KR20200067163A

KR20200067163A - 식물병 방제에 있어서 스트렙토마이세스 멜라노스포로파시엔스 AGL225(Streptomyces melanosporofaciens AGL225)를 함유하는 조성물의 용도

Info

Publication number: KR20200067163A
Application number: KR1020207012208A
Authority: KR
Inventors: 에밀리오 몬테시노스 세구이; 에스터 바도사 로마노스; 이사벨 모라 폰스; 미레이아 푸이그 가르시아
Original assignee: 아그로락, 에스.에이.
Priority date: 2017-10-06
Filing date: 2018-10-05
Publication date: 2020-06-11
Also published as: MX2020003833A; TW201923067A; EP3467097A1; EP3692137A1; JP2020535841A; BR112020006366A2; MA50612A; US20200267994A1; US11390844B2; ECSP20024456A; WO2019068887A1; PE20210463A1; CO2020005593A2; CL2020000866A1

Abstract

본 발명은 스페인 생물자원센터(CECT)에서 스트렙토마이세스멜라노스포로파시엔스(Streptomycesmelanosporofaciens) CECT9420으로 동정된 균주 스트렙토마이세스 멜라노스포로파시엔스 AGL225(Streptomyces melanosporofaciens AGL225), 및 상기 균주의 식물에서 살해충제로서의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 또 다른 양태는 균주 S. 멜라노스포로파시엔스 AGL225의 현탁액 및 추출물 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 추가적인 양태는 S. 멜라노스포로파시엔스 AGL225를 함유하는 살해충제 조성물에 관한 것이다. 마지막으로 본 발명은 균주 S. 멜라노스포로파시엔스 AGL225, 상기 균주를 함유하는 조성물 또는 S. 멜라노스포로파시엔스 AGL225에서 유래하는 무세포 추출물을 식물에 투여하는 단계를 포함하는 식물 병해충의 생물학적 방제 방법에 관한 것이다.

Description

식물병 방제에 있어서 스트렙토마이세스 멜라노스포로파시엔스 AGL225(Streptomyces melanosporofaciens AGL225)를 함유하는 조성물의 용도

본 출원은 2017년 10월 6일 출원된 유럽 특허출원 제 EP17382669.4호의 우선권을 주장한다.

본 발명은 생물농약 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로는 스트렙토마이세스 멜라노스포로파시엔스(Streptomyces melanosporofaciens) 균주 및 특히 채소 작물 및 과실나무에서 세균, 곰팡이 및 선충에 의해 유발되는 식물병의 생물학적 방제에 있어서 이들의 용도에 관한 것이다.

환경 및 소비자 건강에 대한 합성농약의 대량 사용의 부작용은 잘 알려져 있다. 이러한 문제로 인해 식물병 방제는 살곰팡이제 및 살세균제를 합리적으로 사용하고 독성이 적은 제품을 적용하는 경향을 나타낸다. 또한, 식물보호는 상이한(물리적, 기계적, 화학적, 생물학적, 유전적, 법적 및 문화적) 방법을 결합한 통합 병해충 관리(integrated pest management-IPM)에 맞춰져 있다. 병해충 및 질병 방제에 있어서 이러한 방향의 전환은 유럽연합 회원국 및 다른 국가 모두에서 식물보호 제품의 상업화 및 사용을 위한 새로운 입법체계를 이끌어 내고 있다. 이러한 규정은 기존의 식물보호 제품의 사용을 줄이고 통합 병해충 및 질병 관리를 통한 지속 가능성을 구현하는 것을 목표로 하며, 식물위생 방제 수단은 바람직하게는 생물학적이고 물리적이어야 한다는 것을 명시한다.

이와 관련해서, 주로 세균 및 곰팡이와 관련된 식물에 유익한 미생물 균주에 기초한 생물농약은 기존의 합성농약에 대한 대안 또는 보완물을 제공한다. 미생물 농약의 주요한 장점 중 하나는 그 사용으로 잔류물이 없는 농작물의 생산이 가능하다는 점이며, 이는 특히 유기농업 생산에 있어서 승인에 유리하다. 다만, 화학농약과 비교할 때, 소수의 미생물 농약만이 현재 이용 가능하며, 이들 중 대부분은 곰팡이가 유발하는 질병에 대해 효과적이지만 세균성 질병에 대해서는 효과가 없다. 이 분야의 심도 있는 연구에도 불구하고, 상업용 생물학적 제품의 유효성분인 대부분의 미생물 균주는 독성 2차 대사산물을 생산하고, 식물 군락에 대한 충분한 생태학적 적합성이 결여되었으며, 합성 제품보다 효능이 떨어질 뿐만 아니라 시간이 지남에 따라 약간의 불안전성을 나타내어서, 지속성 조성물로 제형화하기 어렵다. 또한, 미생물농약은 살아있는 유기체로서, 환경(온도, 상대 습도, 비 등) 및 숙주 상태(식물 종, 품종, 생물계절 등)는 이들의 생물학적 활성에 강한 영향을 미쳐, 감소되거나 가변적인 질병 방제 효능을 야기하며, 기존의 화학농약보다 효능이 더 낮다.

많은 미생물 생물농약의 문제점은 이들이 기존의 합성농약과 함께 쓸 수 없다는 것이고, 이는 곧 통합 병해충 및 질병 관리에서의 사용을 제한한다는 것이다. 예를 들어, 트리코더마(Trichoderma) 또는 글리오클라디움(Gliocladium) 길항 균주와 같은 곰팡이 균주를 기재로 하는 기초한 대부분의 유효성분은 살곰팡이제에 민감하다. 이러한 의미에서, 세균은 살곰팡이제에 민감하지 않다는 장점이 있으며, 따라서 이들과의 동시 사용에 적합하다.

또한, 관할 관청이 미생물을 생물농약으로 승인하는데 필요한 주요 요건 중 하나는 생물 안전성으로, 이는 환경보전협회(EPA) 또는 유럽 식품안정청(EFSA, 유럽)과 같은 기관으로부터 평가된다. 따라서, 병해충 및 질병 방제에 효능을 나타냈던 특정 미생물은 임상 사례에서 언급된 슈도모나스(Pseudomonas) 및 판토아(Pantoea)의 특정 종의 경우와 같이, 생물농약으로 사용하는데 장애가 되는 인간 또는 동물에 대한 잠재된 기회감염성 병원성때문에 안전성을 이유로 제외되어 왔다.

미생물 생물농약의 개발에 있어서, 미생물 균주 생산의 산업화 역량 뿐만 아니라 오랜 내용 연한(useful life)을 위해 이의 제형 또한 반드시 고려되어야 한다. 이는 주로 탈수에 의해 수득되는 분말 제형에 의해 달성되지만, 건조 공정은 그람(Gram) 양성균 보다 더 민감한 미생물, 특히 그람 음성균(예컨대, 슈도모나스)의 생존력에 크게 영향을 미친다. 포자를 생성하는 스트렙토마이세스 및 바실러스(Bacillus) 속의 경우, 세 가지 성분(식물 세포, 포자 및 발효 대사산물)에 대한적합한 제형을 고성능으로 그리고 농작물 환경에서 적합하게 제조할 수 있다.

상술한 모든 장점을 집약하기 위해, 스트렙토마이세스 또는 이와 관련된 종의 다양한 균주는 스트렙토마이세스 리디커스 WYEC 108(Streptomyces lydicus WYEC 108) 및 스트렙토마이세스 K61(Streptomyces K61) (Montesinos 및 Bonaterra, 2009)와 같은 생물학적 방제제로서 상업적으로 개발되어 왔다. 다만, 이러한 균주는 곰팡이 병원체 방제에 초점을 둔 활성 프로파일(profile)을 나타낸다.

감자 괴경 질병 및 몇 가지의 토양 식물 병원체에 대한 활성을 나타내는 S. 멜라노스포로파시엔스 EF-76(WO2010115802), 다양한 곰팡이 질병에 대한 활성을 나타내는 S. 야텐시스 CJS-24(S. yatensis)(KR100869668) 및 항곰팡이 및 살선충 활성을 갖는 스트렙토마이세스 사라세티쿠스 SS31(Streptomyces saraceticus SS31)(US20140057336)과 같은 일부 스트렙토마이세스 균주가 개시되어 있다.

결과적으로, 병해충의 생물학적 방제에 사용될 식물 병원성 곰팡이, 세균 및 선충에 대해 광범위 활성을 갖는 개량된 세균 균주의 필요성이 여전히 존재한다.

본 발명자는 식물의 근권으로부터 채취한 천연 시료에서 스트렙토마이세스의 새로운 균주를 분리했으며, 이는 생물학적 병해충 방제에 사용하기에 매우 적합하게 하는 특성을 지니고 있다. 균주는 놀라울 정도로 광범위한 살해충 스펙트럼을 특징으로 하며, 이는 다양한 식물병원성 곰팡이 및 세균 뿐만 아니라 선충을 방제하는데 매우 효과적이다. 이러한 균주는 또한 식물 방어를 유도하며, 이는 나아가 생물농약으로서의 용도에 대한 관심을 증대시킨다. 균주는 또한 편리하게도 산업 공정에 잘 견디고, 내구 연한이 길며 그리고 환경적 스트레스에 강하다. 전체적으로, 이러한 균주는 하기에서 나타내는 바와 같이, 최신 기술에서 기술된 다른 균주들이 나타내는 일부 한계를 극복한다.

본 발명의 첫 번째 양태는 스페인 생물자원센터(CECT)에서 스트렙토마이세스멜라노스포로파시엔스(Streptomycesmelanosporofaciens) CECT9420으로 동정된 스트렙토마이세스 멜라노스포로파시엔스 AGL225(Streptomyces melanosporofaciens 멜라노파시엔스 AGL225) 균주에 관한 것이다.

본 발명에 따른 균주 S. 멜라노스포로파시엔스 AGL225는 헤로나 지역의 포플러 나무(Populus nigra) 뿌리로부터 분리되었고 출원인에 의해, 부다페스트 조약에 따라, 2017년 7월 19일, (발렌시아) 46980 파르테나, 카테드라티코 어거스틴에스카르디노 9, 파르케 시엔티피코 소재 발렌시아 대학의 스페인 생물자원센터(Colecci

n Espa

ola de Cultivos Tipo-CECT)에 기탁되었다. S. 멜라노스포로파시엔스 균주는 식별표시 AGL225로 기탁되었고 수탁번호 CECT9420을 부여받았다. 구체적으로, 이러한 균주는 다음을 특징으로 한다:

(i) ISP2(International Streptomyces Project agar), AIA(Actinomyces Isolation Agar), 베네딕트(Benedict) 및 SNM(nitrate and starch agar)과 같은 다양한 배양 배지에서 식물병원성 곰팡이 및 세균에 대한 시험관 내(in vitro) 길항 활성 (표 1).

(ii) 세균 에르위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora), 슈도모나스 시링가에 병원체 변종 토마토(Pseudomonas syringae pv. tomato), 슈도모나스 시링가에 병원체 변종 악티니디아에(P. syringae pv. actinidiae), 잔토모나스 아르보리콜라 병원체 변종 푸르니(Xanthomonas arboricola pv. pruni), 및 곰팡이 보트리티스 시네레아(Botrytis cinerea), 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum) 및 스템필리움 베시카리움(Stemphylium vesicarium)에 대한 길항 활성 (표 1 및 2);

(iii) 모델 선충 캐노랍디티스 엘레강스(Caenorhabditis elegans)에 대한 키틴분해 및 살선충 활성 (표 1, 표 4, 도 5).

(iv) 항미생물성 II형 폴리케티드(act04) 생산 유전자는 있지만 아미노글리코시드 항생제 유전자는 없다 (도 3).

(v) 균주가 증식하는 배양 배지는 일단 무세포 상태(증식 세포 현탁액의 상청액)가 되면, 발효에 의해 균주에 의해 생성되는 활성 대사산물의 독특한 HPLC 프로파일을 갖는다. 이러한 대사산물 프로파일은 AGL225 균주에 특징적이어서 이를 다른 스트렙토마이세스 균주와 구별한다 (도 4). 이러한 대사산물은 또한 살세균, 살곰팡이 및 살선충 활성을 갖는다.

(vi) 과민성 반응을 동반하고 또한 식물에서 방어 유전자를 유도하여 자연 식물 방어를 유도한다 (표 3).

(vii) 배의 식물병원성 세균 E. 아밀로보라, 토마토 식물의 P. 시링가에 병원체 변종 토마토, 살구속(Prunus)의 X. 아르보리콜라 병원체 변종 푸르니에; 및 상추의 식물병원성 곰팡이 스클레로티니아 스클레로티움(Sclerotinia sclerotiorum), 토마토의 F. 옥시스포룸 f. 종 라디시스 리코페르시시(F. oxysporum f. sp. radicis lycopersici) 및 토마토의 B. 시네레아에 의한 감염에 대해 저해능을 갖는다 (도 6).

AGL225 균주는 항곰팡이, 항세균, 살선충 활성을 동시에 수반하는 큰 장점이 있다. 또한, 이러한 균주는 식물에서 자연 방어 기전을 유도한다. 스트렙토마이세스 균주에 이러한 네 가지 기전이 동시에 존재한다는 것은 식물보호 제품에서 단일 활성 성분에 대해 광범위의 질병 방제 기전을 제공하는 장점이 된다.

식물병원성 방제에 대한 본 발명에 따른 균주의 높은 길항 활성은 부분적으로는 식물병원성 세균 및 곰팡이, 그리고 또한 선충의 증식을 저해하는 항미생물 화합물의 생성의 결과이다. 이러한 화합물은 폴리 케티드, 키틴분해효소 그리고 짐작하건대 아직 알려지지 않은 항미생물 활성을 갖는 다른 화합물을 포함한다.

많은 스트렙토마이세스 균주는 (비록 아미노글리코시드 또는 폴리케시드와 같은 항미생물 생합성 유전자를 가지고 있음에도 불구하고) 식물병원성 곰팡이 및 세균에 대해 유의미한 길항 활성을 가지고 있지 않다. 대조적으로, 표 1에서 본 발명에 따른 균주 S. 멜라노스포로파시엔스 AGL225가 각각 다른 식물병원성 세균 그리고 각각 다른 식물병원성 곰팡이에 대해 광범위한 스펙트럼의 현저한 길항작용을 나타낸다는 것을 알 수 있으며, 이는 놀랍게도 네 가지 유형의 배양 배지에서 유지된다. 이는 배 식물의 E. 아밀로보라, 토마토 식물의 P. 시링가에 병원체 변종 토마토 및 살구속 (GF677)의 X. 아르보리콜라 병원체 변종 푸르니와 같은 세균에 의한 감염 및 다른 식물 병원체에 의한 감염을 저해하는데 있어서 본 발명에 따른 균주의 효과를 나타내고 (도 3), 곰팡이와 선충 모두에 대해 활성을 나타내는 키틴분해효소를 생성한다. 살선충 활성은 예시 6에서 기재된 바와 같이 배양체로부터 무세포 상청액의 C. 엘레강스 선충 치사율 분석에서 입증된다 (도 5, 표 4).

이러한 항미생물(동시에 항세균 및 항곰팡이) 프로파일은, 다른 스트렙토마이세스 균주들과 비교해 볼 때 놀라운 것이다 (참조 표 1, 분리된 다른 스트렙토마이세스 균주를 목록화함). 또한, 강력한 항미생물 활성은 본 발명에 따른 균주에 다소 독특한, 살선충 및 식물 방어 활성에 의해 보완된다.

항미생물 폴리케티드의 합성과 관련된 유전자의 존재는 예시 5에서 기재된 바와 같이 결정될 수 있다. 식물병원성 곰팡이 및 세균에 대한 길항 활성은 예시 2와 3에서 기술된 바와 같이 결정될 수 있다. 식물에서 곰팡이 및 세균성 질병을 방제하는 능력은 예시 7에서 기재된 바와 같이 결정될 수 있다.

균주의 또 다른 현저한 특성은 담배 식물에서 과민반응(HR 반응)을 발생시키고, 토마토 식물에서 방어 기전과 관련된 유전자의 발현을 유도한다 (예시 4, 표 3). 식물과 관련된 일부 미생물이, 근권 또는 지상부에 적용되었을 때, 병원체에 대한 방어 반응을 유도할 수 있는 것으로 알려져 있으며, 이는 소위 유도성 전신 항성(Induced Systemic Resistance: ISR)이다. ISR은 예시 4에서 기재된 바와 같이 담배 식물에서 HR 반응에 의해 결정될 수 있다. 다른 경우들에 있어서, 이러한 미생물의 성분 또는 이의 증식 동안 생성된 대사산물(발효 대사산물)은 전신 획득 저항성(Systemic Acquired Resistance: SAR)이라 지칭되는 유형의 반응을 유도할 수 있다. SAR은 예시 4에서 기재된 바와 같이 토마토 식물에서 Harp 유전자와 또는 다른 유전자와 같은 방어 유전자를 유도하여 결정될 수 있다. 식물에서 유도된 이러한 방어 기전은 다양한 병원체에 의한 감염 및 가뭄과 같은 스트레스 상황에 대해 저항성을 부여한다. 다양한 식물 종에서 이러한 방어를 유도하는 슈도모나스, 바실러스 등과 같은 식물-관련 세균의 예는 있지만, 이러한 특성은 스트렙토마이세스 균주에서 이전에 입증된 바가 없다.

AGL225 균주는 또한 아미노글리코시드 항생제를 생성하지 않는다는 장점을 가지고 있다. 아미노글리코시드 항생제의 생산자로 잘 알려진 스트렙토마이세스 균주는 안전상의 문제로 인해, 통합 병해충 방제, 특히 생물학적 병해충 방제에 대해 이들의 용도가 제한된다. AGL225는 이러한 물질을 발현시키는 유전자를 가지고 있지 않으므로 아미노글리코시드를 생성하지 않는다. 이는 도 3에 도시되어 있다. 대신에, AGL225는 II형 폴리케티드(act04)의 합성을 위한 생합성 경로 유전자를 포함하며, 이는 생물학적 병해충 방제에 적합한 항미생물성 폴리케티드의 생산 능력을 수반한다.

S. 멜라노스포로파시엔스 AGL225 균주의 장점은 통합 병해충 방제에 특히 적합하다는 것이다. 본 발명에서, 용어 "통합 병해충 관리"는 농경학 분야에서의 통상적인 의미를 가지며, 여기서 병해충 방제의 물리적, 기계적, 화학적, 생물학적, 유전적, 법적 및 문화적 측면의: 다양한 보완적 방법을 이용하는 전략으로 이해되어야 한다. 생태학적 방법은 화학 합성농약의 사용을 줄이거나 없애고, 환경에 미치는 영향을 최소화하는 것을 목표로 한다. 생태학적 또는 생물학적 병해충 방제라는 얘기도 있다. 따라서, 본 발명에서 용어 "병해충 방제", "생물학적 병해충 방제"는 상호 교환적으로 사용되고 통합 병해충 방제를 지칭하다.

하기의 예시에 의해 효과적으로 도시된 바와 같이, 본 발명에 따른 균주는 원예 식물 및 과실 나무에서 상이한 세균 및 곰팡이 병원체에 의한 감염을 예방하는데 매우 효과적이다. 하기의 제시된 데이터로부터, 이 효과는 주로 뿌리 뿐만 아니라 식물의 지상 기관(잎, 과실 및/또는 꽃)에서, 이들 병원체에 대한 높은 길항 활성에 기인한다고 결론지을 수 있다. 이러한 놀라운 능력은 생물학적 병해충 방제에 매우 중요하다.

따라서, 본 발명의 또 다른 양태는 식물에서 농약으로서의 균주 S. 멜라노스포로파시엔스 AGL225에 관한 것이다.

본 발명에서, 용어 "농약"은 농경학 분야에서 병충해로 간주되는 생물을 죽이거나, 그 증식을 격퇴시키고 또는 방해하기 위한 제품으로서의 통상적인 의미를 갖는 것으로 이해되어야 한다. 명확하게는, 균주 S. 멜라노스포로파시엔스 AGL225의 특성으로 인해, 본 발명에서 "농약"은 생물학적, 또는 생태학적 농약이며 또한 생물농약이라 지칭되는 것으로 이해되어야 한다.

본 발명의 또 다른 양태는 식물에서 세균, 곰팡이 또는 선충에 의한 질병 방제를 위한 S. 멜라노스포로파시엔스 AGL225의 용도에 관한 것이다. "질병 방제"에 의해 세균, 곰팡이 또는 선충에 의해 유발되는 식물 질병을 예방하고, 치료하며 그리고 개선하는 것으로 이해되어야 한다. 균주는 질병을 유발하는 병해충을 예방하고, 감소 또는 박멸하기 때문에, 그리고/또는 식물에서 자연 방어를 향상하기 때문에 이러한 효과를 달성한다. 구체적인 실시예에서, 균주 S. 멜라노스포로파시엔스 AGL225의 용도는 세균, 곰팡이 또는 선충에 의한 식물 병해충을 방제하는 것이다. 이러한 실시예는 또한 살세균, 살곰팡이 및 살선충 활성을 갖는 농약으로서의 균주의 용도를 나타낼 수 있다. 본 발명은 또한 식물에 S. 멜라노스포로파시엔스 AGL225 균주를 투여하는 것을 포함하는 식물 병해충의 생물학적 방제를 위한 방법에 관한 것이다.

일 실시예에서, 치료되는 식물은 원예 또는 과실나무 식물이다.

식물에서 농약으로서의 용도 때문에, 균주로부터 충분한 양의 생존 가능한 세포를 수득하고 그리고 충분한 양의 발효 대사산물도 수득할 수 있다는 것이 매우 중요하다. 예시 2에서 나타내는 바와 같이, 조성물은 저장되는 동안, 심지어 농축 및 동결건조 후에도 유지되는 매우 높은 생존력을 나타낸다.

본 발명의 또 다른 양태는 따라서 청구항 1 항에서 정의된 바와 같은 S. 멜라노스포로파시엔스 AGL225 균주의 생존 가능한 세포를 수득하는 방법에 관한 것으으로 다음 단계를 포함한다:

(i) 상기 AGL225 균주를 적합한 배양 배지에 접종하는 단계;

(ii) 세포 현탁액을 수득하기 위해 단계 (i)의 상기 접종된 배양 배지를 상기 균주의 증식에 적합한 조건으로 처리 단계;

(iii) S. 멜라노스포로파시엔스 AGL225의 생존 가능한 세포 및 대사산물-함유 상청액을 수득하기 위해 단계 (ii)의 상기 세포 현탁액을 분리하는 단계;

(iv) S. 멜라노스포로파시엔스 AGL225의 상기 세포를 수집하는 단계; 및

(v) 선택적으로, 상기 수득된 세포를 탈수하는 단계.

본 발명에 따른 균주는 1 과 5% 사이의 최종 농도로 액체 배지에 접종될 수 있다. 바람직하게는, 접종되는 배양체는 기하급수적인 증식기에 있다. 세포 증가는 바람직하게는 최종 기하급수적 증식기 또는 정지기의 시작에 이르게 하고, 7 × 10^* ⁸ 및 2 × 10^{* 9}CFU/ml 사이의 세포 농도를 달성한다. 스트렙토마이세스 균주는 포자를 생성하는 것으로 잘 알려져 있다. 이러한 능력은 상업적 생물농약의 제형화에 있어 편리하다. 포자는 스트레스 조건에 매우 내성이 강해, 산업 공정을 용이하게 하고, 저장 기간이 길며 스트렙토마이세스를 함유하는 제품을 식물에 적용할 때 높은 생존율을 나타낸다. 본 발명의 일부 실시예에서, AGL225 배양체는 정지기까지 증식되거나 포자를 얻기 위해 스트레스 조건에 둔다. 이어서 배양체를 하기에 기술하는 바와 같이 추가적으로 처리할 수 있고 또는 포자를 분리하기 위해 미라클로스(밀리포어)(Miracloth (Millipore)) 필터를 통해 여과할 수 있다. 이후에, 균질한 포자 현탁액을 유지하기 위해 트윈(Tween) 20과 같은 적절한 용액을 첨가할 수 있다. 본 발명의 또 다른 양태는 또한 AGL225의 포자에 관한 것이다. 이러한 포자는 상술한 바와 같이 수득될 수 있다.

포자는 일부 식물 및 미생물의 생활 주기 일부를 형성하는 것으로 잘 알려져 있기 때문에 이를 포자 세포라고도 할 수 있다. 따라서 다음의 실시예에서는, 용어 “세포”는 조건이 이들을 형성하기에 적절한 경우, 포자 세포를 포함할 수 있다. 본 발명의 균주의 증식에 적합한 배양 배지는 IPS2, AIA, 베네딕트 및 SNM의 합성 배양 배지이다. 균주 증식에 적합한 조건은 25와 30℃ 사이의 온도, 6과 8 사이의 pH, 그리고 10과 50% 사이의 산소 농도이다. 본 발명에 따른 균주의 증식은 고체 배지 또는 교반 하에 액체 배지에서 이루어진다. 바람직하게는, 액체 배지가 사용된다. 액체 배지에서 본 발명에 따른 균주의 세포를 수득하는 상세한 절차에 대한 예는 예시 2에 제시되어 있다. 고체 배지에서 생성인 경우, 균주 AGL225를 ISP2 한천을 구비하는 페트리 디쉬(Petri dishes)에서 종균배양 하고, 28℃에서 1 내지 2주 동안 배양할 수 있다. 접종된 디쉬를 균주 증식을 적합한 조건, 예를 들어, 상술한 조건으로 처리한 후, 3 내지 4개의 배양 플레이트로부터 멸균 증류수를 함유하는 40 내지 60ml의 현탁액을 제조한다.

적합한 분리 기술은 배양체의 원심분리 또는 여과를 포함한다. 배양체의 원심분리를, 예를 들어 최저 8000rpm에서 수행함으로써, 세포는 배양 배지로부터 분리될 수 있다(상청액). 이어서 세포를 바로 사용할 수 있으며, 원하는 밀도로 재현탁하고, 탈수 또는 파괴하여 무세포 추출물을 수득한다.

상기 방법으로 수득된 세포는 완충용액과 같은 적합한 용액에서 원하는 밀도, 예를 들어 10^*10 CFU/ml로 재현탁될 수 있다. 이러한 방법으로 세포 현탁액을 수득할 수 있다. 세포 현탁액을 수득하기 위해, 적합한 용액은 또한 세포가 증식했던 배양 배지, 즉 상기 단계 (iii)의 분리로 인한 대사산물-함유 상청액일 수 있다. 이는 상청액이 분리에 의해서 부분적으로 손실되는 활성 대사산물을 함유하기 때문에 유리할 수 있다. 세포 재현탁을 위한 또 다른 적합한 용액은 신선한 배양 배지의 사용일 수 있다. 세포 현탁은 또한 상기에서 정의 방법의 단계 (i)과 (ii)를 포함하는 방법에 의해, 즉 단계 (ii)로부터 수득한 세포 현탁액을 분리하지 않고 직접 수득할 수 있다. 이러한 방법으로 현탁액은 세균 세포에 의해 분비된 활성 대사산물을 함유한다. 직접-수득된 현탁액을 당업자에게 공지된 임의의 적합한 방법에 의해 농축할 수 있다.

발명의 또 다른 양태는 상기에서 개시한 바와 같이 수득 가능한 AGL225의 세포 현탁액 및 이 세포 현탁액의 식물에서, 구체적으로 곰팡이, 세균 또는 선충에 의한 식물 병해충 방제를 위한 농약으로서의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 구체적인 양태에서, 세포 현탁액은 생존 가능한 AGL225 세포, 배양 배지 및 배양 배지를 발효시킴으로써 균주에 의해 생성된 활성 대사산물을 함유한다. 이러한 세포 현탁액은 특히 적합한 생농약을 제형화함에 있어서 유리하다. 또 다른 양태에서 세포 현탁액은 신선한 배양 배지에서 재현탁된 고농도, 바람직하게는 예를 들어 10⁹초과의 생존 가능한 AGL225 세포를 함유한다. 이러한 후자의 고농도 세포 현탁액을 또한 “접종원”이라고 할 수 있으며 그리고 적합한 배양 배지에 접종시켜 균주의 새로운 생존 가능한 세포를 수득하는 데 사용할 수 있다.

이미 언급한 바와 같이, 배양 배지로부터 세포를 분리하여 수득된 상청액은 길항 활성을 갖는 대사산물을 함유한다. 따라서, 본 발명의 또 다른 측면은 상기에서 정의한 바와 같은 S. 멜라노스포로사피엔스 AGL225의 생존 가능한 세포를 수득하는 방법의 단계 (i) 내지 (iii)을 포함하고 상청액을 수집하는 추가적인 단계를 포함하는 AGL225 대사산물-함유 상청액을 수득하는 방법에 관한 것이다. 선택적으로, 수득된 상청액을 증발 또는 한외여과와 같은 임의의 적합한 수단에 의해 농축할 수 있다. 또 다른 양태는 상기에서 정의된 바와 같은 S. 멜라노스포로파시엔스 AGL225의 생존 가능한 세포를 수득하기 위한 방법의 단계 (i) 내지 (iii)으로 구성된 AGL225 대사산물-함유 상청액을 수득하는 방법에 관한 것으로, 단계 (iii)으로 인한 상청액을 수집하고, 선택적으로 상기 상청액을 농축한다. 또 다른 양태는 이러한 방법에 의해 수득 가능한 AGL225 대사산물-함유 상청액 뿐만 아니라 이 AGL225 대사산물-함유 상청액의 식물에서, 구체적으로는 곰팡이, 세균 또는 선충에 의한 병해충 방제를 위한 농약으로서의 용도에 관한 것이다.

선택적으로, 상기에서 정의한 방법에 의해 수득되는 AGL225 세포를 탈수할 수 있다. 탈수는 동결건조 공정에 의해 수행될 수 있지만, 슬러리는 또한 유동층 건조, 또는 분무화에 의해 건조될 수 있다. 이와 관련하여, 본 발명에 따른 균주의 또 다른 유리한 특성은 산업 규모의 미생물 생산에서 일반적인 탈수 공정에 높은 저항성을 보인다는 것으로, 이는 포자를 생성하기 때문이다. 따라서 본 발명은 또한 본 출원에서 정의된 바와 같이 수득 가능한 AGL225 균주의 탈수된 세포에 관한 것이다. 탈수된 세포는 물론 식물에서, 구체적으로 곰팡이, 세균 또는 선충에 의한 식물 병해충 방제를 위한 농약으로 사용될 수 있다.

S. 멜라노스포로파시엔스 AGL225 세포는 무세포 추출물을 수득하기 위해 추가로 처리될 수 있다. 본 발명의 또 다른 양태는 따라서 S. 멜라노스포로파시엔스 AGL225의 무세포 추출물을 수득하기 위한 방법에 관한 것으로 이는 S. 멜라노스포로파시엔스 AGL225 세포를 다음의 단계로 처리하는 것을 포함한다:

(i) S. 멜라노스포로파시엔스 AGL225의 세포를 파괴하는 단계;

(ii) 세포 파편으로부터 무세포 추출물을 분리하는 단계;

(iii) 무세포 추출물을 수집하는 단계; 및

(iv) 선택적으로 무세포 추출물을 농축하는 단계.

적합한 파괴 수단은 당업자에게 공지되어 있으며, 예컨대 냉동-해동, 프렌치 프레스(French Press)와 같은 물리적 파괴, 또는 예컨대 리소자임(lysozyme)의 첨가에 의한 화학적 파괴를 포함할 수 있다. 적합한 분리 수단은 상기에서 기술하였다. 농축을 위한 적합한 공정의 비제한적 예는 탈수(동결건조 분무-건조), 여과, 한외여과, 침전, 원심분리, 및 크로마토그래피이다. 무세포 추출물을 또한 상기에서 정의한 바와 같은, 바람직하게는 대사산물-함유 상청액을 함유하는 세포 현탁액으로부터 수득할 수 있다.

또 다른 양태는 상기에서 정의한 공정에 의해 수득 가능한 S. 멜라노스포로파시엔스 AGL225의 무세포 추출물 뿐만 아니라 이 무세포 추출물의 식물에서, 구체적으로 곰팡이, 세균 또는 선충에 의한 식물 병해충을 방제하기 위한 농약으로서의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 또한 상기에서 정의한 바와 같은 모든 S. 멜라노스포로파시엔스 AGL225 세포, 탈수된 AGL225 세포, AGL225 세포 현탁액, 대사산물-함유 AGL225 상청액 또는 AGL225 무세포 추출물을 식물에 투여하는 것을 포함하는 식물 병해충의 생물학적 방제 방법에 관한 것이다.

병해충 방제에서의 이들의 용도를 고려할 때, 살해충제는 일반적으로 이들이 설계된 농업적 용도에 적합한 첨가제를 함유하는 조성물로 제형화 된다. 본 발명에 따른 조성물은 고체(예컨대, 탈수된 세균 농축물을 포함) 또는 액체(농축된 세균 현탁액을 포함)일 수 있다. 본 발명의 또 다른 양태는 따라서 균주 S. 멜라노스포로파시엔스 AGL225 및 하나 이상의 농업학적으로 허용 가능한 화합물을 함유하는 조성물에 관한 것이다. "농업학적으로 허용 가능한 화합물"은 농업에 사용하기 적합하고 일반적으로 허용되는 화합물 및/또는 물질을 지칭하다. 전반적으로, 이러한 화합물은 인간에게 비독성이어야 하며 그리고 바람직하게는 환경 친화적이어야 한다.

본 발명은 또한 하나 이상의 농업학적으로 허용 가능한 화합물과 함께 상기 에서 정의한 바와 같은 탈수된 세포, 세포 현탁액, 대사산물-함유 상청액, 무세포 추출물, 또는 이들의 조합을 함유하는 조성물에 관한 것이다. 이하, "발명에 따른 조성물"은 상기에서 언급한 임의의 조성물을 지칭하며, 이들 모두는 AGL225 균주 또는 AGL225 균주로부터 유래하는 생성물을 함유한다.

구체적인 양태에서, 본 발명에 따른 조성물은 치료될 식물에서 균주의 부착성을 개선하는 화합물, 식물 강화 화합물, 영양분, 습윤제, 안정화제, 삼투압 보호제, 항산화제, 자외선 차단제, 완충화합물 또는 이들의 조합을 함유할 수 있다. 일부 부착 증강 화합물은 젤라틴, 전분, 펙틴, 알긴산 그리고 크산탄과 같은 다양한 종류의 검이다. 이러한 화합물 중 다수는 또한 습윤제이다. 자외선 차단제는 콩고 레드(Congo red)와 같은 염료를 함유한다. 식물증강제는 작물에 활성을 주거나 병원체 또는 불리한 환경 조건에 내성을 갖게 하는 화합물이다. 식물증강제의 비제한적 예시는 자스몬산 유사체 및 하핀, 키토산, 및 라미나린과 같은 식물에서의 특정 방어 자극제이다. 특히, 본 발명에 따른 조성물은 적어도 하나의 삼투압 보호제를 함유한다. 삼투압 보호성 조성물의 비제한적 예시는 베타인, 아미노산 그리고 트레할로스이다. 생리학적 적응(삼투압 보호제) 및 영양 강화와 같은 방법에 의한 각종 식물병원체의 감염에 대한 생물학적 방제제의 효능 개선이 각종 미생물농약에서 입증되었다. 예를 들어, 물 스트레스 하에서 판토에아 아글로메란스(Pantoea agglomerans) EPS125에서 페니실리움 엑스펜섬(Penicillium expansum)에 의한 과일의 후-수확 부패에 대한 생존 및 질병 방제 효능은 삼투물질(예컨대 트레할로스)로 제형을 변경함으로써 입증되었다(Bonaterra 등. 2005). 또한, 사과 및 배 나무의 화상병 방제에 대한 적합성 및 효능은 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens) EPS62a에서 영양 강화(예컨대, 글리신, 트윈80의 첨가) 및 삼투물질(예컨대, 글리신-베타인)에 의해 개선 되었다(Cabrefiga 등 2011, Cabrefiga 등 2014). 흥미롭게도, 생물학적 방제 세균과 삼투물질 및/또는 특정 영양분과의 조합은 더 나은 방제 효능을 갖는 시너지 효과를 제공하지만, 또한 실험들에 보다 일관적이었다.

추가적인 양태에서, 본 발명은 AGL225 균주 및 적어도 하나의 추가적인 농약을 함유하는 조성물에 관한 것으로, 추가적인 농약은 AGL225 균주의 활성에 부작용이 없다. 일 실시예에서, 추가적인 농약은 살세균제, 살곰팡이제, 살선충제 또는 살충제이다. 또 다른 실시예에서, 추가적인 농약은 생농약이다. 또 다른 실시예에서 생농약은 살곰팡이, 살세균 및/또는 살선충 활성을 갖는 또 다른 세균 균주이다. 바람직하게는, 추가적인 농약은 스트렙토마이세스 야텐시스 AGL148이다.

본 발명의 추가적인 양태는 상기에서 정의된 임의의 조성물의 식물에서 농약으로서의 용도, 특히 곰팡이, 세균 및 선충에 의한 식물 병해충 방제의 용도 뿐만 아니라 상기에서 정의된 바와 같은 임의의 조성물을 식물에 투여하는 것을 포함하는 식물 병해충의 생물학적 방제를 위한 방법에 관한 것이다.

균주 S. 멜라노스포로파시엔스 AGL225와 마찬가지로, 발명자는 균주 S. 야텐스스 AGL148이 항곰팡이, 항세균 및 살선충 활성을 동시에 발휘하는 큰 장점을 가지고 있다는 것을 발견하였다. 균주 S. 야텐시스 AGL148을 (스페인) 헤로나 지역의 호두나무 밭 토양으로부터 분리하였으며, 출원인은 부다페스트 조약에 따라 2017년 7월 18일 (발렌시아) 46980 파르테나, 카테드라티코 어거스틴에스카르디노 9, 파르케 시엔티피코 소재 발렌시아 대학의 스페인 생물자원센터(CECT)에 기탁하였다. S. 야텐시스 균주는 식별표시 AGL148로 기탁되었고 수탁번호 CECT9421을 부여 받았다.

이 균주는 또한 식물에서 자연 방어 기전을 유도한다. S 야텐시스 AGL148은 특정 길항 패턴에서 AGL225와 다르지만 식물보호 제품에서 단일 활성 성분에 대해 광범위한 질병 방제를 유발한다는 동일한 장점을 제공한다. S. 야텐시스 AGL148은 또한 생물학적 병해충 방제에 사용하기에 안전하며 산업용 바이오농약 생산 및 사용에 특히 적합한 포자-형성 능력과 같은 특성을 갖는다.

따라서, 본 발명은 또한 스페인 생물자원센터(CECT)에서 동정된 S. 야텐시스 AGL148 균주를 스트렙토마이세스 야텐시스 CECT9421이라 지칭한다. 하기 예시에서 도시한 바와 같이, 균주 AGL148은 다음의 특성을 갖는 것을 특징으로 한다:

(i) 세균 E. 아밀로보라, P. 시링가에 병원체 변종 토마토, P. 시링가에 병원체 변종 악티니디아에, 아르보리콜라 병원체 변종 푸르니 X., 및 곰팡이 B. 시네레아, 푸사리움 옥시스포룸 및 스템필리움 베시카리움에 대한 길항 활성 (표 1);

(ii) ISP2, AIA, 베네딕트 및 SNM과 같은 다양한 배양 배지에서 시험관 내 길항 활성 (표 1).

(iii) 표본 선충 캐노랍디티스 엘레강스(Caenorhabditis elegans)에 대한 키틴분해 및 살선충 활성 (도 5, 표 4).

(iv) 항미생물성 II형 폴리케티드(act04/ACT8) 생산 유전자는 있지만 아미노글리코시드 항생제 유전자는 없다 (도 3).

(v) 균주가 증식했던 배양 배지는, 일단 무세포(증식 세포 현탁액의 상청액) 상태가 되면, 발효에 의해 균주에 의해 생성되는 활성 대사산물의 독특한 HPLC 프로파일을 갖는다. 이러한 대사산물 프로파일은 AGL225 균주의 특징으로 스트렙토마이세스의 다른 균주들과 구별된다 (도 4). 이러한 대사산물은 또한 살세균, 살곰팡이 및 살선충 활성을 갖는다.

(vi) 담배 잎에 세포를 침윤시켜 과민반응(HR 반응)을 발생시키고 또한 토마토 식물에서 방어 유전자 Harp 를 유도하여 자연 식물 방어를 유도한다 (표 3).

(vii) 배의 식물병원성 세균 E. 아밀로보라, 토마토 식물의 P. 시링가에 병원체 변종 토마토; 살구속의 X. 아르보리콜라 병원체 변종 및 푸르니에; 그리고 상추의 식물병원성 곰팡이 스클레로티니아 스클레로티움, 토마토의 F. 옥시스포룸 f. 종 라디시스 리코페르시시 및 토마토의 B. 시네레아에 의한 감염에 대해 저해능을 갖는다 (도 6).

상술한 S. 멜라노포로파시엔스 AGL225 균주에 대한 모든 양태 및 실시예는 또한 스트렙토마이세스 야텐시스 AGL148 균주에도 적용된다. 따라서, 본 발명은 또한 상기에서 정의한 바와 같은 특징을 포함하는 스트렙토마이세스 야텐시스 AGL148 세포(상기에서 설명한 바와 같이 조건이 포자 형성에 적절한 경우 포자 형태의 세포를 함유하거나 이로 구성됨), 탈수된 AGL148 세포, AGL148 세포 현탁액, 대사산물-함유 AGL148 상청액 및 AGL148 무세포 추출물을 수득하기 위한 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 방법에 의해 수득 가능한 스트렙토마이세스 야텐시스 AGL148 세포, 탈수된 AGL148 세포, AGL148 세포 현탁액, 대사산물-함유 AGL148 상청액 및 AGL148 무세포 추출물에 관한 것이다. 스트렙토마이세스 야텐시스 AGL148 세포, 탈수된 AGL148 세포, AGL148 세포 현탁액, 대사산물-함유 AGL148 상청액, AGL148 무세포 추출물 또는 이들의 혼합물을 함유하는 조성물은 또한 상기에서 정의한 바와 같은 유사 용어로 제공된다. 균주 AGL148, 이의 유도체(탈수된 세포, 세포 현탁액, 대사산물-함유 상청액 또눈 무세포 추출물), 또는 이들을 함유하는 조성물의 식물에서 특히 곰팡이, 세균 또는 선충에 의한 식물 병해충을 방제를 위한 농약으로 용도에 관한 것이다. 끝으로, 균주 AGL148, 이의 유도체(탈수된 세포, 세포 현탁액, 대사산물-함유 상청액 또는 무세포 추출물), 또는 이들을 함유하는 조성물을 식물에 투여하는 것을 포함하는 식물 병해충의 생물학적 방제를 위한 방법에 관한 것이다. 상술한 S. 멜라노스포로파시엔스 AGL225에 대한 이러한 양태 각각에 대한 특정 실시예는 또한 스트렙토마이세스 야텐시스 AGL148 균주와 관련된 양태에 적용된다. 또한, 상술한 바와 같이, 용어 "세포"는 조건이 포자 세포의 형성에 적절한 경우 이를 포함하거나 이로 구성될 수 있다.

본 발명은 또한 균주 S. 멜라노스포로파시엔스 AGL225 및 스트렙토마이세스 야텐시스 AGL148의 돌연변이에 관한 것이다. 용어 "돌연변이"는 본 발명에 따른 S. 멜라노스포로파시엔스 AGL225 및 스트렙토마이세스 야텐시스 AGL148을 출발 균주로 사용하여 수득된 균주를 지칭하고, 상술한 특성을 유지하는 것을 특징으로 한다. 균주의 "돌연변이"는 또한 발명에 따라 "변이종"으로 이해된다. 당업자는 본 발명에 따른 균주의 사용은 예를 들어 자발적 돌연변이 또는 돌연변이 유발에 의해 본 출원에서 설명하는 특성 및 해당 장점을 유지하는 돌연변이를 통상적으로 수득 가능하다는 것으로 이해할 것이다. 주어진 세균 균주의 돌연변이를 수득하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. (Sambrook, J. and Russell, DW "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Chapter 13, "Mutagenesis", Cold Spring Harbor, 3rd Ed., 2001)에서 예시들을 찾아볼 수 있다.

상세한 설명 및 청구범위 전체에 걸쳐 용어 "포함하다" 및 이의 변형은 다른 기술적 특징, 첨가제, 구성요소 또는 단계를 배제하려는 의도는 아니다. 또한, 용어 "포함하다"는 "구성하다"의 경우를 포함한다. 본 발명의 다른 목적, 장점 및 특성은 당업자에게는 상세한 설명 및 실시로부터 부분적으로 명백해질 것이다. 다음의 예시 및 도면은 실예로서 제공되는 것이며 본 발명을 제한하려는 의도는 아니다. 또한, 본 발명은 본 원에서 제시하는 특정 및 바람직한 실시예의 모든 가능한 조합을 포함한다.

도 1은 스트렙토마이세스 균주에 대한 rpoB 및 16S rRNA 유전자의 일부 서열을 사용하여 얻은 계통수를 도시한다. 균주 AGL225 및 AGL148은 덴드로그램의 상부에 S. 야텐시스/S. 멜라노스포로파시엔스로서 나타난다. 덴드로그램은 다이스 및 네이버-결합 방법(Dice and Neighbour-joining methods)을 사용하여 구성된다.
도 2는 스트렙토마이세스 분리주에 대한 RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA) 패턴으로 얻은 덴드로그램을 도시한다. 거리 행렬은 다이스 계수 및 UPGMA 그룹화(Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean(UPGMA) grouping)를 사용하여 계산되었다. LTI, d8635 및 1.80.7 프라이머로 얻은 RAPD 패턴을 사용하여 각 균주에 대한 데이터를 결합한다. 도시된 균주는 이 작업으로 수득된 25개 스트렙토마이세스의 분리주 및 기준 수집물로부터 9개 균주(S. 사라데티쿠스(S. saraceticus), S. 하이그로스코피쿠스(S. hygroscopicus), S. 그리세오비리디스(S. griseoviridis), S. 비올라센스(S. violascens), S. 립마니(S. lipmanii), S. 안티바이오티쿠스(S. antibioticus), S. 프라디아에(S. fradiae), S. 로케이(S. rochei) 및 S. 비올라세우스(S. violasceus))를 포함한다. 균주 AGL225 및 AGL148이 표시되어 있다.
도 3은 스트렙토마이세스 종 균주에서 상이한 유형의 대사산물(아미노글리코시드, 폴리케티드 및 베타-락탐)의 생합성 경로 유전자의 존재를 도시한다. 검출은 PCR 증폭에 의해 수행되었다. 원 밖의 균주는 3개의 경로 유전자에 대한 임의의 프라이머를 사용하여 증폭 산물이 발견되지 않았던 균주이다.
도 4는 C18 컬럼 키네텍스(Kinetex) 250(좌 패널) 또는 C18-XB 컬럼(우 패널)에서 스트렙토마이세스 균주의 크로마토그래피(HPLC) 프로파일을 도시한다. 좌 패널: ISP2 신선 배양 배지(A), 균주 S. 야텐시스 AGL148 추출물(B) 그리고 균주 S. 멜라노스포로파시엔스 AGL225의 추출물(C). 우 패널: ISP2 신선 배양 배지(A)에서, 균주 스트렙토마이세스 종 AGL260(D)와 비교한 균주 S. 야텐시스 AGL148 추출물(B) 및 균주 S. 멜라노스포로파시엔스 AGL225의 추출물(C). Y축은 수집된 각 분획의 흡광도(mAU = milli - 흡광도 단위)를 나타내고, X축은 방출 시간(분)을 나타낸다.
도 5는 ISP2 배지에서 스트렙토마이세스 균주 배양체로부터 얻은 상청액으로 처리한 후, 캐노랍디티스 엘레강스에 대한 살선충 활성을 도시한다. 대장균(E. coli) OP50(A), 아지드화 나트륨(sodium azide)(B, 사망률 대조군), AGL148의 상청액(C) 및 AGL225의 상청액(D)으로 구성된 M9 완충용액 대조군. 직선형 선충은 사망에 해당하고 곡선형 선충은 살아있는 개체에 해당한다.
도 6은 살구속 잡종 복숭아 ×아몬드 GF677(Xap)의 X. 아르보리콜라 병원체 변종 푸르니, 배(Ea)의 E. 아밀로보라, 토마토(Pst)의 P. 시링가에 병원체 변종 토마토, 토마토(Fox)의 F. 옥시스포룸 f. 종 라디시스 리코페르시시 및 토마토의 B. 시네레아에 의한 감염 방제에서 스트렙토마이세스 AGL225 및 AGL148의 처리 효과를 도시한다. 결과는 미처리(NTC) 대조군과 비교된다. Y축은 질병 발병도를 나타낸다. X축은 균주 코드를 나타낸다. QST713(바실러스 서브틸리스) 및 Ss31(스트렙토마이세스 사라세티쿠스) 균주가 기준 생물대조군 균주로 사용되었다. 값은 3회 반복 평균이며, 오차 막대는 평균의 95%의 신뢰 구간을 나타낸다. Nd: 결정되지 않음.

예 시

예시 1. 균주 S. 멜라노스포로파시엔스 AGL225 및 S. 야텐시스 AGL148의 분리 및 특성 규명

a) 스트렙토마이세스 균주의 분리를 위한 현장 시료 제작

2014년 7월부터 9월 동안 스트렙토마이세스 분리주을 수득하기 위한 시료채취를 수행하였다. 총 54개의 시료를 농장, 숲 지역 및 극한의 조건을 갖는 지역(해안 사구)에서 채취하였다. 균질화기를 사용하여, 인산염 완충 수용액에서 식물 또는 토양 물질의 추출에 의해 시료를 처리하였다. 수득된 현탁액을 희석하여 베네딕트 한천을 포함하는 페트리 플레이트에 플레이팅하고, 30℃에서 3일 동안 배양하였다. 스트렙토마이세스의 전형적인 형태를 갖는 콜로니(Colonies)를 추가로 순수한 배양체를 수득하는데 사용하였다. 54개의 시료로부터 추정된 스트렙토마이세스의 총 397개 분리주를 수득하였다. 분리주를 보존하기 위해, 콜로니를 흠집내고 인산염 완충용액에서 재현탁함으로써 고체 배지에서 대략 5일된 순수 배양체로부터 세포 및 포자 현탁액을 수득하였다. 이후, 동량의 현택액을 40% 글리세롤과 혼합하였다. 이 용량을 동결튜브(cryotube) 2개로 나누었고 그리고 -20℃에서 24시간 후에, 초저온 냉동고에서 -70℃로 보관하였다.

b) 스트렙토마이세스 속 수준에서 분리주 동정

분리주가 스트렙토마이세스 속에 속한다는 것을 확인하기 위해, 속 특이적 프라이머(Strep/StrepF and StrepB/StrepE)를 사용하여 PCR 기반 방법을 사용하였다(Rintala 등 2001). 100℃에서 15분 동안 온도 쇼크를 사용하여 각 현택 배양체의 DNA를 추출하였다. 프라이머 StrepB / StrepF (정방향 5'-3 'ACAAGCCCTGGAAACGGGGT; 서열번호: 1, 역방향 5'-3' ACGTGTGCAGCCCAAGACA; 서열번호: 2) 그리고 음성 증폭을 제공 균주를 사용하여 첫번째 PCR을 수행하였고, StrepB / StrepE 프라이머(정방향 5 ' -3 'ACAAGCCCTGGAAACGGGGT; 서열 번호: 1, 역방향 5'-3' CACCAGGAATTCCGATCT; 서열 번호: 3)를 사용하여 새로운 PCR 세트를 수행하였다. DNA가 프라이머 중 어느 하나로 증폭되는 경우, 분리주는 스트렙토마이세스 속에 속하는 것으로 간주되었다. 397개 분리주 중 311개는 최종적으로 스트렙토마이세스 속에 속하는 것으로 확인되었다. 동시에, 콜로니 형태 또한 스트렙토마이세스용으로 기술된 다양한 배양 배지(ISP2, YEMES 및 오트밀) 및 곰팡이에 적합한 감자한천배지(PDA)(Shirling 및 Gottlieb, 1996, Scheper 등 2010)에서 조사하였다.

c) 시험관 내 길항 및 키틴분해 활성

스트렙토마이세스에 속하는, 순수 배양체에서 수득된 분리주의 곰팡이 및 세균의 증식을 억제하는 능력을 먼저 연구하였다. ISP2 배지에서 5 내지 7일간 증식된 스트렙토마이세스 배양 디스크를 사용하여 길항작용 분석을 수행하였다. 이러한 디스크를 융합 증식에서 미리 병원체로 접종된, ISP2 한천 배지 페트리 플레이트 (또는 스트렙토마이세스 증식에 적합한 다른 증식 배지) 상에 위치시켰다. 각 식물 병원성 세균에 대한 길항 활성을 연구하였다. 병원체는 식물 병원성 세균: 에르위니아 아밀로보라 6076, 장미과에서 화상병을 일으키는 돌연변이 비병원성 균주 CFBP1430(프랑스 식물 병원성 세균 생물자원센터, 앙제, 프랑스), 토마토에서 세균점무늬병을 일으키는 슈도모나스 시링가에 병원체 변종 토마토 DC3000, 키위에서 궤양병을 일으키는 P. 시링가에 병원체 변종 악티니디아에 NCPPB3793(국립 식물 병원성 세균 생물자원센터, 영국), 핵과류 나무에서 세균점무늬병을 일으키는 잔토모나스 아르보리콜라 병원체 변종 푸르니 CFBP 5563; 및 갈색 썩음병 또는 풋마름병을 일으키는 랄스토니아 솔라나세움(Ralstonia solanaceum) CECT 125(스페인 생물자원센터, 발렌시아, 스페인) 내에서 선택되었다. 식물병원성 곰팡이로서, 선택된 지표는: 토마토에서 도관 입고병을 일으키는 F. 옥시스포룸 f.종 리코페르시시 ATCC 201829(미국 생물자원센터, 미국); 많은 식물에서 회색 썩음병을 일으키는 보트리티스 시네레아 33759B, 그리고 배와 양파에서 갈색무늬병을 일으키는 스템필리움 베시카리움 EPS 26(INTEA, 농식품 기술연구소, 헤로나) 이었다.

일단 페트리 디쉬를 30℃에서 수일 동안 배양하면, 스트렙토마이세스 균주 주변 및 표적 미생물에서의 증식 억제 영역의 직경이 결정된다. 억제 영역의 직경을 고려한 활성 지수를 사용하였다. 세균의 경우, 다음의 지수가 사용되었다: 0, 억제 없음; 1, 0cm<IZ≤1cm; 2, 1cm<IZ≤2cm; 3, 2cm<IZ≤3cm. 곰팡이의 경우, 다음 등급이 사용되었다: 0, 억제 없음; 1, 0cm<IZ≤0.6cm; 2, 0.6cm<IZ≤1.2cm; 3, 1.2cm<IZ≤2cm.

키틴 배지를 사용하여 세균 균주의 키틴분해 활성을 평가하였다. 유일한 영양분으로서 키틴이 보충된 무기염으로 구성된 최소 배양 배지를 제작하였다(Rodriguez-Kabana 등, 1983; Fr

ndberg 및 Schn

rer, 1998). 배양 배지는 1L의 증류수에 1.5 g/L의 콜로이달 키틴, 2.7g의 K₂HPO₄; 0.3g의 KH₂PO₄, 0.7g의 MgSO₄ _· 7H₂O, 0.5g의 NaCl, 0.13g의 효모 추출물 그리고 20g의 한천을 포함했다. 스트렙토마이세스 분리주를 키틴 한천 표면 상으로 3회 채취하고, 플레이트를 28℃에서 7일 동안 배양하였다. 키틴분해효소를 분비할 수 있는 콜로니는 주변에 투명한 헤일로(halo)를 나타내었다. 키틴분해효소에 대한 양성 대조군으로서, 기준 균주 슈도모나스 플루오레센스 BL915를 사용하였다. 실험한 281개 분리주 중, 다수(247)가 키틴분해효소 활성을 나타내었다. 유의미하게, S. 멜라노스포로파시엔스 AGL225 및 S. 야텐시스 AGL148는 이들 균주에 잠재적인 살선충 및 살곤충 활성을 부여하는 활성 키틴분해효소 생산자였다.

수득된 스트렙토마이세스의 311개 분리주 중, 66개는 상이한 수준의 항미생물 및 키틴분해 활성을 가지며, 항미생물 활성의 보다 상세한 연구를 위해 선택되었다. 선택된 66개 균주의 1차 스크리닝(screening)은 8가지 식물병원성 미생물에 대해 상이한 스펙트럼 및 작용 강도를 나타낸다.

배양 배지의 유형과 관련하여, 다른 배지(AIA, 베네딕트, SNM)와 비교했을 때, 곰팡이 및 세균 모두에 대해 증가된 항미생물 활성이 ISP2 배지에서 관찰되었다. 일 군에서 균주가 항세균 활성을 나타내었고 (예컨대, AGL7, AGL113, AGL15), 반면 다른 군에서는 주로 항곰팡이 활성을 나타내었다 (예컨대, AGL148, AGL164, AGL227, AGL219). 놀랍게도 균주 AGL225는 항세균 활성과 함께 강력한 항곰팡이 활성을 동시에 나타낸다. 선택된 균주의 예시는 표 1에 제공된다.

표 1은 식물병원성 세균(X. 아르보리콜라 병원체 변종 푸르니, E. 아밀로보라, P. 시링가에 병원체 변종 토마토, P. 시링가에 병원체 변종 악티니디아에, 랄스토니아 솔라나세아움); 및 식물병원성 곰팡이(S. 베시카리움, F. 옥시스포룸 및 B. 시네레아)에 대한 스트렙토마이세스 종 분리주의 항세균 및 키틴분해 활성. 제시된 결과는 증식 배지 ISP2, AIA, 베네딕트 및 SNM로 얻은 평균 할루스(halus)이다. 키틴분해 활성 또한 표시된다. 결과값은 세균 콜로니 주변의 할루스 또는 키틴 할루스의 직경을 고려한 활성 지수(각 병원체에 대해 0 내지 3)에 해당한다.

스트렙토마이세스 균주	세균					곰팡이				키틴분해효소 활성
스트렙토마이세스 균주	Xap	Ea	Pst	Psa	Rs	Sv	Fo	Bc		키틴분해효소 활성
AGL225	2	1	2	2	0	3	3	3	1
S. 프라디아에	2	1	2	2	2	2	3	3	0
S. 하이그로스코피쿠스	2	1	1	1	1	2	2	2	0
S. violaceus (S. 비올라세우스)	2	1	1	0	0	3	3	3	0
S. rochei	1	1	1	0	1	3	3	3	0
S. 멜라노스포로파시엔스	2	1	0	0	1	3	3	3	0
AGL148	2	0	0	0	0	3	3	3	2
S. 사라세티쿠스 Ss31	1	1	1	0	0	2	3	3	1
AGL368	0	0	1	1	0	1	0	0	0

Xap, 잔토모나스 아르보리콜라 병원체 변종 푸르니; Ea,에르위니아 아밀로보라; Pst, 슈도모나스 시링가에 병원체 변종 토마토; Psa, P. 시링가에 병원체 변종 악티니디아에; Rs, 랄스토니아 솔라나세아룸. Sv, 스템필리움 베시카리움; Fo, 푸사리움 옥시스포룸; Bc, 보트리티스 시네레아.

d) 종 수준에서 스트렙토마이세스 균주 동정

원래 스트렙토마이세스로 분류된 311개 분리주 중, 유의미한 항미생물 활성을 갖는 66개를 선택하였다. 분리주는 16S rDNA 및 rpoB 유전자의 부분 서열분석에 제출되었다 (Ki 등, 'Structure of a protein-DNA complex essential for DNA spores of Bacillus protection in species', 2009, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America of the United States of America of the United States of America, Vol. 105, pp. 2806-2811). 배양체의 DNA 상에서 16S rDNA의 519bp 단편을 증폭시키는 프라이머 StrepB/StrepF (Rintala 등 2001), 그리고 352bp의 앰플리콘(amplicon)을 생성하는 SRPOF1 프라이머 (5'-TCGACCACTTCGGCAACCGC-3'; 서열 번호: 4) 그리고 SRPOR1(5'-TCGATCGGGCACATGCGGCC-3'; 서열 번호: 5) (Kim 등 2001)으로 PCR을 수행했다.

2개의 유전자의 증폭을 총 용량 25ul로 수행하였으며, 1× 농도의 완충용액, 염화 마그네슘 3mM, dNTPs 200uM, 각 프라이머 0.2uM, Taq 중합효소 2U(Biootols, 스페인) 및 시료 2ul을 포함하였다. 열주기 장치(thermocycler) 프로그램은 5분 동안 95℃에서 1주기, 45초 동안 95℃, 40초 동안 60℃ 및 2분 동안 72℃에서 30 주기; 마지막으로 증폭을 위해 10분동안 72℃에서 그리고 최종적으로 4℃로 유지하는 단계로 구성되었다. 바이오메트라(Biometra)사의 프로페셔널 TRIO 열주기 장치가 사용되었다. 일단 증폭이 완료되면, 결과를 75V의 전장을 40분 동안 가하고, 20분 동안 브로민화 에티듐으로 염색한, 아가로스 겔 1%에서 관찰하였다. 영상을 바이오래드 래버래토리스(BioRad Laboratories)사의 Molecular Imager ChemiDoc XRS +로 촬영하였다.

PCR 산물을 정제하고(Qiagen Kit Quiquick purificaction PCR), DNA 농도를 50ng/microliter로 조정하고, 서열분석기 ABI PRISM^TM 310 Genetic Analyzer(PE 적용 바이오시스템, 캘리포니아, 미국)를 사용하여 5uM에서 DNA 5ul 및 프라이머 5ul를 사용하여 서열분석을 수행하였다. 서열분석은 DNA 가닥의 양방향에서 수행되었다. 편집된 서열을 Chromas 2.4 (프로그램 http://downloads.informer.com/chromas/2.4/)으로 얻었고, 프로그램 BioEdit Sequencing Editor(http://www.mbio.ncsu.edu/ BioEdit / bioedit.html)를 사용하여 분석하고 정렬하였으며, 상동성은 NCBI 데이터베이스의 BLAST 프로그램(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)에 의해 결정되었다.

BLAST 프로그램(GenBank)을 사용한 16S rDNA는 서열분석으로 종 수준에서 모든 분리주를 명확하게 구별할 수 없었다. 이러한 이유로, RNA 중합효소(rpoB)의 베타 서브유닛(Kim 등 2004)의 유전자 서열분석을 추가로 진행하였으며, 이는 스트렙토마이세스 균주에 적용이 가능하며, 또한 계통분석에 적합하다(Dahll

f 등 2000; Kim 등, 2004).

66개 균주 중, GenBank 데이터베이스와 일치하는 25개를 수득하였다. 25개의 균주 중 9개에서, 두 동정 시스템(16S rDNA and rpoB) 간의 일치가 있었다. 스트렙토마이세스에 속하는 분리주 가운데, 가장 활발한 항미생물 균주는 S. 야텐시스(AGL148, AGL164 및 AGL219) 또는 S. 멜라노스포로파시엔스(AGL171 및 AGL225)와 관련있다는 것을 확인하였다. S. 멜라노스포로파시엔스 AGL225 및 S. 야텐시스 AGL148 균주의 서열은 GenBank에 기탁되었다(균주 AGL225: 유전자16S rDNA 수탁번호 MG008625, 유전자 rpoB 수탁번호 MG007902; 균주 AGL148: 유전자 16S rDNA 수탁번호 MG008626, 유전자 rpoB 수탁번호 MG007903).

또한, 16S rDNA 및 rpoB 유전자의 서열로 계통수를 수행했다. 우선, 분석에 적합한 단편 길이를 선택하기 위하여 이들을 CLUSTALW 프로그램(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)을 사용하여 배열하였다. 덴드로그램을 MEGA6(Tamura K, 등 2013)을 사용하여 1000회 부트스트랩 반복(bootstrap replicates)과 함께 네이버-결합 방법으로 수행하였다.

계통 분석은 대부분의 균주가 덴드로그램 전체에 분포되어 있음을 나타내고 있으나, AGL219, AGL225, AGL164, AGL161 그리고 AGL148로 구성된 별개의 매우 균일하고 잘 정의된 군이 있었다 (도 1). GenBank 데이터베이스와의 상동성에 따르면, 균주 AGL148은 종 S. 야텐시스 그리고 균주 AGL225는 S. 멜라노스포로파시엔스에 해당한다.

e) 균주 수준에서 스트렙토마이세스 분리주의 분획

스트렙토마이세스 AGL225 및 AGL148 균주를 다른 스트렙토마이세스 균주로 부터 분획하기 위하여, 이들의 DNA 지문 프로파일(Fingerprinting profile) 결정을 진행하였다. 균주의 유형화를 가능하게 하는 PCR 증폭(Williams 등, 1990)에 의해 생성된 단일의 짧은 임의적 프라이머(8 내지 12개의 뉴클레오티드)와 함께 RAPD(Random Amplification of Polymorphic DNA) 기술을 사용하였다. 현장 시료로 부터 얻은 25개의 균주 및 9개의 기준 균주 세트를 사용하였으며, S. 사라세티쿠스 SS31을 포함한다. 균주를 ISP2 액체 배지에서 5일간 증식 시켰으며, 제조사의 지시에 따라 QIAamp DNA 추출 미니 키트를 사용하여 DNA를 추출하였다.

RAPD를 수행하기 위하여, 제 1 차 실험에서 균주의 DNA(25ng/μl)를 12개의 프라이머: LIT (5'-3'(TGCCGAGCTG; 서열 번호: 6, OPA9 (5'-3'GGGTAACGCC; 서열 번호: 7), OPA10 (5 GTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTT; 서열 번호: 8), OPA2 5'-3) (Kong 등, 2001)' '-3' GTGATCGCAG; 서열 번호: 9) (Gharaibeh 등, 2003), OPA B9 (5'-3'GGGCGACTAC; 서열 번호: 10) (Boroujeni 등. 2012), d8635 (5'-3'GAGCGGCCAAAGGGAGCAGAC; 서열 번호: 11) (Kutchma 등, 1998) , 유전자 1.80.5 (5'-3'ACCCCAGCCG; 서열 번호: 12), 유전자 1.80.7 (5'-3'GCACGCCGGA; 서열 번호: 13), 유전자 2.80.11 (5'-3'GCAGCAGCCG; 서열 번호: 14), 유전자 4.80.35 (5'-3'CACCTGCCGC; 서열 번호: 15), 유전자 4.80.36 (5'-3 'GGCCTCCACG; 서열 번호: 16), 유전자 4.80.37 (5'-3' CGCCAGGAGC; 서열 번호: 17) (Martin 등, 2000)로 증폭시켰다. 더 많은 수의 밴드를 허용하는 프라이머 LIT, d8635 및 1.80.7로 최상의 결과를 얻었다.

PCR 칵테일은 20μl이고, 이들 중 2μl는 균주의 DNA 였다. 완충용액의 최종 농도는 1×이고, MgCl₂ 2.5 mM, dNTPs 2 mM, 프라이머 0.4 uM 및 Taq 중합효소 1 유닛으로 조성되었다. 2개의 상이한 증폭 주기(37℃에서 5 주기 및 55℃에서 30 주기)의 서열을 갖는 프로그램을 사용하였다. 바이오메트라(Biometra)사의 프로페셔널 TRIO 열주기 장치를 사용하였다. 일단 증폭이 완료되면, 결과를 75V의 전장을 60분 동안 가하고, 20분 동안 브로민화 에티듐으로 염색한 아가로스 겔 1%에서 관찰하였다. 영상을 바이오래드 래버래토리스사의 Molecular Imager ChemiDoc XRS +로 촬영하였다. 겔의 영상을 Image Lab v.4(Bi-Rad) 프로그램으로 처리하여 단편의 크기(bp)를 산출하였다. 균주 내 특정 분자량의 단편의 유무를 결정하기 위해 3개의 프라이머의 데이터를 사용하여 이진 행렬을 구성하였다. 주사위 계수를 이용하여 유사도 산출을 수행하였고 최종적으로 프로그램 NTSYSpc v2.0과 함께 비가중산술결합법(UPGMA:unwewighted Pair Group Method With Arthmetic Mean)을 이용하여 집괴 분석(cluster analysis)으로 덴드로그램을 수행하였다.

도 2는 25개 분리주 그리고 종 S. 사라세티쿠스, S. 하이그로스코피쿠스, S. 그리세오비리디스, S. 비올라센스, S. 립마니, S. 안티바이오티쿠스, S. 프라디아에, S. 로케이 및 S. 비올라세우스의 10개 기준 균주에 대한 LIT, d8635 및 1.80.7 프라이머와 RAPD 패턴의 조합으로부터 유도된 UPGMA 방법으로 획득한 덴드로그램을 나타낸다. 이는 각각의 균주가 RAPD DNA 지문으로, 특히 균주 AGL225 및 AGL148로 구별될 수 있음을 보여준다. 따라서, 본 발명에 따른 균주는 수집물 또는 시판 제품의 분리주를 포함하는 다른 분리주와는 상이한 고유하고 독특한 RAPD 패턴을 가진다.

예시 2. 배양 배지로부터 세포 현탁액 및 추출물의 농축물을 수득하기 위한, 본 발명에 따른 균주 및 무세포 추출물의 배양체 제작

AGL225 및 AGL148 균주의 세포 또는 대사산물의 생성하기 위해, 배양체를 ISP2 플레이트에서 증식시켰다. 본 발명에 따른 스트렙토마이세스의 발효 대사산물을 함유하는 배양체의 농축된 세포 현탁액 또는 무세포 상청액을 수득하기 위하여, 균주를 액체 ISP2 배지에서 1주일 동안 배양하고 28℃에서 150rpm으로 진탕 배양하였다. 안정기에서 수득된 물질을 8000rpm에서 15분 동안 원심분리하였다. 10^*9CFU/ml의 농축된 세포 상청액을 수득하기 위하여 펠릿 함유 세포를 소량의 인삼염 완충용액에서 재현탁할 수 있다. 농축된 세포 상청액을 인위적으로 식물병원체를 감염시킨 식물에서의 질병 방제와 같은, 추가적인 분석에서 사용할 수 있다.

균주 배양에 의해 생성된 대사산물을 포함하는, 원심분리로부터의 상청액을 항미생물 활성 분석에 사용하였다. 상청액을 0.45 마이크로미터 기공 필터를 통해 여과하였고, 여과물은 추후 사용을 위해 -80℃에서 동결하였다. 이러한 여과물을 동결건조에 의해 추가로 농축하여 사용시까지 저장될 수 있는 고체 추출물을 수득했다. 이러한 경우, 고체 물질을 증류수 또는 메탄올에서 현탁하고, 또는 에틸 아세테이트 또는 헥산/클로로포름으로 상(phase) 추출함으로써 그 성분을 추출/부분 정제할 수 있다. 이러한 단편을 증발시킬 수 있으며 펠릿을 메탄올에서 재현탁한다. 이러한 물질 모두는 항미생물 또는 살선충 활성 분석, 및 활성 물질의 HPLC 크로마토그래피 분석에 사용될 수 있다.

예시 3 . 무세포 배양체 상청액의 항미생물 활성

배양체 상청액을 100 마이크로웰(microwell) 플레이를 사용하여 바이오스크린 시스템(Bioscreen system) (Labsystems)에 의해 분석하였다. 플레이트의 각 웰에는 상청액 100ul(직접 또는 원하는 대로 희석), 루리아 베르타니 배지(Luria Bertani broth)(2x) 80 그리고 X. 아르보리콜라 병원체 변종 푸르니 또는 F. 옥시포룸 포자의 상청액 20ul가 포함되었다. 억제 결과를 임의적 단위 AU ml^- ¹으로 변환하였다. AU를 병원체(D)의 증식을 억제하고 40을 곱한 최고 희석의 역수로 계산하였다(Parente 등 1995). 표 2는 6가지 최상의 균주의 결과를 나타낸다. AGL13, AGL25, 그리고 AGL31 균주의 상청액은 F. 옥시포룸에 대해 항곰팡이 활성을 갖고, 균주 AGL286은 항세균 할성을 갖는다. 다만, AGL148 및 AGL225 균주의 상청액은 항세균성 및 항곰팡성을 동시에 가지고 있었다.

표 2는. 스트렙토마이세스 균주의 배양체 상청액의 2가지 병원체에 대한 실험관 내 항미생물 활성(AU ml^-1)

스트렙토마이세스	X.아보리콜라 병원체 변종 푸르니	F. 옥시스포룸
AGL13	0	640
AGL25	0	2560
AGL31	0	1280
AGL286	1280	0
AGL148	160	2560
AGL225	160	1280

예 4. 식물 방어의 유도

a) 담배식물의 과민반응(HR)

식물에서 방어를 유도하는 능력을 입증하기 위해, 담배 식물의 잎을 침윤시키는 것으로 이루어진 기술을 사용하였다. 이 방법은 세포 또는 추출물에 대한 식물 지표에서의 과민반응을 측정한다(Freeman 및 Beattie, 2008). 39개의 선택된 스트렙토마이세스 균주의 성청액을 담배(Nicotiana tabacum) 잎의 엽육에 침윤시켰다. 침윤을 위해, 피하주사 바늘을 사용하여 잎과 반대로 구멍을 뚫었다. 4가지 상이한 식물에서 스트렙토마이세스 균주 물질로 충진된 바늘이 없는 주사기를 사용하여 침윤을 수행하였다. 식물 병원성 세균 슈도모나스 시링가에 EPS94 10⁸cfu/ml를 양성 대조군으로 사용하였고, 물을 음성 대조군으로 사용하였다. 24 내지 72시간 동안 식물의 배양한 후, 증상을 관찰하였다. HR 반응을 2개의 잎맥과 연갈색의 건조된 조직 사이로 제한된 괴사를 차단하는 것으로 구성하였다. 실험된 39개의 균주 중, 수집된 10개의 균주(AGL31, AGL214, AGL225, AGL227, AGL260, AGL272, AGL305, AGL148, AGL161, AGL164, AGL171, AGL174, AGL186), 특히 S. 야텐시스 AGL 148 및S. 멜라노스포로파시엔스 AGL 225는 양성이었다. 이 결과는 담배 잎에서의 HR 반응에 따라 식물에서 방어를 유도할 수 있는 능력을 나타낸다.

b) 식물에서 방어 또는 스트레스와 관련된 유전자의 발현 유도

AGL225 및 AGL148로 처리한 담배 식물 잎에서 관찰된 HR 반응이 식물에서 방어 반응과 관련된 유전자의 유도에 의한 것인지 확인하기 위해 전사체 연구를, 이경우, 토마토 식물에서 수행하였다. 토마토는 유전자 발현에 유용한 많은 연구가 있기 때문에 표본 식물로 사용되었다.

토마토 식물을 불활성 기질 암면(Grodan ⓒ Plug)에서 수경재배로 재배하였다. 2-3주 (2개의 떡잎 생물계절 단계) 후, 묘목을 기질 암면(Grodan ⓒ Delta)으로 종균배양 하였다. 실험을 수행하기에 앞서 이를 온실에서 대략 8주 동안 적응시켰다. 스트렙토마이세스 균주로 단일 처리를 수행하였고 식물 물질(잎) 시료를 24시간에 채취하여 mRNA 추출을 진행하였다. 식물 방어를 자극하는 벤조티아디아졸(benzothiadiazole)(Syngenta사, Bion)을 이용한 기준 처리를 양성 대조군으로 사용하였다. 실험 설계를 처리당 9개의 식물(3개의 식물 각각에 대해 3회 반복)로 구성하였다. 시료로부터 RNA를 추출하기 위해, 3개 단일 식물의 어린 잎 3장(약 30mg)을 2개의 볼(4mm 직경의 붕규산염)을 갖는 액체 질소와 혼합하여 냉동하고 -70℃에서 저장하였다. 시료를 10초 동안 30Hz의 주파수를 사용하여 티슈라이저TissueLyser II(Qiagen사)로 균질화시켰다. mRNA 추출을 트리졸(Trizol) 시약(Invetrogen사)을 사용하여 수행하였다. 수득된 RNA의 정량을 나노드롭 시스템(Nanodrop system)(NanoDrop quantitated ^ⓒ ND-1000, NanoDrop Technologies사)을 사용하여 수행하였다. 미량의 DNA를 제거하기 위해, 시료를 DNA분해효소(DNase)(Ambion® TURBO DNA-free^TM. Live Technologies사)로 처리하였다. 이어, 시료의 핵산 추출물의 역전사(mRNA를 cDNA로 전환)를 제조사의 지시에 따라 cDNA 역전사 키트(cDNA reverse transcription KITS)(Invitrogen 사)를 사용하여 수행하였다. 마지막으로, 모든 내인성 기준 유전자 액틴(F 5'-3': CACTGTATGCCAGTGGTCGT, 서열 번호 18; R 5'-3': GACGGAGAATGGCATGTGGA, 서열 번호: 19) 뿐만 아니라 감염특이적 단백질: PR1a(F 5' - 3': TCTTGTGAGGCCCAAAATTC, 서열 번호: 20; R 5'-3': ATAGTCTGGCCTCTCGGACA, 서열 번호: 21)(Aime 등 2008), 글루칸분해효소: GluA(F 5'-3': TCTTGTGAGGCCCAAAATTC, 서열 번호: 22; R 5'-3': ATAGTCTGGCCTCTCGGACA, 서열 번호: 23)(Aime 등 2008), GLUB(F 5'-3': TTGTCGCCACCAACATTCACA, 서열 번호: 24; R 5'-3': ACCATCTCGCGTGTTCCATC, 서열 번호: 25), 키틴분해효소: chia(F 5'-3': TTCGGCACTGATGGAAGTGG, 서열 번호: 26; R 5'-3': TTTTAAGCTTGCTACACGCGG, 서열 번호: 27), PERAJ(F 5'-3': AGGCCCATTTTATCCGGTGG, 서열 번호: 28; R 5'-3': GCTAAGGCCACGTCTAGCAA, 서열 번호: 29), PER1(F 5'3': TCTTAGCTGTTGCAGCTCGT, 서열 번호: 30; R 5'-3': CTAGTGTATGGCCACCGGAC, 서열 번호: 31), HARP(F 5'-3': ATTATGGCCCGTCCATTCCG, 서열 번호: 32; R 5'-3 ': ATGCAATGACTCCGAGGACG, 서열 번호: 33) 각각에 대해 qPCR를 수행하였다.

표 3은 식물에서 방어 반응과 관련된 4개 유전자에 대응하는 유전자 발현 수준(mRNA)에 대한 처리 효과를 도시한다. 양성 대조군(Syngenta사의 Bion) 및 음성 대조군(물)과 관련하여 AGL148 및 AGL225 균주의 효과를 비교하였다. 음성 대조군과 비교하였을 때, 균주 AGL148은 유전자 Per AJ, Pr 1a, Chia A 및 Harp의 발현을 유도하는 반면, 균주 AGL225는 Harp 유전자를 유도했다. Bion 양성 대조군은 PR1a, Chia 및 Harp를 유도하였다. 따라서, 두 균주 모두는 식물 방어를 유도하지만, 그 효과는 AGL225 보다 AGL148에서 더 광범위하고 강력하다는 결론을 내릴 수 있다.

표 3. 방어 반응과 관련된 Pr 1a, Chi A, Per AJ, 및 Harp 유전자의 발현 수준(mRNA)에 있어서 토마토 식물을 균주 AGL225 및 AGL148로 처리한 효과. 양성 대조군(Bion) 및 음성(물) 대조군.

처리	HR	유전자
처리	HR	PR1a	ChiA	PerAJ	Harp
NTC	-	1.05±0.14	1.17±0.29	1.48±0.50	1.52±0.61
Bion	-	> 40	8.54±4.00	0.34±0.16	13.52±2.02
AGL148	+	22.23±4.92	3.74±0.42	1.92±0.89	13.41±2.82
AGL225	+	0.39±0.20	1.05±0.42	0.19±0.072	3.01±0.59

PR1a, 감염특이적 단백질; ChiA, 키틴분해효소; Per AJ, 과산화효소; Harp, 하핀-유사 유도 단백질.

예시 5. 균주 활성에 관여하는 유전자 및 대사산물

스트렙토마이세스가 여러 미생물 생물농약의 생물학적 방제 활성과 관련되어 있기 때문에 이의 배양에 의한 발효 대사산물의 생성이 연구되었다(Montesinos 및 Bonaterra 2009). 스트렙토마이세스 속에서 아미노글리코시드 및 폴리케티드의 군으로부터 수많은 항미생물 물질의 생성이 기술되어 있다. 속 스트렙토마이세스는 식물위생 분야에서 구성원에 광범위한 적용을 제공하는 이차 대사산물의 생성에 있어서 주목할 만하다.

a) 항미생물성 대사산물의 합성에 관여하는 유전자의 특성화

균주에 의한 식물에 유익한 항미생물성 대사산물의 생성을 확인하기 위해, 특정 대사산물 프로파일의 화학적 분석에 앞서 분자적 접근을 수행하였다. 방선균(actinomycetes)에 의해 생성된 생활성 이차 대사산물 3개 군의 합성과 관련된 유전자의 검출을 진행하였다. 대사산물의 생합성을 위한 프라이머 3쌍을 아미노글리코시드(strD01f 5'-3': CTTCGCCATGTATCTCGGCGACAA, 서열 번호: 34; strD01r 5'-3': TGCCGGTGTCCTTCCAGTAG, 서열 번호: 35), II형 폴리케티드(act04f 5'- 3': GATGGTCTCCACCGGCTGC, 서열 번호: 36; act06r 5'-3': GTCTCGTGGCGGTCGTTCTGC, 서열 번호: 37) 및 beta-lactams(pcb03f 5'-3 ': CGAGTCCTGGTGCTACCTGAACC, 서열 번호: 38; pcb03r 5'-3': TCATCGACACGTCCAGGTGGTC, 서열 번호: 39)(Bervanakis, 2008)을 검출하기 위해 사용하였다. 분리주의 동정 및 예시 1의 단락 b)에서 설명한 바와 동일한 실험 계획서에 따라 배양체로부터 DNA를 추출하였다. 25ul 용량의 칵테일에서 최종 농도 1×의 완충용액, 염화마그네슘 3 mM, dNTPs 200 uM, 각각의 첫번째 0.2 uM, Taq 중합효소(Biootols, 스페인) 2U 그리고 시료 2.5 ul과 함께 증폭을 수행하였다. 열주기 장치 프로그램은 5분간 95℃에서 1주기, 45초 동안 95℃, 40초 동안 65℃ 및 1분 동안 72℃에서 30 주기; 마지막으로 증폭을 위해 10분간 72℃에서 그리고 최종적으로 4℃로 유지하는 단계로 구성되어 있다. 바이오메트라(Biometra)사의 프로페셔널 TRIO 열주기 장치를 사용하였다. 40분 동안 90V의 전장에서 1.5% 아가로스 겔에서 전기영동하여 앰플리콘을 분리하였다. 이후, 겔을 EtBr로 20분 동안 염색하였다. 결과를 바이오래드 래버래토리스사의 Molecular Imager ChemiDoc XRS +로 촬영하였다. 아미노글리코시드 생합성 유전자의 존재에 대한 양성 확인으로서 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus) DSM40236을 사용하였다; 베타-락탐의 경우 S. 카틀레야(cattleya) DMS46488 (NRRL8057)이고 폴리케티드의 경우 S. 노갈라터(nogalater) DSM40546이다.

도 3은 분석된 수집물의 59개 균주 중 14개가 아미노글리코시드 생합성 유전자, 26개 균주는 폴리케티드 합성 유전자를 나타냈고, 반면에 8개 균주는 유전자 군 모두를 보유하고 있다는 것을 나타낸다. 베타-락탐 합성을 위한 유전자를 나타내는 균주는 없었고, 17개의 균주는 어떠한 유전자도 나타내지 않았다. 균주 AGL225 및 AGL148은 II형 폴리케티드 유전자에 대해서만 양성이었다.

b) 발효 대사산물 프로파일

3가지 유형의 항미생물 대사산물 관련 유전자의 분석 후, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의해 균주에 의해 생성된 대사산물의 프로파일을 결정하였다. 액체 배지에서 생성된 대사산물을 각 균주에 대해 특징적인 프로파일로 결정하였다. 이는 특히 AGL225 및 AGL148에 대해 이루어졌다. ISP2 배양 배지를 균주로 접종하고, 150 rpm 교반하에 28℃에서 일주일 동안 배양하였다. 배양체를 여과하여 상척액을 -80℃로 냉동하였다. 대조군으로 사용되는 ISP2 미접종 배지에 대해서 동일한 공정을 수행하였다.

배양체 상청액에서 대사산물의 추출을 수행하였다. 추출 공정은 헥산(1:1) 및 에틸 아세트산(1:1)으로 구성되었으며, 증발 및 아세토니트릴 재현탁이 이어진다. 각 추출물 50 ul를 다음의 조건 하에서 분석하였다: 유속: 1.25 ml/min; 용매: A: 물 + 0.1% TFA B: 아세토니트릴 + 0.1% TFA. 220 nm(펩티드 화합물), 254 nm(방향족 화합물), 280 nm(페놀성 화합물)에서 크로마토그램을 실시하였다. C18-XF 및PFP 칼럼을 사용하여 다양한 파장(220, 245 및 280 nm)의 크로마토그램에서 균주 AGL148과 AGL225 사이의 차별화되고 식별 가능한 피크를 검출할 수 있고, 이는 생성된 개개의 대사산물과 일치한다.

도 4에서 개개의 프로파일은 S. 멜라노스포로파시엔스 AGL225 및 S. 야텐시스 AGL148에 의해 생성되는 배지 성분에 대하여 차별화된 피크를 나타낸다는 것을 알 수 있다. 이러한 프로파일은 그러한 균주의 특징이며 다른 스트렙토마이세스 균주와는 상이한, 독특한 분자 지문이다. 화합물의 성질은 알려져 있지 않지만, 아마도 PCR에 의해 검출된 이러한 경로의 유전자와 일치하는 폴리케티드 유전자 생성물이었을 것이다.

예시 6. 살선충 활성

균주의 살선충 활성을 결정하기 위하여, 캐노랍디티스 유전 센터(CGC)의 야생 균주, 선충 캐노랍디티스 엘레강스 WT 브리스톨(Bristol) N2를 표본 선충으로 사용하였다. 선충을 증식시켜 주기적으로 대장균 OP50에 공급하였다. 생성된 선충이형 집단을 염소산 나트륨(1.5%)로 처리하여 충란만 보존하고 개체는 제거하였다. M9 완충용액으로 수차례 세척한 후, 충란의 부화를 진행하였고, 이를 양분으로서 대장균 OP50을 통해 배지 NMG로 옮겨 L2 단계까지 배양하였다. 이 단계에서, 고체 및 액체 배지 상의 생존 분석이 이루어졌다. 고체 배지 상의 실험에서 대장균 OP50 대신에 대응하는 스트렙토마이세스 균주를 NMG에 접종하였다. 12일의 증식 후, L2 단계의 선충을 침착시켰다. 양성 대조군으로(병원체 대조군) S. 엔티레카 아종 엔테리카(S. enterica subsp. enterica) 균주 ATCC14028(CECT4594) 및 LT2(CECT4085)를 사용하였다. 액체 배지에서, 상술한 바와 같이 원심분리에 의해 수득된, 스트렙토마이세스 균주의 배양체 상청액을 마이크로플레이트(microplate)에서 실험하였다. 각 마이크로플레이트 웰에 배양체 상청액 1ml 그리고 NMG 30마이크로리터를 선충 현탁액(75-100 개체)과 함께 침착시키는 것으로 실험을 구성하였다. 신선한 NMG, ISP2 배지 그리고 M9 완충용액을 음성 대조군으로 사용하였고, 농약 아지드화 나트륨을 살선충 대조군으로 사용하였다. 플레이트를 23℃에서 배양하고 24시간 및 48시간 생존하는 개체를 결정하였다. 입체현미경(SMZ NIKON 1000)을 사용하여 선충을 관찰하였다. 선충의 길이와 모양을 측정하였고, 사망한 선충은 직선 형태로 나타났으며, 반면에 굴모양 및 이동성 개체는 살아있는 것으로 간주되었다. 스트렙토마이세스 균주의 세포 단독으로는 고체 배지에서 이루어진 실험에서 선충의 생존에 유의미하게 영향을 미치지 못했으며, 반면에 병원체 살모넬라의 두 균주의 사망을 유도하였다. 다만, S. 멜라노스포로파시엔스 AGL225 및 S. 야텐시스 AGL148의 무세포 배양물로부터의 상청액은 강한 살선충 효과를 가졌다(도 5, 표 4). 또한 고용량에서, 선충 개체의 일부가 용해되고 실질적으로 인식될 수 없었다는 점에 주목하였다. 이러한 효과는 키틴분해효소의 잠재적 작용과 스트렙토마이세스 균주에 의해 생성된 다량의 대사산물의 결과로 보였다. 그러한 특성은 식물보호에 적용되는, 생물학적 살선충제로서 균주의 사용에 중요한 것으로 간주될 수 있다.

표 4. S. 멜라노스포로파시엔스 AGL225 및 S. 야텐시스 AGL148의 살선충 활성.

처리	희석	초기	사망	생존	용해
상청액 AGL148	1/2	58	11	0	47
상청액 AGL148	1/10	55	21	0	34
상청액 AGL225	1/2	62	36	0	26
상청액 AGL225	1/10	65	45	0	20
아지드화 나트륨 (사망 대조군)	1	70	68	0	2
대조군 배지ISP2	1	60	0	57	3
대조군 용충용액 M9	1	61	0	60	1

예시 7. 식물에서 세균 및 곰팡이 감염의 방제에 있어서 본 발명에 따른 균주의 효과

발명에 따른 균주의 효과를 결정하기 위하여, 식물 병원성 세균 및 식물병원성 곰팡이를 포함하는, 개개의 대표적인 병태계(작물 식물 및 병원체)에 대한 실험을 제어된 환경 조건(온실)에서 수행하였다. 세균 병태계는 GF677 아몬드 × 복숭아 잡종 근경의 X. 아르보리콜라 병원체 변종 푸르니(Xap), 토마토의 P. 시링가에 병원체 변종 토마토(Pto), 그리고 배의 E. 아밀로보라이었다. 곰팡이 병태계의 경우, 상추의 S. 스클레오티오룸(S. sclerotiorum), 토마토의 B. 시네레아, 그리고 F. 옥시스포룸 f. 종 라디시스 리코페르시시(Forl)를 사용하였다. 결과는 도 6에 도시된다.

처리군 제작을 위해, 스트렙토마이세스 균주를 ISP2에 접종하고 28℃에서 5일간 배양하여, 식물 세포, 포자 및 발효 대사산물을 수득하였다. 예시 2에서 상술한 바와 같이 멸균 증류수에서 균주의 상청액을 제작하였다. 생존 총수는 분석에 따라 3-4×10*⁸cfu/ml 이었다.

a) 살구속의 잔토모나스아르보리콜라 병원체 변종 푸르니의 방제

GF667 살구속 근경 식물, 아몬드 및 복숭아 잡종(Prunus amygdalus × Prunus persica)을 사용하였고, 이때 6 내지 7개 사이의 잎이 제공되었다. 실험설계를 각각의 처리마다 1회 반복 당 3개의 식물을 3회 반복하는 것으로 구성하였다. 스트렙토마이세스 균주를 병원체 접종 7일 그리고 1일 전에, 에어브러쉬를 사용하여 낙하점(drop point)까지 처리하였다. S. 사라세티쿠스 SS31을 기준 대조군으로 사용하였다. 병원체로, X. 아르보리콜라 병원체 변종 푸르니 CFBP 5563 균주를 LB 한천 플레이트 상에 접종하여 28℃에서 배양하였고, 그리고 24시간 동안 배양된 플레이트로부터 접종원을 제작하였다. 병원체의 상청액을 대략 6.8×10*⁷cfu/ml의 농도로 조정하였다. 에어브러쉬를 사용하여 유출점(run-off point)까지 분무하여 식물 내 모든 잎에 접종하였다. 일단 접종이 되면, 식물을 48시간 동안 비닐봉지에 넣어 두어 감염 과정을 가속화시키고, 이후 낮에는 26 ± 2℃에서 상대습도 60%로 밝게 16시간 배양하였고, 밤에는 15 ± 2℃에서 80% RH로 어둡게 8시간 배양하였다. 평가는 발병된 잎 면적을 기준으로 질병 지수를 부여하는 병원체(dpi)의 후-접종 15일째에 이루어졌다. 0: 무증상; 1, 잎 면적의 0 내지 25%; 2, 잎 면적의 25 내지 50%, 3, 잎 면적의 50 내지 75%; 그리고 4, 75% 초과.

도 6(Xap)은 대조군으로서 S. 사라세티쿠스 SS31, 뿐만 아니라 본 발명의 스트렙토마이세스 균주의 처리 효과를 나타낸다. AGL148 및 AGL225 균주는 효과적이며 유의미하게 비처리 대조군에 비해 감염의 중증도를 감소시켰다.

b) 배의 에르위니아 아밀로보라 방제

뿌리가 발생되어 화분에서 재배된 서양배 품종(CAV 클론)의 2년된 배 식물을 이용하여 이 실험을 실시하였다. 각각의 처리마다 1회 반복 당 3개의 식물을 3회 반복하는 것으로 실험 설계를 구성하였다. 이 실험에서, 병원체 접종 7일 그리고 1일 전에 처리를 적용하였다. 균주의 처리를 상부 어린 잎(3 내지 4개의 잎/식물)에서 에어브러쉬를 사용하여 낙하점까지 수행하였다. 처리 하루 전에 잎의 주요 신경에 절개로 식물에 상처를 입혔다. 처리는 스트렙토마이세스 균주로 이루어졌다. 해동되어 28℃에서 배양된 신선한 LB 한천 플레이트에서 계대배양하여 유지된 E. 아밀로보라 EPS101을 병원체 균주로 사용하였다. 감염을 위해 3.5×10⁷cfu/ml 용량의 신선한 접종원을 제조하였다. 10 ul의 방울을 각 상처에 가함으로써 E. 아밀로보라의 접종을 수행하였다. 일단 접종이 되면, 식물을 비닐봉지에 넣어 두어 감염과정을 가속화시키고 병원체를 격리하였다. 식물에서 괴사 발병에 따른 0에서 4의 지수를 사용하여 5, 7 및 12dpi에서 질병 평가를 수행하였다: 0: 감염 없음 1: 상처에 괴사 별병; 2: 잎 신경에 의한 괴사 발병; 3: 잎자루에 괴사 도달; 그리고 4: 잎으로부터 싹까지 괴사 도달. 도 6(Ea)은 균주 AGL225가 미처리 대조군과 비교하여 유의미하게 감염 수준을 감소시켰다는 것을 나타낸다.

c) 토마토의 슈도모나스 시링가에 병원체 변종 토마토 방제

토마토 식물을 얻기 위해, 품종 리오 그랑데(Rio Grande)를 폐포에 파종하고 15 내지 21일 후에 화분에 이식하였다. 온실의 조건은 25 ± 2℃에서 밝게 16시간 그리고 15 ± 2℃에서 어둡게 8시간이었다. 각각의 처리마다 1회 반복 당 3개의 식물을 3회 반복하는 것으로 실험 설계를 구성하였다. P. 시링가에 병원체 변종 토마토(Pst) DC3000 균주를 병원체로 사용하였다. 접종원 제작을 위해, 해동하여 28℃에서 24시간 동안 배양된 신선한 LB한천 플레이트에서 콜로니를 유지하였다. 물 현탁액을 제조하여 대략 10^* ⁸cfu/ml로 조절하였다. 접종원을 규조토(1 g/L)로 보완하여 잎에서 미세한 상처 및 그로 인한 감염을 촉진시켰다. 각 식물을 에어브러쉬를 사용하여 낙하점까지 접종시켜, 낮에는 25 ± 2℃에서 상대습도 60%로 밝게 16시간 배양하고, 밤에는 25 ± 2℃에서, 80% RH로 어둡게 8시간 배양하였다.

제 3 및 제 4 진엽이 나타났을 때 처리를 시작하고 병원체 접종 7일 그리고 1일 전에 마쳤다. 바실러스 서브틸리스 QST713을 대조군으로 사용하였다. 7 dpi에서 평가를 하였고 증상이 검출되지 않은 경우의 지수 0에 따라서, 발병된 잎 면적에 의해 등급을 정하였다; 1, 발병된 면적의 25% 미만, 2 발병된 잎 면적 25 내지 50%; 3, 발병된 잎 면적역의 50 내지 75% 그리고 4, 발병된 면적의 75% 초과. 세레나데(Serenade)를 제외한 모든 처리는 Pst (도 6 Pst)에 의한 감염의 중증도에 있어서 감소를 나타냈다. AGL225 및 AGL148 균주는 비처리 대조군과 비교할 때, 질병의 중증도 감소에 효과적이었다.

d) 토마토의 푸사리움 옥시스포룸 f. 종 라디시스 리코페르시시 방제

토마토 식물을 예시 7의 단락 b에서와 같이 제작하였다. 병원체 접종원 제작을 위해, F. 옥시스포룸 f. 종 라디시스 리코페르시시, FORL 균주를 사용하였다. 병원체의 접종 10일 전에 PDF 한천 플레이트를 종균배양하고, 밝게 16시간 그리고 어둡게 8시간으로 하는 광주기에 따라 23 ~ 25 ℃에서 배양하였다. 병원체 현탁액을 제조하여 2.9×10^* ⁶conidia/mL로 조정하였다. 곰팡이의 접종 전에, 수술용 메스를 사용하여 식물 뿌리에 4가지 병변을 만들었다. 각 식물을 관류에 의해 FORL 현택액 10 ml로 접종하였다. 제 1 처리의 수행을 식물에서 제 3 및 제 4 진엽이 나타날 때 시작하였다. 병원체 접종 7일 그리고 1일 전에 처리를 수행하였으며 그리고 20 ml의 각 균주 제작에는 급수가 적용되었다. 바실러스 서브틸리스 QST713을 대조군으로 사용하였다. 질병에 걸린 식물의 평가는 21 dpi에서 이루어졌다. 줄기에서 괴사의 진화에 따른 지수를 사용하였다: 0: 감염 없음; 1 병변 표면이 줄기에 이르지 못함; 2: 식물의 줄기를 통해 감염 발생, 그리고 3: 식물 고사. 도 6(Fox)에서 도시하는 바와 같이, AGL148 및 AGL225 균주는 감염 방제에 효과적이었다.

e) 토마토의 보트리티스 시네레아 방제

토마토 식물을 예시 7의 단락 b에서와 같이 제작하였다. 병원체 접종원 제작을 위해 B. 시네레아 균주를 사용하였다. 병원체의 접종 10일 전에 PDF 한천 플레이트를 종균배양하고, 밝게 16시간 그리고 어둡게 8시간으로 하는 광주기에 따라 23 ~ 25 ℃에서 배양 하였다. 병원체 현탁액을 제조하여 2.9×10⁶ conidia/mL로 조정하였다. 기준 처리로서, 세레나데 MAX (바실러스 서브틸리스 QST713), 상업용 제품을 대조군으로 사용하였다. 식물에 곰팡이 현탁액을 유출점까지 분무하였다. 병원체 접종(dpi) 7일 후에 평가를 수행하였다. 잎에서의 중증도 지수를 0, 비감염; 1, 표면 25% 미만; 2, 25 에서 50% 미만; 3, 50 에서 75% 미만; 4, 75%초과로 설정하였다. 도 6(Bc)는 균주 AGL148 및 AGL225 뿐만 아니라 B. 서브틸리스 QST713도 매우 효과적이었다는 것을 나타낸다.

f) 상추의 스클레로티니아 스클레로티오룸 ( Sclerotinia sclerotiorum ) 방제

상추 종자를 폐포에 파종하고 15 ~ 21일 후 화분으로 이식하였다. 병원체 접종 7일 그리고 1일 전에 처리를 수행하였다. 기준 처리로서, 세레나데 MAX(바실러스 서브틸리스 QST713) 그리고 S. 사라세티쿠스 SS31을 대조군으로 사용하였다. 식물 병원성 곰팡이 S. 스클레로티오룸을 250 ml 삼각 플라스크에서 가압증기멸균된 호밀 종자 25g 및 증류수 25 ml와 함께 배양하였다. 파종 21일 후에 식물에 병원균을 접종하였고 각 식물은 감염된 종자 호밀로 감염되었다. 병원체 접종(dpi) 3일 및 7일 후에 평가를 수행하였다. 중증도 지수를 0, 건강한 식물; 1, 나무갓수관까지 뿌리 썩음병; 2, 나무갓수관에 썩음병 발병; 3, 썩음병이 나무갓수관을 초과; 및 4, 상추 고사로 설정하였다. 도6 (Ss)는 비처리 대조군에서 질병 중증도가 매우 높다는 것을 나타낸다. 균주 AGL148 및 AGL225 억제효과를 가지고 있었다.

인용문헌 목록

Aim

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Claims

스페인 생물자원센터(CECT)에서 스트렙토마이세스 멜라노스포로파시엔스(Streptomyces melanosporofaciens) CECT9420으로 동정된 스트렙토마이세스 멜라노스포로파시엔스 AGL225(Streptomyces melanosporofaciens AGL225) 균주.
제 1 항에서 정의하는 S. 멜라노스포로파시엔스 AGL225 균주의 생존 가능한 세포를 수득하는 방법에 있어서,
(i) 상기 AGL225 균주를 적합한 배양 배지에 접종하는 단계;
(ii) 세포 현탁액을 수득하기 위해 단계 (i)의 접종된 상기 배양 배지를 상기 균주의 증식에 적합한 조건으로 처리하는 단계, 이때 상기 조건은 25 내지 30℃의 온도, 6 내지 8의 pH 및 10 내지 50％의 산소 농도를 포함하고;
(iii) S. 멜라노스포로파시엔스 AGL225의 생존 가능한 세포 및 대사산물-함유 상청액을 수득하기 위해 단계 (ii)의 상기 세포 현탁액을 분리하는 단계;
(iv) S. 멜라노스포로파시엔스 AGL225의 상기 세포를 수집하는 단계; 및
(v) 선택적으로 상기 수득된 세포를 탈수하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
S. 멜라노스포로파시엔스 AGL225 대사산물-함유 현탁액에 있어서,
제 2 항에서 정의하는 단계 (i) 내지 (iii) 그리고 상기 현탁액을 수집하는 단계를 더 포함하는 방법에 의해 수득 가능한 것을 특징으로 하는 현탁액.
S. 멜라노스포로파시엔스 AGL225 세포 현택액에 있어서,
제 2 항에서 정의하는 방법에 의해 S. 멜라노스포로파시엔스 AGL225의 생존 가능한 세포를 수득하고 그리고 완충 용액 및 제 3 항에서 정의하는 대사산물-함유 상청액으로부터 선택되는 적합한 용액에서 상기 수득된 세포를 원하는 밀도로 재현탁하는 단계를 포함하는 방법에 의해 수득 가능한 것을 특징으로 하는 세포 현탁액.
S. 멜라노스포로파시엔스 AGL225의 무세포 추출물에 있어서,
제 2 항에서 정의하는 방법에 의해 S. 멜라노스포로파시엔스 AGL225의 생존 가능한 세포를 수득하고:
(i) S. 멜라노스포로파시엔스 AGL225의 상기 세포를 파괴하는 단계;
(ii) 상기 세포 파편으로부터 상기 무세포 추출물을 분리하는 단계;
(iii) 상기 무세포 추출물을 수집하는 단계; 및
(iv) 선택적으로 상기 무세포 추출물을 농축하는 단계로 처리하는 것을 포함하는 방법에 의해 수득 가능한 것을 특징으로 하는 무세포 추출물:
제 1 항에서 정의하는 균주 S. 멜라노스포로파시엔스 AGL225 및 하나 이상의 농업학적으로 허용가능한 화합물을 함유하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 6 항에 있어서,
상기 하나 이상의 농업학적으로 허용가능한 화합물은 식물 강화제, 영양분, 습윤제, 부착성을 향상시키는 화합물, 완충 화합물, 안정화제, 항산화제, 삼투압 보호제 및 자외선 차단제로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 6 항에 있어서,
적어도 하나의 삼투압 보호제를 함유하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 6 항에 있어서,
추가적인 살해충제를 더 함유하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 9 항에 있어서,
상기 추가적인 살해충제는 살곰팡이, 살세균 및/또는 살선충 활성을 갖는 또 다른 세균 균주인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 10 항에 있어서,
상기 다른 세균 균주는 스페인 생물자원센터(CECT)에서 S. 야텐시스(S. yatensis) CECT9421로 동정된 S. 야텐시스 AGL148 균주인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에서 정의하는 균주 S. 멜라노스포로파시엔스 AGL225 또는 제 6 항 내지 11 항 중 어느 한 항에서 정의하는 조성물의 용도에 있어서,
식물에서 살해충제로 사용되는 것을 특징으로 하는 용도.
제 12 항에 있어서,
곰팡이, 세균 또는 선충에 의한 식물 병해충을 방제하기 위해 사용되는 것을 특징으로 하는 용도.
식물 병해충의 생물학적 방제를 위한 방법에 있어서,
제 1 항에서 정의하는 균주 S. 멜라노스포로파시엔스 AGL225 또는 제 6 항 내지 11 항 중 어느 한 항에서 정의하는 조성물을 상기 식물에 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.