JP5063120B2 - Rna、同rnaを用いたトマト黄化えそウイルス弱毒ウイルス、同弱毒ウイルスを接種したトマト黄化えそウイルス抵抗性植物及びキク科植物のトマト黄化えそウイルスの防除法 - Google Patents
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Description
しかし1990年の国際ウイルス分類委員会でブニアウイルス(Bunyaviridea)科のトスポウイルス(Tospovirus)属のタイプウイルス(代表ウイルス)として分類された。
ブニアウイルス科にはトスポウイルス属以外に4属あるが、これらはすべて動物に感染するウイルスである。同じ科(ウイルスグル−プ)の中に動物ウイルスと植物ウイルスが属するブニアウイルス科は、分類学的に極めて特殊である。
ウイルスゲノムは3分節の1本鎖RNAから成り、基本的にマイナス鎖として遺伝子翻訳系を経る。最短のRNAからS、M、L RNA(若しくはS鎖、M鎖、L鎖)とよばれ、塩基長はそれぞれ約2.9KB、4.8KB、8.9KBである(非特許文献1〜3参照)。
L RNAにはRNA依存RNA複製酵素が、S RNAにはヌクレオキャプシドタンパクがコ−ドされている。また、S RNA、M RNAは、TSWV重要昆虫媒介性に関連している。
更にトスポウイルス属のウイルスは接種継代を繰り返していくと感染植物の病徴に変化を与えることがある。これはトスポウイルスのL RNAが何らかの原因で短くなり、Defectiv Interfering(DI)RNAまたはDI粒子とよばれるものを生じることに起因している(非特許文献4参照)。
また、キク科やタデ科のような雑草にもTSWVは感染でき、越冬するものもあり翌年の伝染源となる。
更にTSWVは一度感染すると植物に定着しやすく、根絶は不可能に近い。
しかし、アザミウマは1mm以下の非常に小さな虫で、侵入阻止のためには、圃場を寒冷紗等の目の細かい網で隔離せざるを得ず、圃場内の気温上昇が懸念されるため、容易には実施されていないのが現状であった。また、アザミウマは花粉を好み、よって、花被の中に入って薬を回避するため、農薬防除も有効な手段にはならなかった。
しかし、耐性または抵抗性遺伝子の探索は、非常に時間と根気のいる作業であり、たとえ同定されても、更に商業品種への導入・定着を確認するには、尚一層の多大な時間を要する。
このため人気品種の入れ替わりが激しく、多大な種類の品種が存在する花卉及び観賞用植物においては、耐性または抵抗性品種の育種は難しく、殆ど行われていないのが現状である。
(a)TSWVのウイルスRNA複製中間体と少なくとも一部に相補性である配列を含有すること。
(b)タバコ、ジャガイモ及びトマト等の植物細胞内でウイルスRNA複製中間体と安定な結合を形成できること。
(c)当該植物細胞内条件のもとで結合に利用可能なTSWVのウイルスRNA複製中間体の一部に結合すること。
(d)TSWVのウイルスRNA複製中間体への安定な結合がTSWVの増殖サイクルを阻害すること。
(1)TSWVを媒介するアザミウマを防除する。
(2)TSWV抵抗性品種を開発する。
(3)遺伝子組換えによって、TSWV抵抗性トランスジェニック植物を開発する。
しかし、これらの方法は、TSWVによる植物への病害を十分に防除するものではなく、ましてキクにおいても、TSWV防除に効果的な方法は未だ開発されていない。
よって、本発明者らはキク品種のTSWV防除に効果を奏する、ウイルス症状が極めて弱い弱毒TSWV、該弱毒TSWVを用いたTSWVの防除法及びTSWV抵抗性キク植物を提供することを目的とする。
そして、これらの植物からTSWVを分離して、キクへの接種試験を行って、強毒TSWVへの防除効果があり、尚且つウイルス症状の軽微なTSWVの中から選抜を重ねた結果、キクに感染してもウイルス症状が極めて軽微であって、そのウイルスを該キクに接種し感染しておくことにより、多種多様の強毒TSWVの病害に対して防除効果のある弱毒TSWVを選抜することに成功した。
(1)配列番号1記載の塩基配列を含むRNA。
(2)配列番号1記載の塩基配列を含むRNAがDI RNAである前記(1)記載のRNA。
(3)配列番号1記載のRNAを含むトマト黄化えそウイルス弱毒ウイルス。
(4)配列番号1記載のRNAを含むトマト黄化えそウイルス弱毒ウイルスを、予め植物の苗に接種して得られるトマト黄化えそウイルス抵抗性植物。
(5)植物がキク科植物である前記(4)に記載のトマト黄化えそウイルス抵抗性植物。
(6)前記(1)に記載のRNAを含むトマト黄化えそウイルス弱毒ウイルスを、予め植物の苗に接種することを特徴とする植物のトマト黄化えそウイルスの防除法。
(7)植物がキク科植物である前記(6)に記載の植物のトマト黄化えそウイルスの防除法。
(8)キク科植物に接種しこれを栽培してもウイルス症状を発生せず、しかもアザミウマ伝搬性が欠如していることを特徴とするトマト黄化えそウイルス弱毒ウイルス。
このウイルスは、キク科、ナス科、マメ科及びウリ科植物等の極めて広い宿主範囲に、えそや黄化症状を呈し、また、アザミウマによって永続伝搬される。
本発明のTSWVは、栽培されているキク、トマト及びトルコキキョウ等を採取し、該植物に感染しているTSWVを採取して、菊に感染した際の病徴が全く観察されず、含有する塩基配列のRNAが安定して次世代のキクに伝搬する性質のTSWVを選択し、そのRNAの塩基配列を決定することによって、目的とする特定塩基配列のRNAを含有するTSWVを取得することが可能である。このような例としては、配列番号1記載のRNAを含有するTSWVが挙げられる。
DI RNAは、そのウイルスのゲノムRNAの一部と相似な配列を持つが、一方で一部の遺伝情報が欠損しているため、複製は完全なウイルスゲノムRNAに依存している。
このDI RNAの干渉作用のために、完全ウイルスの植物細胞傷害性が阻害若しくは軽減され、持続感染防除が成立する。
これは、DI RNAが完全ウイルスRNAよりも塩基長が短いため、複製速度が速く、その結果、完全ウイルスRNAよりもその割合が多くなることが影響していると考えられている。
日本各地で栽培されているTSWVが感染したキク、トマト及びトルコキキョウ等を採取し、以下の操作方法に従って、採取した当該植物からTSWVを分離する。
先ず、該TSWV感染植物よりTSWV病斑を採取した部位を、亜硫酸ナトリウム0.1〜0.2%を含む0.03〜0.1Mのリン酸緩衝液で磨り潰して粗汁液を作成し、該粗汁液を機械的に接種して、タバコまたはチョウセンアサガオの葉にTSWVを感染する。
そして、該タバコまたはチョウセンアサガオ感染葉を同様の方法で作成した粗汁液を、タバコまたはチョウセンアサガオに、機械的に接種することを繰り返した後、該TSWVの中から、ウイルス症状が全く発現しないか、または微かにウイルス症状を呈するTSWVを分離して、TSWVの弱毒ウイルスを分離する。
以上の方法により、7種類のTSWVの弱毒ウイルス(TSWV−6B、TSWV−8B、TSWV−18B、TSWV−19B、TSWV−26B、TSWV−33A、TSWV−36B)を分離した。
得られた7種類の弱毒TSWVを機械的に接種したタバコ感染葉を、上記リン酸緩衝液で磨砕し、キクの若苗(4〜7葉)に機械的に接種する。
そして、機械的接種の数週間後、伸長したキクの主茎を地際部より10cm上の部分で剪定し、その下部から出てきた脇芽を採取する。
次にこれらの弱毒TSWV感染キクを6ポットずつに芽挿しをし、1年間、該挿し芽のTSWV症状の発生を観察して、該弱毒TSWVの中から、キクにウイルス症状が全く発現しないか、または微かにウイルス症状を呈するTSWVを分離して、弱毒TSWVを分離する。
以上の方法により、TSWV−19B、TSWV−26B及びTSWV−33Aの3株を接種したキクにウイルス症状が全く発生しないことが判明した。
前記(2)と同様に弱毒TSWVのタバコ感染葉を上記リン酸緩衝液で磨砕し、キクの若苗に機械的に接種して、伸長したキクの主茎を地際から10cm上の部分で剪定する。
該若苗(4〜7葉)のキクから伸長する5〜10cmの脇芽(4〜6葉)を採取してポットに芽挿しをし、その挿し芽に、強毒TSWVのキク感染葉を上記リン酸緩衝液で磨り潰した粗汁液を機械的に接種する。
そして、該強毒TSWV接種後3週間から8週間にかけて、接種した部位の上位にある葉を観察し、該強毒TSWVによるウイルス症状と該弱毒TSWVによる防除効果を調査して、キクにウイルス症状が全く発現しないか、または微かにウイルス症状を呈する弱毒TSWVを選択する。
以上の方法により、7種類の弱毒TSWVの中から、最も強毒TSWVの病害防除に優れているTSWVを見出して選択し、本発明のTSWV−19Bとした。
本発明のTSWV−19Bの感染タバコ葉を2倍容量の抽出緩衝液(5M塩化ナトリウム/2%N−ドデカノイルサルコシン酸ナトリウム)で磨砕した。
次いで上記緩衝液、当量のフェノ−ル/クロロホルム(1:1)及び3M酢酸ナトリウム(pH5.2)を加えて撹拌混合し、全RNAを抽出した。これを遠心分離しエタノ−ル沈殿して、RNAを濃縮回収した。
このRNAを鋳型に、L鎖(Genbank accession #;D 10066)に相同な配列を持つフォワ−ドプライマ−(gaagatgcctttgatgaagatg)と逆転写酵素Omniscript(QIAGEN社製)を用いて逆転写を行った。
この逆転写産物を鋳型に、上記フォワ−ドプライマ−と、同じくL鎖相同な配列を持つリバ−スプライマ−(gaaactataccgggactctac)及びTaq DNAポリメラ−ゼ(Invitrogen社製)を用いてPCRで94℃4分間、次いで94℃1分間、50℃1分間、72℃1分間の反応を40回繰り返した後、72℃7分間反応して、目的部分を増幅した。
この増幅したDNAフラグメントを電気泳動ゲルから切り出し精製を行った後、pGEM T−EASY vector(Promega社製)にクロ−ニングして、その塩基配列を決定した。
その結果、本発明のTSWV−19BはL鎖領域に、特異的な塩基配列のRNAを有することが判明した(配列番号1)。
TSWVのL RNA鎖の一部をクロ−ニングしたDNAの鋳型に上記フォワ−ドプライマ−、上記リバ−スプライマ−、DIG DNA ラベリングミックス(Roche社製)及びTaq DNAポリメラ−ゼ(Invitrogen社製)を用いて、(4)と同様の方法でPCRを行い、DIG標識プロ−ブを作製した。
このL鎖特異的プロ−ブであるDIG標識プロ−ブを用いて、本発明のTSWV−19BのDI RNAの分析を行った。
先ず、TSWV−19B感染キク葉から抽出したRNAを1%変性アガロ−スゲル電気泳動し、該電気泳動後のゲルを20×SSC緩衝液(3M塩化ナトリウム/0.3Mクエン酸ナトリウム)で20分間洗浄した。
この洗浄したゲルをHybond−Nメンブレン(Amersham社製)に載せて、Whattman 3M濾紙に8時間程挟んで、該メンブレンにRNAを吸着した。
吸着後の該メンブレンをバイブリダイゼ−ション緩衝液(0.5M リン酸水素2ナトリウム/1mM EDTA/7% SDS)に入れて、更に1μg程度のDIG標識L鎖プロ−ブを加え、一晩ハイブリダイゼ−ションを行った。
ハイブリダイゼ−ション後のメンブレンは2×SSC緩衝液で洗浄して、Anti−DIgoxigenin−AP(Roche社製)を反応させて、アルカリフォスファタ−ゼ発色基質NBT/BCIPストック液(Roche社製)で染色した。
その結果、メンブレン上にL鎖及びDI RNAを検出し、よってTSWV−19BはDI RNAを有することが判明した(図1)。
よって、TSWV−19Bは出願人自らが保管し、特許法施行規則第27条の3の規定に準じて、譲渡可能としている(保管場所:郵便番号378−0016、群馬県沼田市清水町3784番地、日本デルモンテ株式会社、研究開発本部、植物ワクチン開発部)。
特定塩基配列のRNAを含有するTSWVに感染したキク葉1gに緩衝液(中性付近の0.1Mリン酸緩衝液)1〜50ml、好ましくは5〜15mlを加えてミキサ−で磨砕して、TSWVを含有してなる接種源を得る。
TSWVを含有してなる接種源のキクへの接種、感染方法は、当該接種源を綿棒、指、ガラス棒などを用いて擦り付ける方法や、キクを研磨剤または摩擦剤等を用いて人為的に摩擦した後、その部分に該接種源を接種する方法、該接種源を直接注入する方法、スプレ−ガンによって該接種源を噴霧する方法、またはキクの表面に該接種源を噴霧した後、研磨剤を付着させたロ−ラ−を圧接回転せしめ、該表面を被傷せしめると共に該植物体に接種する方法(特許第2908594号)、キクの表面にブラシを当てて該キクの表面を被傷させ、その前または後ろにおいてキクの表面に該接種源を接触させる方法(特許第3759560号)、或いは該接種源をキク、またはキク組織の一部に直接ジ−ンガンで撃ち込む方法等があり、その感染または導入方法に制限はない。
従って、該接種源をキクへ接種して感染させる時期は、キクの任意の適宜な時期でよい。
加えて、該キクの育成、または栄養繁殖の方法は、通常の方法に従って行うことができ、その方法に制限はない。
以上の方法によって、特定塩基配列のRNAを含有するTSWVを、特定キク品種に接種感染することができる。
したがって、このキク苗を適当な大きさに切断した後、挿し芽、または生育した菊のわき芽の挿し芽、冬至芽の株分けや挿し芽などの栄養繁殖手段を採用して、通常の育苗管理をすると、容易にTSWVが全身に感染した、キク苗が得られる。
群馬、長野、及び愛知等の日本各地で栽培されているTSWVが感染したキクを採取し、以下の操作方法に従って、採取した当該植物からTSWVを分離した。
まず、該TSWV感染植物よりTSWV病斑をとり、亜硫酸ナトリウム0.1%を含む0.1Mのリン酸緩衝液で磨り潰し、タバコの葉に機械的に接種し感染させた。
そして、該タバコ感染葉を同様の方法で、別のタバコに、機械的に接種することを繰り返し、病徴が軽微なタバコを選抜して、7種類の弱毒TSWV(TSWV−6B、TSWV−8B、TSWV−18B、TSWV−19B、TSWV−26B、TSWV−33A、TSWV−36B)を分離した。
得られた上記弱毒TSWV7種類を機械的に接種したタバコ属感染葉を、それぞれ上記のリン酸緩衝液で磨砕し、キクの若苗(4〜7葉)に機械的に接種した。
機械的接種の数週間後、伸長したキクの主茎を地際から10cm上の部分で剪定し、その下部から出てきた脇芽を採取した。
これらの弱毒TSWV感染キクを6ポットずつに芽挿しをし、1年間、TSWV症状の発生を調査した。その結果を表1に示す。
(2)と同様に7種類の弱毒TSWVのタバコ感染葉を上記リン酸緩衝液で磨砕し、キクの若苗に機械的に接種して、伸長したキクの主茎を地際から10cm上の部分で剪定した。
該若苗(4〜7葉)のキクから伸長する5〜10cmの脇芽(4〜6葉)を採取してポットに芽挿しをし、その挿し芽に、強毒TSWVであるTSWV−JM1のキク感染葉を上記リン酸緩衝液で磨り潰した粗汁液を機械的に接種した。
該強毒TSWV接種後3週間から8週間にわたり、接種した部位の上位にある葉を観察して、該強毒TSWV−JM1によるウイルス症状と該弱毒TSWVによる防除効果を調査した。
その結果を表2に示す。
尚、比較のため、弱毒TSWVを接種しないキクの挿し芽に、強毒TSWVを接種し栽培して、ウイルス症状を調べた。この結果も表2に示す。
本発明のTSWV−19Bと野性株である強毒TSWV−JM1をそれぞれチョウセンアサガオ苗に機械的に接種し、接種3〜4週間後の当該苗から、TSWV−19Bと強毒TSWV−JM1の感染部を採取した。
そして、採取した感染部に、ミカンキイロアザミウマの孵化して間もない幼虫約300体を24時間付着して、ミカンキイロアザミウマの幼虫に、本発明のTSWV−19Bまたは強毒TSWV−JM1を獲得させた。
次いで該幼虫を回収し、12〜20日間20〜23℃の環境下での飼育条件下で、蛹を経て成虫になった該ミカンキイロアザミウマ1個体ずつを、インパチェンスの葉1枚毎に、及びトマト苗1本毎に付着して、インパチェンス及びトマト苗に、TSWV−19Bと強毒TSWV−JM1を伝搬接種した。
伝搬接種後、該インパチェンス及びトマト苗から、該ミカンキイロアザミウマを回収して、該植物を3〜4週間育苗し、育苗した該植物にウイルスが感染しているか調べて、本発明のTSWV−19B分離株と強毒TSWV−JM1のアザミウマ伝搬性を調査し、また、本試験に用いたミカンキイロアザミウマのTSWV保毒率も調査した。
その結果を表3に示す。
尚、一般的にアザミウマによるTSWV伝搬性試験は、ペチュニアまたはチョウセンアサガオを用いて行われる。
しかし本発明者らは、予備実験の結果、アザミウマによる伝搬率はインパチェンスの方が、ペチュニアまたはチョウセンアサガオより高いことを見出した。
また、TSWVは世界各地でトマトに深刻な被害をもたらしているウイルスである。
よって、本試験では、アザミウマによるTSWV−19Bの伝搬性を精査するため、アザミウマ伝搬性が高いインパチェンスと、TSWVが重要病害であるトマトを用いた。
一方、前述したように、このウイルス病はアザミウマ類(ミカンキイロアザミウマ、ヒラズアザミウマ等)により媒介され、伝搬されると考えられており、そのためトマト黄化えそウイルスの防除は、アザミウマ類の防除の徹底を余儀なくされている。
本発明のTSWV弱毒ウイルスは、このアザミウマによって伝搬されず、アザミウマ伝搬性が完全に欠如していることことから、これらの有害昆虫の防除対策(例えば農薬散布など)が軽減される特徴を有する。
Claims (8)
- 配列番号1記載の塩基配列を含むRNA。
- 配列番号1記載の塩基配列を含むRNAがDI RNAである請求項1記載のRNA。
- 配列番号1記載のRNAを含むトマト黄化えそウイルス弱毒ウイルス。
- 配列番号1記載のRNAを含むトマト黄化えそウイルス弱毒ウイルスを、予め植物の苗に接種して得られるトマト黄化えそウイルス抵抗性植物。
- 植物がキク科植物である請求項4に記載のトマト黄化えそウイルス抵抗性植物。
- 請求項1に記載のRNAを含むトマト黄化えそウイルス弱毒ウイルスを、予め植物の苗に接種することを特徴とする植物のトマト黄化えそウイルスの防除法。
- 植物がキク科植物である請求項6に記載の植物のトマト黄化えそウイルスの防除法。
- キク科植物に接種しこれを栽培してもウイルス症状を発生せず、しかもアザミウマ伝搬性が欠如していることを特徴とする配列番号1記載のRNAを含むトマト黄化えそウイルス弱毒ウイルス。
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