JP5063120B2 - Ｒｎａ、同ｒｎａを用いたトマト黄化えそウイルス弱毒ウイルス、同弱毒ウイルスを接種したトマト黄化えそウイルス抵抗性植物及びキク科植物のトマト黄化えそウイルスの防除法 - Google Patents

Description

本発明は、キク科植物に接種しても、該植物のウイルス症状が殆ど観察されないか、または全く観察されず、また媒介昆虫アザミウマによって伝搬されず、キク科植物の栽培管理を容易なものとする、トマト黄化えそウイルス（Ｔｏｍａｔｏ ｓｐｏｔｔｅｄ ｗｉｌｔ ｖｉｒｕｓ）（以下、ＴＳＷＶということがある）弱毒ウイルスに関する。また本発明は、ＴＳＷＶ抵抗性植物を得るためのＲＮＡ、同ＲＮＡを用いたＴＳＷＶ弱毒ウイルス、同弱毒ウイルスを接種したＴＳＷＶ抵抗性植物及びキク科植物のＴＳＷＶの防除法に関する。

トマト黄化えそウイルス（ＴＳＷＶ）は１９１５年に発見された比較的歴史の古い植物ウイルスの一種であって、完全なウイルス粒子の精製が困難であったため、他のウイルスに比べその研究が遅れた。
しかし１９９０年の国際ウイルス分類委員会でブニアウイルス（Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄｅａ）科のトスポウイルス（Ｔｏｓｐｏｖｉｒｕｓ）属のタイプウイルス（代表ウイルス）として分類された。
ブニアウイルス科にはトスポウイルス属以外に４属あるが、これらはすべて動物に感染するウイルスである。同じ科（ウイルスグル−プ）の中に動物ウイルスと植物ウイルスが属するブニアウイルス科は、分類学的に極めて特殊である。

ＴＳＷＶの特徴は、同じブニアウイルス科のウイルスと同様に直径約８０〜１２０ｎｍの被膜をもつ球状ウイルスで、その中に３分節の閉環ひも状のヌクレオキャプシドが入っている。
ウイルスゲノムは３分節の１本鎖ＲＮＡから成り、基本的にマイナス鎖として遺伝子翻訳系を経る。最短のＲＮＡからＳ、Ｍ、Ｌ ＲＮＡ（若しくはＳ鎖、Ｍ鎖、Ｌ鎖）とよばれ、塩基長はそれぞれ約２．９ＫＢ、４．８ＫＢ、８．９ＫＢである（非特許文献１〜３参照）。
Ｌ ＲＮＡにはＲＮＡ依存ＲＮＡ複製酵素が、Ｓ ＲＮＡにはヌクレオキャプシドタンパクがコ−ドされている。また、Ｓ ＲＮＡ、Ｍ ＲＮＡは、ＴＳＷＶ重要昆虫媒介性に関連している。
更にトスポウイルス属のウイルスは接種継代を繰り返していくと感染植物の病徴に変化を与えることがある。これはトスポウイルスのＬ ＲＮＡが何らかの原因で短くなり、Ｄｅｆｅｃｔｉｖ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ（ＤＩ）ＲＮＡまたはＤＩ粒子とよばれるものを生じることに起因している（非特許文献４参照）。

ＴＳＷＶを媒介できる昆虫は、アザミウマ類である。アザミウマ類は、幼虫期にのみＴＳＷＶを獲得でき、幼虫は孵化する前にも伝染能を有するが、一般的に成虫になってからＴＳＷＶを伝搬する。当初、日本でのＴＳＷＶを媒介するアザミウマは、日本在来種であるヒラズハナアザミウマやダイズウスイロアザミウマであったが、ＴＳＷＶ重要媒介虫として知られるミカンキイロアザミウマが１９９０年に海外から日本に侵入し、ＴＳＷＶの被害を拡大させた。そして、ミカンキイロアザミウマは、その遠距離移動能力に優れていることから被害発生分布が拡大し、それに伴いＴＳＷＶの発生様相も激変し、現在ではキク、ガ−ベラ及びトルコキキョウなどの花卉植物を中心に全国的な規模で猛威を振るっている（非特許文献５〜６参照）。

特にキクはその栽培様式が母株から脇芽で増やす栄養繁殖であるために、この母株のＴＳＷＶ汚染が深刻視されている。このＴＳＷＶはキクに感染すると、えそや黄化症状を発現させるが、稀に無病徴感染するため、外観から感染を判別できず、従って、農家が健全株として維持しているキクの中にＴＳＷＶ感染株が混入し、環境条件が成立するとＴＳＷＶが発生して、被害を出すといったことが起こっている。
また、キク科やタデ科のような雑草にもＴＳＷＶは感染でき、越冬するものもあり翌年の伝染源となる。
更にＴＳＷＶは一度感染すると植物に定着しやすく、根絶は不可能に近い。

このため、これまでのＴＳＷＶの防除法は、媒介虫であるアザミウマの徹底した進入阻止防除とＴＳＷＶ感染株の早期抜き取り処分しかなかった。
しかし、アザミウマは１ｍｍ以下の非常に小さな虫で、侵入阻止のためには、圃場を寒冷紗等の目の細かい網で隔離せざるを得ず、圃場内の気温上昇が懸念されるため、容易には実施されていないのが現状であった。また、アザミウマは花粉を好み、よって、花被の中に入って薬を回避するため、農薬防除も有効な手段にはならなかった。

一方、植物品種改良家は特定の病原体に対して、耐性または抵抗性をもつような品種の開発を絶えず試みている。このような耐性または抵抗性遺伝子は野生近縁種から商業品種へ導入される。
しかし、耐性または抵抗性遺伝子の探索は、非常に時間と根気のいる作業であり、たとえ同定されても、更に商業品種への導入・定着を確認するには、尚一層の多大な時間を要する。
このため人気品種の入れ替わりが激しく、多大な種類の品種が存在する花卉及び観賞用植物においては、耐性または抵抗性品種の育種は難しく、殆ど行われていないのが現状である。

また、ＴＳＷＶへの抵抗性を植物に付与する方法としては、１９９８年には、トスポウイルス属に対する抵抗性をもつ野生トマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｐｅｒｕｖｉａｎｕｍ）からＴＳＷＶ抵抗性遺伝子ＳＷ−５が単離されている（非特許文献７参照）。これはトマトにおける有効な抵抗性遺伝子であったが、実用化する前に、該遺伝子の抵抗性を打破するＴＳＷＶ分離株が現れた（非特許文献８参照）。同様のことはトウガラシ属のＴＳＷＶ抵抗性遺伝子Ｔｓｗでも起こっており、抵抗性品種を育種することの難しさを示している。

また、ウイルスの外被タンパク質（Ｃｏａｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子を遺伝子操作及び植物形質転換法により、植物ゲノムに導入することで、ウイルス抵抗性を付与する方法が、タバコ、トマト、ジャガイモ及びパパイヤ等において開発されている（非特許文献９〜１０参照）。

また、下記の（ａ）〜（ｄ）の特徴を有するＲＮＡ分子であり、該ＲＮＡ分子をコ−ドするＤＮＡ配列を含有するトランスジェニック植物を作成することによって、ＴＳＷＶの病害から植物を防除する方法が開示されている（特許文献１参照）。
（ａ）ＴＳＷＶのウイルスＲＮＡ複製中間体と少なくとも一部に相補性である配列を含有すること。
（ｂ）タバコ、ジャガイモ及びトマト等の植物細胞内でウイルスＲＮＡ複製中間体と安定な結合を形成できること。
（ｃ）当該植物細胞内条件のもとで結合に利用可能なＴＳＷＶのウイルスＲＮＡ複製中間体の一部に結合すること。
（ｄ）ＴＳＷＶのウイルスＲＮＡ複製中間体への安定な結合がＴＳＷＶの増殖サイクルを阻害すること。

また（ａ）プラムポックスウイルス（Ｐｌｕｍ Ｐｏｘ Ｖｉｒｕｓ，ＰＰＶ）のＲＮＡから誘導された二本鎖ｃＤＮＡ断片と（ｂ）トマト黄化えそウイルス（ＴＳＷＶ）のＮ構造遺伝子のＳ ＲＮＡから誘導された二本鎖ｃＤＮＡ断片の組み合わせから構成されるか、或いはこれらの構成成分を含有する組み換えデオキシリボ核酸が知られている。この組換えデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）は、必要に応じて他のＤＮＡ断片のほか、植物細胞の中で活性がありかつ組換えＤＮＡ断片の転写を調節するプロモ−タ−を含有することができる特徴を有し、タバコ、ジャガイモ及びトマト等の植物のゲノム中に挿入して、トランスジェニック植物を生産することによってＴＳＷＶ、ＩＮＳＶ等のトポウイルスによって引き起こされる病害を防除する方法が開示されている（特許文献２参照）。

また、植物のゲノムに挿入されたトランス遺伝子（ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）を有し、これによって植物をトスポウイルスの感染に対し抵抗性にし、当該トランス遺伝子は、ＴＳＷＶ−ＢＬ、ＴＳＷＶ−１０Ｗ、ＩＮＳＶ−Ｂ、ＩＮＳＶ−Ｂｅｇ及びＩＮＳＶ−ＩＬの核蛋白質遺伝子配列の翻訳可能または翻訳不可能な配列、及び該核蛋白質遺伝子配列からなる、トスポウイルスによる感染に抵抗性を有する、タバコやトマト等の宿主植物の作出方法が開示されている（特許文献３参照）。

しかし、上記のトランスジェニック植物は、ＴＳＷＶによる病害を完全に防除するものではなく、更にキクに有効なＴＳＷＶの防除法は未だ開発されておらず、効果的なＴＳＷＶの防除方法が所望されていた。
特開平６−９０７５８号公報 特開平６−３４３４６９号公報 特表平８−５０６２４２号公報 Ｄｅ Ｈａａｎ，ｐ． ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，７１巻、第１００１〜１００７ペ−ジ、１９９０年 Ｋｏｒｍｅｌｉｎｋ，Ｒ．，Ｊ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、７３巻、第２７９５〜２８０４ペ−ジ、１９９２年 ｄｅ Ｈａｎｎ，Ｐ． ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，７１巻、第２２０７〜２２１６ペ−ジ、１９９１年 Ｉｎｏｕｅ−Ｎａｇａｔａ，Ａ．，ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ、８７、第１１６８〜１１７３ペ−ジ、１９９７年 花田薫、植物防疫、第５３巻、Ｐ３１２〜３１５、１９９９年 加藤公彦、今月の農業、８月号、Ｐ７９〜８１、２００１年 Ｂｒｏｍｍｏｎｓｃｈｅｎｋｅｌ，Ｓ．Ｈ． ｅｔ ａｌ．，７ｔｈ， Ｉｎｔｅｒ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｇｒｅｓｓ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、１９９８年 Ａｒａｍｂｕｒｕ，Ｊ．、Ｐｌａｎｔ Ｐｈａｔｈｏｌｏｇｙ、５２巻、Ｐ４０７、２００３年 Ｐｏｗｅｌｌ−Ａｂｅｌ，Ｐ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３２巻、Ｐ７３８〜７４３、１９８６年 Ｇｏｎｓａｌｖｅｓ，Ｄ．ｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ、７０巻、Ｐ４１５〜４３７、１９９８年

このようにＴＳＷＶによる植物の病害を防除する方法は、以下のものが挙げられる。
（１）ＴＳＷＶを媒介するアザミウマを防除する。
（２）ＴＳＷＶ抵抗性品種を開発する。
（３）遺伝子組換えによって、ＴＳＷＶ抵抗性トランスジェニック植物を開発する。
しかし、これらの方法は、ＴＳＷＶによる植物への病害を十分に防除するものではなく、ましてキクにおいても、ＴＳＷＶ防除に効果的な方法は未だ開発されていない。
よって、本発明者らはキク品種のＴＳＷＶ防除に効果を奏する、ウイルス症状が極めて弱い弱毒ＴＳＷＶ、該弱毒ＴＳＷＶを用いたＴＳＷＶの防除法及びＴＳＷＶ抵抗性キク植物を提供することを目的とする。

本発明者らは、このような課題を解決するため、種々検討を重ねた結果、日本各地の多くの圃場からウイルスに感染していると思われるキク科の植物を採集した。
そして、これらの植物からＴＳＷＶを分離して、キクへの接種試験を行って、強毒ＴＳＷＶへの防除効果があり、尚且つウイルス症状の軽微なＴＳＷＶの中から選抜を重ねた結果、キクに感染してもウイルス症状が極めて軽微であって、そのウイルスを該キクに接種し感染しておくことにより、多種多様の強毒ＴＳＷＶの病害に対して防除効果のある弱毒ＴＳＷＶを選抜することに成功した。

更に当該弱毒ＴＳＷＶは、アザミウマによって伝搬される能力を失っており、圃場で該弱毒ＴＳＷＶを接種したキクを栽培した際に、該弱毒ＴＳＷＶがアザミウマによって、他の植物へ伝搬しないことも見出した。

本発明は、上記の知見に基づいて完成したものである。即ち、本発明は、以下に示す通りである。
（１）配列番号１記載の塩基配列を含むＲＮＡ。
（２）配列番号１記載の塩基配列を含むＲＮＡがＤＩ ＲＮＡである前記（１）記載のＲＮＡ。
（３）配列番号１記載のＲＮＡを含むトマト黄化えそウイルス弱毒ウイルス。
（４）配列番号１記載のＲＮＡを含むトマト黄化えそウイルス弱毒ウイルスを、予め植物の苗に接種して得られるトマト黄化えそウイルス抵抗性植物。
（５）植物がキク科植物である前記（４）に記載のトマト黄化えそウイルス抵抗性植物。
（６）前記（１）に記載のＲＮＡを含むトマト黄化えそウイルス弱毒ウイルスを、予め植物の苗に接種することを特徴とする植物のトマト黄化えそウイルスの防除法。
（７）植物がキク科植物である前記（６）に記載の植物のトマト黄化えそウイルスの防除法。
（８）キク科植物に接種しこれを栽培してもウイルス症状を発生せず、しかもアザミウマ伝搬性が欠如していることを特徴とするトマト黄化えそウイルス弱毒ウイルス。

本発明の配列番号１の塩基配列を有する弱毒ＴＳＷＶは、キクに接種しても、該キクのウイルス症状はほとんど観察されないか、または全く観察されないという特徴を有し、強毒ＴＳＷＶの病害を防除する。そして、本発明の弱毒ＴＳＷＶは、アザミウマによって、伝搬される能力を失っており、本発明の弱毒ＴＳＷＶを接種感染したキクから、他の植物に伝播されることがない。したがって、本発明の弱毒ウイルスは、植物に接種された場合、その植物内に留まり、その他の植物には伝搬せず、仮に伝搬したとしても当該植物はウイルス症状が殆ど観察されないか、または観察されない特徴を有するため、非常に安全である特徴を有する。本発明の弱毒ウイルスは、最も強毒ＴＳＷＶの病害防除に優れているので、キクの栽培管理が容易となる効果を奏し、キクの花卉産業に資すること大である。

本発明で用いるトマト黄化えそウイルスは、ブニアウイルス（Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄｅａ）科のトスポウイルス（Ｔｏｓｐｏｖｉｒｕｓ）属に属する、直径約８０〜１２０ｎｍの被膜をもつ球状ウイルスであり、その中に３分節の閉環ひも状のヌクレオキャプシドが入っている。
このウイルスは、キク科、ナス科、マメ科及びウリ科植物等の極めて広い宿主範囲に、えそや黄化症状を呈し、また、アザミウマによって永続伝搬される。

そして、本発明で用いるＴＳＷＶは、特定塩基配列のＲＮＡを含むＴＳＷＶが挙げられる。
本発明のＴＳＷＶは、栽培されているキク、トマト及びトルコキキョウ等を採取し、該植物に感染しているＴＳＷＶを採取して、菊に感染した際の病徴が全く観察されず、含有する塩基配列のＲＮＡが安定して次世代のキクに伝搬する性質のＴＳＷＶを選択し、そのＲＮＡの塩基配列を決定することによって、目的とする特定塩基配列のＲＮＡを含有するＴＳＷＶを取得することが可能である。このような例としては、配列番号１記載のＲＮＡを含有するＴＳＷＶが挙げられる。

そして、本発明で用いるＴＳＷＶはＤＩ ＲＮＡを含むＴＳＷＶが挙げられる。
ＤＩ ＲＮＡは、そのウイルスのゲノムＲＮＡの一部と相似な配列を持つが、一方で一部の遺伝情報が欠損しているため、複製は完全なウイルスゲノムＲＮＡに依存している。
このＤＩ ＲＮＡの干渉作用のために、完全ウイルスの植物細胞傷害性が阻害若しくは軽減され、持続感染防除が成立する。
これは、ＤＩ ＲＮＡが完全ウイルスＲＮＡよりも塩基長が短いため、複製速度が速く、その結果、完全ウイルスＲＮＡよりもその割合が多くなることが影響していると考えられている。

（１）弱毒ＴＳＷＶの分離・選択
日本各地で栽培されているＴＳＷＶが感染したキク、トマト及びトルコキキョウ等を採取し、以下の操作方法に従って、採取した当該植物からＴＳＷＶを分離する。
先ず、該ＴＳＷＶ感染植物よりＴＳＷＶ病斑を採取した部位を、亜硫酸ナトリウム０.１〜０．２％を含む０．０３〜０.１Ｍのリン酸緩衝液で磨り潰して粗汁液を作成し、該粗汁液を機械的に接種して、タバコまたはチョウセンアサガオの葉にＴＳＷＶを感染する。
そして、該タバコまたはチョウセンアサガオ感染葉を同様の方法で作成した粗汁液を、タバコまたはチョウセンアサガオに、機械的に接種することを繰り返した後、該ＴＳＷＶの中から、ウイルス症状が全く発現しないか、または微かにウイルス症状を呈するＴＳＷＶを分離して、ＴＳＷＶの弱毒ウイルスを分離する。
以上の方法により、７種類のＴＳＷＶの弱毒ウイルス（ＴＳＷＶ−６Ｂ、ＴＳＷＶ−８Ｂ、ＴＳＷＶ−１８Ｂ、ＴＳＷＶ−１９Ｂ、ＴＳＷＶ−２６Ｂ、ＴＳＷＶ−３３Ａ、ＴＳＷＶ−３６Ｂ）を分離した。

（２）弱毒ＴＳＷＶの副作用試験
得られた７種類の弱毒ＴＳＷＶを機械的に接種したタバコ感染葉を、上記リン酸緩衝液で磨砕し、キクの若苗（４〜７葉）に機械的に接種する。
そして、機械的接種の数週間後、伸長したキクの主茎を地際部より１０ｃｍ上の部分で剪定し、その下部から出てきた脇芽を採取する。
次にこれらの弱毒ＴＳＷＶ感染キクを６ポットずつに芽挿しをし、１年間、該挿し芽のＴＳＷＶ症状の発生を観察して、該弱毒ＴＳＷＶの中から、キクにウイルス症状が全く発現しないか、または微かにウイルス症状を呈するＴＳＷＶを分離して、弱毒ＴＳＷＶを分離する。
以上の方法により、ＴＳＷＶ−１９Ｂ、ＴＳＷＶ−２６Ｂ及びＴＳＷＶ−３３Ａの３株を接種したキクにウイルス症状が全く発生しないことが判明した。

（３）弱毒ＴＳＷＶの強毒ＴＳＷＶに対する防除試験
前記（２）と同様に弱毒ＴＳＷＶのタバコ感染葉を上記リン酸緩衝液で磨砕し、キクの若苗に機械的に接種して、伸長したキクの主茎を地際から１０ｃｍ上の部分で剪定する。
該若苗（４〜７葉）のキクから伸長する５〜１０ｃｍの脇芽（４〜６葉）を採取してポットに芽挿しをし、その挿し芽に、強毒ＴＳＷＶのキク感染葉を上記リン酸緩衝液で磨り潰した粗汁液を機械的に接種する。
そして、該強毒ＴＳＷＶ接種後３週間から８週間にかけて、接種した部位の上位にある葉を観察し、該強毒ＴＳＷＶによるウイルス症状と該弱毒ＴＳＷＶによる防除効果を調査して、キクにウイルス症状が全く発現しないか、または微かにウイルス症状を呈する弱毒ＴＳＷＶを選択する。
以上の方法により、７種類の弱毒ＴＳＷＶの中から、最も強毒ＴＳＷＶの病害防除に優れているＴＳＷＶを見出して選択し、本発明のＴＳＷＶ−１９Ｂとした。

（４）ＴＳＷＶ−１９Ｂの塩基配列決定
本発明のＴＳＷＶ−１９Ｂの感染タバコ葉を２倍容量の抽出緩衝液（５Ｍ塩化ナトリウム／２％Ｎ−ドデカノイルサルコシン酸ナトリウム）で磨砕した。
次いで上記緩衝液、当量のフェノ−ル／クロロホルム（１：１）及び３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５.２）を加えて撹拌混合し、全ＲＮＡを抽出した。これを遠心分離しエタノ−ル沈殿して、ＲＮＡを濃縮回収した。
このＲＮＡを鋳型に、Ｌ鎖（Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＃；Ｄ １００６６）に相同な配列を持つフォワ−ドプライマ−（ｇａａｇａｔｇｃｃｔｔｔｇａｔｇａａｇａｔｇ）と逆転写酵素Ｏｍｎｉｓｃｒｉｐｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて逆転写を行った。
この逆転写産物を鋳型に、上記フォワ−ドプライマ−と、同じくＬ鎖相同な配列を持つリバ−スプライマ−（ｇａａａｃｔａｔａｃｃｇｇｇａｃｔｃｔａｃ）及びＴａｑ ＤＮＡポリメラ−ゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いてＰＣＲで９４℃４分間、次いで９４℃１分間、５０℃１分間、７２℃１分間の反応を４０回繰り返した後、７２℃７分間反応して、目的部分を増幅した。
この増幅したＤＮＡフラグメントを電気泳動ゲルから切り出し精製を行った後、ｐＧＥＭ Ｔ−ＥＡＳＹ ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）にクロ−ニングして、その塩基配列を決定した。
その結果、本発明のＴＳＷＶ−１９ＢはＬ鎖領域に、特異的な塩基配列のＲＮＡを有することが判明した（配列番号１）。

（５）ＤＩ ＲＮＡの検出分析
ＴＳＷＶのＬ ＲＮＡ鎖の一部をクロ−ニングしたＤＮＡの鋳型に上記フォワ−ドプライマ−、上記リバ−スプライマ−、ＤＩＧ ＤＮＡ ラベリングミックス（Ｒｏｃｈｅ社製）及びＴａｑ ＤＮＡポリメラ−ゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、（４）と同様の方法でＰＣＲを行い、ＤＩＧ標識プロ−ブを作製した。
このＬ鎖特異的プロ−ブであるＤＩＧ標識プロ−ブを用いて、本発明のＴＳＷＶ−１９ＢのＤＩ ＲＮＡの分析を行った。
先ず、ＴＳＷＶ−１９Ｂ感染キク葉から抽出したＲＮＡを１％変性アガロ−スゲル電気泳動し、該電気泳動後のゲルを２０×ＳＳＣ緩衝液（３Ｍ塩化ナトリウム／０．３Ｍクエン酸ナトリウム）で２０分間洗浄した。
この洗浄したゲルをＨｙｂｏｎｄ−Ｎメンブレン（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）に載せて、Ｗｈａｔｔｍａｎ ３Ｍ濾紙に８時間程挟んで、該メンブレンにＲＮＡを吸着した。
吸着後の該メンブレンをバイブリダイゼ−ション緩衝液（０．５Ｍ リン酸水素２ナトリウム／１ｍＭ ＥＤＴＡ／７％ ＳＤＳ）に入れて、更に１μｇ程度のＤＩＧ標識L鎖プロ−ブを加え、一晩ハイブリダイゼ−ションを行った。
ハイブリダイゼ−ション後のメンブレンは２×ＳＳＣ緩衝液で洗浄して、Ａｎｔｉ−ＤＩｇｏｘｉｇｅｎｉｎ−ＡＰ（Ｒｏｃｈｅ社製）を反応させて、アルカリフォスファタ−ゼ発色基質ＮＢＴ／ＢＣＩＰストック液（Ｒｏｃｈｅ社製）で染色した。
その結果、メンブレン上にＬ鎖及びＤＩ ＲＮＡを検出し、よってＴＳＷＶ−１９ＢはＤＩ ＲＮＡを有することが判明した（図１）。

尚、本発明のＴＳＷＶ−１９Ｂは、植物ウイルスであることを理由に、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センタ−において受託が拒否されている（受託拒否証明書における識別のための表示：ＴＳＷＶ−１９Ｂ）。
よって、ＴＳＷＶ−１９Ｂは出願人自らが保管し、特許法施行規則第２７条の３の規定に準じて、譲渡可能としている（保管場所：郵便番号３７８−００１６、群馬県沼田市清水町３７８４番地、日本デルモンテ株式会社、研究開発本部、植物ワクチン開発部）。

（６）弱毒ＴＳＷＶの接種源の作成
特定塩基配列のＲＮＡを含有するＴＳＷＶに感染したキク葉１ｇに緩衝液（中性付近の０．１Ｍリン酸緩衝液）１〜５０ｍｌ、好ましくは５〜１５ｍｌを加えてミキサ−で磨砕して、ＴＳＷＶを含有してなる接種源を得る。

（７）弱毒ＴＳＷＶを含有してなる接種源のキクへの接種、感染方法
ＴＳＷＶを含有してなる接種源のキクへの接種、感染方法は、当該接種源を綿棒、指、ガラス棒などを用いて擦り付ける方法や、キクを研磨剤または摩擦剤等を用いて人為的に摩擦した後、その部分に該接種源を接種する方法、該接種源を直接注入する方法、スプレ−ガンによって該接種源を噴霧する方法、またはキクの表面に該接種源を噴霧した後、研磨剤を付着させたロ−ラ−を圧接回転せしめ、該表面を被傷せしめると共に該植物体に接種する方法（特許第２９０８５９４号）、キクの表面にブラシを当てて該キクの表面を被傷させ、その前または後ろにおいてキクの表面に該接種源を接触させる方法（特許第３７５９５６０号）、或いは該接種源をキク、またはキク組織の一部に直接ジ−ンガンで撃ち込む方法等があり、その感染または導入方法に制限はない。
従って、該接種源をキクへ接種して感染させる時期は、キクの任意の適宜な時期でよい。
加えて、該キクの育成、または栄養繁殖の方法は、通常の方法に従って行うことができ、その方法に制限はない。
以上の方法によって、特定塩基配列のＲＮＡを含有するＴＳＷＶを、特定キク品種に接種感染することができる。

このようにして、キク苗に本発明のＴＳＷＶを感染させると、容易にＴＳＷＶが全身に感染したキク苗が得られる。
したがって、このキク苗を適当な大きさに切断した後、挿し芽、または生育した菊のわき芽の挿し芽、冬至芽の株分けや挿し芽などの栄養繁殖手段を採用して、通常の育苗管理をすると、容易にＴＳＷＶが全身に感染した、キク苗が得られる。

また、ＴＳＷＶ感染キク苗からその一部（例えばわき芽）を採り、消毒した後、植物ホルモンを適宜の濃度で含有する寒天培地に挿し芽し、外界と隔離された室内で、至適な温度、照度条件下で育成し、幼苗（例えば本葉の十分展開した幼苗）を得て、この葉片を適当な大きさに切断したあと、植物ホルモンを適宜の濃度で含有する寒天培地に２〜４回移植し、通常の植物体の組織培養法と同様に操作して、葉片から直接誘導させた不定芽から個体の再生を行い、ＴＳＷＶ感染キク苗を大量に得ることができる。

また、このＴＳＷＶ感染キク苗から一部を採り、植物ホルモンを適宜の濃度で含有する寒天培地に２〜４回移植し、カルスから誘導させた不定芽から個体の再生を行い、所望のＴＳＷＶが感染したキク苗を大量に得ることができる。

（１）弱毒ＴＳＷＶの分離・選択
群馬、長野、及び愛知等の日本各地で栽培されているＴＳＷＶが感染したキクを採取し、以下の操作方法に従って、採取した当該植物からＴＳＷＶを分離した。
まず、該ＴＳＷＶ感染植物よりＴＳＷＶ病斑をとり、亜硫酸ナトリウム０.１％を含む０.１Ｍのリン酸緩衝液で磨り潰し、タバコの葉に機械的に接種し感染させた。
そして、該タバコ感染葉を同様の方法で、別のタバコに、機械的に接種することを繰り返し、病徴が軽微なタバコを選抜して、７種類の弱毒ＴＳＷＶ（ＴＳＷＶ−６Ｂ、ＴＳＷＶ−８Ｂ、ＴＳＷＶ−１８Ｂ、ＴＳＷＶ−１９Ｂ、ＴＳＷＶ−２６Ｂ、ＴＳＷＶ−３３Ａ、ＴＳＷＶ−３６Ｂ）を分離した。

（２）弱毒ＴＳＷＶの副作用試験
得られた上記弱毒ＴＳＷＶ７種類を機械的に接種したタバコ属感染葉を、それぞれ上記のリン酸緩衝液で磨砕し、キクの若苗（４〜７葉）に機械的に接種した。
機械的接種の数週間後、伸長したキクの主茎を地際から１０ｃｍ上の部分で剪定し、その下部から出てきた脇芽を採取した。
これらの弱毒ＴＳＷＶ感染キクを６ポットずつに芽挿しをし、１年間、ＴＳＷＶ症状の発生を調査した。その結果を表１に示す。

以上の結果より、当該７種類の弱毒ＴＳＷＶの内、ＴＳＷＶ−１９Ｂ、ＴＳＷＶ−２６Ｂ及びＴＳＷＶ−３３Ａの３株が、全くウイルス症状が発生しないことが判明した。

（３）弱毒ＴＳＷＶの強毒ＴＳＷＶ防除試験
（２）と同様に７種類の弱毒ＴＳＷＶのタバコ感染葉を上記リン酸緩衝液で磨砕し、キクの若苗に機械的に接種して、伸長したキクの主茎を地際から１０ｃｍ上の部分で剪定した。
該若苗（４〜７葉）のキクから伸長する５〜１０ｃｍの脇芽（４〜６葉）を採取してポットに芽挿しをし、その挿し芽に、強毒ＴＳＷＶであるＴＳＷＶ−ＪＭ１のキク感染葉を上記リン酸緩衝液で磨り潰した粗汁液を機械的に接種した。
該強毒ＴＳＷＶ接種後３週間から８週間にわたり、接種した部位の上位にある葉を観察して、該強毒ＴＳＷＶ−ＪＭ１によるウイルス症状と該弱毒ＴＳＷＶによる防除効果を調査した。
その結果を表２に示す。
尚、比較のため、弱毒ＴＳＷＶを接種しないキクの挿し芽に、強毒ＴＳＷＶを接種し栽培して、ウイルス症状を調べた。この結果も表２に示す。

表１と表２の結果より、該弱毒ＴＳＷＶの内、副作用及び防除効果において、本発明のＴＳＷＶ−１９Ｂ株が最も優れていることが判明した。

（４）アザミウマよるＴＳＷＶ伝搬性試験
本発明のＴＳＷＶ−１９Ｂと野性株である強毒ＴＳＷＶ−ＪＭ１をそれぞれチョウセンアサガオ苗に機械的に接種し、接種３〜４週間後の当該苗から、ＴＳＷＶ−１９Ｂと強毒ＴＳＷＶ−ＪＭ１の感染部を採取した。
そして、採取した感染部に、ミカンキイロアザミウマの孵化して間もない幼虫約３００体を２４時間付着して、ミカンキイロアザミウマの幼虫に、本発明のＴＳＷＶ−１９Ｂまたは強毒ＴＳＷＶ−ＪＭ１を獲得させた。
次いで該幼虫を回収し、１２〜２０日間２０〜２３℃の環境下での飼育条件下で、蛹を経て成虫になった該ミカンキイロアザミウマ１個体ずつを、インパチェンスの葉１枚毎に、及びトマト苗１本毎に付着して、インパチェンス及びトマト苗に、ＴＳＷＶ−１９Ｂと強毒ＴＳＷＶ−ＪＭ１を伝搬接種した。
伝搬接種後、該インパチェンス及びトマト苗から、該ミカンキイロアザミウマを回収して、該植物を３〜４週間育苗し、育苗した該植物にウイルスが感染しているか調べて、本発明のＴＳＷＶ−１９Ｂ分離株と強毒ＴＳＷＶ−ＪＭ１のアザミウマ伝搬性を調査し、また、本試験に用いたミカンキイロアザミウマのＴＳＷＶ保毒率も調査した。
その結果を表３に示す。
尚、一般的にアザミウマによるＴＳＷＶ伝搬性試験は、ペチュニアまたはチョウセンアサガオを用いて行われる。
しかし本発明者らは、予備実験の結果、アザミウマによる伝搬率はインパチェンスの方が、ペチュニアまたはチョウセンアサガオより高いことを見出した。
また、ＴＳＷＶは世界各地でトマトに深刻な被害をもたらしているウイルスである。
よって、本試験では、アザミウマによるＴＳＷＶ−１９Ｂの伝搬性を精査するため、アザミウマ伝搬性が高いインパチェンスと、ＴＳＷＶが重要病害であるトマトを用いた。

表３の結果より、本発明のＴＳＷＶ−１９Ｂは、インパチェンスやトマトにおいて、アザミウマによって伝搬されず、アザミウマ伝搬性が完全に欠如していることが判明した。

トマト黄化えそウイルスは、キク、トルコギキョウ、ピーマン、トマト、シシトウ、ナス、及びタバコ等の園芸作物、野菜等に感染すると、それらの植物に対してえそ褐変、えそ条斑、えそによる枯死、葉の退緑輪紋、新葉の黄化、モザイク症状、成葉の輪紋症状、果実の変形、果実の矮化等の症状を招来し、一旦発病すると抜き取るしか対策がないとされている。
一方、前述したように、このウイルス病はアザミウマ類（ミカンキイロアザミウマ、ヒラズアザミウマ等）により媒介され、伝搬されると考えられており、そのためトマト黄化えそウイルスの防除は、アザミウマ類の防除の徹底を余儀なくされている。
本発明のＴＳＷＶ弱毒ウイルスは、このアザミウマによって伝搬されず、アザミウマ伝搬性が完全に欠如していることことから、これらの有害昆虫の防除対策（例えば農薬散布など）が軽減される特徴を有する。

メンブレン上でＤＩ ＲＮＡが、Ｌ鎖ＲＮＡと共に検出された結果を示す。

Claims (8)

1. 配列番号１記載の塩基配列を含むＲＮＡ。
2. 配列番号１記載の塩基配列を含むＲＮＡがＤＩ ＲＮＡである請求項１記載のＲＮＡ。
3. 配列番号１記載のＲＮＡを含むトマト黄化えそウイルス弱毒ウイルス。
4. 配列番号１記載のＲＮＡを含むトマト黄化えそウイルス弱毒ウイルスを、予め植物の苗に接種して得られるトマト黄化えそウイルス抵抗性植物。
5. 植物がキク科植物である請求項４に記載のトマト黄化えそウイルス抵抗性植物。
6. 請求項１に記載のＲＮＡを含むトマト黄化えそウイルス弱毒ウイルスを、予め植物の苗に接種することを特徴とする植物のトマト黄化えそウイルスの防除法。
7. 植物がキク科植物である請求項６に記載の植物のトマト黄化えそウイルスの防除法。
8. キク科植物に接種しこれを栽培してもウイルス症状を発生せず、しかもアザミウマ伝搬性が欠如していることを特徴とする配列番号１記載のＲＮＡを含むトマト黄化えそウイルス弱毒ウイルス。

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