JP3728381B2 - サテライトｒｎａ、キユウリモザイクウイルス弱毒ウイルス、キユウリモザイクウイルスの防除法およびキユウリモザイクウイルス抵抗性植物 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、多くの作物に接種してもその防除効果を奏し、また継代接種しても強毒ウイルスとして変異しない、そしてピーマンなどに接種した場合においても、ウイルス症状が極めて弱い性質を有するサテライトＲＮＡ、を含むキユウリモザイクウイルス弱毒ウイルス、該弱毒ウイルスを用いるキユウリモザイクウイルスの防除法およびキユウリモザイクウイルス抵抗性植物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
一般に、植物には既に感染しているウイルス病と同じウイルスまたは極めて近縁なウイルスには感染しにくいという現象（干渉作用）があるので、植物に容易に感染して、その体内で盛んに増殖しても植物そのものの生育にほとんど影響を及ぼさない程度の弱い病原性のウイルス（以下、弱毒ウイルスという）を、無病の植物にあらかじめ感染させると強毒ウイルスの感染や被害を防ぐこと（以下、防除という）が可能となる。
【０００３】
従来、この現象を利用したキユウリモザイクウイルス（以下、ＣＭＶということがある）の防除法が知られているが、従来知られている弱毒ウイルスは、非常に少ない植物に対してのみ、その防除効果を奏するものであり、対象としない植物に対しては反対にキユウリモザイクウイルス症による病害をもたらすという欠点を有する。従って、圃場などにおいて適用する場合、対象としない植物に感染してモザイク、糸葉、黄化、矮化、えそなどの病害がでる影響を考慮し、隔離した状態での栽培を余儀なくされる欠点を有する。また、一般に弱毒ウイルスは、常に変異を起こす可能性があり、継代接種や圃場での利用の過程で、突然変異などによって強毒ウイルスに変化して、対象作物などに病害が生じる危険性を有する。そのため作出した弱毒ウイルスは、継代接種してウイルス症状の変化を調べることが、非常に重要であるが、その操作に労力と時間を要する欠点を有する。
【０００４】
一方、ピーマンもＣＭＶに感染すると、葉は明瞭なモザイク症状となり、株は萎縮し、果実は硬化し変形する。特に近年、風味、歯応えが良好で、赤色、黄色などの色が鮮やかで、艶があり、形がよく、大きい、カラーピーマンの需要が伸びているが、このカラーピーマンも、ＣＭＶに対する防除が難しく、またこのウイルスに効果的な防除薬はなく、一度感染し発病すれば、症状は回復せず、品質が劣化し、収量が低下する。
しかしながら、ピーマンに発生するＣＭＶを特に対象にした弱毒ウイルスについては、これまでのところ知られていないため、従来公知のナス科およびウリ科作物を対象に作出された弱毒ウイルスを取り寄せ、ピーマンでの適応性を検討し、利用しているにすぎない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、多くの作物に接種してもその防除効果を奏し、また継代接種しても強毒ウイルスとして変異しない、そしてピーマンなどに接種した場合においても、ウイルス症状が極めて弱い性質を有するサテライトＲＮＡ、を保有するキユウリモザイクウイルス弱毒ウイルス、該弱毒ウイルスを用いるキユウリモザイクウイルスの防除法およびキユウリモザイクウイルス抵抗性植物を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、このような課題を解決するため、種々検討を重ねた結果、自然界より得たウイルス症状の軽微なＣＭＶのなかから、上記課題を解消するサテライトＲＮＡの選抜を重ねた結果、多種の作物に感染してもウイルス症状が極めて軽微であって、その弱毒ウイルスを対象作物の苗に接種しておくことにより一般栽培圃場において多種、多様の強毒ＣＭＶに対して防除効果を有し、また植物に継代接種しても変異せず症状が安定して、農薬散布等の環境汚染の問題がなく安全で、直ちに実用化できるサテライトＲＮＡを探索することに成功し、これに基づいて本発明を完成した。
【０００７】
即ち（１）本発明は、配列番号１の塩基配列を含むサテライトＲＮＡを含むキユウリモザイクウイルス弱毒ウイルスであり、（２）また本発明は、配列番号１の塩基配列を含むサテライトＲＮＡを含むキユウリモザイクウイルス弱毒ウイルスであり、（３）また本発明は、上記キユウリモザイクウイルス弱毒ウイルスを植物に接種することを特徴とするキユウリモザイクウイルスの防除法であり、（４）また本発明は、上記キユウリモザイクウイルス弱毒ウイルスを接種して得られるキユウリモザイクウイルス抵抗性植物であり、（５）また本発明は、上記キユウリモザイクウイルス弱毒ウイルスを接種して得られるキユウリモザイクウイルス抵抗性植物の一部を組織培養して得られるキユウリモザイクウイルス抵抗性植物であり、（６）また本発明は上記キユウリモザイクウイルス弱毒ウイルスを接種して得られるキユウリモザイクウイルス抵抗性植物の一部を栄養繁殖して得られるキユウリモザイクウイルス抵抗性植物である。
【０００８】
以下、本発明を詳細に説明する。
（１）キユウリモザイクウイルス弱毒ウイルスの採取と作出
１９８８年に関東から甲信越にかけて５０か所の圃場より、ナス科、ウリ科、キク科、アブラナ科などの植物からウイルス症状の葉を３００枚採集し、これらの葉に１０倍量のリン酸緩衝液（中性付近の０．１Ｍリン酸緩衝液）を加えて磨砕しその液をトマト（日本デルモンテ社製ＴＭＫ１４３）に接種して一週間後、各々のエライザ−検定を行った結果、１４４系統についてＣＭＶの感染を確認した。
これらの中から弱毒ウイルスを選抜すべく、１４４系統のトマトの感染葉をそれぞれトマト（ＴＭＫ１４３）１０株ずつに接種し、一週間後、リボ核酸（ＲＮＡ）分析を行った結果、サテライトＲＮＡを有するＣＭＶが１１系統から検出された。その後それらについてウイルス症状調査を行い、ネクロシス、モザイクが発病した系統や感染力を有しない系統を取り除き、ウイルス症状が軽微でウイルス増殖量の多い弱毒ウイルスを選抜した。
この選抜した弱毒ウイルスは遺伝的に均一でなく、ウイルス症状が異なったので、トマト５００株にこのウイルスを接種し、弱いウイルス症状が揃っている株だけを選抜し、さらにサテライトＲＮＡの存在が継続されている株だけを採集して、ウイルス接種液の調製を行い、再度トマトに接種し、同じ選抜操作をしてウイルス接種液の調製する作業を５回繰り返し、トマトで継代接種を行ってサテライトＲＮＡを安定して含む弱毒ウイルス（ＮＤＭ−３）を作出した。
【０００９】
（２）サテライトＲＮＡの単離
サテライトＲＮＡを含む弱毒ウイルス（ＮＤＭ−３）をトマトの子葉に接種、感染させ、１〜４週間程度ウイルスを増殖させた後、トマト子葉を採取し超低温にて凍結した。この感染葉を粉砕し、２倍量の ０．１％チオグリコ−ル酸を含む ０．５Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ６．５）と同量のクロロホルムを加え、ワ−リングブレンダ−で破砕した。この破砕液を９，５００Ｘｇ、１０分間遠心し、上層（水層）の１０％に当たる重量のポリエチレングリコ−ルを加え溶解させた後、４０分間静置した。この溶液を９，５００Ｘｇ、２０分間遠心し、得られた沈殿に２％トライトンＸ−１００を含む０．０５Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ７．０） を加え懸濁均一化した。この粗精製品を１２，０００Ｘｇで遠心分離した上清を２４０，０００Ｘｇ、４５分間遠心し、沈殿を回収した後 １０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０） に懸濁した。この溶液に最終濃度で１％になるように１０％ ＳＤＳを加え、さらに溶液と等量のフェノ−ルを加えた後１２，０００Ｘｇ、１５分間遠心した。この上層（水層）を回収し常法に従ってエタノ−ル沈殿を繰り返してＲＮＡを単離、精製した。この方法で感染葉１００ｇより約１００μｇのＲＮＡを得た。上記の方法で得られたＲＮＡを水に溶解し、１０〜４０％ショ糖密度勾配により超遠心分離(１７５，０００Ｘｇ，１６時間）して得られたサテ ライトＲＮＡのバンドを採取し、常法に従ってエタノ−ル沈殿を繰り返してサテライトＲＮＡを単離精製した。精製が不十分な場合は６Ｍ尿素を含む９％ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行なった後、臭化エチジウムの溶液で染色し、サテライトＲＮＡのバンドの部分をカミソリ等で切り取った。サテライトＲＮＡのバンドを含むゲル断片を透析チュ−ブに入れＥＤＴＡを含むトリス−酢酸緩衝液中で電気泳動による溶出を行なってサテライトＲＮＡを回収した後、常法に従ってエタノ−ル沈殿を繰り返してサテライトＲＮＡを単離精製した。この電気泳動によるサテライトＲＮＡの溶出の詳細はＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓらの方法［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８２）］に従って行なった。
【００１０】
（３）サテライトＲＮＡのクロ−ニングとシ−クエンス
単離精製したサテライトＲＮＡからマイナス鎖（以下−鎖と表記する）ｃＤＮＡを合成するために、サテライトＲＮＡ（約３μｇ）と３´末端塩基配列に相補的なＤＮＡプライマー（８塩基、１μｇ）を９５℃に加熱した後、徐冷してＲＮＡとＤＮＡプライマ−をアニ−リングさせた。−鎖ｃＤＮＡ合成反応は以下の緩衝液中で１．５時間、４２℃に放置することによって行なった。［ｃＤＮＡ合成反応液；５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ 、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2 、１４０ｍＭ ＫＣｌ、３０ｍＭ β−ｍｅｒｃａｐｔｏ−ｅｔｈａｎｏｌ,５００μＭ ｄＮ ＴＰ 、５０μＣi[α−３２Ｐ]ｄＣＴＰ、１５０ｕｎｉｔｓ ＲＮａｓｉｎ（Ｐ ｒｏｍｅｇａ）、１０５ｕｎｉｔｓ ＡＭＶ ｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）］。
−鎖ｃＤＮＡ合成反応はＦｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ） を用いて行った。次 に、得られたｃＤＮＡをＰＣＲ法によって増幅させた。すなわち、プラス鎖サテライトＲＮＡの５´末端に相同的なＤＮＡプライマ−と３´末端塩基配列に相補的なＤＮＡプライマーを用い、９４℃１分間、３７℃１分間、７２℃２分間の反応を４５回繰り返すことによってＰＣＲ反応を行った。
［ＰＣＲ反応液；１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2 、５０ｍＭ ＫＣｌ、１００μＭ ｄＮＴＰ、５ｕｎｉｔｓ Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）］
このｃＤＮＡを１．５％アガロースゲル電気泳動によって分離させた後、ゲルより切り出し、ＤＮＡ回収キットＧＥＮＥＰＵＲＥ（ニッポンジーン）を用いて精製した。得られたｃＤＮＡをＴ−Ａクローニング用ベクターｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に導入した。このプラスミドを制限酵素ＥｃｏＲＩで切断することによってサテライトＲＮＡ由来のｃＤＮＡの存在を確認した。
【００１１】
このサテライトＲＮＡの塩基配列をＴｈｅｒｍｏ Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）とＤＮＡシーケンサＤＳＱ−１０００Ｌ（島津製作所製）を用いて決定し、３３９塩基から成る塩基配列を配列番号１に示した。
この配列番号１に示すサテライトＲＮＡの塩基配列に相同的な塩基配列を有するプラスミドを大腸菌に導入し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９（ｐＮＤＭ３Ａ）ＦＥＲＭ Ｐ−１６７０１として工業技術院生命工学技術研究所に寄託した。
【００１２】
【配列表】
【００１３】
（４）弱毒ウイルス（ＮＤＭ−３）の接種源作成
弱毒ウイルス（ＮＤＭ−３）に感染したトマト葉１ｇに緩衝液（中性付近の０．１Ｍリン酸緩衝液）を加えた磨砕液１０ｍｌをトマト１００株の子葉または本葉に接種し、１〜２週間程度ウイルスを増殖させたのち、トマト感染葉１５０ｇを採取し、超低温−８０℃で凍結した。この感染葉を粉砕した後、０．１％チオグリコ−ル酸を含む０．５Ｍクエン酸緩衝液（ＰＨ６．５）３００ｍｌと同量のクロロホルムを加え、ワ−リングブレンダ−で磨砕し、ＣＭＶ粒子を含む磨砕液を得た。この磨砕液を２，０００ Ｘｇ、１０分間遠心し、上層（水層）１２０ ｍｌを回収し、それに１０重量％の粉末ポリエチレングリコ−ル１２ｇを加え溶解させた後、４０分静置して、析出させ、沈殿し易くした。
この溶液を９，５００ Ｘｇ、２０分間遠心し、得られた沈殿（ＣＭＶ粒子） を回収し、これに２％トライトンＸ−１００を含む０．０５Ｍクエン酸緩衝液（ＰＨ７．０）を洗浄のため加え溶解した。
これを１２，０００Ｘｇで遠心分離し、ＣＭＶ粒子を含む上澄を分取して、これを２４０，０００Ｘｇ、４５分間遠心し、得られた沈殿を１０ｍＭリン酸緩衝液に懸濁して、弱毒ウイルス（ＮＤＭ−３）のＣＭＶ粒子を約１０ｍｇ抽出し、接種源を得た。
【００１４】
弱毒ウイルスを接種する時期は、目的とする植物の生育中の適宜な時期でよいが、植物の幼苗の時期が好ましい。
【００１５】
キユウリモザイク弱毒ウイルスの接種の方法は、純化した弱毒ウイルスの粒子を５０〜５００μｇ／ｍｌになるように燐酸緩衝液に懸濁し、公知の方法により接種すればよく、例えば、噴霧ローラー法（特開平４−３３０００５号参照）で行なうことが好ましい。すなわち、植物体の表面に弱毒ウイルスと研磨材を介在させて、ローラーを圧接回転せしめ、該植物体を被傷せしめると共に該弱毒ウイルスの接種を行なう方法または、目的とする植物体の表面に、研磨材の散布と弱毒ウイルス懸濁液の噴霧を行い、その上からローラーを接触回転させる方法で行うことが好ましい。この方法は、少量の弱毒ウイルス液で、迅速、簡便、かつ高い感染率で接種することができる特徴を有する。
【００１６】
こうして、植物体に弱毒ウイルスを接種すると、容易に弱毒ウイルスが全身に感染した植物苗が得られる。
したがって、この植物体を適当な大きさに切断したあと、挿し木し、通常の育苗管理をすると、容易に弱毒ウイルスが全身に感染した植物苗が得られる。
【００１７】
また、この植物体を適当な大きさに切断したあと、これを穂木として、弱毒ウイルスの接種していない他の台木に接ぎ木し、通常の育苗管理をすると、台木に弱毒ウイルスが移行し、容易に弱毒ウイルスが全身に感染した植物体が得られる。
【００１８】
さらにまた、この植物体からその一部（例えば側芽）を採り、消毒した後、植物ホルモンを適宜の濃度で含有する寒天培地に挿し芽し、外界と隔離された室内で、至適な温度、照度条件下で育成し、幼苗（例えば本葉の十分展開した幼苗）を得、この葉片を適当な大きさに切断したあと、植物ホルモンを適宜の濃度で含有する寒天培地に２〜４回移植し、通常の植物体の組織培養法と同様に操作して、葉片から直接誘導させた不定芽から個体の再生を行い弱毒ウイルス保毒苗を大量に得ることができる（例えば「今月の農業 ２月号（１９９２）」１０２〜１０５頁、弱毒ウイルス感染作物の組織培養不定芽誘導法による弱毒ウイルス保毒トマトの増殖方法参照）。また植物体からその一部を採り、植物ホルモンを適宜の濃度で含有する寒天培地に２〜４回移植し、カルスから誘導させた不定芽から個体の再生を行い、弱毒ウイルス苗を大量に得ることができる。
【００１９】
【実施例】
以下実施例を示して本発明をより具体的に説明する。
実施例１
弱毒ウイルス（ＮＤＭ−３）の安定性
外界から隔離されてあるガラス温室において、弱毒ウイルス（ＮＤＭ−３）のウイルス粒子を５０〜５００μｇ／ｍｌの接種濃度にし、トマト（品種はＴＭＫ１４３）において、子葉または本葉に接種し、５世代以上にわたって継代接種して本葉６〜８枚期までウイルス症状が現れるか否か調べた結果、ウイルス症状はまったく発生せず、変異によってえそやモザイク症状が発生しない安定している弱毒ウイルス（ＮＤＭ−３）であることが分かった。
【００２０】
実施例２
弱毒ウイルス（ＮＤＭ−３）の多種作物に対する影響
外界から隔離されてあるガラス温室において、ナス、マメ、ヒユ、ウリ、アカザ、アブラナ、キク科などの作物の種子を播種し、発芽して１０〜２０日後それぞれの作物の幼苗に弱毒ウイルス（ＮＤＭ−３）、公知の弱毒ウイルス（ＮＤＭ−１）（植物防疫、１９９６、１ ＶＯＬ５０ 第２３頁参照）および外界から得た強毒ウイルス（ＣＭ８５−３）のＣＭＶ粒子を４００μｇ／ｍｌの接種濃度で５〜１０株ずつ接種し、同時に無接種株も５〜１０株ずつ設けて、それぞれの作物のウイルス症状を接種後一ケ月以上にわたって調査した。無接種には全くウイルス症状が現れなかったので調査結果を示さないが、弱毒ウイルス（ＮＤＭ−３）接種株、公知弱毒ウイルス（ＮＤＭ−１）接種株および強毒ＣＭＶ（ＣＭ８５−３）接種株についてウイルス症状結果を表１に示した。
【００２１】
ａ）病徴：0無病徴、ｃｓ弱いクロロシス、ＣＳクロロシス、ｍ弱いモザイク、 Ｍモザイク、ｙ弱い黄化、Ｙ黄化、ｓｔやや矮化、Ｓｔ矮化、Ｒ縮葉、Ｎ壊死、Ｌ局部斑点
ｂ）戻し接種：弱毒ＣＭＶまたは強毒ＣＭＶをそれぞれの植物に接種して１０日以上経過した後、その植物の葉を擦り潰して液汁を採取し、これをササゲ（品種：黒種３尺）の初生葉に接種して局部斑点の発生（すなわち感染）の有無を調べた。＋は局部斑点有り（ＣＭＶ検出）、−は無し（ＣＭＶ不検出）を示す。
※ピ−マンの戻し接種では、ササゲの局部斑点は発生しにくいことから、ＣＭＶ不検出であった。そこで、全品種全株について、ウイルス全核酸分析を行なった。その結果、全株からＣＭＶを検出した。＋は、その感染を示す。
【００２２】
表１より、対照の強毒ウイルス（ＣＭ８５−３）は、多くの作物に感染してモザイク、糸葉、黄化、矮化、えそなどの病徴がでる欠点を有することが判る。また、従来公知の弱毒ウイルスＮＤＭ−１は、トマト、ナス、タバコに適用した場合、比較的軽微であるがモザイクの病徴が観察され、またピーマン、メロンに対しては、強いモザイクの病徴が観察され、適用することができない。これに対し、本発明により得られた弱毒ウイルスは、トマト、ナス、タバコばかりでなく、ピーマンおよびメロンなど適用作物の種類が多く、しかも適用した場合、現れるウイルス症状が、極めて軽微であるか、まったくないことが判る。すなわち、より多くの作物へ感染して、その弱毒効果を奏し、ウイルス症状への影響は極めて少ないことが判る。
【００２３】
上記実施例１および実施例２の結果より、本発明の自然界から選択分離した配列番号１の塩基配列を含むサテライトＲＮＡを有する弱毒ウイルス（ＮＤＭ−３）は、変異しにくく、多種の作物に対してウイルス症状が極めて軽微で、安全な弱毒ウイルスであることが分かった。
【００２４】
実施例３
本発明の弱毒ウイルス（ＮＤＭ−３）の外界強毒ＣＭＶに対する防除効果試験
（１）弱毒ウイルス（ＮＤＭ−３）接種苗の育成及び植え付け
タキイ種苗社製の培土「たねまき培土」とホ−ネン社製の同「セルトップミックス」を１：１に混合して作成した育苗培土を、ヤンマ−農機社製の２００穴トレイに充填し、これに、カラ−ピ−マンの種子「ゴ−ルデンサマ−ハイブリット（米国ピ−トシ−ド社製）」を３月上旬に播種して育苗管理し、本葉０．５枚期に弱毒ウイルス（ＮＤＭ−３）粒子をリン酸バッファに希釈して噴霧ロ−ラ−法（特開平４−３３０００５号参照）により接種した。
弱毒ウイルスの感染確認は、接種１０日後に接種苗をランダムに選び、その苗の本葉片（０．２ｇ程度）を採取してすり潰し、液汁を作成した後、全核酸をフェノ−ル抽出し、ＮＤＭ−３の２本鎖サテライトＲＮＡのバンドの位置を電気泳動で確認する分析方法で行った。その結果、配列番号１の塩基配列を含むサテライトＲＮＡを１００％（２４株／２４株中）検出した。また弱毒ウイルスを接種したすべての苗には接種後２０日頃より本葉に軽微なウイルス症状であるクロロシスが発生し、この点からも感染を確認することが出来た。
播種して３０日後、黒ポリポット（１０．５ｃｍ）に仮植して４０日目の本葉約１０枚、草丈約１２ｃｍの苗を、弱毒ウイルス（ＮＤＭ−３）接種苗と無接種苗とに振り分け、５月中旬にそれぞれ３７株ずつナス科作物栽培１年目の露地圃場の畦（畦の高さ約２０ｃｍ）に畦間１５０ｃｍ、株間５０ｃｍ（１０ａ当り植え付け本数１，３３３株）として一条に植え付けた。１０ａ当りの元肥の施肥成分量はＮ：１２ｋｇ、Ｐ2 Ｏ5 ：２６ｋｇ、Ｋ2 Ｏ：１２ｋｇとし、堆肥を約２トン施した。
【００２５】
（２）弱毒ウイルス（ＮＤＭ−３）接種の外界ウイルスに対する防除効果
圃場に植え付けた後、それぞれの株に支柱（長さ１．２ｍ、外径２ｃｍ）を立て、生育するに従い紐で株を巻き縛り側枝の枝折れ防止を図った。また、最初に着果した果実は３〜４ケ摘除し、生育の促進を促した。ピ−マンは乾燥に弱いので、灌水は晴天時には毎回株当たり２〜４リットル行った。また、６月下旬より２週間おきに液肥（大塚製薬社製ＯＫ−Ｆ１）を１００〜３００倍に薄めて株元に灌注した。 アブラムシ媒介による外界ウイルスの感染を図るため、栽培圃場での殺虫剤、殺菌剤などの農薬散布は一切行わなかった。そのため、５月下旬よりアブラムシが多数飛来し、外界ウイルスによるウイルス症状が無接種株に６月下旬より発生し始め、８月下旬に至ってはウイルス症状が激しく現れた。そのウイルス発生調査結果を表２に示す。
【００２６】
（ａ）植え付け後の日数
（ｂ）NS：無病徴 ｃ：クロロシス Ｍ：モザイク Ｓ：矮化 ｎ：えそ斑点
（ｃ）植え付け株数３７株の中の発病株数
【００２７】
表２より、植え付け時から３ケ月の長期の渡り、弱毒ウイルス（ＮＤＭ−３）接種株にはウイルス症状としては極めて軽微であるクロロシスが全株に発生したのみであったが、無接種株は植え付け９７日になると、モザイク、えそ、矮化などの激しい多様のウイルス症状が大発生し、健全な生育株は全く見られなくなった。従って、弱毒ウイルス（ＮＤＭ−３）接種によって外界強毒ウイルスを防ぐ効果が歴然と認められるに至った。また弱毒ウイルス（ＮＤＭ−３）接種苗の草丈が揃っていたが、無接種株はウイルスの被害を受けたため不揃いであった。
【００２８】
実施例４
次に、外界のウイルスが激しく無接種株に被害をもたらしていたので、どのようなＣＭＶが関与しているのか知るため、リボ核酸分析、ウエスタンブロツト分析などのウイルス検定を８月に供試株のすべてにおいて行った。
値は植え付け株数３７株中の検出率（％）を示す。
【００２９】
【００３０】
表３の結果から、弱毒ウイルス（ＮＤＭ−３）接種株からは配列番号１の塩基配列を含むサテライトＲＮＡを有するＣＭＶが苗の時点と同様に１００％（３７株／３７株中）検出され、外界ＣＭＶの感染による変化は見られなかった。これに対して、非接種苗からは約３９０塩基数のサテライトＲＮＡを有するＣＭＶが４１％（１５株／３７株中）、約３４０塩基数のサテライトＲＮＡを有するＣＭＶは４１％（１５株／３７株中）、サテライトＲＮＡを有しないＣＭＶが１６％（６株／３７株中）検出され、非接種株の９７％（３６株／３７株中）の株からＣＭＶが検出されるに至った。従って、多種、多様の外界ＣＭＶが無接種株に激しいウイルス症状を起こしていることが分かった。
【００３１】
次に、供試株のすべてについて８月にウエスタンブロツト分析によりＴＭＶ（ピーマンのキウリモザイクウイルスとして問題となっているトウガラシ系キウリモザイクウイルス）の感染を調べた結果、弱毒ウイルス（ＮＤＭ−３）接種株、非接種株のいずれからもＴＭＶは全く検出されず、この栽培圃場において、ＴＭＶが関与しているウイルス症状は発生していないことが判明した。このことから、非接種株のウイルス症状にはＣＭＶが大きく影響していることが分かった。
【００３２】
（３）弱毒ウイルス（ＮＤＭ−３）接種株と非接種株の収量調査比較
８月１８日から晩霜の直前の１１月４日まで着色果の収穫調査を行った。その収量調査結果を表４に示す。
【００３３】
(a) (b) (c) は株にＣＭＶが感染したことにより発生したものを示す。
（ａ）えそ果：果実の表面に茶褐色の斑点が発生した果実を示す。
（ｂ）リング斑点果：果実の表面にリング状の斑点が発生した果実を示す。
（ｃ）小果：果実の大きさが６０ｇ未満であるものを示す。（ウイルスの被害に
より株が矮化して果実の肥大が悪くなった場合に多かった）
【００３４】
表４より、弱毒ウイルス（ＮＤＭ−３）接種株のウイルス果の発生は全体個数の２％程度の発生であった。これに対して非接種株にはえそ果、リング斑点果が多く発生し、ウイルスの被害により矮化した株には小果が発生してウイルスが関与している果実は収穫果の半分近くにも及んだ。そのうえ、えそ、モザイクが発生して葉が損傷を受けている株には日焼け果、腐敗果が多く発生した。
正常果（無症状）の収量は圧倒的に弱毒ウイルス（ＮＤＭ−３）接種株が多く、非接種株を倍近く上回った。
【００３５】
次に正常果収量と一果重について、時期別に比較した結果を表５示す。
【００３６】
カラ−ピ−マンの露地栽培では、着色した１００ｇ程度の正常果実を株当たり１０ケ程度採るのが目安となるが、表−５より、弱毒ウイルス（ＮＤＭ−３）接種株は株当たり正常果が１５．８ケ採れたのに対して、非接種株は８．９ケに止まった。１０ａ当り収量においては弱毒ウイルス（ＮＤＭ−３）株は２．３トンであったのに対し、非接種は１．２トンで大幅に低かった。
１果実当り重量の調査では、弱毒ウイルス（ＮＤＭ−３）接種株がほぼ全収穫期を通じて果実の大きさが安定していたのに対して、非接種株はウイルスの被害により生育が衰え始めていたため、収穫後半には果実が小さくなり、果実の粒揃いが悪かった。
【００３７】
以上のカラ−ピ−マンの露地圃場での結果により、本発明の弱毒ウイルス（ＮＤＭ−３）接種苗は副作用であるウイルス症状が極めて弱く、強毒に変異することがなく安全で、多種多様にわたる外界の強毒ウイルスに対して歴然たる防除効果を有し、ウイルスが激しく発生する圃場において無接種苗より正常果の収量が大幅に向上し、しかも果実の粒揃いが良くなることが判明した。
【００３８】
【本発明の効果】
本発明の弱毒ウイルス（ＮＤＭ−３）は、自然界に揉まれて存在したＣＭＶの系統から選抜しているので変異しにくく、多種の作物にわたって副作用のウイルス症状は極めて弱く、継代接種しても安定な症状を示す安全な弱毒ウイルスである。
また弱毒ウイルス（ＮＤＭ−３）を作物の苗に接種し、一般栽培圃場において栽培した場合、多種、多様の強毒ＣＭＶに対して防除効果を有し、直ちに実用化できる弱毒ウイルスである。
さらに、ウイルスを媒介するアブラムシ防除の農薬や、アブラムシ忌避資材などを要せず、環境汚染の問題がなく、栽培経費を削減できる効果も合わせて奏するものである。
【発明の属する技術分野】
本発明は、多くの作物に接種してもその防除効果を奏し、また継代接種しても強毒ウイルスとして変異しない、そしてピーマンなどに接種した場合においても、ウイルス症状が極めて弱い性質を有するサテライトＲＮＡ、を含むキユウリモザイクウイルス弱毒ウイルス、該弱毒ウイルスを用いるキユウリモザイクウイルスの防除法およびキユウリモザイクウイルス抵抗性植物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
一般に、植物には既に感染しているウイルス病と同じウイルスまたは極めて近縁なウイルスには感染しにくいという現象（干渉作用）があるので、植物に容易に感染して、その体内で盛んに増殖しても植物そのものの生育にほとんど影響を及ぼさない程度の弱い病原性のウイルス（以下、弱毒ウイルスという）を、無病の植物にあらかじめ感染させると強毒ウイルスの感染や被害を防ぐこと（以下、防除という）が可能となる。
【０００３】
従来、この現象を利用したキユウリモザイクウイルス（以下、ＣＭＶということがある）の防除法が知られているが、従来知られている弱毒ウイルスは、非常に少ない植物に対してのみ、その防除効果を奏するものであり、対象としない植物に対しては反対にキユウリモザイクウイルス症による病害をもたらすという欠点を有する。従って、圃場などにおいて適用する場合、対象としない植物に感染してモザイク、糸葉、黄化、矮化、えそなどの病害がでる影響を考慮し、隔離した状態での栽培を余儀なくされる欠点を有する。また、一般に弱毒ウイルスは、常に変異を起こす可能性があり、継代接種や圃場での利用の過程で、突然変異などによって強毒ウイルスに変化して、対象作物などに病害が生じる危険性を有する。そのため作出した弱毒ウイルスは、継代接種してウイルス症状の変化を調べることが、非常に重要であるが、その操作に労力と時間を要する欠点を有する。
【０００４】
一方、ピーマンもＣＭＶに感染すると、葉は明瞭なモザイク症状となり、株は萎縮し、果実は硬化し変形する。特に近年、風味、歯応えが良好で、赤色、黄色などの色が鮮やかで、艶があり、形がよく、大きい、カラーピーマンの需要が伸びているが、このカラーピーマンも、ＣＭＶに対する防除が難しく、またこのウイルスに効果的な防除薬はなく、一度感染し発病すれば、症状は回復せず、品質が劣化し、収量が低下する。
しかしながら、ピーマンに発生するＣＭＶを特に対象にした弱毒ウイルスについては、これまでのところ知られていないため、従来公知のナス科およびウリ科作物を対象に作出された弱毒ウイルスを取り寄せ、ピーマンでの適応性を検討し、利用しているにすぎない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、多くの作物に接種してもその防除効果を奏し、また継代接種しても強毒ウイルスとして変異しない、そしてピーマンなどに接種した場合においても、ウイルス症状が極めて弱い性質を有するサテライトＲＮＡ、を保有するキユウリモザイクウイルス弱毒ウイルス、該弱毒ウイルスを用いるキユウリモザイクウイルスの防除法およびキユウリモザイクウイルス抵抗性植物を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、このような課題を解決するため、種々検討を重ねた結果、自然界より得たウイルス症状の軽微なＣＭＶのなかから、上記課題を解消するサテライトＲＮＡの選抜を重ねた結果、多種の作物に感染してもウイルス症状が極めて軽微であって、その弱毒ウイルスを対象作物の苗に接種しておくことにより一般栽培圃場において多種、多様の強毒ＣＭＶに対して防除効果を有し、また植物に継代接種しても変異せず症状が安定して、農薬散布等の環境汚染の問題がなく安全で、直ちに実用化できるサテライトＲＮＡを探索することに成功し、これに基づいて本発明を完成した。
【０００７】
即ち（１）本発明は、配列番号１の塩基配列を含むサテライトＲＮＡを含むキユウリモザイクウイルス弱毒ウイルスであり、（２）また本発明は、配列番号１の塩基配列を含むサテライトＲＮＡを含むキユウリモザイクウイルス弱毒ウイルスであり、（３）また本発明は、上記キユウリモザイクウイルス弱毒ウイルスを植物に接種することを特徴とするキユウリモザイクウイルスの防除法であり、（４）また本発明は、上記キユウリモザイクウイルス弱毒ウイルスを接種して得られるキユウリモザイクウイルス抵抗性植物であり、（５）また本発明は、上記キユウリモザイクウイルス弱毒ウイルスを接種して得られるキユウリモザイクウイルス抵抗性植物の一部を組織培養して得られるキユウリモザイクウイルス抵抗性植物であり、（６）また本発明は上記キユウリモザイクウイルス弱毒ウイルスを接種して得られるキユウリモザイクウイルス抵抗性植物の一部を栄養繁殖して得られるキユウリモザイクウイルス抵抗性植物である。
【０００８】
以下、本発明を詳細に説明する。
（１）キユウリモザイクウイルス弱毒ウイルスの採取と作出
１９８８年に関東から甲信越にかけて５０か所の圃場より、ナス科、ウリ科、キク科、アブラナ科などの植物からウイルス症状の葉を３００枚採集し、これらの葉に１０倍量のリン酸緩衝液（中性付近の０．１Ｍリン酸緩衝液）を加えて磨砕しその液をトマト（日本デルモンテ社製ＴＭＫ１４３）に接種して一週間後、各々のエライザ−検定を行った結果、１４４系統についてＣＭＶの感染を確認した。
これらの中から弱毒ウイルスを選抜すべく、１４４系統のトマトの感染葉をそれぞれトマト（ＴＭＫ１４３）１０株ずつに接種し、一週間後、リボ核酸（ＲＮＡ）分析を行った結果、サテライトＲＮＡを有するＣＭＶが１１系統から検出された。その後それらについてウイルス症状調査を行い、ネクロシス、モザイクが発病した系統や感染力を有しない系統を取り除き、ウイルス症状が軽微でウイルス増殖量の多い弱毒ウイルスを選抜した。
この選抜した弱毒ウイルスは遺伝的に均一でなく、ウイルス症状が異なったので、トマト５００株にこのウイルスを接種し、弱いウイルス症状が揃っている株だけを選抜し、さらにサテライトＲＮＡの存在が継続されている株だけを採集して、ウイルス接種液の調製を行い、再度トマトに接種し、同じ選抜操作をしてウイルス接種液の調製する作業を５回繰り返し、トマトで継代接種を行ってサテライトＲＮＡを安定して含む弱毒ウイルス（ＮＤＭ−３）を作出した。
【０００９】
（２）サテライトＲＮＡの単離
サテライトＲＮＡを含む弱毒ウイルス（ＮＤＭ−３）をトマトの子葉に接種、感染させ、１〜４週間程度ウイルスを増殖させた後、トマト子葉を採取し超低温にて凍結した。この感染葉を粉砕し、２倍量の ０．１％チオグリコ−ル酸を含む ０．５Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ６．５）と同量のクロロホルムを加え、ワ−リングブレンダ−で破砕した。この破砕液を９，５００Ｘｇ、１０分間遠心し、上層（水層）の１０％に当たる重量のポリエチレングリコ−ルを加え溶解させた後、４０分間静置した。この溶液を９，５００Ｘｇ、２０分間遠心し、得られた沈殿に２％トライトンＸ−１００を含む０．０５Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ７．０） を加え懸濁均一化した。この粗精製品を１２，０００Ｘｇで遠心分離した上清を２４０，０００Ｘｇ、４５分間遠心し、沈殿を回収した後 １０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０） に懸濁した。この溶液に最終濃度で１％になるように１０％ ＳＤＳを加え、さらに溶液と等量のフェノ−ルを加えた後１２，０００Ｘｇ、１５分間遠心した。この上層（水層）を回収し常法に従ってエタノ−ル沈殿を繰り返してＲＮＡを単離、精製した。この方法で感染葉１００ｇより約１００μｇのＲＮＡを得た。上記の方法で得られたＲＮＡを水に溶解し、１０〜４０％ショ糖密度勾配により超遠心分離(１７５，０００Ｘｇ，１６時間）して得られたサテ ライトＲＮＡのバンドを採取し、常法に従ってエタノ−ル沈殿を繰り返してサテライトＲＮＡを単離精製した。精製が不十分な場合は６Ｍ尿素を含む９％ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行なった後、臭化エチジウムの溶液で染色し、サテライトＲＮＡのバンドの部分をカミソリ等で切り取った。サテライトＲＮＡのバンドを含むゲル断片を透析チュ−ブに入れＥＤＴＡを含むトリス−酢酸緩衝液中で電気泳動による溶出を行なってサテライトＲＮＡを回収した後、常法に従ってエタノ−ル沈殿を繰り返してサテライトＲＮＡを単離精製した。この電気泳動によるサテライトＲＮＡの溶出の詳細はＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓらの方法［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８２）］に従って行なった。
【００１０】
（３）サテライトＲＮＡのクロ−ニングとシ−クエンス
単離精製したサテライトＲＮＡからマイナス鎖（以下−鎖と表記する）ｃＤＮＡを合成するために、サテライトＲＮＡ（約３μｇ）と３´末端塩基配列に相補的なＤＮＡプライマー（８塩基、１μｇ）を９５℃に加熱した後、徐冷してＲＮＡとＤＮＡプライマ−をアニ−リングさせた。−鎖ｃＤＮＡ合成反応は以下の緩衝液中で１．５時間、４２℃に放置することによって行なった。［ｃＤＮＡ合成反応液；５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ 、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2 、１４０ｍＭ ＫＣｌ、３０ｍＭ β−ｍｅｒｃａｐｔｏ−ｅｔｈａｎｏｌ,５００μＭ ｄＮ ＴＰ 、５０μＣi[α−３２Ｐ]ｄＣＴＰ、１５０ｕｎｉｔｓ ＲＮａｓｉｎ（Ｐ ｒｏｍｅｇａ）、１０５ｕｎｉｔｓ ＡＭＶ ｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）］。
−鎖ｃＤＮＡ合成反応はＦｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ） を用いて行った。次 に、得られたｃＤＮＡをＰＣＲ法によって増幅させた。すなわち、プラス鎖サテライトＲＮＡの５´末端に相同的なＤＮＡプライマ−と３´末端塩基配列に相補的なＤＮＡプライマーを用い、９４℃１分間、３７℃１分間、７２℃２分間の反応を４５回繰り返すことによってＰＣＲ反応を行った。
［ＰＣＲ反応液；１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2 、５０ｍＭ ＫＣｌ、１００μＭ ｄＮＴＰ、５ｕｎｉｔｓ Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）］
このｃＤＮＡを１．５％アガロースゲル電気泳動によって分離させた後、ゲルより切り出し、ＤＮＡ回収キットＧＥＮＥＰＵＲＥ（ニッポンジーン）を用いて精製した。得られたｃＤＮＡをＴ−Ａクローニング用ベクターｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に導入した。このプラスミドを制限酵素ＥｃｏＲＩで切断することによってサテライトＲＮＡ由来のｃＤＮＡの存在を確認した。
【００１１】
このサテライトＲＮＡの塩基配列をＴｈｅｒｍｏ Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）とＤＮＡシーケンサＤＳＱ−１０００Ｌ（島津製作所製）を用いて決定し、３３９塩基から成る塩基配列を配列番号１に示した。
この配列番号１に示すサテライトＲＮＡの塩基配列に相同的な塩基配列を有するプラスミドを大腸菌に導入し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９（ｐＮＤＭ３Ａ）ＦＥＲＭ Ｐ−１６７０１として工業技術院生命工学技術研究所に寄託した。
【００１２】
【配列表】
（４）弱毒ウイルス（ＮＤＭ−３）の接種源作成
弱毒ウイルス（ＮＤＭ−３）に感染したトマト葉１ｇに緩衝液（中性付近の０．１Ｍリン酸緩衝液）を加えた磨砕液１０ｍｌをトマト１００株の子葉または本葉に接種し、１〜２週間程度ウイルスを増殖させたのち、トマト感染葉１５０ｇを採取し、超低温−８０℃で凍結した。この感染葉を粉砕した後、０．１％チオグリコ−ル酸を含む０．５Ｍクエン酸緩衝液（ＰＨ６．５）３００ｍｌと同量のクロロホルムを加え、ワ−リングブレンダ−で磨砕し、ＣＭＶ粒子を含む磨砕液を得た。この磨砕液を２，０００ Ｘｇ、１０分間遠心し、上層（水層）１２０ ｍｌを回収し、それに１０重量％の粉末ポリエチレングリコ−ル１２ｇを加え溶解させた後、４０分静置して、析出させ、沈殿し易くした。
この溶液を９，５００ Ｘｇ、２０分間遠心し、得られた沈殿（ＣＭＶ粒子） を回収し、これに２％トライトンＸ−１００を含む０．０５Ｍクエン酸緩衝液（ＰＨ７．０）を洗浄のため加え溶解した。
これを１２，０００Ｘｇで遠心分離し、ＣＭＶ粒子を含む上澄を分取して、これを２４０，０００Ｘｇ、４５分間遠心し、得られた沈殿を１０ｍＭリン酸緩衝液に懸濁して、弱毒ウイルス（ＮＤＭ−３）のＣＭＶ粒子を約１０ｍｇ抽出し、接種源を得た。
【００１４】
弱毒ウイルスを接種する時期は、目的とする植物の生育中の適宜な時期でよいが、植物の幼苗の時期が好ましい。
【００１５】
キユウリモザイク弱毒ウイルスの接種の方法は、純化した弱毒ウイルスの粒子を５０〜５００μｇ／ｍｌになるように燐酸緩衝液に懸濁し、公知の方法により接種すればよく、例えば、噴霧ローラー法（特開平４−３３０００５号参照）で行なうことが好ましい。すなわち、植物体の表面に弱毒ウイルスと研磨材を介在させて、ローラーを圧接回転せしめ、該植物体を被傷せしめると共に該弱毒ウイルスの接種を行なう方法または、目的とする植物体の表面に、研磨材の散布と弱毒ウイルス懸濁液の噴霧を行い、その上からローラーを接触回転させる方法で行うことが好ましい。この方法は、少量の弱毒ウイルス液で、迅速、簡便、かつ高い感染率で接種することができる特徴を有する。
【００１６】
こうして、植物体に弱毒ウイルスを接種すると、容易に弱毒ウイルスが全身に感染した植物苗が得られる。
したがって、この植物体を適当な大きさに切断したあと、挿し木し、通常の育苗管理をすると、容易に弱毒ウイルスが全身に感染した植物苗が得られる。
【００１７】
また、この植物体を適当な大きさに切断したあと、これを穂木として、弱毒ウイルスの接種していない他の台木に接ぎ木し、通常の育苗管理をすると、台木に弱毒ウイルスが移行し、容易に弱毒ウイルスが全身に感染した植物体が得られる。
【００１８】
さらにまた、この植物体からその一部（例えば側芽）を採り、消毒した後、植物ホルモンを適宜の濃度で含有する寒天培地に挿し芽し、外界と隔離された室内で、至適な温度、照度条件下で育成し、幼苗（例えば本葉の十分展開した幼苗）を得、この葉片を適当な大きさに切断したあと、植物ホルモンを適宜の濃度で含有する寒天培地に２〜４回移植し、通常の植物体の組織培養法と同様に操作して、葉片から直接誘導させた不定芽から個体の再生を行い弱毒ウイルス保毒苗を大量に得ることができる（例えば「今月の農業 ２月号（１９９２）」１０２〜１０５頁、弱毒ウイルス感染作物の組織培養不定芽誘導法による弱毒ウイルス保毒トマトの増殖方法参照）。また植物体からその一部を採り、植物ホルモンを適宜の濃度で含有する寒天培地に２〜４回移植し、カルスから誘導させた不定芽から個体の再生を行い、弱毒ウイルス苗を大量に得ることができる。
【００１９】
【実施例】
以下実施例を示して本発明をより具体的に説明する。
実施例１
弱毒ウイルス（ＮＤＭ−３）の安定性
外界から隔離されてあるガラス温室において、弱毒ウイルス（ＮＤＭ−３）のウイルス粒子を５０〜５００μｇ／ｍｌの接種濃度にし、トマト（品種はＴＭＫ１４３）において、子葉または本葉に接種し、５世代以上にわたって継代接種して本葉６〜８枚期までウイルス症状が現れるか否か調べた結果、ウイルス症状はまったく発生せず、変異によってえそやモザイク症状が発生しない安定している弱毒ウイルス（ＮＤＭ−３）であることが分かった。
【００２０】
実施例２
弱毒ウイルス（ＮＤＭ−３）の多種作物に対する影響
外界から隔離されてあるガラス温室において、ナス、マメ、ヒユ、ウリ、アカザ、アブラナ、キク科などの作物の種子を播種し、発芽して１０〜２０日後それぞれの作物の幼苗に弱毒ウイルス（ＮＤＭ−３）、公知の弱毒ウイルス（ＮＤＭ−１）（植物防疫、１９９６、１ ＶＯＬ５０ 第２３頁参照）および外界から得た強毒ウイルス（ＣＭ８５−３）のＣＭＶ粒子を４００μｇ／ｍｌの接種濃度で５〜１０株ずつ接種し、同時に無接種株も５〜１０株ずつ設けて、それぞれの作物のウイルス症状を接種後一ケ月以上にわたって調査した。無接種には全くウイルス症状が現れなかったので調査結果を示さないが、弱毒ウイルス（ＮＤＭ−３）接種株、公知弱毒ウイルス（ＮＤＭ−１）接種株および強毒ＣＭＶ（ＣＭ８５−３）接種株についてウイルス症状結果を表１に示した。
【００２１】
ｂ）戻し接種：弱毒ＣＭＶまたは強毒ＣＭＶをそれぞれの植物に接種して１０日以上経過した後、その植物の葉を擦り潰して液汁を採取し、これをササゲ（品種：黒種３尺）の初生葉に接種して局部斑点の発生（すなわち感染）の有無を調べた。＋は局部斑点有り（ＣＭＶ検出）、−は無し（ＣＭＶ不検出）を示す。
※ピ−マンの戻し接種では、ササゲの局部斑点は発生しにくいことから、ＣＭＶ不検出であった。そこで、全品種全株について、ウイルス全核酸分析を行なった。その結果、全株からＣＭＶを検出した。＋は、その感染を示す。
【００２２】
表１より、対照の強毒ウイルス（ＣＭ８５−３）は、多くの作物に感染してモザイク、糸葉、黄化、矮化、えそなどの病徴がでる欠点を有することが判る。また、従来公知の弱毒ウイルスＮＤＭ−１は、トマト、ナス、タバコに適用した場合、比較的軽微であるがモザイクの病徴が観察され、またピーマン、メロンに対しては、強いモザイクの病徴が観察され、適用することができない。これに対し、本発明により得られた弱毒ウイルスは、トマト、ナス、タバコばかりでなく、ピーマンおよびメロンなど適用作物の種類が多く、しかも適用した場合、現れるウイルス症状が、極めて軽微であるか、まったくないことが判る。すなわち、より多くの作物へ感染して、その弱毒効果を奏し、ウイルス症状への影響は極めて少ないことが判る。
【００２３】
上記実施例１および実施例２の結果より、本発明の自然界から選択分離した配列番号１の塩基配列を含むサテライトＲＮＡを有する弱毒ウイルス（ＮＤＭ−３）は、変異しにくく、多種の作物に対してウイルス症状が極めて軽微で、安全な弱毒ウイルスであることが分かった。
【００２４】
実施例３
本発明の弱毒ウイルス（ＮＤＭ−３）の外界強毒ＣＭＶに対する防除効果試験
（１）弱毒ウイルス（ＮＤＭ−３）接種苗の育成及び植え付け
タキイ種苗社製の培土「たねまき培土」とホ−ネン社製の同「セルトップミックス」を１：１に混合して作成した育苗培土を、ヤンマ−農機社製の２００穴トレイに充填し、これに、カラ−ピ−マンの種子「ゴ−ルデンサマ−ハイブリット（米国ピ−トシ−ド社製）」を３月上旬に播種して育苗管理し、本葉０．５枚期に弱毒ウイルス（ＮＤＭ−３）粒子をリン酸バッファに希釈して噴霧ロ−ラ−法（特開平４−３３０００５号参照）により接種した。
弱毒ウイルスの感染確認は、接種１０日後に接種苗をランダムに選び、その苗の本葉片（０．２ｇ程度）を採取してすり潰し、液汁を作成した後、全核酸をフェノ−ル抽出し、ＮＤＭ−３の２本鎖サテライトＲＮＡのバンドの位置を電気泳動で確認する分析方法で行った。その結果、配列番号１の塩基配列を含むサテライトＲＮＡを１００％（２４株／２４株中）検出した。また弱毒ウイルスを接種したすべての苗には接種後２０日頃より本葉に軽微なウイルス症状であるクロロシスが発生し、この点からも感染を確認することが出来た。
播種して３０日後、黒ポリポット（１０．５ｃｍ）に仮植して４０日目の本葉約１０枚、草丈約１２ｃｍの苗を、弱毒ウイルス（ＮＤＭ−３）接種苗と無接種苗とに振り分け、５月中旬にそれぞれ３７株ずつナス科作物栽培１年目の露地圃場の畦（畦の高さ約２０ｃｍ）に畦間１５０ｃｍ、株間５０ｃｍ（１０ａ当り植え付け本数１，３３３株）として一条に植え付けた。１０ａ当りの元肥の施肥成分量はＮ：１２ｋｇ、Ｐ2 Ｏ5 ：２６ｋｇ、Ｋ2 Ｏ：１２ｋｇとし、堆肥を約２トン施した。
【００２５】
（２）弱毒ウイルス（ＮＤＭ−３）接種の外界ウイルスに対する防除効果
圃場に植え付けた後、それぞれの株に支柱（長さ１．２ｍ、外径２ｃｍ）を立て、生育するに従い紐で株を巻き縛り側枝の枝折れ防止を図った。また、最初に着果した果実は３〜４ケ摘除し、生育の促進を促した。ピ−マンは乾燥に弱いので、灌水は晴天時には毎回株当たり２〜４リットル行った。また、６月下旬より２週間おきに液肥（大塚製薬社製ＯＫ−Ｆ１）を１００〜３００倍に薄めて株元に灌注した。 アブラムシ媒介による外界ウイルスの感染を図るため、栽培圃場での殺虫剤、殺菌剤などの農薬散布は一切行わなかった。そのため、５月下旬よりアブラムシが多数飛来し、外界ウイルスによるウイルス症状が無接種株に６月下旬より発生し始め、８月下旬に至ってはウイルス症状が激しく現れた。そのウイルス発生調査結果を表２に示す。
【００２６】
（ｂ）NS：無病徴 ｃ：クロロシス Ｍ：モザイク Ｓ：矮化 ｎ：えそ斑点
（ｃ）植え付け株数３７株の中の発病株数
【００２７】
表２より、植え付け時から３ケ月の長期の渡り、弱毒ウイルス（ＮＤＭ−３）接種株にはウイルス症状としては極めて軽微であるクロロシスが全株に発生したのみであったが、無接種株は植え付け９７日になると、モザイク、えそ、矮化などの激しい多様のウイルス症状が大発生し、健全な生育株は全く見られなくなった。従って、弱毒ウイルス（ＮＤＭ−３）接種によって外界強毒ウイルスを防ぐ効果が歴然と認められるに至った。また弱毒ウイルス（ＮＤＭ−３）接種苗の草丈が揃っていたが、無接種株はウイルスの被害を受けたため不揃いであった。
【００２８】
実施例４
次に、外界のウイルスが激しく無接種株に被害をもたらしていたので、どのようなＣＭＶが関与しているのか知るため、リボ核酸分析、ウエスタンブロツト分析などのウイルス検定を８月に供試株のすべてにおいて行った。
値は植え付け株数３７株中の検出率（％）を示す。
【００２９】
表３の結果から、弱毒ウイルス（ＮＤＭ−３）接種株からは配列番号１の塩基配列を含むサテライトＲＮＡを有するＣＭＶが苗の時点と同様に１００％（３７株／３７株中）検出され、外界ＣＭＶの感染による変化は見られなかった。これに対して、非接種苗からは約３９０塩基数のサテライトＲＮＡを有するＣＭＶが４１％（１５株／３７株中）、約３４０塩基数のサテライトＲＮＡを有するＣＭＶは４１％（１５株／３７株中）、サテライトＲＮＡを有しないＣＭＶが１６％（６株／３７株中）検出され、非接種株の９７％（３６株／３７株中）の株からＣＭＶが検出されるに至った。従って、多種、多様の外界ＣＭＶが無接種株に激しいウイルス症状を起こしていることが分かった。
【００３１】
次に、供試株のすべてについて８月にウエスタンブロツト分析によりＴＭＶ（ピーマンのキウリモザイクウイルスとして問題となっているトウガラシ系キウリモザイクウイルス）の感染を調べた結果、弱毒ウイルス（ＮＤＭ−３）接種株、非接種株のいずれからもＴＭＶは全く検出されず、この栽培圃場において、ＴＭＶが関与しているウイルス症状は発生していないことが判明した。このことから、非接種株のウイルス症状にはＣＭＶが大きく影響していることが分かった。
【００３２】
（３）弱毒ウイルス（ＮＤＭ−３）接種株と非接種株の収量調査比較
８月１８日から晩霜の直前の１１月４日まで着色果の収穫調査を行った。その収量調査結果を表４に示す。
【００３３】
（ａ）えそ果：果実の表面に茶褐色の斑点が発生した果実を示す。
（ｂ）リング斑点果：果実の表面にリング状の斑点が発生した果実を示す。
（ｃ）小果：果実の大きさが６０ｇ未満であるものを示す。（ウイルスの被害に
より株が矮化して果実の肥大が悪くなった場合に多かった）
【００３４】
表４より、弱毒ウイルス（ＮＤＭ−３）接種株のウイルス果の発生は全体個数の２％程度の発生であった。これに対して非接種株にはえそ果、リング斑点果が多く発生し、ウイルスの被害により矮化した株には小果が発生してウイルスが関与している果実は収穫果の半分近くにも及んだ。そのうえ、えそ、モザイクが発生して葉が損傷を受けている株には日焼け果、腐敗果が多く発生した。
正常果（無症状）の収量は圧倒的に弱毒ウイルス（ＮＤＭ−３）接種株が多く、非接種株を倍近く上回った。
【００３５】
次に正常果収量と一果重について、時期別に比較した結果を表５示す。
カラ−ピ−マンの露地栽培では、着色した１００ｇ程度の正常果実を株当たり１０ケ程度採るのが目安となるが、表−５より、弱毒ウイルス（ＮＤＭ−３）接種株は株当たり正常果が１５．８ケ採れたのに対して、非接種株は８．９ケに止まった。１０ａ当り収量においては弱毒ウイルス（ＮＤＭ−３）株は２．３トンであったのに対し、非接種は１．２トンで大幅に低かった。
１果実当り重量の調査では、弱毒ウイルス（ＮＤＭ−３）接種株がほぼ全収穫期を通じて果実の大きさが安定していたのに対して、非接種株はウイルスの被害により生育が衰え始めていたため、収穫後半には果実が小さくなり、果実の粒揃いが悪かった。
【００３７】
以上のカラ−ピ−マンの露地圃場での結果により、本発明の弱毒ウイルス（ＮＤＭ−３）接種苗は副作用であるウイルス症状が極めて弱く、強毒に変異することがなく安全で、多種多様にわたる外界の強毒ウイルスに対して歴然たる防除効果を有し、ウイルスが激しく発生する圃場において無接種苗より正常果の収量が大幅に向上し、しかも果実の粒揃いが良くなることが判明した。
【００３８】
【本発明の効果】
本発明の弱毒ウイルス（ＮＤＭ−３）は、自然界に揉まれて存在したＣＭＶの系統から選抜しているので変異しにくく、多種の作物にわたって副作用のウイルス症状は極めて弱く、継代接種しても安定な症状を示す安全な弱毒ウイルスである。
また弱毒ウイルス（ＮＤＭ−３）を作物の苗に接種し、一般栽培圃場において栽培した場合、多種、多様の強毒ＣＭＶに対して防除効果を有し、直ちに実用化できる弱毒ウイルスである。
さらに、ウイルスを媒介するアブラムシ防除の農薬や、アブラムシ忌避資材などを要せず、環境汚染の問題がなく、栽培経費を削減できる効果も合わせて奏するものである。
Claims (7)
- 配列番号１の塩基配列を含むサテライトＲＮＡ。
- 配列番号１の塩基配列を含むサテライトＲＮＡを含むキユウリモザイクウイルス弱毒ウイルス。
- 請求項２記載のキユウリモザイクウイルス弱毒ウイルスを植物に接種することを特徴とするキユウリモザイクウイルスの防除法。
- 請求項２記載のキユウリモザイクウイルス弱毒ウイルスを接種して得られるキユウリモザイクウイルス抵抗性植物。
- 請求項２記載のキユウリモザイクウイルス弱毒ウイルスを接種して得られるキユウリモザイクウイルス抵抗性植物の一部を組織培養して得られるキユウリモザイクウイルス抵抗性植物。
- 請求項２記載のキユウリモザイクウイルス弱毒ウイルスを接種して得られるキユウリモザイクウイルス抵抗性植物の一部を栄養繁殖して得られるキユウリモザイクウイルス抵抗性植物。
- 植物が、ピーマンである請求項４〜６のいずれかに記載のキユウリモザイクウイルス抵抗性植物。
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| JP10172598A JP3728381B2 (ja) | 1998-03-31 | 1998-03-31 | サテライトｒｎａ、キユウリモザイクウイルス弱毒ウイルス、キユウリモザイクウイルスの防除法およびキユウリモザイクウイルス抵抗性植物 |
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