TW201923067A - 含有生黑孢鏈黴菌agl225的組成物於控制植物疾病的用途 - Google Patents

含有生黑孢鏈黴菌agl225的組成物於控制植物疾病的用途 Download PDF

Info

Publication number
TW201923067A
TW201923067A TW107135048A TW107135048A TW201923067A TW 201923067 A TW201923067 A TW 201923067A TW 107135048 A TW107135048 A TW 107135048A TW 107135048 A TW107135048 A TW 107135048A TW 201923067 A TW201923067 A TW 201923067A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
streptomyces
agl225
strain
plant
niger
Prior art date
Application number
TW107135048A
Other languages
English (en)
Inventor
賽格 伊米蘭諾 蒙特席諾斯
羅曼諾 伊瑟 巴多薩
寶恩斯 伊莎貝爾 摩瑞
格西亞 莫里亞 布格
Original Assignee
西班牙商阿格羅拉有限公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 西班牙商阿格羅拉有限公司 filed Critical 西班牙商阿格羅拉有限公司
Publication of TW201923067A publication Critical patent/TW201923067A/zh

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/20—Bacteria; Substances produced thereby or obtained therefrom
    • A01N63/28—Streptomyces
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/465—Streptomyces

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本發明係關於在西班牙典型培養物保存中心（CECT）中鑑別為生黑孢鏈黴菌CECT9420之菌株生黑孢鏈黴菌AGL225、及該菌株作為植物殺有害生物劑之用途。本發明之其他方面係關於菌株生黑孢鏈黴菌AGL225之懸浮液及萃取物及其等之製備方法。另外的方面係關於包含生黑孢鏈黴菌AGL225之殺有害生物組成物。最終，本發明係關於用於生物控制植物有害生物之方法，其包含向該植物投予菌株生黑孢鏈黴菌AGL225、包含該菌株之組成物或自生黑孢鏈黴菌AGL225衍生之無細胞萃取物。

Description

含有生黑孢鏈黴菌AGL225的組成物於控制植物疾病的用途
本發明係關於生物殺有害生物劑之領域，更特定言之係關於生黑孢鏈黴菌（Streptomyces melanosporofaciens ）菌株及其等在生物控制由細菌、真菌及線蟲所致之植物疾病（尤其是在蔬菜作物及水果樹中）之用途。
大規模使用合成殺有害生物劑對環境及對消費者健康狀況之副作用已熟知。由於此等問題，植物疾病之控制傾向於合理使用殺真菌劑及殺菌劑，及施用較小毒性的產品。另外，植物保護適合於有害生物綜合管理（integrated pest management，IPM），從而組合不同方法（物理、機械、化學、生物、遺傳學、法律及文化）。此控制有害生物及疾病之重新定向導致了用於商業化之新穎立法框架及在歐盟之成員國中與在其他國家中使用植物保護產品。此調節旨在減少習知植物保護產品之使用及經由有害生物及疾病綜合管理實現其可持續性，從而表明植物檢疫控制手段應為較佳生物及物理手段。
在此情形下，基於有益於植物之微生物菌株，主要為與其相關之細菌及真菌的生物殺有害生物劑，提供習知合成殺有害生物劑之替代或補充。微生物殺有害生物劑之主要優勢中之一者為其使用使得作物生產不含殘留物，此尤其為其在有機農業生產中得以授權之優勢。然而，與化學殺有害生物劑相比，現在可得到的微生物殺有害生物劑數目小，其中大多數對於由真菌所致之疾病有效但對於細菌性疾病無效。儘管此領域中之研究熱門，但作為商業生物產品之活性成分的大多數微生物菌株會製造毒性次級代謝物，對於植物定殖缺乏適當生態適用性，展示比合成產品小之功效，以及隨時間推移之一定不穩定性，由此使得難以將其調配於持久組成物中。另外，當微生物殺有害生物劑為活的生物體時，環境（溫度、相對濕度、雨等）及宿主條件（植物物種、栽培品種、物候台等）對其生物活性具有強烈影響，從而導致疾病控制效率降低或變化，低於習知化學殺有害生物劑。
許多微生物生物殺有害生物劑之問題為其與習知合成殺有害生物劑不相容，由此限制其用於農業有害生物及疾病綜合管理中。舉例而言，基於諸如木黴菌屬（Trichoderma ）或膠黴屬（Gliocladium ）拮抗菌株之真菌菌株之最具活性的成分對殺真菌劑敏感。在此意義上，細菌之優勢為其對殺真菌劑不敏感且因此與其同時使用相容。
另外，主管機關批准微生物作為生物殺有害生物劑之主要要求中之一者為其生物安全，其藉由諸如環境保護署（Environmental Protection Agency，EPA）或歐洲食物安全署（European Food Safety Authority，EFSA，歐洲）之機構來評估。因此，已因為安全拋棄某些已展示控制有害生物及疾病之功效的微生物，因為對人類或動物可能有機會致病性，如在假單胞菌屬（Pseudomonas ）及泛菌屬（Pantoea ）之某些物種之情況下，此情況在臨床病例中已提及，此為其用作生物殺有害生物劑之障礙。
在微生物生物殺有害生物劑之研發中，亦必須考慮微生物菌株生產工業化以及其調配以具有有長使用壽命之產品之能力。此情況主要藉由由脫水獲得之粉末調配物來實現，但乾燥過程顯著影響微生物、尤其革蘭氏陰性細菌（例如假單胞菌屬）（其比革蘭氏陽性更敏感細菌）之存活力。在產生孢子之鏈黴菌屬（Streptomyces ）及芽孢桿菌屬（Bacillus ）之情況下，適合三組分（無性細胞、孢子及醱酵之代謝物）調配物可在高效能及適合度下在田間作物環境中製備。
在收集所有上文所述優勢之努力中，商業上已研發多種鏈黴菌菌株或相關物種作為生物控制劑，諸如利迪鏈黴菌（Streptomyces lydicus ）WYEC 108及鏈黴菌K61（Montesinos及Bonaterra, 2009）。然而，此等菌株展示主要集中於真菌病原體控制之活性輪廓。已揭示一些鏈黴菌菌株，如對馬鈴薯塊莖病及若干土壤植物病原體具有活性之生黑孢鏈黴菌EF-76（WO2010115802）、對多種真菌性疾病具有活性之耶特鏈黴菌（S.yatensis ） CJS-24 （KR100869668）及具有之抗真菌及殺線蟲活性之薩臘賽鏈黴菌（Streptomyces saracetius ） SS31 （US20140057336）。
因此，仍存在對待用於生物控制有害生物之對植物病原性真菌、細菌及線蟲具有廣泛範圍活性的改良之細菌菌株之需求。
本發明人已自來自植物之根際的天然樣品分離新穎鏈黴菌菌株，其具有使其高度適用於生物有害生物控制之特徵。該菌株之特徵在於出人意料地寬的殺有害生物譜，從而對於控制多種植物病原性真菌及細菌以及線蟲極有效。此菌株亦誘發植物防禦，此進一步增加其於用作生物殺有害生物劑之關注。該菌株亦方便地耐工業加工，具有長儲存期且耐環境壓力。總而言之，此菌株克服尖端技術領域中所述之其他菌株所示之若干限制，如下文所示。
本發明之第一方面因此係關於西班牙典型培養物保存中心（Spanish Type Culture Collection）中鑑別為生黑孢鏈黴菌CECT9420之生黑孢鏈黴菌AGL225菌株。
本發明之菌株生黑孢鏈黴菌AGL225分離自Girona之白楊樹（黑楊（Populus nigra ））之根且由本申請人根據布達佩斯條約在2017年7月18日寄存於位於Universidad de Valencia, Parc Científic Universitat de València, Catedrático Agustín Escardino, 9, 46980 Paterna （Valencia）之西班牙典型培養物保存中心（Colección Española de Cultivos Tipo，CECT）。該生黑孢鏈黴菌菌株以鑑別參考號AGL225寄存且得到寄存編號CECT9420。詳言之，此菌株之特徵在於展示：
（i）在如ISP2（國際鏈黴菌規劃瓊脂（International Streptomyces Project agar））、AIA（放線菌分離瓊脂）、Benedict及SNM（硝酸鹽及澱粉瓊脂）之多種培養基中對於植物病原性真菌及細菌之試管內拮抗活性（表1）。
（ii）對於細菌解澱粉歐文菌（Erwinia amylovora ）、丁香假單胞菌番茄致病變種（Pseudomonas syringae pv. tomato）、丁香假單胞菌獼猴桃致病變種（P . syringae pv. actinidiae）、核桃黃單孢菌桃李致病變種（Xanthomonas arboricola pv. pruni）及真菌灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea ）、尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum ）及膨脹匍柄黴（Stemphylium vesicarium ）之拮抗活性（表1及2）；
（iii）對於模式線蟲秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans ）之幾丁質分解及殺線蟲活性（表1、表4、圖5）。
（iv）具有用於製造II型抗微生物聚酮化合物之基因（act04 ），但無用於胺基醣苷抗生素之基因（圖3）。
（v）菌株於其中生長之培養基一旦不含細胞（生長細胞懸浮液之上清液）即具有由菌株藉由醱酵製造之活性代謝物之獨特HPLC輪廓。此代謝物輪廓為AGL225菌株之特徵，且將其與其他鏈黴菌菌株區分（圖4）。此等代謝物亦具有殺細菌、殺真菌及殺線蟲活性。
（vi）藉由發揮過敏反應以及藉由誘發植物中之防禦基因來誘發天然植物防禦（表3）。
（vii）能夠抑制由梨中之植物病原性細菌解澱粉歐文菌、番茄植物上之丁香假單胞菌番茄致病變種；李屬中之核桃黃單孢菌桃李致病變種；及萵苣中之植物病原性真菌向日葵核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum ）、番茄中之尖孢鐮刀菌番茄根皮病菌（F . oxysporum f. sp.radicis lycopersici ）及番茄中之真菌灰葡萄孢菌所致之感染（圖6）。
AGL225菌株具有同時發揮抗真菌、抗細菌及殺線蟲活性之巨大優勢。另外，此菌株誘發植物之天然防禦機制。鏈黴菌菌株中同時存在此等四個機制具有對於植物保護產品中之單一活性成分將廣大範圍的疾病控制機制集合於一起之優勢。
本發明之菌株對於植物病原性物之高拮抗活性部分為抑制植物病原性細菌及真菌以及線蟲的抗微生物化合物之製造之結果。此等化合物包括聚酮化合物、幾丁質酶及尚未知之具有抗微生物活性之可能的其他化合物。
鏈黴菌之許多菌株（儘管具有抗微生物生物合成基因，如胺基糖苷或聚酮化合物）不具有顯著的對於植物病原性真菌及細菌之拮抗活性。相反，在表1中，可見本發明之菌株生黑孢鏈黴菌AGL225展現廣譜之對於不同植物病原性細菌及對於不同植物病原性真菌之重要拮抗作用，且在四種類型之培養基中出人意料地維持此情況。此情況展示本發明之菌株在抑制由細菌所致感染中之有效性，該等細菌為諸如植物梨中之解澱粉歐文菌、番茄植物中之丁香假單胞菌番茄致病變種及李屬中之核桃黃單孢菌桃李致病變種（GF677）及其他植物病原體（圖6）。另外，出人意料地，菌株AGL225除呈現聚酮生物合成基因（圖3）之外製造對於真菌與線蟲具有活性之幾丁質酶。此殺線蟲活性係在秀麗隱桿線蟲死亡率之分析中用來自培養物之無細胞上清液展示，如實施例6中所述（圖5、表4）。
當與鏈黴菌之其他菌株（參見表1，其中列舉分離之其他鏈黴菌菌株）相比時，此抗微生物輪廓（同時抗細菌及抗真菌）出人意料。另外，有效抗微生物活性被其殺線蟲及植物防禦活性補充，在某種程度上對本發明之菌株而言為特有。
與抗微生物聚酮化合物之合成相關之基因的存在可如實施例5中所述來確定。對於植物病原性真菌及細菌之拮抗活性可如實施例2及3中所述來確定。植物中控制真菌性及細菌性疾病之能力可如實施例7中所述來確定。
該菌株之另一顯著特性為其在菸草植物中產生過敏反應（HR反應）且誘發與番茄植物中之防禦機制相關之基因表現（實施例4、表3）。眾所周知，與植物相關之某些微生物在作為處理施用於根際或於空氣中的部分時可誘發其對於病原體之防禦反應，亦即所謂誘發性系統抗性（ISR）。ISR可藉由菸草植物中之HR反應確定，如實施例4中所揭示。在其他情況下，此等微生物或在其生長期間製造之代謝物（醱酵代謝物）之組分可誘發一類稱為後天性系統抗性（SAR）的反應。SAR可藉由在番茄植物中誘發如Harp 基因或其他基因之防禦基因來確定，如實施例4中所揭示。植物中所誘發之此等防禦機制賦予對藉由多種病原體產生之感染且甚至對諸如乾旱之壓力情形的抗性。存在有在多種植物物種中誘發此等防禦的植物相關細菌之實例，諸如假單胞菌、芽孢桿菌等，但此特性先前在鏈黴菌菌株中尚未被表明。
AGL225菌株亦具有不製造胺基醣苷抗生素之優勢。鏈黴菌菌株為胺基醣苷抗生素之熟知生產者，而此由於安全考量限制其等於有害生物綜合管理（尤其是生物有害生物控制）的用途。AGL225不製造胺基糖苷，因為其缺乏表現此等物質之基因。此示於圖3中。作為替代，AGL225含有合成II型聚酮之生物合成路徑基因（act04 ）（實施例5），其意味製造適用於生物有害生物控制之抗微生物聚酮化合物的能力。
生黑孢鏈黴菌AGL225菌株具有若干優勢，該等優勢使其尤其適用於有害生物綜合控制。在本發明中，術語「有害生物綜合管理（integrated pest management）」具有農學領域中常見之含義，而於農學領域中其應理解為使用多種互補方法的策略：有害生物控制之物理、機械、化學、生物、遺傳學、法律及文化方面。其為旨在減少或消除化學合成殺有害生物劑之使用且使對環境之影響降至最低的生態方法。亦討論生態或生物有害生物控制。因此，在本發明中，術語「有害生物控制」、「生物有害生物控制」可互換使用且係指有害生物綜合控制。
如以下實施例所有效展示，本發明之菌株在預防園藝植物及水果樹中之由不同細菌性及真菌性病原體所致之感染中高度有效。自下文所示之資料亦可推斷，此有效性主要歸因於在植物之於空氣中的器官（葉片、果實及/或花）以及根其對於此等病原體之高拮抗活性。此驚人的能力對於生物有害生物控制極重要。
因此，本發明之另一方面係關於將菌株生黑孢鏈黴菌AGL225用作植物中之殺有害生物劑。
在本發明中，術語「殺有害生物劑」以其在農學領域中之常見含義理解為意欲殺死被視為有害生物之生物體、驅除其等、調節或破壞其生長之產品。顯然，由於菌株生黑孢鏈黴菌AGL225之性質，在本發明中，應理解「殺有害生物劑」為生物或生態殺有害生物劑，亦稱為生物殺有害生物劑。
在另一方面，本發明提供使用菌株生黑孢鏈黴菌AGL225來控制由植物中之細菌、真菌或線蟲所致之疾病。「疾病控制」應理解為預防、治癒或改善由細菌、真菌或線蟲所致之植物疾病。該菌株實現此功效，因為其預防、減少或根除導致疾病之有害生物及/或因為其增強在植物中之天然防禦。在一特殊具體實例中，使用菌株生黑孢鏈黴菌AGL225以控制由細菌、真菌或線蟲所致之植物有害生物。此具體實例亦可表現為使用該菌株作為具有殺細菌、殺真菌及殺線蟲活性之殺有害生物劑。本發明亦提供用於生物控制植物有害生物之方法，其包含向植物投予生黑孢鏈黴菌AGL225菌株。
在一個具體實例中，待處理之植物為園藝或水果樹植物。
鑒於其在植物中作為殺有害生物劑之用途，重要的是能夠自菌株獲得足夠量之活細胞以及醱酵代謝物。如實施例2中所示，該等組成物展示極高存活力，而該存活力在儲存期間、甚至在濃縮及凍乾之後仍維持。
在另一方面，本發明因此係關於獲得如申請專利範圍請求項1所述之生黑孢鏈黴菌AGL225菌株之活細胞之方法，其包含以下步驟：
（i）將AGL225菌株接種於適合的培養基中，
（ii）使步驟（i）之接種之培養基經歷適用於菌株生長之條件以得到細胞懸浮液，
（iii）使步驟（ii）之細胞懸浮液經歷分離以得到生黑孢鏈黴菌AGL225活細胞及含代謝物之上清液，
（iv）收集生黑孢鏈黴菌AGL225細胞，及
（v）視情況使獲得之細胞經歷脫水程序。
本發明之菌株可以1與5%之間的最終濃度接種至液體培養基中。較佳地，待接種之培養物處於指數生長期。較佳使細胞增殖達到最終指數期或穩定期之開始，從而獲得7×10* 8 與2×10* 9 CFU/ml之間的細胞濃度。眾所周知，鏈黴菌菌株產生孢子。此能力對於調配商業生物殺有害生物劑而言係方便的。孢子為高度耐壓力條件的，而此使得含有鏈黴菌之產品易於工業加工、有長保存期及在施用於植物時有高存活率。在本發明之一些具體實例中，將AGL225培養物生長至穩定期或使其經歷壓力條件以獲得孢子。培養物接著可如下所述進一步加工或經由Miracloth（Millipore）過濾器過濾以分離孢子。接著可添加諸如Tween 20之適當溶液以維持均勻孢子懸浮液。在另一方面，本發明亦提供AGL225之孢子。此等孢子可如上文所闡述獲得。
眾所周知，孢子形成一些植物及微生物之生命週期之一部分，因此亦可將其稱為孢子細胞。因此，在下文具體實例中，當條件已適合於其等形成時，術語「細胞」可包括孢子細胞。適用於本發明之菌株生長之培養基為合成培養基，諸如ISP2、AIA、Benedict及SNM。適用於菌株生長之條件為25與30℃之間的溫度、6與8之間的pH值及10與50%之間的氧濃度。本發明之菌株之生長在固體培養基中或在液體培養基中在攪拌下產生。較佳地，使用液體培養基。在液體培養基中獲得本發明之菌株之細胞的詳細程序之實例闡述於實施例2中。對於在固體培養基中製造，可將菌株AGL225接種於具有ISP2瓊脂之培養皿中且在28℃下培育1至2週。在使接種之培養皿經歷適用於菌株生長之條件（例如上文所述條件）之後，由3至4個培養盤用無菌蒸餾水製備40-60 ml懸浮液。
適合的分離技術包括培養物之離心或過濾。藉由執行培養物之離心（例如在最少8000 rpm下），可自培養基（上清液）分離細胞。細胞接著可直接使用，再懸浮至所需密度，經歷脫水或破碎以獲得無細胞萃取物。
可使自以上方法獲得之細胞於適合的溶液（諸如緩衝溶液）中再懸浮至所需密度，例如10* 10 CFU/ml。以此方式，獲得細胞懸浮液。為獲得細胞懸浮液，適合的溶液亦可為已細胞已於其中生長之培養基，亦即由以上步驟（iii）之分離產生之含代謝物之上清液。此可為有利的，因為上清液會含有藉由分離會部分損失之活性代謝物。另一適用於再懸浮細胞之溶液可為使用新鮮培養基。細胞懸浮液亦可藉由包含上文所定義方法之步驟（i）及（ii）之方法而直接獲得，亦即獲自步驟（ii）之細胞懸浮液不經歷分離。以此方式，懸浮液含有由細菌細胞分泌之活性代謝物。直接獲得之懸浮液可藉由所屬技術領域中具有通常知識者已知之任何適合手段濃縮。
在本發明之另一方面，提供可如上文所揭示獲得之AGL225細胞之細胞懸浮液及此細胞懸浮液作為植物之殺有害生物劑（尤其是用於控制由真菌、細菌或線蟲所致之植物有害生物者）的用途。在本發明之一特殊具體實例中，該細胞懸浮液含有活的AGL225細胞、培養基及已由該菌株藉由醱酵培養基製造之活性代謝物。此細胞懸浮液對於調配適合的生物殺有害生物劑而言尤其有利。在另一具體實例中，細胞懸浮液含有再懸浮於新鮮培養基中的活AGL225細胞，較佳為高濃度的（例如高於109 ）。後者的高濃度細胞懸浮液亦可稱為「接種物」且用於當接種至適合的培養基中時獲得菌株之新活細胞。
如已提及的，藉由自培養基分離細胞獲得之上清液含有具有拮抗活性之活性代謝物。因此，本發明之另一方面提供用於獲得含AGL225代謝物之上清液之方法，其包含如上文所定義用於獲得生黑孢鏈黴菌AGL225之活細胞之方法之步驟（i）-（iii）及另一收集上清液之步驟。視情況，所得上清液可藉由任何適合手段（諸如蒸發或超濾）濃縮。另一方面係關於用於獲得含有AGL225代謝物上清液之方法，其由如上文所定義用於獲得生黑孢鏈黴菌AGL225之活細胞之方法之步驟（i）-（iii）、收集由步驟（iii）產生之上清液及視情況濃縮該上清液組成。另一方面提供可藉由此等方法獲得之含AGL225代謝物之上清液以及此含AGL225代謝物之上清液作為植物中之殺有害生物劑（尤其是用於控制由真菌、細菌或線蟲所致之植物有害生物者）之用途。
視情況，藉由上文所定義方法獲得之AGL225細胞可經歷脫水程序。脫水可藉由凍乾方法進行，但漿料亦可藉由流體化床乾燥或藉由霧化來乾燥。就此而言，本發明之菌株之另一有利特性為因為其產生孢子，所以其對常見於工業規模微生物生產中之脫水程序展現高耐受性。本發明因此亦提供可如本文所定義獲得之AGL225菌株之脫水細胞。脫水細胞當然亦可用作植物中之殺有害生物劑（尤其是用於控制由真菌、細菌或線蟲所致之植物有害生物者）。
生黑孢鏈黴菌AGL225之細胞可進一步加工以獲得無細胞萃取物。本發明之另一方面因此提供用於獲得生黑孢鏈黴菌AGL225之無細胞萃取物之方法，其包含使生黑孢鏈黴菌AGL225之細胞經歷：
（i）破碎生黑孢鏈黴菌AGL225之細胞，
（ii）自細胞碎片分離無細胞萃取物，
（iii）收集無細胞萃取物，及
（iv）視情況使無細胞萃取物經歷濃縮程序。
適合的破碎手段對所屬技術領域中具有通常知識者而言係已知且可包括物理破碎（例如凍融或弗氏擠壓（French Press））或化學破碎（例如藉由添加溶菌酶）。適合的分離手段上文已描述。適用於濃縮之程序之非限制性實例為脫水（凍乾噴霧乾燥）、過濾、超濾、沈澱、離心及層析。無細胞萃取物亦可自如上文所定義之細胞懸浮液（較佳係含有含代謝物之上清液）獲得。
另一方面提供可藉由上文所定義之方法獲得之生黑孢鏈黴菌AGL225之無細胞萃取物以及此無細胞萃取物作為植物中之殺有害生物劑（尤其是用於控制由真菌、細菌或線蟲所致之植物有害生物者）之用途。
本發明亦係關於用於生物控制植物有害生物之方法，其包含向植物投予生黑孢鏈黴菌AGL225細胞、脫水AGL225細胞、AGL225之細胞懸浮液、含代謝物之AGL225上清液或無AGL225細胞萃取物，所有均如上文所定義。
鑒於其等在有害生物控制中之用途，通常將殺有害生物劑調配成組成物，該等組成物亦包括適用於其等被設計用於之農業用途之添加劑。本發明之組成物可為固體（包括例如脫水細菌濃縮物）或液體（包括濃縮細菌懸浮液）。因此本發明之另一方面提供包含菌株生黑孢鏈黴菌AGL225及一或多種農業上可接受之化合物的組成物。「農業上可接受之化合物」係指該等適用於農業且在農業使用中一般可接受之化合物及/或物質。一般而言，此類化合物應對人類無毒且較佳應為對環境友善的。
本發明亦提供包含如上文所定義之脫水細胞、細胞懸浮液、含代謝物之上清液、無細胞萃取物或其等之組合連同一或多種農業上可接受之化合物的組成物。在下文中，「本發明之組成物」係指以上提及之組成物（其等皆包含AGL225菌株或自AGL225菌株衍生之產物）中之任一者。
在特殊具體實例中，本發明之組成物可含有用於改良該等菌株於待處理之植物之黏著力的化合物、植物強化化合物、營養物、保濕劑、穩定劑、滲透保護劑、抗氧化劑、防曬劑、緩衝化合物或其等之組合。一些黏著力提高化合物為明膠、澱粉、果膠、海藻酸鹽及各種類型之樹膠（諸如三仙膠）。許多此等化合物亦為保濕劑。防曬劑包括染料，諸如剛果紅。植物強化劑為可有利於作物活力或對病原體或不良環境條件之耐受性的化合物。植物強化劑之非限制性實例為茉莉酸類似物及植物中之某些防禦刺激劑，諸如哈耳派（harpine）、聚葡萄胺糖及海帶多醣。特別地，本發明之組成物含有至少一種滲透保護劑。滲透保護化合物之非限制性實例為甜菜鹼、胺基酸及海藻糖。在若干微生物殺有害生物劑中，已展示生物控制劑對於由若干植物病原體所致之感染之功效藉助於生理學調節（滲透保護劑）及營養增強的改善。舉例而言，已證實藉由用滲壓劑（例如海藻糖）修改調配物，成團泛菌（Pantoea agglomerans ）EPS125的在水壓力下之存活及對於由擴展青黴（Penicillium expansum ）所致之水果之收穫後腐病的疾病控制功效（Bonaterra等人2005）。另外，已藉由營養增強（例如添加甘胺酸、Tween80）及滲壓劑（例如甘胺酸-甜菜鹼）改良螢光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens ）EPS62a控制蘋果及梨樹之火疫病之適合度及功效（Cabrefiga等人 2011，Cabrefiga等人 2014）。
有趣的是，生物控制細菌與滲透劑及/或與特定營養物之組合之效果提供較佳控制功效之協同效應，並且在各試驗之間更一致。
在另一方面，本發明提供包含AGL225菌株及至少一種另外的殺有害生物劑之組成物，該另外的殺有害生物劑不會不利地影響菌株AGL225之活性。在一個具體實例中，該另外的殺有害生物劑為殺細菌劑、殺真菌劑、殺線蟲劑或殺昆蟲劑。在另一具體實例中，該另外的殺有害生物劑為生物殺有害生物劑。在另一具體實例中，該生物殺有害生物劑為具有殺真菌、殺細菌及/或殺線蟲活性之另一細菌菌株。較佳地，該另外的殺有害生物劑為耶特鏈黴菌AGL148。
本發明之另一方面提供上文定義為植物中之殺有害生物劑（尤其是用於控制由真菌、細菌或線蟲所致之植物有害生物者）之組成物中之任一者之用途以及用於生物控制植物有害生物之方法，其包含向植物投予如上文所定義組成物中之任一者。
如同菌株生黑孢鏈黴菌AGL225一樣，本發明人已發現菌株耶特鏈黴菌AGL148展示同時發揮抗真菌、抗細菌及殺線蟲活性之巨大優勢。菌株耶特鏈黴菌AGL148分離自Girona（西班牙）之胡桃樹田野之土壤，且由本申請人根據布達佩斯條約在2017年7月18日寄存於位於Universidad de Valencia, Parc Científic Universitat de València, Catedrático Agustín Escardino, 9, 46980 Paterna （Valencia）之西班牙典型培養物保存中心（CECT）。該耶特鏈黴菌菌株以鑑別參考號AGL148寄存且得到寄存編號CECT9421。
此菌株亦誘發植物中之天然防禦機制。耶特鏈黴菌AGL148之特定拮抗模式與AGL225不同，但提供相同的對於植物保護產品中之單一活性成分將廣大範圍的疾病控制集合於一起之優勢。耶特鏈黴菌AGL148用於生物有害生物控制亦安全，且具有使其尤其適用於工業生物殺有害生物劑生產及使用之特性，諸如孢子形成能力。
因此，本發明亦關於在西班牙典型培養物保存中心（CECT）中鑑別為耶特鏈黴菌CECT9421之耶特鏈黴菌AGL148菌株。如以下實施例中所示，菌株AGL148之特徵在於具有以下特性：
（i）對於細菌解澱粉歐文菌、丁香假單胞菌番茄致病變種、丁香假單胞菌獼猴桃致病變種、核桃黃單孢菌桃李致病變種及真菌灰葡萄孢菌、尖孢鐮刀菌及膨脹匍柄黴之拮抗活性（表1）；
（ii）在諸如ISP2、AIA、Benedict及SNM之多種培養基中之試管內拮抗活性（表1）。
（iii）對於線蟲秀麗隱桿線蟲之幾丁質分解及殺線蟲活性（圖5、表4）。
（iv）具有用於製造II型抗微生物之聚酮化合物之基因（act04 /ACT8 ），但無用於胺基醣苷抗生素之基因（圖3）。
（v）菌株於其中生長之培養基一旦不含細胞（生長細胞懸浮液之上清液）即具有由菌株藉由醱酵製造之活性代謝物之獨特HPLC輪廓。此代謝物輪廓為AGL225菌株之特徵，且將其與其他鏈黴菌菌株區分（圖4）。此等代謝物亦具有殺細菌、殺真菌及殺線蟲活性。
（vi）藉由透過菸草葉片中之滲浸細胞而發揮過敏反應（HR反應）以及藉由在番茄植物中誘發防禦基因Harp 來誘發天然植物防禦（表3）。
（vii）能夠抑制由梨中之植物病原性細菌解澱粉歐文菌、番茄植物上之丁香假單胞菌番茄致病變種；李屬中之核桃黃單孢菌桃李致病變種；及萵苣上之植物病原性真菌向日葵核盤菌、番茄中之尖孢鐮刀菌番茄根皮病菌及番茄中之真菌灰葡萄孢菌所致之感染（圖6）。
上文針對生黑孢鏈黴菌AGL225菌株所述之所有方面及實施方式亦適用於耶特鏈黴菌AGL148菌株。因此，本發明亦提供獲得包含與上文所定義相同的特性之耶特鏈黴菌AGL148細胞（當條件已適合於如上文所闡述之孢子形成時，包括呈孢子形式之細胞或由其等組成）、脫水AGL148細胞、AGL148之細胞懸浮液、含代謝物之AGL148上清液及無AGL148細胞萃取物之方法。本發明亦提供可藉由該等方法獲得之耶特鏈黴菌AGL148細胞、脫水AGL148細胞、AGL148之細胞懸浮液、含代謝物之AGL148上清液及無AGL148細胞萃取物。包含耶特鏈黴菌AGL148細胞、脫水AGL148細胞、AGL148之細胞懸浮液、含代謝物之AGL148上清液、無AGL148細胞萃取物或其等之混合物之組成物亦以與如上文所定義者類似的方式提供。提供菌株AGL148、其衍生物（脫水細胞、細胞懸浮液、含代謝物之上清液或無細胞萃取物）或含有其等之組成物作為植物中之殺有害生物劑（尤其是用於控制由真菌、細菌或線蟲所致之植物有害生物者）之用途。最終，提供用於生物控制植物有害生物之方法，其包含向植物投予菌株AGL148、其衍生物（脫水細胞、細胞懸浮液、含有代謝物之上清液或無細胞萃取物）或含有其等之組成物。上文已針對生黑孢鏈黴菌AGL225所描述之此等方面中之各者之特定實施方式亦適用於與耶特鏈黴菌AGL148菌株相關之方面。此外，如上所指出，當條件已適合於其等形成時，術語「細胞」可包括孢子細胞或由其等組成。
本發明亦關於菌株生黑孢鏈黴菌AGL225及耶特鏈黴菌AGL148之突變體。術語「突變體」係指使用本發明之生黑孢鏈黴菌AGL225或耶特鏈黴菌AGL148作為開始菌株獲得且特徵在於維持上文所述之特性之菌株。根據本發明，菌株之「突變體」亦理解為「變體」。所屬技術領域中之專家會理解使用本發明之菌株作為起始物質，通常可例如藉由自發性突變或定點突變誘發獲得保持本文所述之特徵及相關優勢之突變體。獲得給定細菌菌株之突變體之方法在所屬技術領域中係已知的。實例可見於（Sambrook, J.及Russell, DW 「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」, 第13章, 「Mutagenesis」, Cold Spring Harbor, 第3版, 2001）。
在整個說明書及申請專利範圍中，詞語「包含」及其變化形式並不意欲排除其他技術特徵、添加事物、組分或步驟。另外，詞語「包含」包括「由……組成」之情況。所屬技術領域中具有通常知識者部分自本說明書且部分自本發明之實踐會清楚本發明之其他目標、優勢及特徵。以下實施例及圖式以說明之方式提供且並不意欲限制本發明。另外，本發明涵蓋本文所闡述之特定及較佳實施方式之所有可能組合。
實施例
實施例 1 . 菌株生黑孢鏈黴菌 AGL225 及耶特鏈黴菌 AGL148 之分離及表徵
a ） 製備用於分離鏈黴菌菌株之田間樣品
在2014年7月至9月之幾個月期間進行取樣以用於獲得鏈黴菌之分離物。在所有54個樣品中，採集農田、森林區域及具有極端條件之區域（海岸沙丘）。樣品使用均質機藉由用磷酸鹽緩衝水溶液萃取植物或土壤物質來處理。將獲得之懸浮液稀釋且接種於含有本尼迪克特瓊脂（Benedict's agar）之培養皿上，且在30℃下培育3天。使用具有典型形態鏈黴菌之群落以進一步獲得純培養物。自54個樣品獲得推定鏈黴菌之總計397個分離物。為保存分離物，自在固體培養基上約5天之純培養物藉由刮擦群落及再懸浮於磷酸鹽緩衝液中獲得細胞及孢子懸浮液。接著，將相同體積之懸浮液與40%丙三醇混合。將該體積分配於兩個冷凍管中且在-20℃下24 h之後，將其儲存於-70℃下之超低溫冷凍器中。

b ） 在鏈黴菌屬層面鑑別分離物
為確認分離物屬於鏈黴菌屬，使用基於用對該屬具有特異性之引子（Strep/StrepF及StrepB/StrepE）之PCR之方法（Rintala等人 2001）。各懸浮培養物使用100℃下之熱衝擊15 min而經歷DNA萃取。第一PCR由引子StrepB/StrepF（正向5'-3 'ACAAGCCCTGGAAACGGGGT；SEQ ID NO: 1，反向5'-3' ACGTGTGCAGCCCAAGACA ；SEQ ID NO: 2）及產生陰性擴增之彼等菌株執行，一組新穎PCR由StrepB/StrepE引子（正向5'-3' ACAAGCCCTGGAAACGGGGT；SEQ ID NO: 1，反向5'-3' CACCAGGAATTCCGATCT；SEQ ID NO: 3）執行。若DNA用引子中之任一者擴增，則認為分離物屬於鏈黴菌屬。對於397個分離物，311者最終證實屬於鏈黴菌屬。同時，亦在針對鏈黴菌所描述之多種培養基（ISP2、YEMES及Oatmeal）中及在適用於真菌之馬鈴薯右旋糖瓊脂（PDA）中檢查群落形態（Shirling及Gottlieb, 1996，Scheper等人 2010）。

c ） 試管內拮抗及 幾丁質分解 活性
首先研究屬於鏈黴菌之純培養物中所獲得之分離物之抑制真菌及細菌生長之能力。
使用在ISP2培養基中生長5-7天之鏈黴菌培養物之盤執行拮抗作用分析。將此等盤置放於先前已接種病原體匯合生長之ISP2瓊脂培養皿上（或適用於生長鏈黴菌之其他生長培養基）。研究對於若干植物病原體之拮抗活性。在植物病原性細菌內選擇病原體：解澱粉歐文菌6076，一種導致薔薇科中之火疫病的突變型無毒菌株CFBP1430（法國植物病原性細菌保存中心（French Bacterial Collection of Plant Pathogenic Bacteria）, Angers, France）；丁香假單胞菌番茄致病變種DC3000，其導致番茄中之細菌性斑點；丁香假單胞菌獼猴桃致病變種NCPPB3793 （國家植物病原性細菌保存中心（National Collection of Plant Pathogenic Bacteria）, United Kingdom），其導致獼猴桃中之細菌性潰瘍；核桃黃單孢菌桃李致病變種CFBP 5563，其導致核果樹中之細菌性斑點；及青枯勞爾氏菌（Ralstonia solanaceum ）CECT 125（西班牙典型培養物保存中心, Valencia, Spain），其導致褐腐病或細菌性萎蔫病。作為植物病原性真菌，所選指示劑為：尖孢鐮刀菌番茄專化變種ATCC 201829（美國菌種保存中心（American Type Culture Collection）, USA），其導致番茄中之脈管枯萎；灰葡萄孢菌33759B，其導致許多植物中之灰腐病；及膨脹匍柄黴EPS 26（INTEA, 農業食品技術研究所（Agricultural Food Technology Institute）, Girona），其導致梨及洋蔥上之褐斑病。
一旦將培養皿在30℃下培育若干天，即測定鏈黴菌菌株周圍及目標微生物中生長抑制區域之直徑。使用考量抑制區域直徑之活性指數。對於細菌，使用以下指數：0，無抑制；1，0 cm ＜ IZ ≤ 1 cm；2，1 cm ＜ IZ ≤ 2 cm；3，2 cm ＜ IZ ≤ 3 cm。用於真菌，使用以下標度：0，無抑制；1，0 cm ＜ IZ ≤ 0.6 cm；2，0.6 cm ＜ IZ ≤ 1.2 cm；3，1.2 cm ＜ IZ ≤ 2 cm。
使用幾丁質培養基評定細菌菌株之幾丁質分解活性。製備由補充有作為唯一營養物之幾丁質之礦物質鹽組成的基本培養基（Rodriguez-Kabana等人, 1983；Frändberg及Schnürer, 1998）。培養基含有於1L蒸餾水中之1.5 g/L膠態幾丁質、2.7 g K2 HPO4 ；0.3 g KH2 PO4 、0.7 g MgSO4 •7H2 O、0.5 g NaCl、0.13 g酵母萃取物及20 g瓊脂。將鏈黴菌分離物一式三份拾取於幾丁質瓊脂表面上，且在28℃下培育盤7天。能夠分泌幾丁質酶之群落在其周圍展示透明暈圈。作為幾丁質酶之陽性對照，使用參考菌株螢光假單胞菌BL915。對於281個測試分離物，大多數（247）展示幾丁質活性。明顯，生黑孢鏈黴菌AGL225及耶特鏈黴菌AGL148為活性幾丁質酶生產者，其賦予此等菌株可能的殺線蟲且甚至殺昆蟲活性。
對於311個獲得之鏈黴菌分離物，66者具有不同水準之抗微生物及幾丁質分解活性，且經選擇用於抗微生物活性之更詳細研究。66個所選菌株之第一次篩檢展示八個植物病原性微生物之不同的譜及作用強度。
對於該類型培養基，在ISP2培養基中觀察到與其他培養基（AIA、Benedict、SNM）相比對於真菌與細菌之抗微生物活性增加。在一個群組中，菌株展示抗細菌活性（例如AGL7、AGL113、AGL15），而在另一群組中，其展示主要抗真菌活性（例如AGL148、AGL164、AGL227、AGL219）。出人意料地，菌株AGL225呈現抗細菌活性，同時呈現有效抗真菌活性。所選菌株之實例在表1中給出。

表1. 鏈黴菌屬分離物對於植物病原性細菌（核桃黃單孢菌桃李致病變種、解澱粉歐文菌、丁香假單胞菌番茄致病變種、丁香假單胞菌獼猴桃致病變種、青枯勞爾氏菌）；及植物病原性真菌（膨脹匍柄黴、尖孢鐮刀菌及灰葡萄孢菌）之抗微生物及幾丁質分解活性。結果展示由生長培養基ISP2、AIA、Benedict及SNM獲得之平均細圈（halus）。亦指示幾丁質酶活性。值對應於考量細菌群落周圍細圈或甲殼素細圈之直徑的活性指數（對於各病原體為0至3）。


Xap ，核桃黃單孢菌桃李致病變種；Ea ，解澱粉歐文菌；Pst ，丁香假單胞菌番茄致病變種；Psa ，丁香假單胞菌獼猴桃致病變種；Rs，青枯勞爾氏菌；Sv，膨脹匍柄黴；Fo，尖孢鐮刀菌；Bc，灰葡萄孢菌。

d ） 在物種層面鑑別鏈黴菌菌株
對於311個最初歸類為鏈黴菌之分離物，選擇具有顯著抗微生物活性之66者。使分離物經受16S rDNA及rpoB 基因之部分測序（Ki等人「Structure of a protein-DNA complex essential for DNA spores of Bacillus protection in species』, 2009, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America of the United States of America of the United States of America, 第105卷, 第2806-2811頁）。用擴增16S rDNA之519 bp之片段的引子StrepB/StrepF（Rintala等人 2001）且用產生352 bp擴增子之SRPOF1引子（5'-TCGACCACTTCGGCAACCGC-3'；SEQ ID NO: 4）及SRPOR1（5'-TCGATCGGGCACATGCGGCC-3'；SEQ ID NO: 5）（Kim等人 2001）對來自培養物之DNA執行PCR。
在25 μl含有1倍濃度之緩衝液、3 mM氯化鎂、200 μM dNTP、0.2 μM各引子、2 U Taq聚合酶（Biootols, Spain）及2 μl樣品之最終體積中執行兩種基因之擴增。熱循環儀程式由1個95℃維持5 min之週期、30個95℃維持45 s之週期、60℃維持40 s及在72℃下維持2 min；最終在72℃下擴增10 min及最終維持在4℃下組成。使用來自Biometra（Biometra）之專業TRIO熱循環儀。一旦擴增完成，在經歷75 V電場40 min且用溴化乙錠染色20 min之瓊脂糖凝膠1%中觀察結果。用分子成像器ChemiDoc XRS +（BioRad Laboratories）捕捉影像。純化PCR產物（Qiagen Kit Quiquick純化PCR），DNA濃度調節為50 ng/ml，且使用測序儀ABI PRISMTM 310遺傳分析儀（PE Applied Biosystems, CA, USA）用5 μl DNA及5 μl引子在5μM下執行測序。在DNA股之兩個方向中執行測序。編輯之序列由Chromas 2.4獲得（程式http://downloads.informer.com/chromas/2.4/）且使用程式BioEdit測序編輯器分析並比（http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html）對，且藉由BLAST程式在NCBI資料庫進行同源性測定（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）。
用BLAST程式（GenBank）對16S rDNA之序列分析並不在物種層面明顯區分所有分離物。因此，對RNA聚合酶之β次單元之基因（rpoB ）進行進一步測序（Kim等人 2004），可將其應用於鏈黴菌菌株，且亦適用於譜系學分析（Dahllof等人 2000；Kim等人, 2004）。
對於66個菌株，由GenBank資料庫獲得25個匹配。在25個菌株中之9者中，在兩個鑑別系統（16S rDNA 與rpoB ）之間存在一致性。在屬於鏈黴菌之分離物中，確認最具活性之抗微生物菌株屬於耶特鏈黴菌（AGL148、AGL164及AGL219）或生黑孢鏈黴菌（AGL171及AGL225）。菌株生黑孢鏈黴菌AGL225及耶特鏈黴菌AGL148之序列寄存於GenBank中（菌株AGL225：基因16S rDNA 寄存編號MG008625、基因rpoB 寄存編號MG007902；菌株AGL148：基因16S rDNA 寄存編號MG008626、基因rpoB 寄存編號MG007903）。
此外，用16S rDNA 及rpoB 基因之序列執行系統樹。首先，將其與CLUSTALW程式（http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/）比對以選擇適當片段長度進行分析。由鄰連方法用1000個啟動複本使用MEGA6執行樹枝狀圖（Tamura K等人 2013）。
譜系學分析展示大多數菌株分佈於整個樹枝狀圖中，但存在明顯極均勻且明確定義之由AGL219、AGL225、AGL164、AGL161及AGL148組成之群（圖1）。根據與GenBank資料庫之同源性，菌株AGL148對應於物種耶特鏈黴菌且菌株AGL225對應於生黑孢鏈黴菌。

e ）在 菌株層面區分鏈黴菌分離物
為區分鏈黴菌菌株AGL225及AGL148與鏈黴菌之其他菌株，吾人開始確定其DNA指紋分析輪廓。吾人使用RAPD技術（多晶型DNA之無規擴增）用由使菌株典型化之PCR擴增產生之單短任意引子（8-12個核苷酸）（Williams等人, 1990）。使用一組25個來自田間樣品之菌株及九個參考菌株，包括薩臘賽鏈黴菌SS31。
菌株生長於ISP2液體培養基中5天，且使用QIAamp DNA萃取微型套組遵循製造商之說明書萃取DNA。
為執行RAPD，在第一次測試中使菌株之DNA（25 ng/pl）經受用12個引子擴增：LIT（5'-3'（TGCCGAGCTG；SEQ ID NO: 6，OPA9（5'-3' GGGTAACGCC；SEQ ID NO: 7）、OPA10（5 GTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTT；SEQ ID NO: 8）、OPA2 5'-3）（Kong等人, 2001）''-3' GTGATCGCAG；SEQ ID NO: 9）（Gharaibeh等人, 2003）、OPA B9（5'-3'GGGCGACTAC；SEQ ID NO: 10）（Boroujeni等人 2012））、d8635（5'-3' GAGCGGCCAAAGGGAGCAGAC；SEQ ID NO: 11）（Kutchma等人, 1998）、基因1.80.5（5'-3'ACCCCAGCCG；SEQ ID NO: 12）、基因1.80.7（5'-3' GCACGCCGGA；SEQ ID NO: 13）、2.80.11（5'-3'GCAGCAGCCG；SEQ ID NO: 14）、基因4.80.35（5'-3' CACCTGCCGC；SEQ ID NO: 15）、基因4.80.36（5'-3'GGCCTCCACG；SEQ ID NO: 16）、基因4.80.37（5'-3' CGCCAGGAGC；SEQ ID NO: 17）（Martin等人, 2000）。最佳由引子LIT、d8635及1.80.7提供結果，從而使得有更多條帶。
PCR混合液為25 μl，其中2 μl為菌株之DNA。緩衝液之最終濃度為1倍，MgCl2 2.5 mM，2 mM dNTP，0.4 μM引子及1單位Taq聚合酶。使用具有兩個不同擴增週期（5個37℃之週期及30個55℃之週期）之序列的程式。使用來自Biometra（Biometra）之專業TRIO熱循環儀。一旦擴增完成，在經歷75 V電場60 min且用EtBr染色20 min之瓊脂糖凝膠1.5%中觀察結果。用分子成像器ChemiDoc XRS +（BioRad Laboratories）捕捉結果。用Image Lab v.4（Bi-Rad）程式處理凝膠之影像以計算片段大小（bp）。在三個引子之資料情況下，構建二元矩陣以確定菌株中存在或不存在特定分子量之片段。使用戴斯係數執行相似性之計算，且最終由叢集分析使用UPGMA方法（利用算術平均值之未加權配對組方法）用程式NTSYSpc v2.0執行樹枝狀圖。
圖2展示25個分離物及十個物種薩臘賽鏈黴菌、吸水鏈黴菌、灰綠鏈黴菌、淺紫鏈黴菌、利波曼鏈黴菌、抗生素鏈黴菌、費氏鏈黴菌、婁徹氏鏈黴菌及紫色鏈黴菌之參考菌株之自RAPD模式與LIT、d8635及1.80.7引子之組合導出之由UPGMA方法獲得之樹枝狀圖。可見各菌株，尤其菌株AGL225及AGL148可由RAPD DNA指紋分析區分。因此，本發明之菌株具有不同於其他分離物之特有且獨特RAPD模式，包括不同於集合或不同於商業產品之RAPD模式。

實施例 2 . 製備本發明菌株之培養物及無細胞萃取物 ，以 自培養基獲得細胞懸浮液及萃取物之濃縮物 。
對於AGL225及AGL148菌株之細胞或代謝物之產生，使培養物生長於ISP2盤中。為獲得含有本發明鏈黴菌之醱酵代謝物之培養物的濃縮細胞懸浮液或無細胞上清液，將菌株培養於液體ISP2培養基中1週且在28℃下、在150 rpm下在振盪的同時進行培育。使穩定期中所獲得之物質經歷8000 rpm下之離心15 min。可使含有細胞之集結粒再懸浮於小體積之磷酸鹽緩衝液中，以獲得10* 9 CFU/ml之濃縮細胞懸浮液。濃縮細胞懸浮液可用於其他分析中，如人工感染植物病原體之植物中之疾病控制。
將含有由培養菌株產生之代謝物的來自離心之上清液用於抗微生物活性分析。上清液經由0.45微米孔隙濾波器過濾且將濾液冷凍於-80℃下以用於後續使用。此等萃取物另外藉由凍乾濃縮以獲得固體萃取物，可將其儲存直至使用。在此情況下，使固體材料懸浮於蒸餾水或甲醇中，或可藉由用乙酸乙酯或己烷/氯仿相萃取而經受其組分之萃取/部分純化。可將此類溶離份蒸發且使集結粒再懸浮於甲醇中。所有此等物質均可用於抗微生物或殺線蟲活性分析中，且用於對活性組分之HPLC層析分析。

實施例 3 . 無細胞培養上清液之抗微生物活性
藉由Bioscreen系統（Labsystems）使用100微孔盤分析培養上清液。盤之各孔含有100 μl上清液（直接或在所需稀釋度下）、80魯利亞貝爾塔尼培養液（Luria Bertani broth）（2×）及20 μl核桃黃單孢菌桃李致病變種或尖孢鐮刀菌之孢子的懸浮液。抑制結果轉換為任意單位，如AU ml- 1 。將AU計算為抑制病原體（D）生長之最高稀釋度之倒數，且乘以40（Parente等人 1995）。表2展示六個最佳菌株之結果。AGL13、AGL25及AGL31菌株之上清液對於尖鐮孢菌具有抗真菌活性，且菌株AGL286具有抗細菌活性。然而，AGL148及AGL225菌株之上清液為同時抗細菌且抗真菌的。

表2. 鏈黴菌菌株之培養上清液對於兩種病原體之試管內抗微生物活性（AU ml- 1 ）。

實施例 4 . 誘發植物防禦
a ）菸草植物中之過敏反應（ HR ）
為表明誘發植物中之防禦能力，使用由滲浸菸草植物之葉片組成之技術。此方法量測指示植物對於細胞或萃取物之過敏反應（HR）（Freeman及Beattie, 2008）。在菸草（tobacco/Nicotiana tabacum ）葉片之葉肉中，滲浸39個所選鏈黴菌菌株之懸浮液。對於滲浸，在葉片之反向藉助於皮下注射針進行穿刺。在四種不同植物中用裝入鏈黴菌菌株物質之無針注射器執行滲浸。使用108 cfu/ml之植物病原性細菌丁香假單胞菌EPS94作為陽性對照，且使用水作為陰性對照。在培育植物24-72 h之後，觀察到症狀。HR反應由阻斷限於兩個葉脈與淺棕色乾化組織之間的壞死組成。對於39個測試菌株，10個來自集合之菌株為陽性的（AGL31、AGL214、AGL225、AGL227、AGL260、AGL272、AGL305、AGL148、AGL161、AGL164、AGL171、AGL174、AGL186），尤其耶特鏈黴菌AGL 148及生黑孢鏈黴菌AGL 225。此結果根據菸草葉片中之HR反應指示其誘發植物上之防禦之能力。

b ） 誘發與植物上之防禦或壓力相關之基因的表現
為確定在用AGL225及AGL148菌株處理之菸草植物葉片中觀察到之HR反應歸因於誘發與植物中之防禦反應相關之基因，執行轉錄組研究，在此情況下在番茄植物上執行。使用番茄作為模型植物，因為可獲得關於基因表現之大量研究。
使番茄植物以水耕法生長於惰性基質石棉中（Grodan © Plugs）。在2-3週之後（兩個子葉之物候階段），將秧苗移植於石棉塊（Grodan © Delta）中。在進行測試前，此等秧苗在溫室中適應大致8週。執行用鏈黴菌菌株單次處理且在24小時採集植物物質之樣品（葉片）以繼續進行萃取mRNA。使用刺激植物防禦之用苯并噻二唑進行之參考處理（Bion, Syngenta）作為陽性對照。實驗設計由每次處理9種植物（各三種植物之3個複本）組成。對於自樣品萃取RNA，將三個單株植物之三個幼葉（約30 mg）混合且經兩個球（4 mm直徑硼矽酸鹽）用液氮冷凍，且儲存於-70℃下。樣品用組織研磨機II（Qiagen）使用30 Hz之頻率均質化10 s。mRNA萃取使用Trizol試劑（Invitrogen）來執行。獲得之RNA之定量由Nanodrop系統（NanoDrop quantitated© ND-1000，NanoDrop Technologies）實現。為移除痕量DNA，用DNase（Ambion® TURBO DNA-free™. Live Technologies）處理樣品。隨後，用cDNA反轉錄KITS（Invitrogen）遵循製造商之說明書執行樣品之核酸萃取物之反轉錄（mRNA轉變為cDNA）。最終，對內源性參考基因肌動蛋白（F 5'-3'：CACTGTATGCCAGTGGTCGT，SEQ ID NO 18；R 5'-3'：GACGGAGAATGGCATGTGGA，SEQ ID NO: 19）以及對病原性相關蛋白質之各基因執行qPCR：PR1a （F 5'-3'：TCTTGTGAGGCCCAAAATTC，SEQ ID NO: 20；R 5'-3'：ATAGTCTGGCCTCTCGGACA，SEQ ID NO: 21）（Aime等人 2008）、葡聚糖酶： GluA （F 5'-3'：TCTTGTGAGGCCCAAAATTC，SEQ ID NO: 22；R 5'-3'：ATAGTCTGGCCTCTCGGACA，SEQ ID NO: 23）（Aime等人 2008）、GLUB （F 5'-3'：TTGTCGCCACCAACATTCACA，SEQ ID NO: 24；R 5'-3'：ACCATCTCGCGTGTTCCATC，SEQ ID NO: 25）、幾丁質酶：chia （F 5'-3'：TTCGGCACTGATGGAAGTGG，SEQ ID NO: 26；R 5'-3'：TTTTAAGCTTGCTACACGCGG，SEQ ID NO: 27）、PERAJ （F 5'-3'：AGGCCCATTTTATCCGGTGG，SEQ ID NO: 28；R 5'-3'：GCTAAGGCCACGTCTAGCAA，SEQ ID NO: 29）、PER1 （F 5'3'：TCTTAGCTGTTGCAGCTCGT，SEQ ID NO: 30；R 5'-3'：CTAGTGTATGGCCACCGGAC，SEQ ID NO: 31）、HARP （F 5'-3'：ATTATGGCCCGTCCATTCCG，SEQ ID NO: 32；R 5'-3'：ATGCAATGACTCCGAGGACG，SEQ ID NO: 33）。
在表3中，展示對應於與植物中之防禦反應相關之四種基因之處理對基因表現量（mRNA）之效應。相對於陽性對照（來自Syngenta之Bion）及陰性對照（水）比較AGL148及AGL225菌株之效應。與陰性對照相比，菌株AGL148誘發基因Per AJ 、 Pr 1a 、 Chia A 及Harp 之表現，而菌株AGL225誘發Harp 基因。Bion陽性對照誘發PR1a 、 Chia 及Harp 。因此，可推斷兩種菌株皆誘發植物防禦，但與在AGL225中相比，在AGL148中效應更廣泛且更強烈。

表3. 用菌株AGL225及AGL148處理番茄植物對與防禦反應相關之基因Pr 1a 、Chi A 、Per AJ 及Harp 之表現量（mRNA）之效應。陽性對照（Bion）及陰性（水）對照。
PR1a ，病原性相關蛋白質；ChiA ，幾丁質酶；Per AJ ，過氧化酶；Harp ，超敏蛋白樣誘發蛋白。

實施例 5 . 與菌株活性有關之基因及代謝物
研究藉由鏈黴菌培養物產生醱酵代謝物，因為其與若干微生物生物殺有害生物劑中之生物對照活性相關（Montesinos及Bonaterra 2009）。在鏈黴菌屬中，已描述自胺基糖苷及聚酮化合物群組產生許多抗微生物化合物。鏈黴菌屬可明顯產生次級代謝物，由此使其成員廣泛應用於植物檢疫領域中。

a ） 與抗微生物代謝物之合成有關基因之表徵
為確定藉由菌株產生有益的植物抗微生物代謝物，在對特定代謝輪廓進行化學分析之前執行分子途徑 吾人開始偵測與藉由放線菌產生之生物活性次級代謝物之三個基團之合成相關之基因。使用用於代謝物之生物合成的三對引子以偵測胺基糖苷（strD01f 5'-3'：CTTCGCCATGTATCTCGGCGACAA，SEQ ID NO: 34；strD01r 5'-3'：TGCCGGTGTCCTTCCAGTAG，SEQ ID NO: 35）、II型聚酮化合物（act04f 5'-3'：GATGGTCTCCACCGGCTGC，SEQ ID NO: 36；act06r 5'-3'：GTCTCGTGGCGGTCGTTCTGC，SEQ ID NO: 37）及β-內醯胺（pcb03f 5'-3 '：CGAGTCCTGGTGCTACCTGAACC，SEQ ID NO: 38；pcb03r 5'-3'：TCATCGACACGTCCAGGTGGTC，SEQ ID NO: 39）（Bervanakis, 2008）。遵循與分離物之鑑別及與實施例1段落b）中所述相同的方案萃取來自培養物之DNA。在體積25 μl具有1倍最終濃度之緩衝液、3 mM氯化鎂、200 μM dNTP、0.2 μM各第一引子、2 U Taq聚合酶（Biootols, Spain）及2.5 μl樣品之混合液中執行擴增。熱循環儀程式由1個95℃維持5 min之週期、30個95℃維持45 s之週期、65℃維持45 s及在72℃下維持1 min；最終在72℃下擴增10 min及維持在4℃下之最終階段組成。使用來自Biometra（Biometra）之專業TRIO熱循環儀。藉由電泳在1.5%瓊脂糖凝膠中在90 V電場中分離擴增子40 min。接著，用EtBr染色凝膠20 min。
用分子成像器ChemiDoc XRS +（BioRad Laboratories）捕捉結果。灰色鏈黴菌DSM40236用作存在胺基糖苷生物合成基因之陽性檢查；牡畜鏈黴菌（S.cattleya ）DMS46488（NRRL8057））針對β-內醯胺且黑胡桃鏈黴菌（S.nogalater ）DSM40546針對聚酮化合物。
圖3展示，對於所分析集合中之59個菌株，14個展示胺基醣苷生物合成基因、26個菌株展示聚酮合成基因，而八個菌株具有兩組基因。並無菌株展示用於合成β-內醯胺之基因，且17個菌株並不展示任一基因。菌株AGL225及AGL148僅對於II型聚酮化合物之基因為陽性的。

b ） 醱酵代謝物輪廓
在對三個類型之抗微生物代謝物相關基因分析之後，開始確定由菌株藉由高效液相層析（high performance liquid chromatography，HPLC）產生之代謝物之輪廓。以各菌株之特徵輪廓測定液體培養物中產生之代謝物。特定對AGL225及AGL148菌株進行此測定。ISP2培養基用菌株接種，在28℃下在攪拌下、在攪拌下、在150 rpm下培養一週。過濾培養物且將上清液冷凍於-80℃。用ISP2未接種培養基執行相同程序用作對照。
對培養上清液執行代謝物萃取。萃取程序由己烷（1:1）及乙酸乙酯（1:1）組成，之後蒸發且乙腈再懸浮。在以下條件下分析50 μl各萃取物：流動速率：1.25 ml/min；溶劑：A：水+ 0.1% TFA，B：乙腈+ 0.1% TFA。在220 nm（肽化合物）、254 nm（芳族化合物）、280 nm（酚系化合物）下運作層析圖。使用C18-XF及PFP管柱使得可在層析圖中對菌株AGL148與AGL225之間的多種波長（220、245及280 nm）差別的識別峰進行偵測，其符合所產生之若干代謝物。
若干輪廓可見於圖4中，其展示關於藉由生黑孢鏈黴菌AGL225及耶特鏈黴菌AGL148產生之培養基組分的差別峰。此等輪廓為此類菌株之特徵且為獨特分子指紋，其不同於鏈黴菌之其他菌株。化合物之性質未知但可能為聚酮化合物基因產物，與藉由PCR偵測之此等路徑之基因一致。

實施例 6 . 殺線蟲活性
為確定菌株之殺線蟲活性，使用線蟲秀麗隱桿線蟲WT Bristol N2作為模型線蟲，其為來自隱桿線蟲遺傳中心（Caenorhabditis Genetic Center ， CGC）之野生菌株。線蟲通常生長於大腸桿菌OP50上。用次氯酸鈉（1.5%）處理所得線蟲非均質群體以僅保留卵且去除個體。在用M9緩衝液若干次洗滌之後，吾人進行卵孵化，將其轉移至具有大腸桿菌OP50作為食物之培養基NMG，且培育直至L2階段。在此階段，在固體上及液體培養基中進行存活率分析。在固體培養基上之測試中，將對應鏈黴菌菌株接種於NMG，而非大腸桿菌OP50中。在生長12天之後，將L2階段線蟲存放。作為陽性對照（病原體對照），使用腸道沙門氏菌腸道亞種（S.enterica subsp . enterica ）菌株ATCC14028（CECT4594）及LT2（CECT4085）。在液體培養基中，在微定量盤中測試如上文所述藉由離心獲得之鏈黴菌菌株之培養上清液。測試由將1 ml培養上清液及30微升具有線蟲懸浮液（75-100個個體）之NMG存放於各微定量盤孔中組成。將新鮮NMG、ISP2培養基及M9緩衝液用作陰性對照，且將殺生物疊氮化鈉用作殺線蟲對照。在23℃下培育盤且測定存活24及48 h之個體。使用立體顯微鏡（SMZ NIKON 1000）觀察線蟲。量測線蟲之長度及形狀，且死亡線蟲呈現直線形態，而曲線狀且移動的個體視為存活的。
鏈黴菌菌株之細胞單獨並不明顯影響固體培養基上進行之測試中之線蟲之存活率，而病原性沙門氏菌屬之兩個菌株導致死亡率。然而，來自生黑孢鏈黴菌AGL225及耶特鏈黴菌AGL148之無細胞培養物之上清液具有強殺線蟲效應（圖5、表4）。注意到，亦在高劑量下，線蟲個體之一部分溶解且實際上不可識別。此效應歸因於幾丁質酶及許多藉由鏈黴菌菌株產生之線蟲毒性代謝物之可能作用。在應用於植物保護中之情況下，此類特性可視為對於將菌株用作生物殺線蟲劑重要。

表4. 生黑孢鏈黴菌AGL225及耶特鏈黴菌AGL148之殺線蟲活性。

實施例 7 . 本發明菌株在控制植物中之細菌性及真菌性感染中之有效性
為表明本發明菌株之有效性，在控制之環境條件（溫室）中在涉及植物病原性細菌與植物病原性真菌之若干代表性病原系統（作物植物及病原體）上執行若干測試。細菌性病原系統為GF677（杏仁與桃之雜交砧木）中之核桃黃單孢菌桃李致病變種（Xap）、番茄中之丁香假單胞菌番茄致病變種（Pto）及梨上之解澱粉歐文菌。在真菌病原系統之情況下，使用萵苣上之向日葵核盤菌、番茄中之灰葡萄孢菌及番茄中之尖孢鐮刀菌番茄根皮病菌（Forl）。結果示於圖6中。
對於處理之製備，將鏈黴菌菌株接種於ISP2中且在28℃下培育五天，以獲得營養細胞、孢子及醱酵代謝物。如上文在實施例2中所述製備菌株於無菌蒸餾水中之懸浮液。視分析而定，活體計數為3-4×10* 8 cfu/ml。

a ） 控制李屬中之核桃黃單孢菌桃李 致病變種
當呈現6至7片葉片之間時，使用GF667李屬砧木植物，一種杏仁及桃雜交物（扁桃與水蜜桃雜交物）。實驗設計由各處理每次重複時3種植物之3個複本組成。在接種病原體之前7及1天，用噴槍施用鏈黴菌菌株處理直至滴點。將薩臘賽鏈黴菌SS31用作參考對照。將病原體核桃黃單孢菌桃李致病變種菌株5563接種於LB瓊脂盤之表面上且在28℃下培育且由培育24 h之盤製備接種物。將病原體之懸浮液調節至大致6.8×10* 7 cfu/ml之濃度。植物內之所有葉片藉由用噴槍噴塗直至溢流點來接種。一旦接種，即將植物置放於塑膠袋中48 h，以促進感染過程，且接著在26 ± 2℃、在60%之相對濕度及16 h白天光亮下及15±2℃、80% RH及8 h黑暗下隔夜培育。在病原體接種後15天（dpi）進行評定，基於葉片受影響面積指定疾病指數。0：無症狀；1，葉片面積之0至25%；2，葉片面積之25-50%，3，葉片面積之50至75%；及4，高於75%。
圖6（Xap）展示用作為參考對照的薩臘賽鏈黴菌SS31以及用本發明之鏈黴菌菌株處理之效應。相對於未處理對照，AGL148及AGL225菌株有效且明顯減小感染之嚴重程度。

b ） 控制梨上之解澱粉歐文菌
用自生根且生長於盆中之栽培品種會（CAV純系）之2年齡梨植物進行此測試。實驗設計由各處理每次重複時3種植物之三個複本組成。在此測試中，在病原體接種之前7及1天施用處理。在上部較新葉片（3-4片葉片/植物）中用噴槍至滴點執行菌株處理。在處理之前一天，植物在葉片之主脈製造切口。處理由鏈黴菌菌株組成。所用病原體菌株為解澱粉歐文菌EPS101，將其解凍且保持於28℃下培育之新鮮LB瓊脂盤中繼代培養。製備新鮮接種物以用於以3.5×107 cfu/ml之劑量感染。藉由將一滴10 μl施用於各傷口中執行解澱粉歐文菌接種。一旦接種，即將植物置放於塑膠袋中以促進感染過程，且使病原體保持隔離。在5、7及12 dpi下，使用基於植物中之壞死進展的0至4之指數執行疾病之評定：0：無感染；1：開始傷口外壞死；2：開始葉片神經壞死；3：壞死達到葉柄，及4：由葉片至嫩芽壞死。圖6（Ea）展示與未處理對照相比菌株AGL225明顯減小感染程度。

c ） 控制番茄植物中之丁香假單胞菌 番茄致病變種
為獲得番茄植物，將Rio Grande品種種子播種於小窩中且在15-21天後移植至盆中。溫室中之條件為在25±2℃下16 h光亮及在15±2℃下8 h黑暗。實驗設計由各處理每次重複時3種植物之3個複本組成。將丁香假單胞菌番茄致病變種（Pst）DC3000菌株用作病原體。對於接種物製備，將群落解凍且保持於28℃下培育24 h之新鮮LB盤中。製備水懸浮液且調節至大致10* 8 cfu/ml。接種物補充有矽藻土（1 g/L）以有助於葉片微創且因此發生感染。各植物用噴槍直至滴點進行接種，在25±2℃、60%之相對濕度及16 h白天光亮下及15±2℃、80% RH及8 h夜晚黑暗下培育。
當第三及第四片真葉出現時處理開始，且在病原體接種之前7及1天進行。使用枯草桿菌QST713作為對照。在7 dpi下進行評定且視受影響葉片面積根據以下指數來評級，0，偵測到無症狀；1，小於25%之面積受影響，2，25-50%葉片面積受影響；3，50-75%葉片面積受影響；及4，高於75%之面積受影響。除塞倫德（Serenade）外之所有處理展示Pst感染之嚴重程度減小（圖6 Pst）。與未處理對照相比，AGL148及AGL225菌株有效減小疾病之嚴重程度。

d ） 控制番茄中之尖孢鐮刀菌番茄根皮病菌
番茄植物如實施例7段落b中來製備。對於病原體接種物製備，使用尖孢鐮刀菌番茄根皮病菌，FORL菌株。PDA瓊脂盤在接種病原體前10天接種，且在23-25℃下16 h光亮及8 h黑暗之光週期下培育。製備病原體之懸浮液且調節至2.9×10* 6 個分生孢子/毫升。在接種真菌之前，使用刮刀在植物之根上製造四種病變。各植物藉由灌溉接種10 ml FORL之懸浮液。當植物中第三及第四片真葉出現時，開始執行第一處理。在病原體接種之前7及1執行處理且藉由澆水施用20 ml各菌株製劑。使用枯草桿菌QST713作為對照。在21 dpi進行病變植物之評定。指數基於莖幹中之壞死演變使用：0：無感染；1：病變表面未達到莖幹；2：感染增長遍及植物之莖幹，及3：植物死亡。如圖6（Fox）中所示，AGL148及AGL225菌株有效控制感染。

e ） 控制番茄上之灰葡萄孢菌
番茄植物如實施例7段落c中來製備。對於病原體接種物製備，使用灰葡萄孢菌菌株。PDA瓊脂盤在接種病原體前10天接種，且在23-25℃下16 h光亮及8 h黑暗之光週期下培育。製備病原體之懸浮液且調節至2.9×106 個分生孢子/毫升。作為參考處理，使用塞倫德MAX（枯草桿菌QST713 ）（一種市售產品）作為對照。用真菌性懸浮液噴霧植物直至溢流點。在病原體接種之後7天（dpi）進行評定。葉片中之嚴重程度指數確定為0，非感染；1，小於25%之表面；2，25至小於50%；3，50至小於75%；4，超過75%。
圖6（Bc）展示菌株AGL148及AGL225以及枯草桿菌QST713高度有效。

f ） 控制萵苣上之向日葵核盤菌
將萵苣種子播種於小窩中且15-21天之後移植至盆中。在接種病原體之前7及1天執行處理。作為參考處理，使用塞倫德MAX（枯草桿菌QST713）及薩臘賽鏈黴菌SS31作為對照。植物病原性真菌向日葵核盤菌在具有25 g熱壓處理之粗麥種子及25 ml蒸餾水之250 ml愛倫美氏燒瓶（Erlenmeyer flask）中培養。在播種之後21天將病原體接種至植物且各植物用一種經感染之粗麥種子感染。在病原體接種之後3及7天（dpi）進行評定。嚴重程度指數確定為0：健康植物；1：根腐病達至冠部；2：腐病影響冠部；3：腐病超過冠部，及4：萵苣死亡。圖6（Ss）展示非處理對照中之疾病之嚴重程度相當高。菌株AGL148及AGL225具有抑制作用。

引用清單
Aimé. S.; Cordier, C.; Alabouvette, C.; Olivain, c.2008. Comparative analysis of PR gene expression in tomato Inoculated With virulent Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici and F. oxysporum Fo47 the biocontrol strain.Physiol Mol Plant Pathol . 73 (1-3): 9-15. doi: 10.1016 / j.pmpp.2008.10.001。
Ait-Barka E.等人 31.3.2009. Use of composition comprising at least one actynomicetes strains for control of miro organimsms inducing plant disease, where actinomycetes strains are different fromStreptomyces melanosporofaciens. WO2010115802-A1。
Beaulieu C.等人 8.12.2003. Geldamycin-producing strains, uses thereof and methods of producing same. US2007/0237755-A1。
Bervanakis, G. 2008. Detection and Expression of Biosynthetic Genes in Actinobacteria. Thesis for the degree of Master of Science. Flinders University。
Bonaterra, A.; Camps, J.; Montesinos, E. 2005. Osmotically induced trehalose and glycine betaine accumulation improves tolerance to desiccation, survival and efficacy of the postharvest biocontrol agentPantoea agglomerans EPS125. FEMS Microbiology Letters. 250:7-15。
Boroujeni, ME; Das, A.; Prashanthi, K.; Suryan, S.及Bhattacharya, S. 2012. Enzymatic screening and random amplified polymorphic DNA fingerprinting of soil streptomyces isolated from Wayanad district in Keralda, India. Journal of Biological Sciences 12 (1): 43-50。
Cabrefiga, J., Francés, J., Montesinos, E., Bonaterra, A.. 2011. Improvement of fitness and efficacy of a fire blight biocontrol agent via nutritional enhancement combined with osmoadaptation. Applied and Environmental Microbiology77 : 3174-3181。
Cabrefiga, J., Francés, J, Montesinos,E., Bonaterra, A. 2014. Improvement of a dry formulation ofPseudomonas fluorescens EPS62e for fire blight disease biocontrol by combination of culture osmoadaptation with a freeze-drying lyoprotectant. J. Applied Microbiology. 06/2014; DOI: 10.1111/jam.12582。
Dahllöf, I.; Baillie, H.; Kjelleberg, S. 2000. rpoB-based microbial community analysis 16S rRNA Avoids limitations inherent in intraspecies gene heterogeneity.Appl Environ Microbiol 66 : 3376-3380。
Frändberg, E.; Schnurer, J. 1998. Antifungal activity of chitinolytic bacteria isolated from cereal grain stored airtight. 127: 121-127。
Freeman, BC及Beattie, GA 2008. An Overview of Plant Defenses Against Pathogens and Herbivores. The Plant Health instructor. DOI: 10.1094 / PHI-I-2008-0226-01。
Gharaibeh, R.; Saadoun, I.; Mahasneh, A.2003. Genotypic and phenotypic Characteristics of antibiotic-producing Streptomyces soil Investigated by RAPD.J Basic Microbiol . 43 (1) : 18-27. doi: 10.1002 / jobm.200390000。
Kim, BJ; Kim, CJ; Chun, J.; Koh, YH; Lee, SH; Hyun, JW; Cha, CY; Kook, 2004. Phylogenetic analysis of the generated YH Streptomyces and Kitasatospora based on partial RNA polymerase β-subunit gene (rpoB) sequences.Int J Syst Evol Microbiol 54 (2) : 593-598. doi: 10.1099 / ijs.0.02941-0。
Kong, L.; Tzeng, D.; Yang, C. .2001. Generation of PCR-based DNA Fragments for Specific Detection of Streptomyces saraceticus N45. Proc. Natl. Sci. 25 (2): 119-127。
Kuchma, AJ; Roberts, MA; Knaebel, DB及Crawford, DL 1998.- Small-scale isolation of genomic DNA fromStreptomyces mycelia or spores. BioTechniques 24: 452-457。
Montesinos, E.及Bonaterra A. 2009. Microbial pesticides. Encyclopedia of Microbiology, 出版商：Elsevier公司，編者：Schaechter M，第110-120頁。
Parente, E.; Brienza, C.; Moles, M.; Riccardi, A. 1995. A comparison of methods for the measurement of bacteriocin activity. Journal of Microbiological Methods, 22: 95-108)。
Rintala, H.; Nevalainen, A.; Rönkä, E.; Suutari, M.2001. PCR primers targeting the 16S rRNA gene for the specific detection of streptomycetes.Mol Cell Probes . 15 (6): 337347. doi: 10.1006 / mcpr.2001.0379。
Rodriguez-Kabana, R.; Godoy G, Shelby RA. 1983. The determination of soil chitinase activity: Conditions for assay and ecological studies. Plant Soil. 106: 95-106。
Sambrook, J.及Russell, DW 「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」, 第13章, 「Mutagenesis」, Cold Spring Harbor, 第3版, 2001。
Shepherd, MD; Kharel, MK; Bosserman, MA; Rohr, J. 2010. Laboratory maintenance of Streptomyces species.Curr Protoc Microbiol ; 第1章：1-10. . doi: 10.1002 / 9780471729259.mc10e01s18.Laboratory。
Shirling, EB及Gottlieb D. 1966. Methods for characterization ofStreptomyces species. International Journal of Systematic Bacteriology. 13: 313-340。
Tamura K, Stecher G, Peterson D, Filipski A及Kumar S (2013) Molecular Evolutionary Genetics Analysis Version 6.0 program, Molecular Biology and Evolution 30 : 27252729。
Tzeng D.等人. 10.5.2005. Biocontrol formulation containingStreptomyces spp., method for preparing the formulation and relevant use. US20140057336 A1。
Williams, JGK; Kubelik, AR; Livak, KL; Rafalski, JA; SV Tingey 1990. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers」, Nucleic Acids Res., 1990, 第18卷, 第6531-6535頁)。
Yoon-Byung D.等人 A novelStreptomyces yatensis CJS-24 KCTC 11107BP active against plant fungal pathogens and a microbial pesticide using the same.
KR100869668。
無
圖1. 使用鏈黴菌菌株之rpoB 及16S rRNA 基因之部分序列獲得之系統樹。菌株AGL225及AGL148以耶特鏈黴菌/ 生黑孢鏈黴菌出現於樹枝狀圖之上半部分中。使用戴斯（Dice）及鄰連方法構建樹枝狀圖。
圖2. 由RAPD模式獲得之鏈黴菌分離物之樹枝狀圖。使用戴斯係數及UPGMA分組計算距離矩陣。使用由LTI、d8635及1.80.7引子獲得之RAPD模式組合各菌株之資料。所示菌株包括此研究中所獲得之鏈黴菌之25種分離物及來自參考集合之九種菌株（薩臘賽鏈黴菌（S . saraceticus ）、吸水鏈黴菌（S . hygroscopicus ）、灰綠鏈黴菌（S . griseoviridis ）、淺紫鏈黴菌（S . violascens ）、利波曼鏈黴菌（S . lipmanii ）、抗生素鏈黴菌（S . antibioticus ）、費氏鏈黴菌（S . fradiae ）、婁徹氏鏈黴菌（S . rochei ）及紫色鏈黴菌（S . violasceus ）。指出菌株AGL225及AGL148。
圖3. 在鏈黴菌屬菌株中存在不同類型代謝物（胺基糖苷、聚酮化合物及β-內醯胺）之生物合成路徑基因。偵測藉由PCR擴增執行。圓形外之菌株為在用於三種路徑基因之引子中之任一者下均無擴增產物之菌株。
圖4.鏈黴菌菌株在C18管柱Kinetex 250中（左圖）或在C18-XB管柱中（右圖）之層析曲線（HPLC）。左圖：ISP2新鮮培養基（A）、菌株耶特鏈黴菌AGL148之萃取物（B）及菌株生黑孢鏈黴菌AGL225之萃取物（C）。右圖：ISP2新鮮培養基（A）、菌株耶特鏈黴菌AGL148之萃取物（B）及菌株生黑孢鏈黴菌AGL225之萃取物（C），與菌株鏈黴菌屬AGL260（D）相比。Y軸展示收集溶離份中之各者之吸收（mAU=毫吸收單位），且X軸為溶離時間（以分鐘計）。
圖5. 在用來自鏈黴菌菌株於ISP2培養基中之培養物之上清液處理之後，對秀麗隱桿線蟲之殺線蟲活性。具有大腸桿菌OP50之M9緩衝液對照（A）、疊氮化鈉（B，控制死亡率）、AGL148（C）及AGL225（D）之上清液。應注意，直線線蟲對應於殺死的，且彎曲線蟲對應於存活個體。
圖6. 用菌株鏈黴菌AGL225及AGL148處理在由李屬桃雜交杏仁GF677中之核桃黃單孢菌桃李致病變種（Xap）、梨上之解澱粉歐文菌（Ea）、番茄中之丁香假單胞菌番茄致病變種（Pst）、番茄中之尖孢鐮刀菌番茄專化變種（F . oxysporum f . sp . lycopersici ）（Fox）、番茄中之灰葡萄孢菌（Bc）及萵苣上之向日葵核盤菌（Ss）所致之控制感染中之效應。將結果與未處理（NTC）對照相比。 Y軸表示疾病嚴重程度。X軸表示菌株編碼。將QST713（枯草桿菌）及Ss31（薩臘賽鏈黴菌）菌株用作參考生物控制。數值為三個複本之平均值，且誤差條表示平均值之95%置信區間。Nd：未測定。

Claims (14)

  1. 一種生黑孢鏈黴菌（Streptomyces melanosporofaciens ）菌株AGL225，其在西班牙典型培養物保存中心（Spanish Type Culture Collection，CECT）中鑑別為生黑孢鏈黴菌CECT9420。
  2. 一種用於獲得如請求項1所述之生黑孢鏈黴菌AGL225菌株之活細胞的方法，其包含以下步驟： （i）將該AGL225菌株接種於適合的培養基中， （ii）使步驟（i）之接種之培養基經歷適用於該菌株生長之條件以得到細胞懸浮液，該等條件包含25至30℃之溫度、6至8之pH、及10至50%之氧濃度， （iii）使步驟（ii）之細胞懸浮液經歷分離以得到生黑孢鏈黴菌AGL225活細胞及含代謝物之上清液， （iv）收集生黑孢鏈黴菌AGL225細胞，及 （v）視情況使獲得之細胞經歷脫水程序。
  3. 一種含生黑孢鏈黴菌AGL225代謝物之上清液，其可藉由包含以下之方法獲得：如請求項2中所定義之步驟（i）-（iii）及另一收集該上清液之步驟。
  4. 一種生黑孢鏈黴菌AGL225細胞懸浮液，其可藉由包含以下之方法獲得：藉由如請求項2所述之方法獲得生黑孢鏈黴菌AGL225之活細胞及使獲得之細胞再懸浮於選自緩衝溶液及如請求項3所述之含代謝物之上清液的適合溶液中達至所需密度。
  5. 一種生黑孢鏈黴菌AGL225之無細胞萃取物，其可藉由包含以下之方法獲得：藉由如請求項2所述之方法獲得生黑孢鏈黴菌AGL225之活細胞及執行以下步驟： （i）破碎生黑孢鏈黴菌AGL225之細胞， （ii）自細胞碎片分離無細胞萃取物， （iii）收集該無細胞萃取物，及 （iv）視情況使該無細胞萃取物經歷濃縮程序。
  6. 一種組成物，包含如請求項1所述之菌株生黑孢鏈黴菌AGL225及一或多種農業上可接受之化合物。
  7. 如請求項6所述之組成物，其中該一或多種農業上可接受之化合物選自由以下組成之群：植物增強劑（plant strengthener）、營養物、潤濕劑、改良黏著力之化合物、緩衝化合物、穩定劑、抗氧化劑、滲透保護劑及日光保護劑。
  8. 如請求項6所述之組成物，其包含至少一種滲透保護劑。
  9. 如請求項6所述之組成物，其進一步包含另外的殺有害生物劑。
  10. 如請求項9所述之組成物，其中該另外的殺有害生物劑為具有殺真菌、殺細菌及/或殺線蟲活性之另一細菌菌株。
  11. 如請求項10所述之組成物，其中該另一細菌菌株為在西班牙典型培養物保存中心中鑑別為耶特鏈黴菌(S. yatensis)CECT9421之耶特鏈黴菌AGL148菌株。
  12. 一種如請求項1所述之菌株生黑孢鏈黴菌AGL225或如請求項6至11中任一項所述之組成物之用途，其用作植物中之殺有害生物劑。
  13. 如請求項12所述之用途，其用於控制由真菌、細菌或線蟲所致之植物有害生物。
  14. 一種用於生物控制植物有害生物之方法，其包含向該植物投予如請求項1所述之菌株生黑孢鏈黴菌AGL225或如請求項6至11中任一項所述之組成物。
TW107135048A 2017-10-06 2018-10-04 含有生黑孢鏈黴菌agl225的組成物於控制植物疾病的用途 TW201923067A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP17382669.4 2017-10-06
EP17382669.4A EP3467097A1 (en) 2017-10-06 2017-10-06 Use of compositions containing streptomyces melanosporofaciens agl225 in controlling plant diseases

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TW201923067A true TW201923067A (zh) 2019-06-16

Family

ID=60162164

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW107135048A TW201923067A (zh) 2017-10-06 2018-10-04 含有生黑孢鏈黴菌agl225的組成物於控制植物疾病的用途

Country Status (13)

Country Link
US (1) US11390844B2 (zh)
EP (2) EP3467097A1 (zh)
JP (1) JP2020535841A (zh)
KR (1) KR20200067163A (zh)
BR (1) BR112020006366A2 (zh)
CL (1) CL2020000866A1 (zh)
CO (1) CO2020005593A2 (zh)
EC (1) ECSP20024456A (zh)
MA (1) MA50612A (zh)
MX (1) MX2020003833A (zh)
PE (1) PE20210463A1 (zh)
TW (1) TW201923067A (zh)
WO (1) WO2019068887A1 (zh)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3962273B1 (en) * 2019-05-24 2024-01-03 Danstar Ferment Ag Composition and method for enhancing spore germination and biological efficacy
WO2022004515A1 (ja) * 2020-06-29 2022-01-06 住友化学株式会社 ラクトバチルス属に属する新規微生物、並びにラルストニア・ソラナケアルムまたはラルストニア・シュードソラナケアルムによる植物病害に対する防除剤および防除方法
ES2900384B2 (es) * 2020-09-16 2022-08-01 Desarrollo Agricola Y Minero S A Cepa del genero streptomyces y usos en agricultura
EP4355080A1 (en) * 2021-06-17 2024-04-24 Aphea.bio NV Broad spectrum pathogen control in plants
CN113801823B (zh) * 2021-10-12 2023-05-23 贵州省草业研究所 一种利用微生物菌剂提高牧草抗病性的方法和用途
CN116694485B (zh) * 2023-08-07 2023-11-10 南京农业大学三亚研究院 一种胶孢炭疽菌及其胞外多糖作为植物免疫诱抗剂的应用

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7294501B2 (en) 2003-12-08 2007-11-13 Universite De Sherbrooke Geldanamycin-producing strains, uses thereof and methods of producing same
US20070148755A1 (en) 2005-05-10 2007-06-28 National Chung Hsing University Biocontrol formulation containing streptomyces spp., method for preparing the formulation and relevant use
KR100869668B1 (ko) 2007-08-22 2008-11-21 한국생명공학연구원 식물병원성 진균에 대한 항균활성을 가지는스트렙토마이세스 야텐시스 ｃｊｓ-24 ｋｃｔｃ 11107ｂｐ및 이를 이용한 미생물 제제
WO2010115802A1 (en) 2009-03-31 2010-10-14 Universite De Reims Champagne-Ardenne New actinomycetes strain compositions and their use for the prevention and/or the control of micro organism inducing plant diseases

Also Published As

Publication number Publication date
CO2020005593A2 (es) 2020-05-29
EP3692137A1 (en) 2020-08-12
KR20200067163A (ko) 2020-06-11
MA50612A (fr) 2020-08-12
BR112020006366A2 (pt) 2020-09-29
ECSP20024456A (es) 2020-08-31
US11390844B2 (en) 2022-07-19
MX2020003833A (es) 2020-09-25
CL2020000866A1 (es) 2020-09-11
PE20210463A1 (es) 2021-03-08
EP3467097A1 (en) 2019-04-10
US20200267994A1 (en) 2020-08-27
WO2019068887A1 (en) 2019-04-11
JP2020535841A (ja) 2020-12-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Pavlova et al. Colonization strategy of the endophytic plant growth‐promoting strains of Pseudomonas fluorescens and Klebsiella oxytoca on the seeds, seedlings and roots of the epiphytic orchid, Dendrobium nobile Lindl
EP3288361B1 (en) Isolated complex endophyte compositions and methods for improved plant traits
US11390844B2 (en) Use of compositions containing Streptomyces melanosporofaciens AGL225 in controlling plant diseases
CN111356761A (zh) 用于植物病原体的生物防治的方法和组合物
JP5567634B2 (ja) バチルスバリスモルティスｂｓ０７ｍ菌株、微生物製剤、及び作物育成方法
WO2016127184A1 (en) Bacteria and method for improving plant health and growth
BRPI0717851A2 (pt) Microorganismo, agente que controla doença de planta, e, método para controlar uma doença de planta
Cao et al. An endophytic Streptomyces sp. strain DHV3-2 from diseased root as a potential biocontrol agent against Verticillium dahliae and growth elicitor in tomato (Solanum lycopersicum)
Sato et al. Suppressive potential of Paenibacillus strains isolated from the tomato phyllosphere against Fusarium crown and root rot of tomato
EP3941205A1 (en) Pseudomonas sp. strain, composition comprising the same, and uses thereof
CN108347945B (zh) 抗植物致病组合物
Mishra et al. Effect of plant growth promoting rhizobacteria on coriander (Coriandrum sativum) growth and yield under semi-arid condition of India
Rokni et al. The tripartite consortium of Serendipita indica, Trichoderma simmonsii, and bell pepper (Capsicum annum)
Abada et al. Management of pepper Verticillium wilt by combinations of inducer chemicals for plant resistance, bacterial bioagents and compost
Liu et al. Biocontrol of Fusarium crown and root rot of tomato and growth-promoting effect of bacteria isolated from recycled substrates of soilless crops
Paul et al. Inoculation with bacterial endophytes and the fungal root endophyte, Piriformospora indica improves plant growth and reduces foliar infection by Phytophthora capsici in black pepper
Sanei et al. Suppression of Verticillium wilt of olive by Pseudomonas fluorescens.
AU2018267591A1 (en) An Herbicidal Composition for Controlling Parthenium Weed and Strain Thereof
KR101953835B1 (ko) 식물의 병 저항성을 증진시키는 아스페르질루스 테레우스 균주 및 이의 용도
KR101211681B1 (ko) 스트렙토마이세스 니그로글리세러스 씨엠씨0647 균주를 이용한 식물병 방제제
Lops et al. Biological methods to control parasitic weed Phelipanche ramosa L. Pomel in the field tomato Crop
Tane The main fungal diseases in strawberries crop-review.
Khalil et al. Biological control of root pathogens in strawberry cultivation in tunnel
Khanal Occurrence of bacterial spot disease in Illinois tomato fields, characterization of the casual agents, and management of the disease
Tytarenko et al. Impact of Enterococcus italicus ONU547 on the growth and acclimatization of micropropagated Rubus fruticosus L. and Paulownia tomentosa Steud. plants to ex vitro conditions