注册商标)X-100至最终浓度0.12％或0.5％，使用所得到的溶液作为提取缓冲液。向冷冻感染叶中加入叶重量的2.5倍量的添加有Triton(注册商标)X-100的提取缓冲液，利用高速混合机磨碎(15分钟、4℃)。之后，离心分离(7,000rpm、25分钟、4℃)，得到上清液。与实施例9同样操作，测定所得到的各含CM14株液的病毒含量。
将结果示于表13。CM14株的含量与未添加Triton(注册商标)X-100的离心上清液102.0ID50/0.3mL相比，添加Triton(注册商标)X-100至0.12％或0.5％时，也是高至102.75ID50/0.3mL的值，因此明确了利用添加有Triton(注册商标)X-100的提取缓冲液磨碎感染叶在CM14株的提取中是有效的。
实施例12：WMV弱毒株的提取
在WMV弱毒株的提取中，将预先感染了WM14株南瓜品种EBISU感染叶以－80℃冷冻保存后使用。
对冷冻感染叶加入叶重量的2.5倍量的提取缓冲液(0.1M磷酸钾缓冲液、0.01MEDTA、0.01M N,N-二乙基二硫代氨基甲酸钠三水合物(DIECA)、pH7.0、0.1％巯基乙醇)，利用均质机磨碎(15,000rpm、5分钟、4℃)。之后，对于磨碎汁液，加入四氯化碳15容量％，并磨碎、搅拌后，离心分离(7,000rpm、15分钟、4℃)，得到上清液。未添加有机溶剂的汁液也同样离心分离，得到上清液。
接着，与实施例9同样操作，测定各含WM14株上清液的病毒含量。利用0.1M磷酸钾缓冲液、0.01M DIECA、pH7.0调整10倍分段稀释后的试样，将各试样的0.3mL吸入棉棒中，利用金刚砂法对南瓜幼苗摩擦接种。对各试样中的4株或8株实施接种。接种后立刻向接种叶洒水，在自然光下以20～30℃的玻璃温室进行栽培。在接种14～21天后采取南瓜叶，利用DAS-ELISA法确认WMV的感染。
将结果示于表14。确认了通过添加四氯化碳，离心上清液澄清化，但WM14株的含量在添加四氯化碳和未添加四氯化碳时是相同的。
[表14]
实施例13：从离心沉渣中提取WMV弱毒株
在实施例10中明确了从离心沉渣中再提取CM14株时，Triton(注册商标)X-100是有效的。
因此，对WM14株进行离心沉渣中的病毒残留及其提取试验。在WMV弱毒株的提取中，将预先感染了WM14株的南瓜品种EBISU感染叶以－80℃冷冻保存后使用。
对冷冻感染叶加入叶重量的2.5倍量的提取缓冲液(0.3M磷酸钾缓冲液、0.01MEDTA、pH7.5、0.1％巯基乙醇)，利用高速混合机磨碎(15分钟、4℃)。之后，离心分离(7,000rpm、25分钟、4℃)，得到上清液和离心沉渣。向该离心沉渣中添加沉渣容量的3倍量的提取缓冲液，再利用高速混合机再悬浊10分钟，离心分离(7,000rpm、25分钟、4℃)，得到再悬浊上清液。此时，提取缓冲液使用未添加Triton(注册商标)X-100的溶液、添加Triton(注册商标)X-100至最终浓度0.5容量％的溶液。与实施例12同样操作，测定所得到的各含WM14株液的病毒含量。
将结果示于表15。离心沉渣中的WM14株的含量在未添加Triton(注册商标)X-100时为102.25ID50/0.3mL，在Triton(注册商标)X-100为0.5容量％时为102.75ID50/0.3mL，因此明确了与CM14株同样不向离心上清液浮游而大量残留在WM14株的离心沉渣中。还确认了通过添加Triton(注册商标)X-100，能够从离心沉渣中高效地提取WM14株。
[表15]
实施例14：WMV弱毒株的高提取条件的确立
对提高WMV弱毒株的提取效率的条件进行验证。向冷冻感染叶中添加叶重量的2.5倍量的与实施例13相同的提取缓冲液(0.3M磷酸钾缓冲液、0.01M EDTA、pH7.5、0.1％巯基乙醇)，利用高速混合机磨碎(15分钟、4℃)。之后，离心分离(7,000rpm、25分钟、4℃)，得到上清液(1)和沉渣。向上述提取缓冲液中添加Triton(注册商标)X-100至最终浓度0.5％，向所得到的沉渣中加入沉渣容量的3倍量，再利用高速混合机再悬浊10分钟，离心分离(7,000rpm、25分钟、4℃)，得到上清液(再悬浊上清液(2))。之后，将(1)和(2)液混合。与实施例12同样操作，测定所得到的各含WM14株液的病毒含量。
将结果示于表16。关于WM14株的含量，离心上清液为102.5ID50/0.3mL，但再悬浊上清液为高至102.75ID50/0.3mL的值。另外，离心上清液(1)与所得到的沉渣的再悬浊上清液(2)的混合液为102.75ID50/0.3mL。根据以上的说明明确了通过添加Triton(注册商标)X-100而进行的离心沉渣的再悬浊在WM14株的提取中是有效的。
[表16]
使用添加Triton(注册商标)X-100后的提取缓冲液，进行WM14株的提取试验。在感染叶的磨碎中，向与实施例13相同的缓冲液(0.3M磷酸钾缓冲液、0.01M EDTA、pH7.5、0.1％巯基乙醇)中添加Triton(注册商标)X-100至最终浓度0.5容量％，使用所得到的溶液作为提取缓冲液。向冷冻感染叶中加入叶重量的2.5倍量的添加Triton(注册商标)X-100的提取缓冲液，利用高速混合机磨碎(15分钟、4℃)。之后，离心分离(7,000rpm、25分钟、4℃)，得到上清液。与实施例12同样操作，测定所得到的各含WM14株液的病毒含量。
将结果示于表16。WM14株的含量与未添加Triton(注册商标)X-100的离心上清液102.50ID50/0.3mL相比，添加Triton(注册商标)X-100 0.5容量％时，为高至103.25ID50/0.3mL的值，因此明确了利用添加有Triton(注册商标)X-100的提取缓冲液磨碎感染叶在WM14株的提取中是有效的。
序列表
<110> 株式会社微生物化学研究所
<120> 黄瓜花叶病毒弱毒株
<130> W2032PCT
<150> JP2018-126965
<151> 2018-07-03
<160> 9
<210> 1
<211> 333
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: CMV H23的2b蛋白
<400> 1
atggaattga acgtaggtgc aatgacaaac gtcgaactcc aactggctcg tatggtggag 60
gcgaagaagc agagacgaag gtctcacaag cagaatcgac gggaacgagg tcacaaaagt 120
cccagcgaga gagcgcgttc aaatctcaga ctgttccgct tcctaccgtt ctatcaagta 180
gatggttcgg aactgccagg gtcgtgccgc catgcgaacg tggcggagtt gcccgagcct 240
gaggcctctc gtttagagtt atcggcggaa gaccatgatt ttgacgatac agattggttc 300
gccggtaacg aatgggcgga aggtgctttc tga 333
<210> 2
<211> 321
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: CMV CM14的弱毒化2b蛋白
<400> 2
atggaattga acgtaggtgc aatgacaaac gtcgaactcc aactggctcg tatggtggag 60
gcgaagaagc agagacgaag gtctcacaag cagaatcgac gggaacgagg tcacaaaagt 120
cccagcgaga gagcgcgttc aaatctcaga ctgttccgct tcctaccgtt ctatcaagta 180
gatggttcgg aactgccagg gtcgtgccgc catgcgaacg tggcggagtt gcccgagcct 240
gaggcctctc gtttagagtt atcggcggaa gaccatgatt tgacgataca gattggttcg 300
ccggtaacga ttgggcggta g 321
<210> 3
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: CMV CM14的弱毒化2b蛋白
<400> 3
Met Glu Leu Asn Val Gly Ala Met Thr Asn Val Glu Leu Gln Leu Ala
1 5 10 15
Arg Met Val Glu Ala Lys Lys Gln Arg Arg Arg Ser His Lys Gln Asn
20 25 30
Arg Arg Glu Arg Gly His Lys Ser Pro Ser Glu Arg Ala Arg Ser Asn
35 40 45
Leu Arg Leu Phe Arg Phe Leu Pro Phe Tyr Gln Val Asp Gly Ser Glu
50 55 60
Leu Pro Gly Ser Cys Arg His Ala Asn Val Ala Glu Leu Pro Glu Pro
65 70 75 80
Glu Ala Ser Arg Leu Glu Leu Ser Ala Glu Asp His Asp Leu Thr Ile
85 90 95
Gln Ile Gly Ser Pro Val Thr Ile Gly Arg
100 105
<210> 4
<211> 1371
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: WMV WM14的HC-Pro
<400> 4
tcccatgttc cagaagttca attctttcta ggttggaaga aggtatttga caagatgcaa 60
ccacgagttg gtactcatga gtgcacaatc gatttcacaa atgaacaatg tggtgaattg 120
gcagcagcaa ttagtcaatc gatttttccg gttaagaaat tgtcatgtaa acattgcagg 180
cgacacatca aggatcttag ttgggaggaa tataaacaat ttcttctaac tcatatgggt 240
tgttctgagg ccacatggga ggatgttcga aaagctgagg gcatggagca cgtgaagaaa 300
ttaattgaaa gatcgactgc agagaatctg agcttacaaa cgtcaatgga aattgtaagg 360
ttgacacaga attacaagag cacacatatg ctgcaaatac aggacatcaa caaggctctc 420
atgaaaggtt cattggtgac acaagatgaa ctggagcaag cttccaaaca acttcttgcc 480
atgacacagt ggtggaagaa tcacatgacc ttgactgatg aagatgcact taaagtgttt 540
agaaataagc gatcttccaa agcattgctt aatccaagtt tgctctgtga taatcagttg 600
gacaagaacg gaaattttgt ttggggtgag cgcggtaagc attcaaagcg tttcttcgca 660
aattattttg aagaggtggt tccttccgaa ggatatagta aatatgttgt taggaaaaac 720
ccaaatggac agagagaatt agcaattggg tcgctcattg taccattaga cttcgagcgt 780
gcacgcatgg cattgcaagg caaaagtata gcaagggaac caattacaat ggcgtgcatt 840
tcaaggcagg atggtaactt tgtatatcct tgttgctgtg tcacacatga tgatgggaag 900
gccttctatt ctgaacttaa aagtcctaca aaacgccact tggttattgg gacatctggt 960
gacccgaaat atattgacct cccagccact gaaacagatc gcatgtatat agcaaaggaa 1020
ggatattgct atctcaatat ctttttaaca atgttggtca atgtcaatga ggatgaagcc 1080
aaggatttca ccaaaatggt cagagatgtc attgtaccaa agcttgggca atggccgaca 1140
atgtttgatg tggccacagc tgtgtatatg ttgacagttt ttcatcctga aactagaaat 1200
gctgaacttc cacgtattct ggttgaccat gcatgccaga ctatgcacgt tatagactct 1260
tttggttctc tgacagttgg atatcatgta ctaaaagctg gcacagtgaa tcagcttatt 1320
cagttcgcgt caaacgatct gcaaagcgag atgaagttct atagggttgg t 1371
<210> 5
<211> 457
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: WMV WM14的HC-Pro
<400> 5
Ser His Val Pro Glu Val Gln Phe Phe Leu Gly Trp Lys Lys Val Phe
1 5 10 15
Asp Lys Met Gln Pro Arg Val Gly Thr His Glu Cys Thr Ile Asp Phe
20 25 30
Thr Asn Glu Gln Cys Gly Glu Leu Ala Ala Ala Ile Ser Gln Ser Ile
35 40 45
Phe Pro Val Lys Lys Leu Ser Cys Lys His Cys Arg Arg His Ile Lys
50 55 60
Asp Leu Ser Trp Glu Glu Tyr Lys Gln Phe Leu Leu Thr His Met Gly
65 70 75 80
Cys Ser Glu Ala Thr Trp Glu Asp Val Arg Lys Ala Glu Gly Met Glu
85 90 95
His Val Lys Lys Leu Ile Glu Arg Ser Thr Ala Glu Asn Leu Ser Leu
100 105 110
Gln Thr Ser Met Glu Ile Val Arg Leu Thr Gln Asn Tyr Lys Ser Thr
115 120 125
His Met Leu Gln Ile Gln Asp Ile Asn Lys Ala Leu Met Lys Gly Ser
130 135 140
Leu Val Thr Gln Asp Glu Leu Glu Gln Ala Ser Lys Gln Leu Leu Ala
145 150 155 160
Met Thr Gln Trp Trp Lys Asn His Met Thr Leu Thr Asp Glu Asp Ala
165 170 175
Leu Lys Val Phe Arg Asn Lys Arg Ser Ser Lys Ala Leu Leu Asn Pro
180 185 190
Ser Leu Leu Cys Asp Asn Gln Leu Asp Lys Asn Gly Asn Phe Val Trp
195 200 205
Gly Glu Arg Gly Lys His Ser Lys Arg Phe Phe Ala Asn Tyr Phe Glu
210 215 220
Glu Val Val Pro Ser Glu Gly Tyr Ser Lys Tyr Val Val Arg Lys Asn
225 230 235 240
Pro Asn Gly Gln Arg Glu Leu Ala Ile Gly Ser Leu Ile Val Pro Leu
245 250 255
Asp Phe Glu Arg Ala Arg Met Ala Leu Gln Gly Lys Ser Ile Ala Arg
260 265 270
Glu Pro Ile Thr Met Ala Cys Ile Ser Arg Gln Asp Gly Asn Phe Val
275 280 285
Tyr Pro Cys Cys Cys Val Thr His Asp Asp Gly Lys Ala Phe Tyr Ser
290 295 300
Glu Leu Lys Ser Pro Thr Lys Arg His Leu Val Ile Gly Thr Ser Gly
305 310 315 320
Asp Pro Lys Tyr Ile Asp Leu Pro Ala Thr Glu Thr Asp Arg Met Tyr
325 330 335
Ile Ala Lys Glu Gly Tyr Cys Tyr Leu Asn Ile Phe Leu Thr Met Leu
340 345 350
Val Asn Val Asn Glu Asp Glu Ala Lys Asp Phe Thr Lys Met Val Arg
355 360 365
Asp Val Ile Val Pro Lys Leu Gly Gln Trp Pro Thr Met Phe Asp Val
370 375 380
Ala Thr Ala Val Tyr Met Leu Thr Val Phe His Pro Glu Thr Arg Asn
385 390 395 400
Ala Glu Leu Pro Arg Ile Leu Val Asp His Ala Cys Gln Thr Met His
405 410 415
Val Ile Asp Ser Phe Gly Ser Leu Thr Val Gly Tyr His Val Leu Lys
420 425 430
Ala Gly Thr Val Asn Gln Leu Ile Gln Phe Ala Ser Asn Asp Leu Gln
435 440 445
Ser Glu Met Lys Phe Tyr Arg Val Gly
450 455
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 引物PeR2-2367F
<400> 6
tagtacagag ttcagagttg agcg 24
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 引物PeR2-2967R
<400> 7
gtccttccga agaaacctag g 21
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 引物WMV-1389F
<400> 8
tgtgcgaggt agagagaatg g 21
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 引物WMV-2865R
<400> 9
ttcacacttc atcctttgtt g 21
Claims (15)
1.一种黄瓜花叶病毒弱毒株，其特征在于：
在基因组中，具有从编码2b蛋白的序列编号1所示的RNA的5′侧算起第279位～第282位的碱基序列中缺失了1个或2个碱基的RNA，或者具有在所述第279位～第282位的碱基序列中插入了1个或2个碱基的RNA。
2.如权利要求1所述的黄瓜花叶病毒弱毒株，其特征在于：
编码2b蛋白的RNA包含序列编号2所示的碱基序列。
3.如权利要求1或2所述的黄瓜花叶病毒弱毒株，其特征在于：
具有由序列编号3所示的氨基酸序列构成的2b蛋白。
4.一种葫芦科植物用的花叶病抗病性诱导剂，其特征在于：
含有权利要求1～3中任一项所述的黄瓜花叶病毒弱毒株作为有效成分。
5.如权利要求4所述的葫芦科植物用的花叶病抗病性诱导剂，其特征在于：
还含有在基因组中具有编码辅助成分蛋白酶的序列编号4所示的RNA的西瓜花叶病毒弱毒株。
6.如权利要求5所述的葫芦科植物用的花叶病抗病性诱导剂，其特征在于：
所述西瓜花叶病毒弱毒株具有由序列编号5所示的氨基酸序列构成的辅助成分蛋白酶。
7.一种葫芦科植物的花叶病防治方法，其特征在于：
对葫芦科植物接种权利要求1～3中任一项所述的黄瓜花叶病毒弱毒株。
8.如权利要求7所述的葫芦科植物的花叶病防治方法，其特征在于：
对葫芦科植物还接种在基因组中具有编码辅助成分蛋白酶的序列编号4所示的RNA的西瓜花叶病毒弱毒株。
9.如权利要求7或8所述的葫芦科植物的花叶病防治方法，其特征在于：
所述西瓜花叶病毒弱毒株具有由序列编号5所示的氨基酸序列构成的辅助成分蛋白酶。
10.一种葫芦科植物，其特征在于：
其接种了权利要求1～3中任一项所述的黄瓜花叶病毒弱毒株，该葫芦科植物具有花叶病抗病性。
11.如权利要求10所述的葫芦科植物，其特征在于：
其还接种了在基因组中具有编码辅助成分蛋白酶的序列编号4所示的RNA的西瓜花叶病毒弱毒株。
12.如权利要求11所述的葫芦科植物，其特征在于：
所述西瓜花叶病毒弱毒株具有由序列编号5所示的氨基酸序列构成的辅助成分蛋白酶。
13.一种花叶病毒弱毒株的提取方法，其特征在于：
使用包含聚(氧乙烯)辛基苯基醚的添加有非离子系表面活性剂的提取缓冲液，从花叶病毒弱毒株感染叶进行提取。
14.如权利要求13所述的提取方法，其特征在于：
所述提取方法得到的是花叶病毒弱毒株感染叶的磨碎物离心沉淀后的上清液与使用所述添加有非离子系表面活性剂的提取缓冲液从沉渣得到的提取物的混合液，或者是使用所述添加有非离子系表面活性剂的提取缓冲液而得到的磨碎物的离心沉淀上清液。
15.如权利要求13或14所述的提取方法，其特征在于：
所述花叶病毒为黄瓜花叶病毒或西瓜花叶病毒。
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