CN110857438A

CN110857438A - 一种高效产生siRNA的烟草花叶病毒基因片段、弱毒疫苗、制备方法及其应用

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Publication number: CN110857438A
Application number: CN201810949935.2A
Authority: CN
Inventors: 耿超; 姜瀚林; 刘茜; 郭兆奎; 田延平; 刘锦; 万秀清; 刘文涛; 李向东; 李若; 乔婵
Original assignee: MUDANJIANG TOBACCO SCIENCE RESEARCH INSTITUTE HEILONGJIANG TOBACCO Co OF CHINA NATIONAL TOBACCO Corp; Shandong Agricultural University
Current assignee: MUDANJIANG TOBACCO SCIENCE RESEARCH INSTITUTE HEILONGJIANG TOBACCO Co OF CHINA NATIONAL TOBACCO Corp; Shandong Agricultural University
Priority date: 2018-08-20
Filing date: 2018-08-20
Publication date: 2020-03-03
Anticipated expiration: 2038-08-20
Also published as: CN110857438B

Abstract

本发明涉及植物抗病毒基因工程领域，公开了一种高效产生siRNA的烟草花叶病毒基因片段、弱毒疫苗、制备方法及其应用。高效产生siRNA的烟草花叶病毒基因片段包括TMV1片段、TMV2片段和TMV3片段中的至少一种，TMV1片段、TMV2片段和TMV3片段的核苷酸序列分别如Seq ID No.13、Seq ID No.14、Seq ID No.15所示，所述基因片段在接种寄生植物后可高效产生siRNA。弱毒疫苗以TVBMV弱毒突变体为基础，TVBMV弱毒突变体中嵌入了可诱导对烟草花叶病毒产生交叉保护的有效基因片段，所述的有效基因片段包括可产生siRNA的烟草花叶病毒基因片段。本发明的抗烟草花叶病毒的弱毒疫苗作用稳定，可以起到有效的交叉保护作用，显著减轻植物受烟草花叶病毒强毒株系感染后的伤害，延迟植物发病，大大减少损失。

Description

一种高效产生siRNA的烟草花叶病毒基因片段、弱毒疫苗、制备方法及其应用

技术领域

本发明属于植物抗病毒基因工程领域，具体地说，涉及一种高效产生siRNA的烟草花叶病毒基因片段、弱毒疫苗、制备方法及其应用。

背景技术

病毒病是作物上的重要病害，给农业生产造成巨大损失。由于作物病毒病种类多，传播途径复杂，生产上没有免疫或高抗病毒病的品种，市场上又没有对病毒病特效的药剂，因而病毒病的防治非常困难。

烟草病毒病一直是制约我国烟叶生产的重要因素。目前生产上的烟草主栽品种对病毒病的抗性都不理想，烟草病毒病的防治主要依赖农业防治和化学防治。但生产中没有针对病毒病的特效药剂，通过杀灭传毒昆虫来防治烟草病毒病的效果很差，而且农药的大量应用也不符合烟叶生产可持续发展的要求。利用弱毒株系保护植物免受强毒株系的侵染和危害(交叉保护)是防治病毒病非常有效的手段，在许多作物病毒病的防治中取得了成功。最近几年，交叉保护受到了越来越多的关注。

植物可利用RNA沉默来抵抗病毒侵染，病毒侵染植物后会产生大量病毒来源的小RNA(virus-derived small interfering RNAs,vsiRNA)，介导对病毒RNA的降解或抑制病毒基因的转录。交叉保护是指植株受弱毒株系侵染后，免受后继的病毒强毒株系侵染的现象，已经在许多作物病毒病的防治中取得了成功。而限制交叉保护广泛应用的关键因素是一是目前可用的弱毒株系种类不多，应用不方便，二是已发现的弱毒株系都是自然存在或人工诱变产生的，可能只在个别甚至是一个氨基酸位点发生了突变。这些弱毒株系或突变体在用于防治病毒病时有突变为强毒株系的风险。

烟草花叶病毒(TMV)属于烟草花叶病毒属(Tobamovirus)，分布范围和寄主范围均十分广泛，能侵染烟草、番茄、马铃薯等茄科作物，形成疱斑或花叶症状，严重影响作物产量及品质。TMV与黄瓜花叶病毒间有协生作用，一旦复合侵染会引起严重症状，造成更大损失。

田颖川、方荣祥报道获得转基因抗TMV工程植株，田波、陈章良也分别把从TMV-CP基因及卫星RNA导入到烟草品种NC89、C-28中，创造出抗TMV的转基因烟草，但因为转基因烟草受限而不能推广种植。杨恭、邵碧英筛选到TMV弱毒株系N14、TMV-152，并开发成弱毒疫苗，但因为接种和扩繁不便未能推广使用。因此，急需能够起到有效交叉保护作用的稳定的弱毒疫苗来防治植物的病毒病。

有鉴于此特提出本发明。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于克服现有技术的不足，提供一种高效产生siRNA的烟草花叶病毒基因片段、弱毒疫苗、制备方法及其应用。本发明获得了序列保守且能够高效脱靶产生siRNA的TMV片段，抗烟草花叶病毒的弱毒疫苗作用稳定，可以起到有效的交叉保护作用，显著减轻植物受烟草花叶病毒强毒株系感染后的伤害，延迟植物发病，大大减少损失。

为解决上述技术问题，本发明采用技术方案的基本构思是：

本发明的第一目的是提供一种高效产生siRNA的烟草花叶病毒基因片段，高效产生siRNA的烟草花叶病毒基因片段包括TMV1片段、TMV2片段和TMV3片段中的至少一种，TMV1片段、TMV2片段和TMV3片段的核苷酸序列分别如Seq ID No.13、Seq ID No.14、Seq IDNo.15所示，所述基因片段在接种寄生植物后可高效产生siRNA。

本发明的第二目的是提供一种抗烟草花叶病毒的弱毒疫苗，弱毒疫苗以TVBMV弱毒突变体为基础，TVBMV弱毒突变体中嵌入了可诱导对烟草花叶病毒产生交叉保护的有效基因片段，所述的有效基因片段包括可产生SiRNA的烟草花叶病毒基因片段。

进一步的方案，可产生SiRNA的烟草花叶病毒基因片段包括TMV1片段、TMV2片段和TMV3片段，TMV1片段、TMV2片段和TMV3片段的核苷酸序列分别如Seq ID No.13、Seq IDNo.14、Seq ID No.15所示。

进一步的方案，所述的TVBMV弱毒突变体中嵌入TMV1或TMV3片段。

进一步的方案，所述的TVBMV弱毒突变体中嵌入TMV3片段。

本方案以自主构建的烟草脉带花叶病毒(Tobacco vein banding mosaic virus，TVBMV)突变体为基础，该突变体在接种植物后不会引起可见症状，不会由蚜虫传播，使用安全。通过RT-PCR、酶切连接技术将烟草花叶病毒(TMV)的不同基因片段连入TVBMV突变体获得嵌合体病毒，也就是弱毒疫苗。然后将弱毒疫苗接种植物，接种15天后再用烟草花叶病毒(TMV)强毒株系侵染植物。结果意外地发现携带TMV的TMV1片段、TMV2片段和TMV3片段的弱毒疫苗可减轻烟草发病，尤其是TMV3片段交叉保护的效果更好，可以减轻植株感染病毒病后的损失。

进一步的方案，所述的TVBMV弱毒突变体包括烟草脉带花叶病毒HN39的基因组，基因组的5’末端连接有35S启动子；且基因组的HC-Pro氨基酸序列中含有突变，至少第52位的精氨酸突变为谷氨酸。

利用反向遗传学技术，明确了TVBMV中的HC-Pro调控TVBMV致病力、协生和抑制RNA沉默的氨基酸。并在这些位点引入突变，获得了含有多个氨基酸突变、不能蚜传、与TMV无协生作用的TVBMV弱毒突变体。这些突变体不易发生回复突变，使用安全，对野生型TVBMV有良好的交叉保护效果。

进一步的方案，基因组的HC-Pro氨基酸序列中含有的突变还包括：第198位的天冬氨酸突变为赖氨酸。

进一步的方案，基因组的HC-Pro氨基酸序列中含有的突变还包括：第250位的异亮氨酸突变为天冬氨酸，251位的谷氨酰胺突变为谷氨酸。

本发明的第三目的是提供一种如上任一方案所述的抗烟草花叶病毒的弱毒疫苗的制备方法，包括以下步骤：

(1)构建TVBMV弱毒突变体；

(2)获得可诱导对烟草花叶病毒产生交叉保护的烟草花叶病毒基因片段TMV1或TMV2或TMV3；

(3)将得到的TMV1或TMV2或TMV3基因片段插入TVBMV弱毒突变体，获得弱毒疫苗。

进一步的方案，以烟草花叶病毒的基因组为模板，利用PCR技术扩增得到TMV1或TMV2片段或TMV3，然后分别插入到TVBMV弱毒突变体的多克隆位点中，获得含有各基因片段的弱毒疫苗。

本发明的第四目的是提供一种含有如上任一方案所述的抗烟草花叶病毒的弱毒疫苗的重组菌；

优选的，所述的重组菌包括转入了弱毒疫苗的农杆菌。

本发明的第五目的是提供一种如上所述的高效产生siRNA的烟草花叶病毒基因片段，或者任一方案所述的抗烟草花叶病毒的弱毒疫苗在防治烟草花叶病毒强毒株系侵染植物方面的应用；

优选的，所述的植物为双子叶植物；

优选的，所述的植物为烟草。

本发明的弱毒疫苗的制备及应用的具体过程包括：

a.TMV片段的筛选：经过Bioedit比对及siRNA Direct筛选，得到TMV1、TMV2和TMV3三个保守且高效产生small RNA的片段。

b.片段克隆及载体构建：PCR扩增片段后使用酶切连接将目的片段连接到烟草脉带花叶病毒弱毒突变体上，并通过农杆菌转化制成弱毒疫苗。

c.片段保护效果的筛选：通过农杆菌浸润法将b中获得的单抗弱毒疫苗接种到寄主植物普通烟，观察这些突变体所致症状的变化，筛选致病力明显降低的载体片段。

d.交叉保护效果测定：在接种弱毒株系后10天和15天接种TMV强毒株系，观察弱毒疫苗对强毒株系的交叉保护效果，证明携带TMV3片段的弱毒疫苗对强毒株的抗性效果最好。

采用上述技术方案后，本发明与现有技术相比具有以下有益效果：

1、本发明获得了3个保守且能够高效脱靶产生siRNA的TMV片段。

2、本发明的弱毒疫苗可以起到有效的交叉保护作用，显著减轻植物受烟草花叶病毒强毒株系感染后的伤害，延迟植物发病，大大减少损失。

3、本发明的带有TMV1、TMV2和TMV3基因片段的弱毒疫苗可以保护烟草免受TMV强毒株的危害，带有TMV3基因片段的弱毒疫苗保护效果最好，病毒粒子的浓度降低70.16％。

4、本发明的弱毒疫苗采用自主构建的TVBMV弱毒突变体，并在该TVBMV弱毒突变体基础上插入了可诱导对烟草花叶病毒产生交叉保护的有效基因片段，因此弱毒疫苗并非自然存在或人工诱变产生，作用稳定，有利于大规模应用。

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的描述。

附图说明

附图作为本发明的一部分，用来提供对本发明的进一步的理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，但不构成对本发明的不当限定。显然，下面描述中的附图仅仅是一些实施例，对于本领域普通技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他附图。在附图中：

图1为TVBMV基因组片段扩增示意图；

图2为pCamTVBMV基因组结构示意图；

图3为TMV三个片段PCR扩增电泳图；

图4显示间隔期为15天时，不同片段在接种后15天对烟草植株的保护效果；

图5为不同处理的烟草植株内病毒的积累水平。。

需要说明的是，这些附图和文字描述并不旨在以任何方式限制本发明的构思范围，而是通过参考特定实施例为本领域技术人员说明本发明的概念。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例一多位点TVBMV弱毒突变体的构建

1、烟草脉带花叶病毒侵染性克隆的构建

以烟草脉带花叶病毒的RNA为模板，用随机引物进行反转录。根据现有烟草脉带花叶病毒全基因组的限制性酶切图谱，可分三部分扩增，酶切后装配为TVBMV全长cDNA克隆。首先，通过Overlap-PCR将35S启动子融合到TVBMV5′非翻译区到HC-pro基因Nru I酶切位点这一片段的上游，发明人将该片段命名为p35S-HC；PCR扩增HC-pro基因Nru I酶切位点到6K2Xho I酶切位点之间的这一片段，发明人将该片段命名为pHC-6K2；PCR扩增6K2Xho I酶切位点到ploy(A)尾巴这一片段，发明人将该片段命名为p6K2-polyA(如图1所示)。

cDNA合成所用反转录酶为Moloney murine leukaemia virus reversetranscriptase(Promega)；以植物总RNA为模板，以随机引物为反转录引物进行反转录。

以所得反转录产物为模板和相应的引物进行PCR扩增。PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳。切胶回收后获得p35S-HC₂₁₁₀，pHC₂₁₁₁-6K2₆₀₇₅和p6K2₆₀₇₆-polyA三个片段，将三个片段连接后用SbfI和Sma I双酶切后0.8％琼脂糖凝胶电泳，回收，连接到农杆菌介导的表达载体pCAMBIA0390，发明人将该策略构建的侵染性克隆命名为pCamTVBMV(如图2所示)。

2、TVBMV弱毒突变体的构建

获得烟草脉带花叶病毒侵染性克隆后，通过在HC-Pro序列中关键位点进行突变，获得TVBMV弱毒突变体，具体方法如下：

设计突变引物，根据Liu等(2008)的方法，对烟草脉带花叶病毒HC-Pro的保守氨基酸位点进行定点突变，突变的引物名称及序列如表1中所示。

表1TVBMV HC-Pro突变引物名称及序列

其中，引物1和引物2定点突变HC-Pro氨基酸序列的52位氨基酸，由精氨酸突变为谷氨酸；引物3和引物4定点突变HC-Pro氨基酸序列的198位氨基酸，由天冬氨酸突变为赖氨酸；引物5和引物6定点突变HC-Pro氨基酸序列的250位和251位氨基酸，第250位的异亮氨酸突变为天冬氨酸，251位的谷氨酰胺突变为谷氨酸。

用pCamTVBMV为模板，PCR突变体系：5×PCR Buffer 10μL，dNTP(10mM)1μL，突变引物F(10μM)1μL，突变引物R(10μM)1μL，模板质粒10ng，Phusion DNA聚合酶0.3μL，ddH₂O补齐到50μL。

PCR突变程序：98℃/30sec；98℃/10sec，Tmno+3℃/20sec，72℃/5min，20个循环；98℃/10sec；Tmpp/20sec；72℃/15min；4℃保存。

突变PCR结束后，每一个反应体系加入1μL Dpn I，充分混匀后，于37℃消解4h。

PCR反应体系用Dpn I处理完后，加入125μL无水乙醇(2.5×体积)和5μL 3MNaAcpH8.0，混匀后沉淀过夜；12000r/min，10min，弃上清；1mL 75％乙醇洗涤沉淀，弃上清；干燥沉淀，10μL ddH₂O溶解沉淀。

突变沉淀产物转化大肠杆菌，将转化后的菌体均匀涂在含有X-gal和IPTG的Amp抗生素的LB平板上，挑选单菌落进行培养，提取质粒进行测序，测序正确则获得四个位点突变的TVBMV弱毒突变体，命名为pCamTVBMV1。

3、TVBMV弱毒突变体致病力研究

将获得的突变质粒转入农杆菌中，经菌落PCR验证后，获得重组菌。然后挑单斑接种于含有卡那霉素(50μg/mL)、利福霉素(50μg/mL)、四环素(50μg/mL)的液体LB培养基中。取500μL菌液加至5mL含10mmol/L 2-(N-吗啉)-乙基磺酸(MES)和20μmol/L乙酰丁香酮(AS)及上述三种抗生素的LB培养基中，28℃振荡培养至对数生长期。

离心收集菌体并重新悬浮于10mmol/L MgCl₂，10mmol/L MES，150μmol/L AS中，调整浓度使其OD₆₀₀为0.5左右，室温静置3小时。取5mL一次性注射器，去掉针头吸取农杆菌菌液，从普通烟草(5－6周龄或4－6片真叶)叶片背面浸润。每株浸润2片叶。浸润的植株置于23℃光照培养箱中培养(16小时光照/8小时黑暗交替)。

选取多株6周左右的普通烟NC89，接种TVBMV弱毒突变体，接种15天后发现烟草没有表现出症状。说明该TVBMV弱毒突变体在接种植物后不会引起可见症状，不会由蚜虫传播，使用安全。

实施例二烟草花叶病毒相关基因片段的扩增及弱毒疫苗的构建

1、烟草花叶病毒相关基因片段的扩增

以TMV的cDNA基因组为模板，利用RT-PCR进行扩增各基因片段。本发明所提供的实施例，均按照常规实验条件，其中所采用的引物序列如下表：

表2TMV基因片段扩增引物序列

其中引物1和2应用于扩增TMV1基因片段，引物3和4应用于扩增TMV 2基因片段，引物5和6应用于扩增TMV 3基因片段。扩增获得的TMV1基因片段的核苷酸序列如Seq IDNo.13所示，TMV 2基因片段的核苷酸序列如Seq ID No.14所示，TMV 3基因片段的核苷酸序列如Seq ID No.15所示。

以TMV的cDNA为模板，利用PCR进行扩增，所用聚合酶为Phusion高保真聚合酶。

PCR反应体系如下：

反应结束，PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离后(如图3所示)，紫外灯下切取目的胶条并使用EasyPure Quick Gel Extraction Kit试剂盒回收PCR产物。

2、载体构建

使用烟草脉带花叶病毒弱毒突变体pCamTVBMV1的多克隆位点中PacI和XbaI两个酶切位点，分别酶切载体和片段。

载体酶切体系如下：

片段酶切体系如下：

酶切产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离后，回收并用T4DNA连接酶，4℃下静置8h进行连接。连接体系如下：

将连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，测序验证菌落并摇床培养菌体，提取质粒载体，得到3个单联弱毒疫苗，分别命名为pCamTVBMV1-TMV1、pCamTVBMV1-TMV2、pCamTVBMV1-TMV3。

实施例三弱毒疫苗接种植物

将实施例二中构建好的单联弱毒疫苗载体转化农杆菌GV3101。经菌落PCR验证后，挑单斑接种于含有卡那霉素(50μg/mL)、利福霉素(50μg/mL)、四环素(50μg/mL)的液体LB培养基中。取500μL菌液加至5mL含10mmol/L 2-(N-吗啉)-乙基磺酸(MES)和20μmol/L乙酰丁香酮(AS)及上述三种抗生素的LB培养基中，28℃振荡培养至对数生长期。离心收集菌体并重新悬浮于10mmol/L MgCl₂，10mmol/L MES，150μmol/L AS中，调整浓度使其OD600为0.5左右，室温静置3小时。取5mL一次性注射器，去掉针头吸取农杆菌菌液，从普通烟(5－6周龄或4－6片真叶)叶片背面浸润。每株浸润2片叶。浸润的植株置于23℃光照培养箱中培养(16小时光照/8小时黑暗交替)。

试验例1交叉保护效果测定

将弱毒疫苗预先接种普通烟15天后，接种TMV的强毒株系，比较不同片段介导的交叉保护效果。

具体方法包括：

选取5周左右的普通烟，分为4组，每组10棵。第一组为Mock组，仅接种TVBMV弱毒突变体，不携带基因片段。从第二组到第四组分别依次接种pCamTVBMV1-TMV1、pCamTVBMV1-TMV2、pCamTVBMV1-TMV3。

保护接种15天后，4个组的普通烟均分别接种TMV强毒株系。

在接种强毒株系后的第15天调查发病情况，发现结果如图4中所示：

1、mock组中，接种了强毒株系的普通烟植株表现严重的疱斑及花叶症状，发病率为100％；；

2、预先接种pCamTVBMV1-TMV1和pCamTVBMV1-TMV2弱毒疫苗的普通烟植株同样出现疱斑但症状较轻，发病率分别为80％和90％。

3、预先接种pCamTVBMV1-TMV3弱毒疫苗的普通烟植株仅心叶出现轻微疱斑，发病率为70％。

将以上试验重复三次，分别观察，记录结果。将三次重复实验烟草发病率结果进行汇总，结果表明：pCamTVBMV1-TMV1、pCamTVBMV1-TMV2和pCamTVBMV1-TMV3弱毒疫苗均能够起到交叉保护的效果，其中pCamTVBMV1-TMV3弱毒疫苗的保护效果最好。

试验例2检测烟草植株内的病毒积累水平

本试验例采用ELISA检测试验例2中各组烟草在接种强毒株系15天后植株内的病毒积累水平。

ELISA检测结果表明，接种强毒株系15天后，预先接种了单联弱毒疫苗，再接种强毒株系的烟草植株内病毒粒子的浓度明显低于mock组的植株。其中，预先接种了pCamTVBMV1-TMV3弱毒疫苗的烟草植株中，病毒粒子的浓度显著降低70.16％，如图5所示。因此，pCamTVBMV1-TMV3弱毒疫苗可以起到有效的交叉保护作用，显著减轻植物受烟草花叶病毒强毒株系感染后的伤害，延迟植物发病，减少损失。

以上所述仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专利的技术人员在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述提示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明方案的范围内。

Claims

1.一种高效产生siRNA的烟草花叶病毒基因片段，其特征在于，高效产生siRNA的烟草花叶病毒基因片段包括TMV1片段、TMV2片段和TMV3片段中的至少一种，TMV1片段、TMV2片段和TMV3片段的核苷酸序列分别如Seq ID No.13、Seq ID No.14、Seq ID No.15所示，所述基因片段在接种寄生植物后可高效产生siRNA。

2.一种抗烟草花叶病毒的弱毒疫苗，其特征在于，弱毒疫苗以TVBMV弱毒突变体为基础，TVBMV弱毒突变体中嵌入了可诱导对烟草花叶病毒产生交叉保护的有效基因片段，所述的有效基因片段包括可产生SiRNA的烟草花叶病毒基因片段。

3.根据权利要求2所述的一种抗烟草花叶病毒的弱毒疫苗，其特征在于，可产生SiRNA的烟草花叶病毒基因片段包括TMV1片段、TMV2片段和TMV3片段，TMV1片段、TMV2片段和TMV3片段的核苷酸序列分别如Seq ID No.13、Seq ID No.14、Seq ID No.15所示。

4.根据权利要求2或3所述的一种抗烟草花叶病毒的弱毒疫苗，其特征在于，所述的TVBMV弱毒突变体中嵌入TMV1或TMV3片段。

5.根据权利要求2或3所述的一种抗烟草花叶病毒的弱毒疫苗，其特征在于，所述的TVBMV弱毒突变体中嵌入TMV3片段。

6.一种如权利要求2-5任一所述的抗烟草花叶病毒的弱毒疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)构建TVBMV弱毒突变体；

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，以烟草花叶病毒的基因组为模板，利用PCR技术扩增得到TMV1或TMV2片段或TMV3，然后分别插入到TVBMV弱毒突变体的多克隆位点中，获得含有各基因片段的弱毒疫苗。

8.一种含有如权利要求2-5任一所述的抗烟草花叶病毒的弱毒疫苗的重组菌。

9.根据权利要求8所述的重组菌，其特征在于，所述的重组菌包括转入了弱毒疫苗的农杆菌。

10.一种如权利要求1所述的高效产生siRNA的烟草花叶病毒基因片段，或者权利要求2-5任一所述的抗烟草花叶病毒的弱毒疫苗在防治烟草花叶病毒强毒株系侵染植物方面的应用；

优选的，所述的植物为双子叶植物；

优选的，所述的植物为烟草。