BR112020006366A2 - uso de composições contendo streptomyces melanosporofaciens agl225 no controle de doenças vegetais - Google Patents

Abstract

A presente invenção se refere à cepa Streptomyces melanosporofaciens AGL225 identificada na Coleção Espanhola de Culturas Tipo (CECT) como Streptomyces melanosporofaciens CECT9420, e o uso da referida cepa como pesticida em plantas. Aspectos adicionais da invenção se referem a suspensões e extratos da cepa S. melanosporofaciens AGL225 e métodos para o preparo das mesmas. Aspectos adicionais se referem a composições de pesticida compreendendo S. melanosporofaciens AGL225. Por fim, a invenção se refere a um método para o controle biológico de pragas vegetais compreendendo a administração à planta da cepa S. melanosporofaciens AGL225, uma composição incluindo a referida cepa ou um extrato livre de células derivado de S. melanosporofaciens AGL225.

Description

USO DE COMPOSIÇÕES CONTENDO STREPTOMYCES MELANOSPOROFACIENS AGL225 NO CONTROLE DE DOENÇAS VEGETAIS

[001] Este pedido reivindica o benefício do pedido de patente europeu EP17382669.4 depositado em 06 de outubro de 2017.

Campo tecnológico

[002] A presente invenção se refere ao campo de biopesticidas, mais particularmente a cepas de Streptomyces melanosporafaciens e seu uso no controle biológico de doenças vegetais causas por bactérias, fungos e nematódeos, especialmente em culturas hortícolas e árvores frutíferas.

Antecedentes da técnica

[003] Os efeitos adversos do uso massivo de pesticidas sintéticos no meio ambiente e na saúde dos consumidores são bem conhecidos. Devido a estes problemas, o controle de doenças vegetais tende para o uso racional de fungicidas e bactericidas e para a aplicação de produtos menos tóxicos. Em adição, a proteção vegetal está orientada para o manejo integrado de pragas (TPM), combinando diferentes métodos (físicos, mecânicos, químicos, biológicos, genéticos, legais e culturais). Esta reorientação no controle de pragas e doenças levou a um novo quadro legislativo para a comercialização e uso de produtos de proteção vegetal em ambos os estados membros da União Europeia e em outros países. A regulação objetiva reduzir o uso de produtos convencionais de proteção vegetal e implementar sua sustentabilidade através do manejo integrado de pragas e doenças, declarando que os meios de controle fitossanitário devem ser preferencialmente biológicos e físicos.

[004] Neste contexto, os biopesticidas a base de cepas de micro-organismos benéficos para as plantas, principalmente bactérias e fungos associados aos mesmos, oferecem uma alternativa ou complemento aos pesticidas sintéticos convencionais. Uma das principais vantagens dos pesticidas microbianos é que seu uso permite uma produção de cultura livre de resíduos, o que é uma vantagem especialmente para a sua autorização na produção agrícola orgânica. No entanto, em comparação aos pesticidas químicos, um pequeno número de pesticidas microbianos está agora disponíveis, a maioria dos quais é eficaz contra doenças causadas por fungos, porém não contra doenças bacterianas. Apesar da intensa pesquisa neste campo, a maioria das cepas microbianas que são ingredientes ativos de produtos biológicos comerciais, produzem metabólitos secundários tóxicos, carecem de adequação ecológica adequada para a colonização vegetal, apresentam menor eficácia do que os produtos sintéticos, bem como alguma instabilidade ao longo do tempo, o que dificulta a sua formulação em composições de longa duração. Em adição, como os pesticidas microbianos são organismos vivos, as condições ambientais (temperatura, umidade relativa, chuva, etc.) e as condições do hospedeiro (espécies vegetais, cultivares, fase fenológica, etc.) apresentam uma forte influência na sua atividade biológica, resultando em uma eficiência decrescente ou variável no controle de doenças, inferior à dos pesticidas químicos convencionais.

[005] Um problema com muitos biopesticidas microbianos é que eles são incompatíveis com os pesticidas sintéticos convencionais, o que limita o seu uso no manejo integrado de pragas e doenças na agricultura. Por exemplo, a maioria dos ingredientes ativos à base de cepas de fungos tais como as cepas antagonistas Trichoderma ou Gliocladium, é sensível aos fungicidas. Neste sentido, as bactérias apresentam a vantagem de serem insensíveis aos fungicidas e, portanto, compatíveis com o seu uso simultâneo.

[006] Em adição, um dos principais requisitos para a aprovação de micro-organismos como biopesticidas pelas autoridades competentes é a sua biossegurança, a qual é avaliada por agências tais como a Agência de Proteção Ambiental (EPA) ou a Autoridade Europeia para a Segurança Alimentar (EFSA, Europa). Assim, determinados micro- organismos que demonstraram eficácia no controle das pragas e doenças foram descartados como seguros devido a uma possível patogenicidade oportunista para os seres humanos ou animais, como no caso de determinadas espécies de Pseudomonas e Pantoea, as quais foram referidas em casos clínicos, o que constitui um obstáculo à sua utilização como agentes biopesticidas.

[007] No desenvolvimento de um biopesticida microbiano também deve ser considerada a capacidade de industrializar a produção da cepa microbiana, bem como a sua formulação para obter produtos com uma longa vida útil. Isto é alcançado principalmente por formulações em pó obtidas por desidratação, porém os processos de secagem afetam drasticamente a viabilidade dos micro-organismos, especialmente das bactérias Gram negativas (por exemplo, Pseudomonas), as quais são mais sensíveis do que as Gram positivas. No caso do gênero Streptomyces e Bacillus que produzem esporos, as formulações adequadas em três componentes (células vegetativas, esporos e metabólitos da fermentação) podem ser preparadas com um alto desempenho e aptidão no ambiente de cultura de campo.

[008] Em um esforço para coletar todas as vantagens descritas acima, diversas cepas de Streptomyces ou espécies relacionadas foram comercialmente desenvolvidas como agentes de controle biológico, tais como Streptomyces lydicus WYEC 108 e Streptomyces K61 (Montesinos and Bonaterra, 2009). No entanto, estas cepas mostram um perfil de atividade focado principalmente no controle de patógenos fúngicos. Algumas cepas de Streptomyces foram descritas, como S. melanosporofaciens EF-76 (WO 2010115802) ativa contra doenças do tubérculo da batata e diversos patógenos vegetais do solo, S. yatensis CJS-24 (KR 100869668) contra diversas doenças fúngicas e Streptomyces saracetius SS31l (US 20140057336) com atividade antifúngica e nematicida.

[009] Consequentemente, ainda existe uma necessidade de cepas bacterianas melhoradas para serem usadas no controle biológico de pragas, com um ampla faixa de atividade contra fungos, bactérias e nematódeos patogênicos vegetais.

Sumário da invenção

[010] Os inventores isolaram uma nova cepa de Streptomyces a partir de uma amostra natural da rizosfera de uma planta, a qual possui características que a tornam altamente adequada para uso no controle biológico de pragas. A cepa é caracterizada por um espectro surpreendentemente amplo de pesticidas, sendo —“muito eficiente no controle de diversos fungos e bactérias fitopatogênicos, bem como nematódeos. Esta cepa também induz as defesas vegetais, Oo que aumenta ainda mais o seu interesse para o uso como biopesticida. A cepa também é convenientemente resistente ao processamento industrial, apresenta longa vida útil e é resistente ao estresse ambiental. No conjunto, esta cepa supera diversas limitações mostradas por outras cepas descritas no estado da técnica, tal como mostrado abaixo.

[011] Um primeiro aspecto da invenção, então, se refere a uma cepa Streptomyces melanosporofaciens AGL225 identificada na Coleção Espanhola de Culturas Tipo como Streptomyces melanosporofaciens CECT9420.

[012] A cepa S. melanosporofaciens AGL225 da invenção foi isolada a partir das sementes de choupo (Populus nigra) em Girona e foi depositada pelo requerente, de acordo com o Tratado de Budapeste, em 18 de julho de 2017, na Coleção Espanhola de Culturas Tipo (CECT) localizada na Universidade de Valência, Parque Científico da Universidade de Valência, Catedrático Agustín Escardino, 9, 46980 Paterna (Valência). A cepa de Ss. melanosporofaciens foi depositada com a referência de identificação AGL225 e recebeu o número de acesso CECT9420. Em particular, esta cepa é caracterizada por mostrar: (1) Atividade antagonista in vitro contra fungos e bactérias fitopatogênicos em uma variedade de meios de cultura como ISP2 (ágar do Projeto Internacional de Streptomyces), AIA (ágar de isolamento de actinomicetos) Benedict e SNM (ágar de nitrato e amido) (TABELA 1).

(ii) Atividade antagonista contra as bactérias Erwinia amylovora, Pseudomonas syringae pv. tomato, P. syringae pv. actinidiae, Xanthomonas arboricola pv. pruni, e os fungos

Botrytis cinerea, Fusarium OXysporum e Stemphylium vesicarium (TABELAS 1 e 2); (iii) Atividades quitinolíticas e nematicidas contra o nematódeo modelo Caenorhabditis elegans (TABELA 1, TABELA 4, FIGURA 5).

(iv) Apresenta genes para a produção de policetídeos antimicrobianos tipo II (act04), porém não apresenta genes para antibióticos aminoglicosídeos (FIGURA 3).

(v) O meio de cultura no qual a cepa foi cultivada, uma vez livre de células (sobrenadante da suspensão celular cultivada), apresenta um perfil de HPLC distinto de metabólitos ativos os quais são produzidos pela cepa por fermentação. Este perfil metabólico é característico da cepa AGL225 e a distingue de outras cepas de Streptomyces (FIGURA 4). Estes metabólitos também apresentam atividade bactericida, fungicida e nematicida.

(vi) Induz as defesas naturais das plantas, exercendo uma reação de hipersensibilidade e também induzindo os genes de defesa na planta (TABELA 3).

(vii) Apresenta a capacidade de inibir infecções causadas por bactérias fitopatogênicas E. amylovora em pêras, P. syringae pv. tomato em plantas de tomate; X. arboricola pv pruni em Prunus; e os fungos fitopatogênicos Sclerotinia sclerotiorum em alface, F. oxysporum f. sp. radicis lycopersici em tomates e B. cinerea em tomates (FIGURA 6).

[013] A cepa AGL225 apresenta a grande vantagem de exercer simultaneamente atividade antifúngica, antibacteriana e nematicida. Além disso, esta cepa induz mecanismos naturais de defesa em plantas. A existência destes quatro mecanismos simultaneamente em uma cepa Streptomyces apresenta a vantagem de reunir uma ampla faixa de mecanismos de controle de doenças para um único ingrediente ativo em um produto de proteção vegetal.

[014] A alta atividade antagonista da cepa da invenção contra agentes fitopatogênicos é, em parte, consequência da produção de compostos antimicrobianos os quais inibem o crescimento de bactérias e fungos fitopatogênicos, e também de nematódeos. Estes compostos incluem policetídeos, quitinases e presumivelmente outros compostos com atividade antimicrobiana ainda não conhecidos.

[015] Muitas cepas de Streptomyces (apesar de possuírem genes de biossíntese antimicrobiana tais como aminoglicosídeos ou policetídeos), não apresentam atividade antagonista significativa contra fungos e bactérias fitopatogênicas. Por outro lado, na TABELA 1 pode ser observado que a cepa S. melanosporofaciens AGL225 da invenção exibe um amplo espectro de antagonismo proeminente contra diferentes bactérias fitopatogênicas e contra diferentes fungos fitopatogênicos, e isto é mantido de forma surpreendente em quatro tipos de meios de cultura. Isto mostra a eficácia da cepa da invenção na inibição de infecções causadas por bactérias, tais como E. amylovora em plantas de pêra, P. syringae pv. tomato em plantas de tomate e X. arboricola pv. pruni em Prunus (GF677), e de outros patógenos vegetais (FIGURA 6). Em adição, de forma surpreendente, a cepa AGL225, além de apresentar genes de biossíntese de policetídeos (FIGURA 3), produz quitinases, as quais são ativas contra ambos os fungos e nematódeos. A atividade nematicida é demonstrada em um ensaio de mortalidade do nematódeo C. elegans com sobrenadantes livres de células de culturas tais como descritas no Exemplo 6 (FIGURA 5, TABELA 4).

[016] Este perfil antimicrobiano (simultaneamente antibacteriano e antifúngico) é surpreendente quando comparado com outras cepas de Streptomyces (vide TABELA 1 na qual estão listadas Outras cepas de Streptomyces isoladas). Em adição, a potente atividade antimicrobiana é complementada pela sua atividade nematicida e de defesa vegetal, algo peculiar à cepa da invenção.

[017] A presença dos genes relacionados com a síntese de policetídeos antimicrobianos pode ser determinada tal como descrito no Exemplo 5. A atividade antagonista contra fungos e bactérias fitopatogênicos pode ser determinada tal como descrito nos Exemplos 2 e 3. A capacidade de controlar doenças fúngicas e bacterianas em plantas pode ser determinada tal como descrito no Exemplo

7.

[018] Outra propriedade marcante da cepa é que esta desenvolve uma reação de hipersensibilidade nas plantas de tabaco (reação HR) e induz a expressão de genes relacionados com os mecanismos de defesa nas plantas de tomate (Exemplo 4, TABELA 3). Sabe-se que determinados micro-organismos associados às plantas, quando aplicados como tratamentos na rizosfera ou na parte aérea, podem induzir nelas uma resposta defensiva contra patógenos, é a chamada Resistência Sistêmica Induzida (ISR). A ISR pode ser determinada pela reação HR em plantas de tabaco, conforme divulgado no exemplo 4. Em outros casos,

componentes destes micro-organismos ou metabólitos produzidos durante o seu crescimento (metabólitos de fermentação) podem induzir um tipo de resposta chamada Resistência Sistêmica Adquirida (SAR). A SAR pode ser determinada pela indução de genes de defesa como os genes Harp ou outros nas plantas de tomate, tal como divulgado no exemplo 4. Estes mecanismos de defesa induzidos na planta conferem resistência à infecção por diversos patógenos e até mesmo a situações de estresse, tal como a seca. Existem exemplos de bactérias associadas às plantas tais como Pseudomonas, Bacillus, etc., que induzem estas defesas em diversas espécies vegetais, porém esta propriedade não foi previamente demonstrada em cepas de Streptomyces.

[019] A cepa AGL225 também apresenta a vantagem de não produzir antibióticos amino glicosídicos. As cepas de Streptomyces são produtoras de antibióticos amino glicosídicos conhecidas, o que limita o seu uso no controle integrado de pragas, e em particular no controle biológico de pragas, devido a preocupações de segurança. A AGL225 não produz aminoglicosídeos, uma vez que não possui os genes para expressar estas substâncias. Isto é mostrado na FIGURA

3. Ao invés disso, a AGL225 contém os genes da via biossintética para à síntese de policetídeo tipo II (act04) (Exemplo 5), o que implica a capacidade de produzir policetídeos antimicrobianos adequados para o controle biológico de pragas.

[020] A cepa Ss. melanosporofaciens AGL225 apresenta diversas vantagens as quais a torna particularmente adequada para uso no controle integrado de pragas. Na presente invenção, o termo “manejo integrado de pragas” apresenta O significado usual no campo da agronomia, no qual é entendido como uma estratégia que utiliza uma variedade de métodos complementares: físicos, mecânicos, químicos, biológicos, genéticos, legais e culturais de controle de pragas. É um método ecológico que objetiva reduzir ou eliminar o uso de pesticidas de síntese química e minimizar o impacto sobre o meio ambiente. Também se fala em controle ecológico ou biológico de pragas. Assim, na presente invenção, os termos “controle de pragas”, “controle biológico de pragas” são utilizados indiferentemente e referem-se ao controle integrado de pragas.

[021] Como mostrado efetivamente pelos exemplos abaixo, a cepa da invenção é altamente eficaz na prevenção de infecções causadas por diferentes patógenos bacterianos e fúngicos em plantas hortícolas e árvores frutíferas. A partir dos dados mostrados abaixo, também se pode concluir que esta eficácia se deve principalmente à sua alta atividade antagonista contra estes patógenos nos órgãos aéreos das plantas (folhas, frutos e/ou flores), bem como nas raízes. Esta incrível capacidade é muito importante para o controle biológico de pragas.

[022] Assim, outro aspecto da invenção se refere ao uso da cepa S. melanosporofaciens AGL225 como um pesticida em plantas.

[023] Na presente invenção, o termo “pesticida” é entendido com o seu significado usual no campo da agronomia como um produto destinado para matar, repelir, regular ou perturbar o crescimento de seres vivos considerados como pragas. Claramente, devido à natureza da cepa SS.

melanosporofaciens AGL225, na presente invenção, entende-se que “pesticida” é um pesticida biológico ou ecológico, também chamado biopesticidas.

[024] Em um aspecto adicional, a invenção fornece o uso da cepa S. melanosporofaciens AGL225 para o controle de uma doença causada por bactérias, fungos ou nematódeos em uma planta. Por “controle da doença” é entendido prevenção, cura ou melhora de doenças vegetais causadas por bactérias, fungos ou nematódeos. A cepa alcança este efeito uma vez que evita, diminui ou erradica a praga à qual causa a doença e/ou uma vez que melhora as defesas naturais nas plantas. Em uma modalidade particular, o uso da cepa S. melanosporofaciens AGL225 é para o controle de pragas vegetais causadas por bactérias, fungos ou nematódeos. Esta modalidade também pode ser expressa como uso da cepa como um pesticida com atividade bactericida, fungicida e nematicida. A invenção também fornece um método para o controle biológico de pragas vegetais compreendendo a administração à planta da cepa S. melanosporofaciens AGL225.

[025] Em uma modalidade, a planta a ser tratada é uma planta hortícola ou frutífera.

[026] Em vista do seu uso como pesticida em plantas, é importante ser capaz de obter quantidades suficientes de células viáveis a partir da cepa e também de metabólitos de fermentação. Tal como mostrado no Exemplo 2, a composição mostra uma viabilidade muito alta a qual é mantida durante o armazenamento, mesmo após a concentração e liofilização.

[027] Em um aspecto adicional, a presente invenção então se refere a um método de obtenção de células viáveis da cepa S. melanosporofaciens AGL225 conforme definido na reivindicação 1 compreendendo as etapas de: (1) inocular a cepa AGL225 em um meio de cultura adequado, (1i) submeter o meio de cultura inoculado da etapa (1) a condições adequadas para o crescimento da cepa para produzir uma suspensão celular, (iii) submeter a suspensão celular da etapa (ii) à separação para produzir células viáveis de Ss. melanosporofaciens AGL225 e um sobrenadante contendo metabólito, (iv) coletar as células de SS. melanosporofaciens AGL225, e (v) opcionalmente submeter a células obtidas a um processo de desidratação.

[028] A cepa da invenção pode ser inoculada no meio líquido com uma concentração final entre 1 e 5 &%. Preferencialmente, a cultura a ser inoculada está em uma fase de crescimento exponencial. A multiplicação celular é preferencialmente permitida para alcançar a fase exponencial final ou o início da fase estacionária, alcançando uma concentração celular entre 7 x 10 *º e 2 x *º UFC/ml. É bem conhecido que as cepas de Streptomyces produzem esporos. Esta capacidade é conveniente para a formulação de biopesticidas comerciais. Os esporos são altamente resistentes a condições de estresse, o que resulta na facilidade de processamento industrial, longa vida útil e alta taxa de sobrevivência quando aplicados às plantas dos produtos contendo Streptomyces. Em algumas modalidades da invenção, a cultura AGL225 é cultivada em fase estacionária ou submetida a condições de estresse para a obtenção de esporos. A cultura pode, então, ser ainda processada tal como descrito abaixo ou filtrada através de filtro Miracloth (Millipore) para a separação dos esporos. Uma solução adequada, tal como o Tween 20, pode então ser adicionada para manter uma suspensão de esporos homogênea. A presente invenção também fornece, em outro aspecto, os esporos de AGL225. Estes esporos podem ser obtidos tal como explicado acima.

[029] É sabido que os esporos fazem parte do ciclo de vida de algumas plantas e micro-organismos, logo, também podem ser chamados de células de esporos. Assim, nas modalidades a seguir, o termo “células” pode incluir células de esporos quando as condições forem adequadas para a sua formação.

[030] Meios de cultura adequados para o crescimento da cepa da invenção são meios de cultura sintéticos, tais como ISP2, AIA, Benedict e SNM. As condições “adequadas para oO crescimento da cepa são temperaturas entre 25 e 30 ºC, pH entre 6 e 8 e concentração de oxigênio entre 10 e 50 %. O crescimento da cepa da invenção é produzido em meio sólido ou sob agitação em meio líquido. Preferencialmente, um meio líquido é utilizado. Um exemplo do procedimento detalhado para a obtenção de células da cepa da invenção em meio líquido é apresentado no Exemplo 2. Para a produção em meio sólido, a cepa AGL225 pode ser semeada em placas de Petri com ágar ISP? e incubada a 28 ºC durante 1 - 2 semanas. Após submeter um prato inoculado a condições adequadas para o crescimento da cepa, por exemplo, com as condições acima descritas, suspensões de 40 - 60 ml com água destilada estéril são preparadas de 3 - 4 placas de cultura.

[031] Técnicas de separação adequadas incluem a centrifugação ou filtração da cultura. Ao realizar a centrifugação da cultura, por exemplo, a um mínimo de 8000 rpm, as células podem ser separadas do meio de cultura (sobrenadante). As células podem, então, ser diretamente utilizadas, ressuspendidas para uma densidade desejada, submetidas à desidratação ou rompidas para obter um extrato livre de células.

[032] As células obtidas a partir do método acima podem ser ressuspendidas para uma densidade desejada, por exemplo, 10 *1!º UFC/ml, em soluções adequadas tais como uma solução de tampão. Neste sentido, uma suspensão celular é obtida. Para obter uma suspensão celular, uma solução adequada pode ser também o meio de cultura no qual as células cresceram, isto é, o sobrenadante contendo metabólitos resultantes da separação da etapa (iii) acima. Isto pode ser vantajoso uma vez que o sobrenadante contém metabólitos ativos que, de outra forma, são parcialmente perdidos pela separação. Outra solução adequada para a ressuspensão das células pode ser o uso de meio de cultura fresco. A suspensão celular também pode ser obtida diretamente por um método que compreende as etapas (i) e (ii) do método definido acima, isto é, não submeter uma suspensão celular obtida na etapa (ii) à separação. Desta forma, a suspensão contém os metabólitos ativos secretados pelas células bacterianas. A suspensão diretamente obtida pode ser concentrada por quaisquer meios adequados conhecidos por um técnico no assunto.

[033] Em outro aspecto da invenção, é fornecida uma suspensão celular de células AGL225 obteníveis tal como descrito acima e o uso desta suspensão celular como um pesticida em plantas, em particular para o controle de pragas vegetais causadas por fungos, bactérias ou nematódeos. Em uma modalidade particular da invenção, a suspensão celular contém células AGL225 viáveis, meio de cultura e metabólitos ativos que foram produzidos pela cepa por fermentação do meio de cultura. Esta suspensão celular é particularmente vantajosa para a formulação de um biopesticida adequado. Em outra modalidade, a suspensão celular contém células AGL225 viáveis, preferencialmente em uma alta concentração, por exemplo, mais de 10º, ressuspendidas em meio de cultura fresco. Esta última suspensão celular em alta concentração pode ser também denominada “inóculo” e, ser utilizada para a obtenção de novas células viáveis da cepa quando inoculadas em um meio de cultura adequado.

[034] Como já mencionado, o sobrenadante obtido pela separação das células do meio de cultura contém metabólitos ativos com atividades antagonistas. Sendo assim, outro aspecto da invenção fornece um método para a obtenção de um sobrenadante de AGL225 contendo metabólito que compreende as etapas (i) - (iii) do método para a obtenção de células viáveis de S. melanosporofaciens AGL225 tal como definido acima e uma etapa adicional de coleta do sobrenadante. Opcionalmente, o sobrenadante resultante pode ser concentrado por qualquer meio adequado, tal como evaporação ou ultrafiltração. Outro aspecto se refere a um método para a obtenção de um sobrenadante de AGL225 contendo metabólito que consiste das etapas (i) - (iii) do método para a obtenção de células viáveis da SS. melanosporofaciens AGL225 tal como definido acima, coletando o sobrenadante que resulta da etapa (iii) e opcionalmente concentração do referido sobrenadante. Outro aspecto fornece um sobrenadante AGL225 contendo metabólito obtenível por estes métodos, bem como o uso deste sobrenadante AGL225 contendo metabólito como um pesticida em plantas, em particular para o controle de pragas vegetais causadas por fungos, bactérias ou nematódeos.

[035] Opcionalmente, as células AGL225 obteníveis pelos métodos definidos acima podem ser submetidas a um processo de desidratação. A desidratação pode ser realizada por um processo de liofilização, porém a polpa pode também ser secada por secagem em leito fluidizado, Ou por atomização. Neste sentido, outra característica vantajosa da cepa da invenção é que ela exibe uma alta resistência aos processos de desidratação os quais são comuns na produção de micro-organismos em escala industrial, uma vez que produz esporos. A invenção, então, também fornece células desidratadas da cepa AGL225 obteníveis tal como aqui definido. As células desidratadas podem, é claro, ser usadas como um pesticida em plantas, em particular para o controle de pragas vegetais causadas por fungos, bactérias ou nematódeos.

[036] As células de S. melanosporofaciens AGL225 podem ser ainda processadas para obter um extrato livre de células. Outro aspecto da invenção, assim, fornece um método para a obtenção de um extrato livre de células de S.

melanosporofaciens AGL225 o qual compreende submeter as células de S. melanosporofaciens AGL225 a: (1) rompimento das células de S. melanosporofaciens AGL225, (ii) separação do extrato livre de células a partir dos resíduos celulares, (iii) coleta do extrato livre de células, e (iv) opcionalmente submissão do extrato livre de células a um processo de concentração.

[037] Meios adequados de rompimento são conhecidos por um técnico no assunto e podem incluir rompimento físico, por exemplo, congelamento - descongelamento ou por pressão (French Press) ou rompimento químico, por exemplo pela adição de lisozima. Os meios de separação adequados foram descritos acima. Exemplos não limitativos de processos adequados para a concentração são desidratação (liofilização, secagem por pulverização), filtração, ultrafiltração, precipitação, centrifugação e cromatografia. O extrato livre de células pode também ser obtido a partir de uma suspensão celular tal como definida acima, preferencialmente contendo o sobrenadante contendo o metabólito.

[038] Outro aspecto fornece um extrato livre de células de S. melanosporofaciens AGL225 obtenível pelo processo definido acima, bem como o uso deste extrato livre de células como um pesticida em plantas, em particular para o controle de pragas vegetais causadas por fungos bactérias ou nematódeos.

[039] A invenção também se refere a um método para o controle biológico de pragas vegetais compreendendo a administração à planta das células de S. melanosporofaciens AGL225, células AGL225 desidratadas, uma suspensão celular de AGL225, um sobrenadante de AGL225 contendo metabólitos ou um extrato livre de células AGL225, todos tal como definidos acima.

[040] Em vista do seu uso no controle de pragas, agentes pesticidas são usualmente formulados nas composições as quais também incluem aditivos adequados para o uso agrícola para o qual eles foram projetados. As composições da invenção podem ser sólidas (incluindo, por exemplo, concentrado de bactérias desidratadas) ou líquidas (incluindo suspensões de bactérias concentradas). Outro aspecto da invenção, então, fornece uma composição compreendendo a cepa S. melanosporofaciens AGL225, e um ou mais compostos agricolamente aceitáveis. “Compostos agricolamente aceitáveis” se referem àqueles compostos e/ou materiais os quais são adequados e em geral aceitos para uso na agricultura. Em geral, tais compostos devem ser não tóxicos para seres humanos e devem, preferencialmente, ser compatíveis com o meio ambiente.

[041] A invenção também fornece composições compreendendo células desidratadas, uma suspensão celular uma sobrenadante contendo metabólitos, um extrato livre de células tal como definido acima, ou combinações dos mesmos, junto com um ou mais compostos agricolamente aceitáveis. Daqui em diante, a “composição da invenção” se refere a qualquer das composições acima mencionadas, todas as quais compreendem a cepa AGL225 ou um produto derivado da cepa AGL225.

[042] Em uma modalidade particular, a composição da invenção pode conter compostos para melhorar a aderência das cepas nas plantas a serem tratadas, compostos fitofortificantes, nutrientes, umectantes, estabilizantes, protetores da osmolaridade, antioxidantes, protetores solares, compostos tamponantes ou combinações dos mesmos.

Alguns compostos de melhora da adesão são gelatinas, amidos, pectinas, alginatos e diversos tipos de gomas tais como xantanas.

Muitos destes compostos são também umectantes.

Os protetores solares incluem corantes tais como o vermelho Congo.

Fitofortificantes são compostos que podem favorecer em culturas o vigor ou a tolerância a patógenos ou condições ambientais adversas.

Exemplos não limitativos de fitofortificantes são análogos do ácido jasmônico e determinados estimulantes defensivos em plantas tais como harpinas, quitosanas e laminarinas.

Em particular, as composições da invenção contêm pelo menos um protetor da osmolaridade.

Exemplos não limitativos de compostos protetores da osmolaridade são betaínas, aminoácidos e trehalose.

A melhora da eficácia dos agentes de controle biológico contra a infecção por diversos fitopatógenos por meio da adaptação fisiológica (protetores da osmolaridade) e melhoramento nutricional, tem sido demonstrados em diversos pesticidas microbianos.

Por exemplo, a sobrevivência sob estresse hídrico e eficácia do controle de doenças tem sido comprovada em Pantoea agglomerans EPS125 contra a murcha pós-colheita dos frutos causada por Penicillium expansum, por alteração da formulação com osmólitos (por exemplo, trehalose) (Bonaterra et al. 2005). Em adição, a aptidão e eficácia do controle da doença da praga do fogo das árvores de maçã e pêra foi melhorada em Pseudomonas fluorescens EPS62a por meio do aumento nutricional (por exemplo, adição de glicina, Tween 80) e osmólitos (por exemplo, glicina - betaína) (Cabrefiga et al. 2011, Cabrefiga et al. 2014). De forma interessante, o efeito da combinação das bactérias de controle biológico com o osmólito e/ou com o nutriente específico, proporcionou um efeito sinérgico com melhor eficácia de controle, porém também mais consistente entre os ensaios.

[043] Em um aspecto adicional, a presente invenção fornece uma composição compreendendo a cepa AGL225 e pelo menos um pesticida adicional, o referido pesticida adicional não afetando de forma adversa a atividade da cepa AGL225. Em uma modalidade, O pesticida adicional é um bactericida, um fungicida, um nematicida ou um inseticida. Em outra modalidade, o pesticida adicional é um biopesticida. Em outra modalidade, o biopesticida é outra cepa bacteriana com atividade fungicida, bactericida e/ou nematicida. Preferencialmente, o pesticida adicional é Streptomyces yatensis AGL148.

[044] Um aspecto adicional da invenção fornece o uso de qualquer uma das composições definidas acima como um pesticida em plantas, em particular para o controle de pragas vegetais causadas por fungos, bactérias ou nematódeos, bem como um método para o controle biológico de pragas vegetais compreendendo a administração à planta de qualquer uma das composições tal como definidas acima.

[045] Assim como com a cepa S. melanosporafaciens AGL225, os inventores descobriram que a cepa S. yatensis AGL148 mostra uma grande vantagem de simultaneamente exercer atividade antifúngica, bacteriana e nematicida. A cepa S. yatensis AGLI48 foi isolada do solo em um campo de nogueiras em Girona (Espanha), e foi depositada pelo requerente, de acordo com o Tratado de Budapeste, em 18 de julho de 2017, na Coleção Espanhola de Culturas Tipo (CECT), localizada na Universidade de Valência, Parque Científico da Universidade de Valência, Catedrático Agustín Escardino, 9, 46980 Paterna (Valência). A cepa S. yatensis foi depositada com a referência de identificação AGL148 e recebeu o número de acesso CECT9421.

[046] Esta cepa também induz os mecanismos naturais de defesa em plantas. S. yatensis AGLI148 difere de AGL225 no padrão antagonista específico, porém oferece a mesma vantagem de reunir uma ampla faixa de controle de doenças para um único ingrediente ativo em um produto de proteção vegetal. S. yatensis AGL148 também é segura para uso no controle biológico de pragas e apresenta propriedades, tais como capacidade de formação de esporos, que a torna particularmente adequada para a produção e uso industrial de biopesticida.

[047] Assim, a divulgação também se refere a cepa S. yatensis AGLI48 identificada na Coleção Espanhola de Culturas Tipo (CECT) como Streptomyces yatensis CECT9421. Tal como ilustrado nos exemplos abaixo, a cepa AGL1I48 é caracterizada por apresentar as seguintes propriedades: (i) Atividade antagonista contra as bactérias E. amylovora, P. syringae pv tomato, P. syringae pv actinidiae, arboricola pv pruni X. e os fungos B. cinerea, F. oxysporum e S. vesicarium (TABELA 1); (ii) Atividade antagonista in vitro em uma ampla variedade de meios de cultura tais como ISP2, AIA, Benedict e SNM (TABELA 1); (iii) Atividade quitinolítica e nematicida contra o nematódeo C. elegans (FIGURA 5, TABELA 4); (iv) Apresenta genes para a produção de policetídeos antimicrobianos tipo II (act04/ACT8), porém não apresenta genes de antibióticos aminoglicosídeos (FIGURA 3); (v) O meio de cultura no qual a cepa foi cultivada, uma vez livre de células (sobrenadante da suspensão celular cultivada), apresenta um perfil de HPLC distinto de metabólitos ativos os quais são produzidos pela cepa por fermentação. Este perfil metabólico é característico da cepa AGL225 e a distingue de outras cepas de Streptomyces (FIGURA 4). Estes metabólitos também apresentam atividade bactericida, fungicida e nematicida; (vi) Induz as defesas naturais das plantas exercendo uma reação de hipersensibilidade por meio da infiltração de células nas folhas de tabaco (reação HR) e também pela indução dos genes de defesa Harp nas plantas de tomate (TABELA 3); (vii) Apresenta a capacidade de inibir infecções causadas por bactérias fitopatogênicas E. amylovora em pêras, P. syringae pv. tomato em plantas de tomate; X. arboricola pv e pruni em Prunus; e fungos fitopatogênicos S. sclerotiorun em alface, F. oxysporun f. Sp. radicis lycopersici em tomates e B. cinerea em tomates (FIGURA 6).

[048] Todos os aspectos e modalidades descritas acima para a cepa S. melanosporofaciens AGL225 também se aplicam à cepa Streptomyces yatensis AGLI48. Assim, a invenção também fornece métodos para a obtenção de células

AGL148 de Streptomyces yatensis (incluindo ou consistindo de células na forma de esporos quando as condições são adequadas para a formação de esporos, tal como explicado acima), células AGL148 desidratadas, uma suspensão celular de AGL148, um sobrenadante de AGL148 contendo metabólitos e um extrato livre de células AGL148 compreendendo as mesmas características tal como definido acima.

A invenção também fornece células AGLI48 de Streptomyces yatensis, células AGL148 desidratadas, uma suspensão celular de AGL1I48, um sobrenadante de AGL148 contendo metabólitos e um extrato livre de células AGL148 obtenível pelos referidos métodos.

As composições compreendendo células AGL148 de Streptomyces yatensis, células AGL148 desidratadas, uma suspensão celular de AGLI48, um sobrenadante de AGLI48 contendo metabólitos e um extrato livre de células AGLI48 ou misturas dos mesmos, são também fornecidas em termos análogos tal como definidos acima.

O uso da cepa AGL148, seus derivados (células desidratadas, suspensão celular, sobrenadante contendo metabólitos ou extrato livre de células) ou composições contendo os mesmos é fornecido como pesticida em plantas, em particular para o controle de pragas vegetais causadas por fungos, bactérias ou nematódeos.

Por fim, é fornecido um método para o controle biológico de pragas vegetais compreendendo a administração à planta da cepa AGL148, seus derivados (células desidratadas, suspensão celular, sobrenadante contendo metabólitos ou extrato livre de células) ou composições contendo os mesmos.

Modalidades particulares para cada um destes aspectos os quais foram descritos acima para S. melanosporafaciens AGL225 também se aplica para os aspectos relacionados à cepa Streptomyces yatensis AGL148. Ainda, tal como indicado acima, o termo “células” podem incluir ou consistir em células de esporo quando as condições forem adequadas para a sua formação.

[049] A invenção também se refere a mutantes da cepa S. melanosporofaciens AGL225 e AGLI48 de Streptomyces yatensis. O termo “mutantes” se refere às cepas obtidas usando como cepa de partida AGL225 de S. melanosporofaciens ou AGLI48 de Streptomyces yatensis da invenção, e é caracterizado pela manutenção das propriedades descritas acima. Um “mutante” da cepa é também entendido de acordo com a invenção como uma “variante”. Um especialista no assunto irá entender que o uso das cepas da invenção como material de partida é rotineiramente possível para obter por exemplo, por mutação espontânea ou mutagênese direta, mutantes que retém as características e vantagens relevantes aqui descritas. Os métodos para a obtenção de mutantes de uma determinada cepa bacteriana são conhecidos na técnica. Exemplos podem ser encontrados em (Sambrook, JJ. e Russell, DW “Clonagem Molecular: um Manual de Laboratório”, capítulo 13, “Mutagênese”, Cold Spring Harbor, 3º edição, 2001).

[050] Ao longo do relatório descritivo e reivindicações, a palavra “compreende” e suas variantes não pretendem excluir outras características técnicas, aditivos, componentes ou etapas. Em adição, a palavra “compreende” inclui o caso “consiste em”. Outros objetos, vantagens e características da invenção serão evidentes para um técnico no assunto em parte a partir do relatório descritivo e em parte a partir da prática da invenção. Os exemplos a seguir e figuras são fornecidos para fins de ilustração e não pretendem ser limitativos da presente invenção. Em adição, a presente invenção cobre todas as possíveis combinações de modalidades particulares e preferidas aqui indicadas.

Breve descrição das figuras

[051] FIGURA 1. Árvore filogenética obtida usando a sequência parcial dos genes rpoB e 16S rRNA para as cepas de Streptomyces. As cepas AGL225 e AGLI148 aparecem na parte superior do dendrograma como Ss. yatensis/S. melanosporofaciens. O dendrogama foi construído usando os métodos de junção Dice and Neighbour.

[052] FIGURA 2. Dendrograma obtido com os padrões RAPD para isolados de Streptomyces. A matriz de distância foi calculada usando o coeficiente Dice e o agrupamento UPGMA. Os dados são combinados para cada cepa usando padrões RAPD obtidos com iniciadores LTI, d8635 e 1.80.7. As cepas mostradas incluem 25 isolados de Streptomyces obtidos neste trabalho e nove cepas de coleções de referência (S. saraceticus, Ss. hygroscopicus, Ss. griseoviridis, S. violascens, S. lipmanii, S. antibioticus, S. fradiae, S. rochei e S. violasceus). As cepas AGL225 e AGL148 são indicadas.

[053] FIGURA 3. Presença dos genes da via biossintética de diferentes tipos de metabólitos (aminoglicosídeos, policetídeos e beta-lactamas) em cepas de Streptomyces sp. A detecção foi realizada por amplificação por PCR. As cepas para fora dos círculos são cepas nas quais nenhum produto de amplificação foi encontrado com nenhum dos iniciadores para os três genes das vias.

[054] FIGURA 4. Perfis cromatográficos (HPLC) de cepas de Streptomyces em uma coluna C18 Kinetex 250 (painel da esquerda) ou em uma coluna C18-XB (painel da direita) Painel da esquerda: em meio de cultura ISP2 fresco (A), extrato da cepa S. yatensis AGL148 (B) e extrato da cepa S. melanosporofaciens AGL225 (C). Painel da direita: em meio de cultura ISP2 fresco (A), extrato da cepa S. yatensis AGL148 (B) e extrato da cepa S. melanosporofaciens AGL225 (C) comparado com a cepa AGL260 de Streptomyces sp. (D). O eixo Y mostra a absorbância de cada uma das frações coletadas (MAU = unidades de mili - absorbância), e o eixo x é o tempo de eluição (em min).

[055] FIGURA 5. Atividade nematicida em Caenorhabditis elegans, após tratamento com sobrenadantes a partir de culturas de cepas de Streptomyces em meio ISP2. Controle de tampão M9 com E. coli OP50 (A), azida de sódio (B, controle de mortalidade), sobrenadantes de AGL148 (C) e AGL225 (D). Nota-se que os nematódeos retos correspondem aos mortos e aqueles curvados, aos indivíduos vivos.

[056] FIGURA 6. Efeito do tratamento com as cepas AGL225 e AGLI48 de Streptomyces no controle de infecções causadas por X. arboricola pv. pruni em Prunus híbrido com pêssego x amêndoas GF677 (Xap), E. amylovora em pêras (Ea), P. Ssyringae pv. tomato em tomates (Pst), F. oxysporum f. sp. lycopersici em tomates (Fox), Botrytis cinerea em tomates (Bco) e S. sclerotiorum em alfaces (Ss). Os resultados são comparados com um controle não tratado (NTC). O eixo Y representa a severidade da doença. O eixo X representa o código da cepa. Cepas GQST713 (Bacillus subtilis) e Ss3l (Streptomyces saraceticus) foram usadas como biocontrole de referência. Valores são médias de três replicatas e barras de erro representam 95 % de intervalo de confiança da média. Nd: não determinado.

Exemplos Exemplo 1. Isolamento e caracterização das cepas AGL225 de S. melanosporofaciens e AGL148 de S. yatensis a) Preparo das amostras do campo para isolamento das cepas de Streptomyces

[057] A amostragem para a obtenção de isolados de Streptomyces foi realizada durante os meses de julho a setembro de 2014. Em todas as 54 amostras, terras agrícolas, áreas de florestas e áreas com condições extremas (dunas costeiras) foram tomadas. As amostras foram processadas por extração de materiais vegetais ou de solo em solução de água tamponada com fosfato, usando um homogeneizador. As suspensões obtidas foram diluídas e plaqueadas em placas de Petri contendo ágar de Benedict, e incubadas a 30 ºC por 3 dias. As colônias com morfologia típica de Streptomyces foram usadas para ainda obter culturas puras. Um total de 397 isolados de Streptomyces putativa de 54 amostras foi obtido. Para preservar os isolados, suspensões de células e esporos foram obtidas a partir de culturas puras de cerca de 5 dias em meio sólido por raspagem das colônias e ressuspensão em tampão fosfato. Então, o mesmo volume de suspensão foi misturado com 40 % de glicerol. O volume foi dividido em dois criotubos e, após 24 h a -20 ºC, eles foram armazenados em um congelador a -70 ºC.

b) Identificação dos isolados no nível do gênero

Streptomyces

[058] Para a confirmação de que os isolados pertencem ao gênero Streptomyces, um método baseado em PCR com iniciadores (Strep/StrepF e StrepB/StrepE) específicos para o gênero foi utilizado (Rintala et al. 2001). Cada cultura de suspensão foi submetida à extração do DNA usando um choque térmico a 100 ºC por 15 min. Primeiro, o PCR foi realizado com iniciadores StrepB/StrepF (Forward 5' - 3' ACAAGCCCTGGAAACGGGGT; SEQ ID NO: 1l, Reverse 5' - 3' ACGTGTGCAGCCCAAGACA; SEQ ID NO: 2) e com aquelas cepas que apresentaram amplificação negativa, um novo conjunto de PCR foi realizado com os iniciadores StrepB/StrepE (Forward 5 — 3' ACAAGCCCTGGAAACGGGGT; SEQ ID NO: l, Reverse 5' - 3 CACCAGGAATTCCGATCT; SEQ ID NO: 3). Os isolados eram considerados pertencentes ao gênero Streptomyces se o DNA amplificasse com qualquer um dos iniciadores. Dos 397 isolados, 311 foram, por fim, confirmados como pertencentes ao gênero Streptomyces. Em paralelo, a morfologia da colônia foi também examinada em diversos meio de cultura descritos para Streptomyces (ISP2, YEMES e Oatmeal) e em ágar de dextrose de batata (PDA) que é adequado para fungos (Shirling and Gottlieb, 1996, Scheper et al. 2010).

c) Atividade antagônica e quitinolítica in vitro

[059] os isolados obtidos na cultura pura, pertencentes a Streptomyces, foram primeiro estudados para a sua capacidade de inibir o crescimento de fungos e bactérias.

[060] Ensaios de antagonismos foram realizados usando discos de culturas de Streptomyces cultivadas por 5 - 7 dias em meios ISP2. Estes discos foram posicionados em placas de Petri com ágar ISP2 (ou outro meio de crescimento adequado para o crescimento de Streptomyces), as quais tinham sido previamente semeadas com o patógeno em crescimento confluente. A atividade antagonista contra diversos patógenos vegetais foi estudada. Os patógenos foram selecionados dentro das bactérias vegetais patogênicas: Erwinia amylovora 6076, uma cepa mutante não virulenta CFBP1430 (Coleção Bacteriana Francesa de Bactérias vegetais patogênicas, Angers, França) que causa praga do fogo em Rosaceae, Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000, a qual causa manchas bacterianas em tomates, P. sSyringae pv. actinidiae NCPPB3793 (Coleção Nacional de Bactérias vegetais patogênicas, Reino Unido) causando bacteriana cancro em kiwis, Xanthomonas arboricola pv. pruni CFBP 5563 a qual causa manchas bacterianas em árvores de frutas de caroço; e CECT 125 de Ralstonia solanaceum (Coleção Espanhola de Culturas Tipo, Valência, Espanha) que causa mal murcho ou murcha bacteriana. Como os fungos fitopatogênicos, os indicadores selecionados foram: ATCC 201829 de F. oxysporun f. sp. lycopersici (Coleção Americana de Culturas Tipo, Estados Unidos) que causa murcha vascular em tomates; Botrytis cinerea 33759B que causa murcha cinzenta em muitas plantas e Stemphylium vesicariunm EPS 26 (INTEA, Instituto de Tecnologia de Alimentos Agrícolas, Girona) causando manchas marrons em pêras e cebolas.

[061] Uma vez que as placas de Petri foram incubadas a 30 ºC por diversos dias, o diâmetro da zona de inibição de crescimento em torno da cepa de Streptomyces e no micro-organismo alvo foi determinada. Um índice de atividade que considera o diâmetro da zona de inibição foi utilizado. Para as bactérias, o seguinte índice foi utilizado: O, nenhuma inibição; 1, O cm < 1 Z €< 1 cm; 2, 1 em < IZ7 €< 2 cm; 3, 2 cm < IZ €< 3 cm. Para fungos, a seguinte escala: 0, nenhuma inibição; l1, O cm < IZ <€ 0.6 cm; 2, 0.6 cem < IZ7 < 1,2 cm; 3, 1,2 cm < IZ € 2 cm.

[062] Atividade quinolítica das cepas bacterianas foi avaliada usando um meio de quitina. Um meio de cultura mínimo consistindo de sais minerais suplementados com quitina como único nutriente foi preparado (Rodriguez- Kabana et al, 1983; Frândberg and Schnúrer, 1998). O meio de cultura continha 1,5 g/L de quitina coloidal, 2,7 g de K2HPOs; 0,3 g de KH>POs, 0,7 g de M9gSOs 7 H7O, 0,5 g de NaCl, 0,13 g de extrato de levedura e 20 gq de ágar em 1 L de água destilada. Isolados de Streptomyces foram colhidos em triplica na superfície de ágar de quitina e as placas foram incubadas por 7 dias a 28 ºC. As colônias capazes de secretar quitinase mostraram um halo transparente em torno dos mesmos. Como controle positivo para as quitinases, usamos a cepa de referência Pseudomonas fluorescens BL915. Dos 281 isolados testados, a maioria (247) mostrou atividade da quitinase. De forma significativa, Ss. melanosporofaciens AGL225 e S. vyatensis AGLI48 foram produtoras ativas de quitinase, o que conferiu a estas cepas uma potencial atividade nematicida e até mesmo inseticida.

[063] Dos 311 isolados de Streptomyces obtidos, 66 possuíram atividade antimicrobiana e quinolítica em diferentes níveis e foram selecionados para um estudo mais detalhado de atividade antimicrobiana. A primeira triagem das 66 cepas selecionadas mostrou diferentes espectros e intensidades de ação contra os oito micro-organismos fitopatogênicos.

[064] Quanto ao tipo de meio de cultura, foi observado um aumento da atividade antimicrobiana em meio ISP2 contra ambos os fungos e bactérias, quando comparado com os outros meios (AIA, Benedict, SNM). Em um grupo, as cepas apresentaram atividade antibacteriana (por exemplo, AGL7, AGLI13, AGLI5), enquanto no outro grupo, elas apresentaram atividade predominantemente antifúngica (por exemplo, AGL148, AGLI164, AGL227, AGL219). De forma surpreendente, a cepa AGL225 apresentou atividade antibacteriana simultaneamente com uma potente atividade antifúngica. Um exemplo das cepas selecionadas é fornecido na TABELA 1.

TABELA 1. Atividade antimicrobiana e quinolítica de isolados de Streptomyces sp. contra bactérias vegetais patogênicas (X. arboricola pv. pruni, E. amylovora, P. syringae pv. tomato, P. syringae pv. actinidiae, Ralstonia solanacearum); e fungos fitopatogênicos (S. vesicarium, F. oxysporum e B. cinerea). Os resultados mostrados são a o halo médio obtido com os meios de crescimento ISP2, AIA, Benedict e SNM. A atividade da quitinase é também indicada. Os valores correspondem aos índices de atividade (0 a 3 para cada patógeno) que considera o diâmetro do halo em torno das colônias de bactérias ou o halo de quitina.

Loser [2 [1 [2 2 o sis a a |

FE SIINNIIINHNDNRTEE

Lee] | de + | 2 1 1 1 2 2 2 hygroscopicus S. violaceus 2 | 1 | 1 o o | 3 | 3 | 3 o | eroenes [a [a 12 [o a sis ds o | Ss. melanosporofa 2 1 o o 1 3 3 3 o ciens [ass [2 [0 10 o o sis la| 2 | Ss. saraceticus 1 1 1 o 2 3 3 1 Ss31 [ams Lo lo 12 |: [o 1 o o| o | Xap = Xanthomonas arborícola pv. pruni; Ea = Erwinia amylovora; Pst = Pseudomonas syringae pv. tomato; Psa = P. syringae pv. actinidiae; Rs = Ralstonia solanacearum; Sv = Sthemphylium vesicarium; Fo = Fusarium oxysporum; Bc = Botritys cinerea. d) Identificação das cepas de Streptomyces em nível de espécies

[065] Dos 311 isolados originalmente classificados como Streptomyces, selecionamos 66 com atividade antimicrobiana significativa. Os isolados foram submetidos ao sequenciamento parcial dos genes 16S rDNA e rpoB (Ki et al. “Estrutura de um complexo proteína - DNA essencial para os esporos de DNA da proteção de Bacillus nas espécies”, 2009, Procedimentos da Academia Nacional de Ciências dos Estados Unidos da América, Volume 105, páginas 2806 - 2811). O PCR foi realizado em DNA de culturas com iniciadores StrepB/StrepF, que amplificam um fragmento de 519 bp de 16S rDNA (Rintala et al. 2001) e com iniciadores SRPOF1 (5' - TCGACCACTTCGGCAACCGC - 3'; SEQ ID NO: 4) e SRPOR1 (5' — TCGATCGGGCACATGCGGCC - 3'; SEQ ID NO: 5) que produzem um amplicon de 352 bp (Kim et al. 2001).

[066] A amplificação dos dois genes foi realizada em um volume final de 25 ul, contendo uma concentração de lx de tampão, 3 mM de cloreto de magnésio, 200 uM de dNTPs, 0,2 puM de cada iniciador, 2 U de Taq polimerase (Biootols, Espanha) e 2 ul de amostra. O programa do termociclador consistiu de 1 ciclo de 95 ºC por 5 min, 30 ciclos de 95 ºC por 45 s, 60 ºC por 40 s e 2 min a 72 ºC; por fim, a 72 ºC para 10 min de amplificação e, no final, manutenção a 4 “ºC. O termociclador profissional TRIO de Biometra (Biometra) foi utilizado. Uma vez que a amplificação foi completada, os resultados foram visualizados em gel de agarose a 1 % submetidos a um campo elétrico de 75 V por 40 min e corados com brometo de etídio por 20 min. As imagens foram capturadas com o imageador molecular ChemiDoc XRS + (BioRad Laboratories).

[067] Os produtos de PCR foram purificados (kit de purificação rápida de PCT Qiagen), a concentração do DNA foi ajustada a 50 ng/microlitro e o sequenciamento foi realizado com 5 pl de DNA e 5 ul de iniciadores a 5 UM usando um sequenciador analisador genético ABI PRISM *" 310 (PE Applied Biosystems, CA, USA). O sequenciamento foi realizados em ambas as direções da fita de DNA. As sequências editadas foram obtidas com Chromas 2.4 (programa http://downloads.informer.com/chromas/2.4/) e foram analisadas e alinhadas usando o programa editor de sequenciamento BioEdit (http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/ bioedit.html) e a homologia foi determinada pelo programa BLAST no banco de dados NCBI (https://blast.ncbi.nlm.nih. gov/Blast.cgi).

[068] A análise da sequência do 16S rDNA com o programa BLAST (GenBank) não permitiu distinguir claramente todos os isolados ao nível de espécies. Por este motivo, procedemos com o sequenciamento adicional do gene da subunidade beta da RNA polimerase (rpoB) (Kim et al. 2004), o qual pode ser aplicado às cepas de Streptomyces, e é também adequado para a análise filogenética (Dahllõóf et al. 2000; Kim et al, 2004).

[069] Das 66 cepas, 25 correspondências foram obtidas com o banco de dados GenBank. Em 9 das 25 cepas, houve concordância entre os dois sistemas de identificação (16S rDNA e rpoB). Dentre os isolados pertencentes ao Streptomyces, foi confirmado que as cepas mais ativamente antimicrobianas pertenciam a S. yatensis (AGL148, AGL164 e AGL219) ou S. melanosporofaciens (AGLI7l e AGL225). As sequências das cepas de S. melanosporofaciens AGL225 e S. yatensis AGL148, foram depositadas no GenBank (cepa AGL225: número de acesso do gene 16S rDNA = MGO008625, número de acesso do gene rpoB = MG007902 ; cepa AGL148: número de acesso do gene 165 rDNA = MG008626 , número de acesso do gene rpoB = MG007903).

[070] Além disso, uma árvore filogenética foi realizada com as sequências dos genes 165 rDNA e rpoB. Primeiro, elas foram alinhadas com o programa CLUSTALW (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/) a fim de escolher o comprimento adequado do fragmento para análise.

O dendrograma foi realizado com o método de junção Neighbor com 1000 replicatas de arranque usando o MEGA6 (Tamura K, et al. 2013).

[071] A análise filogenética mostrou que a maioria das cepas foi distribuída ao longo do dendrograma, porém, existia um grupo distinto, muito homogêneo e bem definido consistindo de AGL219, AGL225, AGL164, AGLI61 e AGL148 (FIGURA 1). De acordo com a homologia com o banco de dados GenBank, a cepa AGL148 correspondeu à espécie S. yatensis e a cepa AGL225, à S. melanosporofaciens.

e) Diferenciação dos isolados de Streptomyces em nível de cepa

[072] A fim de diferenciar cepas de Streptomyces AGL225 e AGL148 de outras cepas de Streptomyces, procedemos com a determinação do seu perfil de impressões digitais de DNA. Usamos a técnica RAPD (amplificação aleatória de DNA polimórfico), com iniciadores arbitrários curtos únicos (8 - 12 nucleotídeos) gerados pelas amplificações por PCR as quais permitem a tipificação das cepas (Williams et al., 1990). Um conjunto de 25 cepas de amostras de campo e nove cepas de referência foi utilizado, incluindo S. saraceticus ss31.

[073] As cepas foram cultivadas em meio líquido ISP2 por 5 dias e o DNA foi extraído usando o mini kit de extração de DNA QIAamp seguindo as instruções do fabricante.

[074] Para realizar o RAPD, o DNA das cepas (25 ng/pul) foi submetido à amplificação com 12 iniciadores em um primeiro teste: LIT (5' - 3' TGCCGAGCTG; SEQ ID NO: 6), OPA9 (5' - 3' GGGTAACGCC; SEQ ID NO: 7), OPAIO (5' - 3'

GTTGGCGGGTGTCGGGGCTEGCTT; SEQ ID NO: 8), OPA2 (Kong et al. 12001) (5' - 3' GTGATCGCAG; SEQ ID NO: 9) (Gharaibeh et al., 2003), OPA B9 (5' - 3' GGGCGACTAC; SEQ ID NO: 10) (Boroujeni et al., 2012), d8635 (5' - 3º GAGCGGCCAAAGGGAGCAGAC; SEQ ID NO: 11) (Kutchma et al., 1998), gene 1.80.5 (5' - 3' ACCCCAGCCG; SEQ ID NO: 12), gene 1.80.7 (5' - 3' GCACGCCGGA; SEQ ID NO: 13), gene

2.80.11 (5' - 3' GCAGCAGCCG; SEQ ID NO: 14), gene 4.80.35 (5' — 3' CACCTGCCGC; SEQ ID NO: 15), gene 4.80.36 (5' - 3º GGCCTCCACG; SEQ ID NO: 16), Gene 4.80.37 (57 = 3 CGCCAGGAGC; SEQ ID NO: 17) (Martin et al., 2000). Os melhores resultados foram fornecidos com os iniciadores LIT, d8635 e 1.80.7 que permitiram uma maior número de bandas.

[075] O coquetel de PCR era de 25 ul, 2 ul dos quais eram o DNA da cepa. A concentração final do tampão era de lx, 2,5 mM de MgCla, 2 mM de daNnNTPs, 0,4 pM de iniciador e 1 unidade de Taq polimerase. Um programa com uma sequência de dois diferentes ciclos de amplificação (5 ciclos a 37 ºC e 30 ciclos a 55 *C) foi utilizado. O termociclador profissional TRIO de Biometra (Biometra) foi utilizado. Uma vez completada a amplificação, os resultados foram visualizados em gel de agarose a 1,5 %, que foi submetido a um campo elétrico de 75 V por 60 min e corado com EtBr por 20 min. Os resultados foram capturados com o imageador molecular ChemiDoc XRS + (BioRad Laboratories). As imagens dos geis foram processadas com o programa Image Lab v.4 (Bi-Rad) para calcular o tamanho do fragmento (bp). Com os dados dos três iniciadores, uma matriz binária foi construída para determinar a presença ou ausência de um fragmento de um peso molecular particular nas cepas. oO cálculo da similaridade foi realizado usando o coeficiente Dice e, por fim, o dendrograma foi realizado com uma análise de cluster usando o método UPGMA (método de agrupamento de pares não ponderados com média aritmética) com o programa NTSYSpc v2.0.

[076] A Figura 2 mostra o dendrograma obtido com o método UPGMA derivado da combinação dos padrões RAPD com os iniciadores LIT, d8635 e 1.80.7, para os 25 isolados e dez cepas de referência das espécies S. saraceticus, Ss. hygroscopicus, Ss. griseoviridis, Ss. violascens, Ss. lipmanii, S. antibioticus, S. fradiae, S. rochei e S. violasceus. Pode ser observado que cada uma das cepas pode ser distinguida com impressão digital de DNA de RAPD, particularmente as cepas AGL225 e AGLI48. Sendo assim, as cepas da invenção apresentam um padrão RAPD único e distintivo, diferente de outros isolados, incluindo aqueles de coleções ou de produtos comerciais.

Exemplo 2. Preparo de culturas das cepas da invenção e de extratos livre de célula para a obtenção de concentrados de suspensões e extratos celulares a partir do meio de cultura.

[077] Para a produção de células ou metabólitos das cepas AGL225 e AGL148, as culturas foram cultivadas em placas com ISP2. Para obter uma suspensão celular concentrada ou sobrenadante livre de células de culturas contendo os metabólitos de fermentação de Streptomyces da invenção, as cepas foram cultivadas por 1 semana em meio líquido ISP2 e incubadas a 28 “C com agitação a 150 rpm. O material obtido em fase estacionária foi submetido a centrifugação a 8000 rpm durante 15 min. O pélete contendo células pode ser ressuspendido em um pequeno volume de tampão fosfato para obter uma suspensão celular concentrada de 10 *º UFC/ml. A suspensão celular concentrada pode ser usada em ensaios adicionais, como controle de doenças em plantas artificialmente infectadas com fitopatógenos.

[078] O sobrenadante da centrifugação, contendo metabólitos produzidos pela cultura da cepa, foi utilizado para ensaios de atividade antimicrobiana. Os sobrenadantes foram filtrados através de filtros de poros de 0,45 micrômetros e os filtrados foram congelados a -80 ºC para uso posterior. Estes extratos foram adicionalmente concentrados por liofilização para obter um extrato sólido, que pode ser armazenado até o uso. Neste caso, o material sólido é suspendido em água destilada ou metanol, ou pode ser submetido a uma extração/purificação parcial dos seus componentes por extração de fase com acetato de etila ou hexano/clorofórmio. Tais frações podem ser evaporadas e o pélete ressuspendido em metanol. Todos estes materiais podem ser utilizados em ensaios de atividade antimicrobiana ou nematicida, e para análise de cromatografia por HPLC dos componentes ativos.

Exemplo 3. Atividade antimicrobiana de sobrenadantes de culturas livres de células

[079] Os sobrenadantes da cultura foram avaliados pelo sistema Bioscreen (Labsystems) usando placas com 100 micropoços. Cada poço da placa continha 100 ul de sobrenadante (direto ou na diluição desejada), 80 de caldo Luria Bertani (2x) e 20 pl de uma suspensão de &X. arboricola pv. pruni ou esporos de F. oxyporum. OS resultados da inibição foram transformados em unidades arbitrárias como AU ml". A AU foi calculada como o inverso da maior diluição que inibiu o crescimento do patógeno (D) e multiplicada por 40 (Parente et al. 1995). A TABELA 2 mostra os resultados das seis melhores cepas. os sobrenadantes das cepas AGL13, AGL25 e AGL3l apresentaram atividade antifúngica contra F. oxysporum e a cepa AGL286 apresentou atividade antibacteriana. No entanto, os sobrenadantes das cepas AGL148 e AGL225 foram, simultaneamente, antibacterianos e antifúngicos.

TABELA 2. Atividade antimicrobiana in vitro (AU ml!) contra dois patógenos das culturas de sobrenadante de cepas de Streptomyces.

me Streptomyces . F. oxysporum pruni Las a | oa a as | oe | ro | 5 | Exemplo 4. Indução das defesas vegetais a) Resposta da hipersensibilidade em plantas de tabaco (HR)

[080] Para demonstrar a capacidade de induzir a defesa em plantas, uma técnica que consiste na infiltração de folhas de plantas de tabaco foi utilizada. Este método mede a resposta da hipersensibilidade (HR) em um indicador vegetal contra células ou extratos (Freeman and Beattie, 2008). As suspensões de 39 cepas de Streptomyces selecionadas foram infiltradas no mesófilo das folhas de tabaco (Nicotiana tabacum). Para a infiltração, um punção foi feita no lado reverso da folha com o auxílio de uma agulha hipodérmica. As infiltrações foram realizadas em quatro diferentes plantas com uma seringa sem agulha carregada com o material da cepa de Streptomyces. A bactéria patogênica vegetal Pseudomonas syringae EPS94 em 10º UFC/ml foi utilizada como controle positivo e água como controle negativo. Após 24 - 72 h de incubação, os sintomas das plantas foram observados. A resposta HR consistiu no bloqueio da necrose limitada entre duas costelas e um tecido dissecado marrom claro. Das 39 cepas testadas, 10 cepas da coleção foram positivas (AGL3l, AGL214, AGL225, AGL227, AGL260, AGL272, AGL305, AGLI1I48, AGL161, AGLI164, AGL171, AGL174, AGLI186), particularmente S. yatensis AGL148 e S. melanosporofaciens AGL225. Este resultado indicou sua capacidade em induzir as defesas nas plantas de acordo com a reação HR em folhas de tabaco.

b) Indução da expressão dos genes relacionados às defesas ou estresse em plantas

[081] Para confirmar que a reação HR observada nas folhas de tabaco com o tratamento com cepas AGL225 e AGL148 foi devido à indução de genes relacionados à resposta defensiva na planta, foi realizado um estudo transcriptômico, neste caso, em plantas de tomate. O tomate foi utilizado como planta modelo devido ao abundante número de estudos disponíveis sobre a expressão gênica.

[082] As plantas de tomate foram cultivadas em hidropônicos, em substrato inerte de 1ã de rocha (GrodanO Plugs). Após 2 - 3 semanas (estágio fenológico de dois cotilédones), as plântulas foram transplantadas em blocos de 1ã de rocha (GrodanO Delta). Estas foram aclimatadas na estufa por aproximadamente 8 semanas antes da realização dos testes.

Um único tratamento com as cepas de Streptomyces foi realizado e as amostras de material vegetal (folhas) foram colhidas em 24 horas para realizar a extração do mMRNA. o tratamento de referência com benzotiadiazol (Bion, Syngenta), que estimula as defesas vegetais, foi utilizado como controle positivo.

O desenho experimental consistiu de 9 plantas por tratamento (3 replicatas de 3 plantas cada). Para a extração do RNA das amostras, três folhas jovens de três plantas simples (cerca de 30 mag) foram misturadas e congeladas com nitrogênio líquido com duas esferas (borosilicato de 4 mm de diâmetro) e armazenadas a -70 ºC.

As amostras foram homogeneizadas com TissueLyser II (Qiagen) utilizando uma frequência de 30 Hz por 10 s.

A extração do mRNA foi realizada usando o reagente Trizol (Invitrogen). A quantificação do RNA obtido foi feita com o sistema Nanodrop (NanoDrop quantitativoO ND-1000, NanoDrop Technologies). Para remover os vestígios de DNA, as amostras foram tratadas com DNase (Ambion& TURBO DNA-free "”. Live Technologies). Em seguida, a transcrição reversa dos extratos de ácido nucleico das amostras (conversão de mRNA em cDNA) foi realizada com kits de transcrição reversa de cDNA (Invitrogen) seguindo as instruções do fabricante.

Por fim, foram realizados qPCR para ambos, o gene de referência endógeno Actin (F 5' -3': CACTGTATGCCAGTGGTCGT, SEQ ID NO 18; R 5º - 3': GACGGAGAATGGCATGTGGA, SEQ ID NO: 19), bem como para cada um dos genes de proteínas de patogenoses relacionadas: PRla (EF

5' - 3': TCTTGTGAGGCCCAAAATTC, SEQ ID NO: 20 ; R 5' -3': ATAGTCTGGCCTCTCGGACA, SEQ ID NO: 21) (Aime et al., 2008), Glucanases: GluA (F 5' - 3': TCTTGTGAGGCCCAAAATTC, SEQ ID NO: 22 ; R 5' - 3': ATAGTCTGGCCTCTCGGACA, SEQ ID NO: 23) (Aime et al., 2008), GLUB (F 5º - 3': TTGTCGCCACCAACATTCACA, SEQ ID NO: 24 ; R 5' - 3': ACCATCTCGCGTGTTCCATC, SEQ ID NO: 25), Quitinases: chia (F 5' -3': TTCGGCACTGATGGAAGTGG, SEQ ID NO: 26; R 5' - 3': TTTTAAGCTTGCTACACGCGG, SEQ ID NO: 27), PERAJ (F 5' - 3': AGGCCCATTTTATCCGGTGG, SEQ ID NO: 28; R 5º - 3': GCTAAGGCCACGTCTAGCAA, SEQ ID NO: 29), PERI (F 5' - 3': TCTTAGCTGTTGCAGCTCGT, SEQ ID NO: 30; R 5º - 3': CTAGTGTATGGCCACCGGAC, SEQ ID NO: 31), HARP (F 5' - 3': ATTATGGCCCGTCCATTCCG, SEQ ID NO: 32; R 5º - 3': ATGCAATGACTCCGAGGACG, SEQ ID NO: 33).

[083] Na TABELA 3, é mostrado o efeito dos tratamentos nos níveis de expressão gênica (mMRNA) correspondente a quatro genes relacionados à resposta de defesa em plantas. Foi comparado o efeito das cepas AGL148 e AGL225, em relação a um controle positivo (Bion da Syngenta) e a um controle negativo (água). Comparado ao controle negativo, a cepa AGL148 induz a expressão de genes Per AJ, Pr la, Chia À e Harp, enquanto a cepa AGL225 induz o gene Harp. O controle positivo Bion induz PRlIa, Chia e Harp. Sendo assim, pode ser concluído que ambas as cepas induzem as defesas vegetais, porém o efeito é mais extenso e forte em AGL148 do que em AGL225.

TABELA 3. Efeito do tratamento de plantas de tomato com cepas AGL225 e AGLI148 nos níveis de expressão (mRNA) dos genes Pr la, Chi A, Per AJ e Harp relacionados à resposta defensiva. Controle positivo (Bion) e controle negativo (água) . Tratamento | HR PRla ChiA PerAJ Harp 1,17 + NTC 1,05 + 0,14 1,48 + 0,50 |1,52 + 0,61 0,29 8,54 + 13,52 + Bion - > 40 0,34 + 0,16 4,00 2,02 22,23 t 3,74 t+ 13,41 + AGL148 + 1,92 + 0,89 4,92 0,42 2,82 1,05 + 0,19 + AGL225 + |0,39 + 0,20 3,01 t+ 0,59 0,42 0,072 PRla = proteína relacionada a patogenoses; ChiA = quitinase; Per AJ = peroxidase; Harp = proteína induzida tipo harpina. Exemplo 5. Genes e metabólitos envolvidos na atividade das cepas

[084] A produção de metabólitos da fermentação por culturas de Streptomyces foi estudada devido ao fato de ter sido associada à atividade do controle biológico em diversos biopesticidas microbianos (Montesinos and Bonaterra, 2009). No gênero Streptomyces, a produção de numerosos compostos antimicrobianos a partir do grupo de aminoglicosídeos e policetídeos, foram descritos. O gênero Streptomyces é notável pela produção de metabólitos secundários que dão aos seus membros uma ampla faixa de aplicações no campo fitossanitário. a) Caracterização de genes envolvidos na síntese de metabólitos antimicrobianos

[085] Para confirmar a produção de metabólitos antimicrobianos benéficos às plantas pelas cepas, foi realizada uma abordagem molecular antes da análise química dos perfis metabólicos específicos.

Procedemos à detecção de genes relacionados à síntese de três grupos de metabólitos secundários bioativos produzidos por actinomicetos.

Foram utilizados três pares de iniciadores para a biossíntese dos metabólitos a fim de detectar os aminoglicosídeos (strDOlf 5º - 3": CTTCGCCATGTATCTCGGCGACAA, SEQ ID NO: 34; strDOlr 5' - 3': TGCCGGTGTCCTTCCAGTAG, SEQ ID NO: 35), policetídeos tipo II (acto4f 5' - 3': GATGGTCTCCCCACCGGCTGC, SEQ ID NO: 36; act06r 5' - 3': GTCTCGTGGGCGGTCGTTCTGC, SEQ ID NO: 37) e beta-lactamas (pcb03f 5' - 3': CGAGTCCTGGTGCTACCTGAACC, SEQ ID NO: 38; pcbO0O3r 5' - 3': TCATCGACGACGTCCAGGTGGTC, SEQ ID NO: 39) (Bervanakis, 2008). O DNA das culturas foi extraído seguindo o mesmo protocolo para a identificação de isolados, tal como descrito no Exemplo 1, parágrafo b.

A amplificação foi realizada em um coquetel com um volume de pl, com uma concentração final de lx de tampão, 3 mM de cloreto de magnésio, 200 pM de dNTPs, 0,2 pM de cada iniciador, 2 U de Tag polimerase (Biootols, Espanha) e 2,5 pl de amostra.

O programa do termociclador consistiu de 1 ciclo de 95 ºC por 5 min, 30 ciclos de 95 ºC por 45 s, 65 ºC por 45 s e 1 min a 72 ºC; por fim, a 72 ºC para amplificação por 10 min e uma fase final de manutenção a 4 ºC.

O termociclador profissional TRIO da Biometra (Biometra) foi utilizado.

Os amplicons foram separados por eletroforese em gel de agarose a 1,5 % em um campo elétrico de 90 V por 40 min.

Em seguida, os geis foram corados com EtBr por 20 min.

Os resultados foram capturados com o imageador molecular ChemiDoc XRS + (Laboratórios BioRad) Streptomyces griseus DSM40236 foi usado como verificação positiva para a presença de genes biossintéticos aminoglicosídeos; S. cattleya DMS46488 (NRRL8057) para beta-lactamas e S. nogalater DSM40546 para policetídeos.

[086] A Figura 3 mostra que das 59 cepas da coleção analisada, 14 mostraram a biossíntese de genes aminoglicosídeos, 26 cepas mostraram genes da síntese de policetídeos, enquanto oito cepas possuíram ambos os grupos de genes. Nenhuma das cepas mostrou os genes para a síntese de beta-lactamas e 17 cepas não mostraram qualquer dos genes. As cepas AGL225 e AGL148 foram apenas positivas para os genes de policetídeos do tipo II.

b) Perfis de metabólitos de fermentação

[087] Após a análise dos três tipos de genes relacionados a metabólitos antimicrobianos, procedemos com a determinação dos perfis dos metabólitos produzidos pelas cepas por cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC). Os metabólitos produzidos em cultura líquida foram determinados como perfis característicos para cada cepa. Isto foi feito especificamente para as cepas AGL225 e AGL148. O meio de cultura ISP2 foi inoculado com as cepas, cultivado por uma semana a 28 ºC sob agitação a 150 rpm. As culturas foram filtradas e os sobrenadantes congelados a - 80 ºC. O mesmo procedimento foi realizado com o meio de cultura ISP2 não inoculado para ser utilizado como controle.

[088] A extração dos metabólitos foi realizada nos sobrenadantes da cultura. O processo de extração consistiu de hexano (1:1) e acetato de etila (1:1), seguido de evaporação e ressuspensão em acetonitrila. 50 ul de cada extrato foram analisados sob as seguintes condições: Taxa de fluxo: 1,25 ml/min; Solventes: A: Água + 0,1 % de TFA B: acetonitrila + 0O0,l % de TFA. Os cromatogramas foram corridos a 220 nm (compostos peptídicos), 254 nm (compostos aromáticos), 280 nm (compostos fenólicos). A utilização das colunas C18-XF e PFP permite detectar nos cromatogramas picos diferenciais e identificativos em diversos comprimentos de onda (220, 245 e 280 nm) entre as cepas AGL148 e AGL225, as quais estão em conformidade com os diversos metabólitos produzidos.

[089] Vários perfis podem ser observados na Figura 4, que mostram picos diferenciais em relação aos componentes do meio, os quais são produzidos por S&S. melanosporofaciens AGL225 e S. vatensis AGLI48. Estes perfis são característicos das referidas cepas e são impressões digitais moleculares distintas, as quais diferem de outras cepas de Streptomyces. A natureza dos compostos é desconhecida, porém provavelmente eram produtos genéticos de policetídeos, em concordância com os genes destas vias detectadas por PCR.

Exemplo 6. Atividade nematicida

[090] Para determinar a atividade nematicida das cepas, o nematódeo Caenorhabditis elegans WT Bristol N2 foi usado como um nematódeo modelo, o qual é uma cepa selvagem do Centro Genético de Caenorhabditis (CGC). Os nematódeos foram cultivadas em E. coli OP50 rotineiramente. A população de nematódeos heterogêneos resultante foi tratada com hipoclorito de sódio (1,5 %) para preservar apenas ovos e eliminar indivíduos. Após diversas lavagens com tampão

M9, procedemos com a incubação dos ovos, os quais foram transferidos ao meio NMG com E. coli OP50 como alimento e incubados até o estágio L2. Neste estágio, os ensaios de sobrevivência em meio sólido e líquido foram feitos. Nos testes em meio sólido, a cepa correspondente ao Streptomyces foi semeada em NMG, em vez de E. coli OP50. Após 12 dias de crescimento no estágio L2, os nematódeos foram depositados. As cepas S. enterica subsp. enterica ATCC14028 (CECT4594) e LT2 (CECT4085) para controles positivos (patógenos controle) foram utilizadas. No meio líquido, o sobrenadante da cultura das cepas de Streptomyces, obtidas por centrifugação tal como descritas acima foi testada em microplacas. O testes consistiu do depósito de 1 ml de sobrenadante da cultura e 30 microlitros de NMG com uma suspensão de nematódeos (75 - 100 indivíduos) em cada poço da microplaca. Meios NMG fresco, ISP2 e tampão M9 foram usados como controles negativos e o biocida azida de sódio foi usado como controle nematicida. As placas foram incubadas a 23 ºC e foram determinados os indivíduos que sobreviveram 24 e 48 h. Um estereomicroscópio (SMZ NIKON 1000) foi utilizado para a visualização dos nematódeos. O comprimento e o formato dos nematódeos foram medidos, e os nematódeos mortos “apareceram com morfologia reta, enquanto os indivíduos sinusoidais e móveis foram considerados vivos.

[091] As células de cepas de Streptomyces isoladas não afetaram significativamente a sobrevivência dos nematódeos nos testes feitos em meio sólido, enquanto as duas cepas da Salmonella patogênica causou mortalidade. No entanto, os sobrenadantes a partir das culturas livres de células de S. melanosporofaciens AGL225 e S. vyatensis AGL148 apresentaram uma forte efeito nematicida (FIGURA 5, TABELA 4). Foi observado que também em altas doses, uma parte dos indivíduos de nematódeo foi lisada e praticamente irreconhecível. Este efeito foi atribuído à possível ação das quitinases, e aos inúmeros metabólitos nematóxicos produzidos pelas cepas de Streptomyces. Tal propriedade pode ser considerada importante para o uso das cepas como nematicidas biológicos, com aplicações na proteção vegetal. TABELA 4. Atividade nematicida de S. melanosporofaciens AGL225 e S. yatensis AGL148. En Er 1 70 2 (controle de morte) 1 60 o 57 3 ISP2 | tempão coneroze mo | 2 | sm | o [6] 1 | Exemplo 7. Eficácia das cepas da invenção no controle de infecções bacteriana e fúngica em plantas

[092] Para demonstrar a eficácia das cepas da invenção, diversos testes foram realizados em condições ambientais controladas (estufa) em diversos patosistemas representativos (plantas de cultura e patógenos), envolvendo ambas bactérias vegetais patogênicas e fungos fitopatogênicos. Os patosistemas bacterianos foram &X. arboricola pv. pruni (Xap) em GF677 um porta enxerto híbrido de amêndoas x pêssego, P. syringae pv. tomato (Pto) em tomates e PE. amylovora em pêras. No caso dos patosistemas fúngicos, Ss. sclerotiorum em alface, B. cinerea em tomates e F. oxysporum É. sp. radicis lycopersici (Forl) em tomates, foram usados. Os resultados são mostrados na FIGURA 6.

[093] Para o preparo dos tratamentos, as cepas de Streptomyces foram semeadas em ISP2 e incubadas a 28 “C por cinco dias, para obter células vegetativas, esporos e metabólitos de fermentação. As suspensões das cepas em água destilada estéril foram preparadas tal como descrito acima no Exemplo 2. Contagens viáveis foram 3 - 4 x 10 * $ UFC/ml, dependendo do ensaio.

a) Controle de Xanthomonas arboricola pv. pruni em Prunus

[094] Plantas de porta-enxerto Prunus GF667, um híbrido de amêndoa e pêssego (Prunus amygdalus x Prunus persica) foram usadas, quando apresentavam entre 6 a 7 folhas. O desenho experimental consistiu de 3 repetições de 3 plantas por repetição para cada tratamento. os tratamentos com cepas de Streptomyces foram aplicados com um aerógrafo até o ponto de gota, 7 e ll dia antes da inoculação do patógeno. S. saraceticus SS31l foi usado como controle de referência. A cepa de X. arboricola pv. pruni CFBP 5563, o patógeno, foi inoculada na superfície de placas com ágar LB e incubadas a 28 ºC e o inóculo foi preparado a partir de placas incubadas por 24 h. A suspensão do patógeno foi ajustada para uma concentração de aproximadamente 6,8 x 10 * 7 UFC/ml. Todas as folhas dentro de uma planta foram inoculadas por pulverização com um aerógrafo até o ponto de escorrimento. Uma vez inoculadas, as plantas foram posicionadas em sacos plástico por 48 h para acelerar o processo de infecção e, então, incubadas a 26 + 2 ºC com uma umidade relativa de 60 % e 16 h de luz durante o dia e 15 + 2 ºC, 80 % de UR e 8 h de escuro ao longo da noite. Avaliações foram feitas em 15 dias após a inoculação do patógeno (dpi) atribuindo um índice de doença com base na área foliar afetada. 0: sem sintomas; 1,0 a 25 % da área foliar; 2, 25 a 50 % da área foliar, 3, 50 a 75 % da área foliar; e 4, acima de 75 &.

[095] Figura 6 (Xap) mostra o efeito dos tratamentos com S. saraceticus SS3l como controle de referência, bem como com as cepas de Streptomyces da invenção. As cepas AGLI48 e AGL225 foram eficazes e reduziram significativamente a severidade da infecção em relação ao controle não tratado.

b) Controle de Erwinia amylovora em pêras

[096] O teste foi conduzido com plantas de pêra de 2 anos de idade da cultivar Conference (clone CAV) auto- enraizada e crescida em vasos. O desenho experimental consistiu de três repetições de 3 plantas por repetição, para cada tratamento. Neste teste, os tratamentos foram aplicados em 7 e 1 dias antes da inoculação do patógeno. Os tratamentos com as cepas foram realizados nas folhas superiores mais jovens (3 - 4 folhas/planta) com um aerógrafo até o ponto de gota. Um dia antes do tratamento, as plantas foram feridas com uma incisão no nervo principal das folhas. Os tratamentos consistiram de cepas de Streptomyces. A cepa de patógeno utilizada foi E. amylovora EPS101, a qual foi descongelada e mantida por subculturas em placas com ágar LB fresco incubadas a 28 “*C. Um inóculo fresco foi preparado para infecções em uma dose de 3,5 x 10 * 7 UFC/ml. A inoculação de E. amylovora foi realizada pela aplicação de uma gota de 10 À1pl em cada ferida. Uma vez inoculadas, as plantas foram posicionadas em sacos plásticos para acelerar o processo de infecção e manter o patógeno em quarentena. A avaliação da doença foi realizada em 5, 7 e 12 dpi, usando um índice de O a 4 com base no desenvolvimento da necrose nas plantas: o: nenhuma infecção; 1: início da necrose fora da ferida; 2: início da necrose pelo nervo foliar; 3: necrose alcança o pecíolo, e 4: necrose a partir da folha para o galho. A Figura 6 (Ea) mostra que uma cepa AGL225 reduziu significativamente os níveis de infecção quando comparada com o controle não tratado.

c) Controle de Pseudomonas syringae pv. tomato em plantas de tomate

[097] Para obter plantas de tomate, sementes da variedade Rio Grande foram semeadas em alvéolos e 15 - 21 dias após, foram transplantadas para vasos. As condições na estufa eram de 16 h de luz a 25 + 2 ºCeB8h de escuro a 15 + 2 ºC. O desenho experimental consistiu de 3 repetições de 3 plantas por repetição, para cada tratamento. A cepa P. syringae pv. tomato (Pst) DC3000 foi usada como patógeno. Para o preparo do inóculo, uma colônia foi congelada e mantida em placas com LB fresco incubadas a 28 por 24 h. Uma suspensão aquosa foi preparada e foi ajustada para aproximadamente 10 * 8º UFC/ml. O inóculo foi complementado com terra diatomácea (1 g/L) para facilitar micro feridas nas folhas e, assim, a infecção. Cada planta foi inoculada com aerógrafo até o ponto de gota, foi incubada a 25 + 2 ºC com umidade relativa de 60 % e 16 h de luz durante o dia e + 2 ºc, 80 % de UR e 8 h de escuro durante a noite.

[098] Os tratamentos começaram quando a terceira e quarta folhas verdadeiras emergiram e foram realizados de 7 e l dia antes da inoculação do patógeno. Bacillus subtilis QOST713 foi usado como controle. As avaliações foram feitas em 7 dpi e foram classificadas dependendo da área da folha afetada, de acordo com um índice de O quando não são detectados sintomas; l, menos de 25 % da área afetada; 2, de 25 a 50 % da área foliar afetada; 3, de 50 a 75 % da área foliar afetada e 4, mais de 75 % da área afetada. Todos os tratamentos exceto Serenade mostraram uma redução na severidade da infecção por Pst (FIGURA 6, Pst). As cepas AGL225 e AGLI48 foram eficazes na redução da severidade da doença, em comparação com o controle sem tratamento.

d) Controle de Fusarium oxysporum f. sp. radicis lycopersici em tomates

[099] As plantas de tomate foram preparadas como no Exemplo 7, parágrafo b. Para o preparo do inóculo de patógeno, F. oxysporum f. sp. radicis lycopersici, a cepa FORL foi usada. Placas de ágar PDA foram semeadas 10 dias antes da inoculação do patógeno, e foram incubadas a 23 - ºC com um foto período de 16 h de luz e 8 h de escuro. Uma suspensão do patógeno foi preparada e ajustada para 2,9 x 10 * é conídios/mL. Antes da inoculação do fungo, quatro lesões foram feitas nas raízes da planta usando um bisturi. Cada planta foi inoculada com 10 ml da suspensão de FORL por irrigação. O primeiro tratamento realizado começou quando as terceira e quarta folhas verdadeiras emergiram nas plantas. Os tratamentos foram realizados aos 7 e 1 antes da inoculação do patógeno e 20 ml de cada preparação de cepa foram aplicados por irrigação. Bacillus subtilis QOST713 foi usado como controle. As avaliações de plantas doentes foram feitas a 21 dpi. Um índice foi usado com base na evolução da necrose no caule: 0: nenhuma infecção; 1: a superfície da lesão não alcança o caule; 2: a infecção aumenta ao longo do caule da planta e 3: a planta estava morta. Tal como mostrado na FIGURA 6 (Fox), as cepas AGL148 e AGL225 foram eficazes no controle das infecções.

e) Controle de Botrytis cinerea em tomates

[100] Plantas de tomate foram preparadas como no Exemplo 7, parágrafo c. Para o preparo do inóculo de patógeno, uma cepa de B. cinerea foi utilizada. Placas de ágar PDA foram semeadas 10 dias antes da inoculação do patógeno, e foram incubadas a 23 - 25 ºC com um foto período de 16 h de luz e 8 h de escuro. Uma suspensão do patógeno foi preparada e ajustada para 2,9 x 10 * &€& conídios/mL. Como tratamentos de referência, Serenade MAX (Bacillus subtilis QST713), um produto comercial, foi usado como controle. As plantas foram pulverizadas com a suspensão fúngica até o ponto de escorrimento. As avaliações foram feitas em 7 dias após a inoculação do patógeno (dpi). Um índice de severidade nas folhas foi estabelecido como 0, nenhuma afetada; 1, menos do que 25 % da superfície; 2, 25 a menos do que 50 %; 3, 50 a menos do que 75 %; 4, mais do que 75 %.

[101] A FIGURA 6 (Bc) mostra que as cepas AGL148 e AGL225 foram altamente eficazes, bem como BB. subtilis QST713.

£f) Controle de Sclerotinia sclerotiorum em alface

[102] As sementes de alface foram semeadas em alvéolos e 15 - 21 dias depois foram transplantadas para vasos. Os tratamentos foram realizados aos 7 e 1 dia antes da inoculação do patógeno. Como tratamentos de referência, Serenade MAX (Bacillus subtilis QST713) e S. saraceticus SS31 foram utilizadas como controle. O fungo fitopatogênico S. sclerotiorum foi cultivado em frascos Erlenmeyer de 250 ml com 25 g de semente de centeio autoclavada e 25 ml de água destilada. A inoculação do patógeno nas plantas foi realizada 21 dia após a semeadura e cada planta foi infectada com uma semente de centeio infestada. As avaliações foram realizadas aos 3 e 7 dias após a inoculação do patógeno (dpi). Um índice de severidade foi estabelecido como 0: uma planta saudável; 1: murcha da raiz até a coroa; 2: murcha afeta a coroa; 3: a murcha excede a coroa e 4: alface morta. A FIGURA 6 (Ss) mostra que a severidade da doença nos controles não tratados foi bastante alta. As cepas AGLI48 e AGL225 apresentaram um efeito inibitório.

Lista de citações

[103] Aimé. S.; Cordier, C.; Alabouvette, C.; Olivain, c.2008. Análise comparativa da expressão do gene PR em tomates inoculados com Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici virulento and F. oxysporum Fo47 como cepa de biocontrole. Physiol Mol Plant Pathol. 73 (1 - 3): 9 - 15. doi: 10.1016/j.pmpp.2008.10.001.

[104] Ait-Barka E. et al. 31 de março de 2009. Uso de composição compreendendo pelo menos uma cepa de actinomicetos para o controle de micro-organismos que induzem doenças vegetais, em que as cepas de actinomicetos são diferentes de Streptomyces melanosporofaciens. WO 2010115802 Al.

[105] Beaulieu C. et al. 8 de dezembro 2003. Cepas produtoras de geldamicina, usos das mesmas e métodos de produção das mesmas. US 2007/0237755 Al.

[106] Bervanakis, G. 2008. Detecção e Expressão de genes biossintéticos em actinobactérias. Tese para O grau de Mestrado em Ciências. Universidade de Flinders.

[107] Bonaterra, A.; Camps, J.; Montesinos, E.

2005. o acúmulo de trehalose e betaína glicina osmoticamente induzida melhora a tolerância à dessecação, à sobrevivência e a eficácia do agente de biocontrole Pantoea agglomerans EPS1I25 após a colheita. FEMS Microbiology Letters. 250: 7 — 15.

[108] Boroujeni, ME; Das, A.; Prashanthi, K.; Suryan, S. e Bhattacharya, S. 2012. Triagem enzimática e impressão digital aleatória de DNA polimórfico amplificado de estreptomicetos de solo isolados no distrito de Wayanad, em Keralda, Índia. Revista de Ciências Biológicas 12 (1): 43 — 50.

[109] Cabrefiga, J., Francés, J., Montesinos, E., Bonaterra, A.. 2011. Melhora da aptidão e eficácia de um agente de biocontrole da praga do fogo por meio de uma melhora nutricional combinada com osmoadaptação. Microbiologia Aplicada e Ambiental 77: 3174 - 3181.

[110] Cabrefiga, J., Francés, J, Montesinos, E., Bonaterra, A. 2014. Melhora de uma formulação seca de Pseudomonas fluorescens EPS62e para o biocontrole da doença da praga do fogo através da combinação da osmoadaptação da cultura com um lioprotetor da liofilização. JJ. Applied Microbiology. 06/2014; DOI: 10.1111/jam.12582.

[111] Dahllôóf, I.; Baillie, H.; Kjelleberg, S&S.

2000. Análise de comunidade microbiana baseada em rpoB: 16585 rRNA evita limitações inerentes na heterogeneidade de genes intraespécies. Appl Environ Microbiol 66: 3376 - 3380.

[112] Frândberg, E.; Schnúrer, J. 1998. Atividade antifúngica de bactérias quitinolíticas isoladas a partir de grãos de cereais armazenados hermeticamente. 127: 121 -

127.

[113] Freeman, BC; e Beattie, GA 2008. Uma visão geral das defesas vegetais contra os patógenos e herbívoros. O instrutor da saúde vegetal. DOI: 10.1094/PHI- 1-2008-0226-01.

[114] Gharaibeh, R.; Saadoun, I.; Mahasneh, A.2003. Características genotípicas e fenotípicas do Streptomyces de solo produtor de antibióticos investigadas por RAPD. J Basic Microbiol. 43 (1): 18 - 27. doi:

10.1002/jobm.200390000.

[115] Kim, BJ; Kim, CJ; Chun, J.; Koh, YH; Lee, SH; Hyun, JW; Cha, CY; Kook, 2004. Análise filogenética dos Streptomyces e Kitasatospora YH gerados com base nas sequências parciais do gene da subunidade B da RNA polimerase (rpoB). Int J Syst Evol Microbiol 54 (2): 593 -

598. doi: 10.1099/ijs.0.02941-0.

[116] Kong, L.; Tzeng, D.; Yang, C..2001. Geração de fragmentos de DNA à base de PCR para a detecção específica de Streptomyces saraceticus N45. Proc. Natl. Sci. 25 (2): 119 — 127.

[117] Kuchna, AJ; Roberts, MA; Knaebel, DB e

Crawford, DL 1998. Isolamento em pequena escala de DNA genômico de micélios ou esporos de Streptomyces. BioTécnicas 24: 452 — 457.

[118] Montesinos, E. e Bonaterra A. 2009. Pesticidas microbianos. Enciclopédia de Microbiologia, Editora: Elsevier Inc., Editores: Schaechter M, páginas 110 —- 120.

[119] Parente, E.; Brienza, C.; Moles, M.; Riccardi, A. 1995. Uma comparação dos métodos para a medida de atividade da bacteriocina. Revista de Métodos Microbiológicos, 22: 95 - 108).

[120] Rintala, H.; Nevalainen, A.; ROnkã, E.; Suutari, M.2001. Iniciadores para PCR direcionados para o gene 168 rRNA para a detecção específica de estreptomicetos. Mol Cell Probes. 15 (6): 337 - 347. doi:

10.1006/mcpr.2001.0379.

[121] Rodriguez-Kabana, R.; Godoy G, Shelby RA.

1983. A determinação da atividade da quitinase no solo: condições para o ensaio e estudos ecológicos. Plant Soil. 106: 95 - 106.

[122] Sambrook, J. e Russell, DW “Clonagem Molecular: um manual de laboratório”, capítulo 13, “Mutagênese”, Cold Spring Harbor, 3º edição, 2001.

[123] Shepherd, MD; Kharel, MK; Bosserman, MA; Rohr, J. 2010. Laboratório de manutenção de espécies de Streptomyces. Curr Protoc Microbiol; capítulo 1: 1 - 10. doi: 10.1002/9780471729259.mcl10e0ls18.Laboratory.

[124] Shirling, EB e Gottlieb D. 1966. Métodos para a caracterização de espécies de Streptomyces. Revista Internacional de Bacteriologia Sistemática. 13: 313 - 340.

[125] Tamura K, Stecher G, Peterson D, Filipski A, e Kumar S (2013) Análise Genética Evolucionária Molecular. Versão 6.0 do programa, Biologia Molecular e Evolução 30: 2725 - 2729.

[126] Tzeng D. et al. 10 de maio de 2005. Formulação de biocontrole contendo Streptomyces Sspb., método para o preparo da formulação e uso relevante. US 2014/0057336 Al.

[127] Williams, JGK; Kubelik, AR; Livak, KL; Rafalski, JA; SV Tingey 1990. Polimorfismos de DNA amplificados por iniciadores arbitrários são úteis como marcadores genéticos. Nucleic Acids Res., 1990, volume 18, páginas 6531 - 6535.

[128] Yoon-Byung D. et al. Novos Streptomyces yatensis CJS-24 KCTC 11107BP ativos contra patógenos fúngicos vegetais e um pesticida microbiano utilizando o mesmo. KR 100869668.

Claims (14)

REIVINDICAÇÕES

1. Cepa Streptomyces melanosporofaciens AGL225 CARACTERIZADA pelo fato de ser identificada na Coleção Espanhola de Culturas Tipo (CECT) como Streptomyces melanosporofaciens CECT9420.

2. Método para a obtenção de células viáveis da cepa Ss. melanosporofaciens AGL225 conforme definida na reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de compreender as etapas de: (1) inocular a cepa AGL225 em um meio de cultura adequado, (ii) submeter o meio de cultura inoculado da etapa (i) a condições adequadas para o crescimento da cepa para produzir uma suspensão celular, as condições compreendendo uma temperatura de 25 a 30 “ºC, pH de 6 a 8 e concentração de oxigênio de 10 a 50 %, (iii) submeter a suspensão celular da etapa (ii) à separação para produzir células viáveis de Ss. melanosporofaciens AGL225 e um sobrenadante contendo metabólito, (iv) coletar as células de S. melanosporofaciens AGL225, e (v) opcionalmente submeter as células obtidas a um processo de desidratação.

3. Sobrenadante de SS. melanosporofaciens AGL225 CARACTERIZADO pelo fato de conter metabólito obtenível por um método compreendendo as etapas (i) - (iii) conforme definido na reivindicação 2 e uma etapa adicional de coleta do sobrenadante.

4, Suspensão celular de S. melanosporofaciens AGL225 obtenível por um método CARACTERIZADO pelo fato de compreender a obtenção de células viáveis de Ss. melanosporofaciens AGL225 por um método conforme definido na reivindicação 2 e ressuspensão das células obtidas para uma densidade desejada em uma solução adequada selecionada a partir de uma solução de tampão e um sobrenadante contendo metabólito conforme definido na reivindicação 3.

5. Extrato livre de células de S. melanosporofaciens AGL225 obtenível por um método CARACTERIZADO pelo fato de compreender a obtenção de células viáveis de Ss. melanosporofaciens AGL225 por um método conforme definido na reivindicação 2 e realização das seguintes etapas: (i) romper as células de S. melanosporofaciens AGL225, (ii) separar o extrato livre de células a partir dos resíduos celulares, (iii) coletar o extrato livre de células, e (iv) opcionalmente submeter o extrato livre de células a um processo de concentração.

6. Composição CARACTERIZADA pelo fato de compreender a cepa S. melanosporofaciens AGL225 conforme definida na reivindicação 1 e um ou mais compostos agricolamente aceitáveis.

7. Composição, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADA pelo fato de um ou mais compostos agricolamente aceitáveis serem selecionados a partir do grupo que consiste em reforçadores de plantas, nutrientes agentes molhantes, compostos que melhoram a aderência, compostos tamponantes, estabilizantes, antioxidantes protetores da osmolaridade e protetores solares.

8. Composição, de acordo com a reivindicação 6,

CARACTERIZADA pelo fato de compreender pelo menos um protetor da osmolaridade.

9. Composição, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADA pelo fato de compreender ainda um pesticida adicional.

10. Composição, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADA pelo fato de o pesticida adicional ser outra cepa bacteriana com atividade fungicida, bactericida e/ou nematicida.

11. Composição, de acordo com a reivindicação 10, CARACTERIZADA pelo fato de a outra cepa bacteriana ser cepa S. yatensis AGL1I48 identificada na Coleção Espanhola de Culturas Tipo como S. yatensis CECT9421.

12. Uso da cepa S. melanosporofaciens AGL225 conforme definida na reivindicação 1 ou da composição conforme definida em qualquer uma das reivindicações de 6 a 11 CARACTERIZADO pelo fato de ser como pesticida em plantas.

13. Uso, de acordo com a reivindicação 12, CARACTERIZADO pelo fato de ser para controle de pragas vegetais causadas por fungos, bactérias ou nematódeos.

14. Método para o controle biológico de pragas vegetais CARACTERIZADO pelo fato de compreender a administração à planta da cepa S. melanosporofaciens AGL225 conforme definido na reivindicação l1 ou uma composição conforme definida em qualquer uma das reivindicações de 6 a

11.