CN114410749B - 基于点击化学和arget-atrp放大策略的电致化学发光检测试剂盒及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了基于点击化学和ARGET‑ATRP放大策略的电致化学发光检测试剂盒及方法，该试剂盒包括金电极、hairpin DNA、TCEP、MCH、鲁米诺、PBIB、AA、CuSO4、BPDS、CuBr2/ME6TREN、NAS。本发明利用长链聚合物来放大ECL信号，避免了目前常用信号放大策略中的纳米材料和生物酶的使用，信号得到成倍的放大，提高检测的灵敏度，稳定性和重现性。本发明采用ARGET‑ATRP策略，避免了传统ATRP反应中重金属离子催化剂的大量使用，具有商业化的引发剂和广泛的可用单体，以及温和的反应条件。与现有检测植物病毒的方法相比，本发明具有更广泛的检测范围和更低的LOD，且本发明具有良好的选择性、重现性和稳定性，有望用于tRNA的检测。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于点击化学和ARGET-ATRP放大策略的电致化学发光检测试剂盒及方法，属于生物分析技术领域。
背景技术
烟草花叶病毒(TMV)是最常见的植物病毒之一，自19世纪末以来对世界农业经济造成巨大影响。TMV是一种直径为18nm、长度为300nm的单链杆状RNA病毒。除了能够感染烟草、辣椒和西红柿等经济作物外，它还能感染地黄、太子参等药用植物。被TMV感染的植株早期会出现叶片变厚、黄斑等症状，后期出现萎缩甚至死亡，这将严重影响植物产量和质量。因此，在侵染植株的早期阶段进行检测TMV具有重要意义。目前，已经开发了几种检测TMV的方法，如酶联免疫吸附试验(ELISA)、反转录聚合酶链反应(RT-PCR)、激光诱导击穿光谱(LIBS)、RT-环介导的等温扩增(RT-LAMP)等。然而，这些方法存在一些缺点，如操作复杂，成本高，或必须由专业技术人员操作。
电致发光(ECL)是近年来出现的一种新技术。由于它结合了化学发光和电化学的优点，如检测范围广、成本低、操作简单等，已被广泛应用于生物分析领域。在各种ECL电致发光系统中，鲁米诺及其衍生物因其高发光量子产率、无毒性和耐受性而成为最有名的发光载体。然而，ECL生物传感器的检测性能依赖于其原始信号的增强或淬灭，产生的噪声相对较高，不利于提高灵敏度。因此，为了提高ECL的灵敏度，发光载体的有效固定化是核心。
ARGET-ATRP所具有的优点：(1)反应条件相对较温和，可在有少量氧气及自由基存在下进行；(2)所用还原剂还原过程中并不产生新的引发自由基或活性种；(3)所使用催化剂为稳定的高价态过渡金属化合物，有利于大批量生产、存储、运输；(4)该ATRP体系所用的催化剂、配体用量相对较小(Cu类催化剂用量可降至数ppm)，从而使聚合后处理简单化；(5)ARGET-ATRP的反应需要低浓度的铜催化剂(小于100pM)，而且不需要无氧环境，有利于环境保护和经济效益。此外，目前将聚合物嫁接到电极表面的方法有化学键、静电吸附等。其中，通过稳定的化学键将聚合物嫁接到电极表面的效果较好，克服了其他方法容易使聚合物移位的缺陷。点击化学是一种化学合成常用的方法，旨在通过小单元的拼接快速可靠地完成各种分子的合成，具有条件简单、产率高、无副作用等优点。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种基于点击化学和ARGET-ATRP放大策略的新型电致化学发光检测试剂盒及其检测方法，其操作简单，且信号得到成倍的放大，提高了检测的灵敏度，且具有良好的稳定性、选择性和和重现性。
为了实现上述目的，本发明的技术方案是：
一种基于点击化学和ARGET-ATRP放大策略的新型电致化学发光检测试剂盒，包括以下原料：金电极、hairpin DNA、TCEP、MCH、鲁米诺、PBIB、AA、CuSO4、BPDS、CuBr2/ME6TREN、NAS、超纯水、乙醇、DEPC水、DMSO和H2O2。
部分原料使用时需配制成溶液，其中，hairpin DNA溶液的浓度为2μM，TCEP溶液浓度为10mM，MCH溶液的浓度为2mM，鲁米诺溶液的浓度为20mM，PBIB溶液的浓度为10mM，AA溶液的浓度为2mM，CuSO4溶液的浓度为2mM，BPDS溶液的浓度为2mM，CuBr2/ME6TREN溶液的浓度为10mM，NAS溶液的浓度为10mM，H2O2溶液的浓度为10mM。
发夹DNA的序列为5′-SH-(CH2)6-CCACGCAGACACACGCTCACACCTCCGTGG-N3-3′。
一种检测烟草花叶病毒RNA的方法，包括以下步骤：
①将hairpin DNA溶液滴加到金电极表面，在室温下放置过夜，清洗；
②将步骤①的电极浸泡在MCH溶液中，反应，清洗，吹干；
③将待检测样品溶液滴加到步骤②电极表面，孵育，洗涤；
④将步骤③的电极浸入点击化学反应溶液中，孵育，清洗；
⑤将步骤④的电极放置放入ARGET-ATRP反应溶液中，孵育，清洗；
⑥将步骤⑤的电极浸入鲁米诺溶液中孵育；
⑦将步骤⑥的电极放置在H2O2溶液中测定其发光强度。
hairpin DNA溶液的制备方法为：
①将hairpin DNA加热保温后，冷却；
②加入等体积TCEP溶液，避光振摇，得到具有茎环结构的hairpin DNA溶液；
其中，hairpin DNA的加热温度为95℃，加热时间为10min，加热速度为1.6℃/s，冷却至25℃。
先将金电极进行预处理，预处理方法为：将金电极打磨至镜面，清洗，吹干，备用。
步骤②的避光振摇温度为37℃，时间为3～6h；步骤②的反应温度为37℃，时间为30～60min；步骤③的孵育温度为37℃，时间为90～120min；步骤④的孵育温度为37℃，时间为40～60min；步骤⑤的孵育温度为37℃，时间为60～90min；步骤⑥的孵育温度为37℃，时间为160～240min。
点击化学反应溶液是由PBIB溶液、AA溶液和CuSO4/BPDS溶液等体积混合制备而成；其中，CuSO4/BPDS溶液是由CuSO4溶液和BPDS溶液等体积混合制备而成；ARGET-ATRP反应溶液是由体积比7:1:1:1的DEPC水、AA溶液、CuBr2/ME6TREN溶液和NAS溶液混合制备而成。
一种上述试剂盒在烟草花叶病毒检测中的应用。
本发明检测方法原理示意图如图1所示。
本发明的有益效果：
1、本发明利用长链聚合物来放大ECL信号，避免了目前常用信号放大策略中的纳米材料和生物酶(繁琐的合成和纯化步骤以及容易受到外界环境和温度影响等)的使用，信号得到成倍的放大，提高检测的灵敏度，稳定性和重现性。
2、本发明采用电子转移再生活化剂原子转移自由基聚合(ARGET-ATRP)策略，避免了传统ATRP反应中重金属离子催化剂的大量使用，具有商业化的引发剂和广泛的可用单体，以及温和的反应条件。
3、本发明采用ARGET-ATRP作为信号放大的策略，以鲁米诺-H2O2作为电化学发光系统。然后，tRNA和hairpin DNA通过特异性识别形成DNA/RNA杂交，hairpin DNA的发夹结构被打开，导致叠氮基的暴露。杂交后，ARGET-ATRP引发剂PBIB的炔基通过"Cu(I)催化的叠氮烷基环化反应"(CuAAC)连接到hairpin DNA上。接下来，在ATRP引发剂的溴基存在下，ARGET-ATRP反应在电极表面启动，形成大量NAS标记的聚合物链。最后，大量的鲁米诺通过酰胺键与聚合物链中的NAS相连，最后进行ECL检测实现tDNA的检测。研究结果表明，在0.1pM到10nM的范围内，ECL的强度与tRNA浓度的对数之间存在明确的线性关系。线性方程为：I＝2417.828lg[CtRNA/pM]+3824.423(R2＝0.997)，其中I代表ECL强度，CtRNA是tRNA浓度(pM)。而检测限(LOD)为6.61fM(S/N＝3)。与现有检测植物病毒的方法相比，本发明具有更广泛的检测范围和更低的LOD，且本发明具有良好的选择性、重现性和稳定性，有望用于tRNA的检测。
附图说明
图1为本发明检测方法的原理示意图。
图2A为不同修饰条件电极的ECL强度。
图2B为从裸金电极到每个组分修饰后电极(曲线a→g)的CV曲线。
图3为从裸金电极到每个组分修饰后电极在5mM[Fe(CN)6]3/4-中的EIS拟合图，其中，曲线a为裸Au，曲线b为hairpin DNA/Au，曲线c为MCH/hairpin DNA/Au，曲线d为tRNA/MCH/hairpin DNA/Au，曲线e为PBIB/tRNA/MCH/hairpin DNA/Au，曲线f为NAS/PBIB/tRNA/MCH/hairpin DNA/Au，曲线g为鲁米诺/NAS/PBIB/tRNA/MCH/hairpin DNA/Au。插图是EIS的等效电路图。Rs为溶液电阻，CPE为恒相元件，Zw为Warburg阻抗和Rct是电荷转移电阻。
图4为金电极表面ARGET-ATRP反应前后的原子力显微镜照片。其中，A为ARGET-ATRP前，B为ARGET-ATRP后。
图5为不同修饰状态电极表面的接触角照片。其中A为裸Au，B为hairpin DNA/Au，C为MCH/hairpin DNA/Au，D为tRNA/MCH/hairpin DNA/Au，E为PBIB/tRNA/MCH/hairpin DNA/Au，F为NAS/PBIB/tRNA/MCH/hairpin DNA/Au，G为鲁米诺/NAS/PBIB/tRNA/MCH/hairpinDNA/Au。
图6为ECL强度与NAS浓度(A)、鲁米诺浓度(B)和鲁米诺反应时间(C)的关系图(n＝3)。
图7为全修饰电极对不同浓度tRNA的ECL强度(A)和对不同浓度tRNA反应(B)的校准曲线(n＝3)。
图8为全修饰电极对不同核酸序列的ECL响应值。其中所有RNA的浓度均为100pM。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
发夹DNA(hairpin DNA)的序列为5′-SH-(CH2)6-CCACGCAGACACACGCTCACACCTCCGTGG-N3-3′(SEQ ID NO.1)。
TMV RNA(tRNA)的序列为5′-GAGGUGUGAGCGUGUGUCUG-3′(SEQ ID NO.2)。
单碱基错配RNA(SBM)的序列为5′-GAGGUGUGAGCAUGUGUCUG-3′(SEQ ID NO.3)。
三碱基错配RNA(TBM)的序列为5′-GAGGCGUGAGCAUGUGUAUG-3′(SEQ ID NO.4)。
全错配RNA(NC)的序列为5′-AUCACUCCGAUCACGCGAGC-3′(SEQ ID NO.5)。
实施例1：试剂盒
一种基于点击化学和ARGET-ATRP放大策略的新型电致化学发光检测试剂盒，包括以下原料：金电极、发夹DNA(hairpin DNA)、三(2-羧基乙基)膦盐酸盐(TCEP)、6-巯基-1-己醇(MCH)、鲁米诺(luminol)、2-溴异丁酸炔丙酯(PBIB)、抗坏血酸(AA)、硫酸铜(CuSO4)、水合红菲绕啉二磺酸钠(BPDS)、CuBr2/ME6TREN、N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺(NAS)、超纯水、乙醇、焦碳酸二乙酯(DEPC)水、二甲基亚砜(DMSO)、过氧化氢(H2O2)。
使用时，部分原料需配制成溶液，其中，发夹DNA溶液的浓度为2μM，TCEP溶液浓度为10mM，MCH溶液的溶剂为无水乙醇，浓度为2mM，鲁米诺溶液的浓度为20mM，PBIB溶液的浓度为10mM，AA溶液的浓度为2mM，CuSO4溶液的浓度为2mM，BPDS溶液的浓度为2mM，CuBr2/ME6TREN溶液的浓度为10mM，NAS溶液的浓度为10mM，H2O2溶液的浓度为10mM。
实施例2：检测方法的构建
(1)hairpin DNA的前处理
①将hairpin DNA以1.6℃/s的速度加热到95℃并保持10min，然后缓慢冷却到25℃；
②加入等体积TCEP溶液(10mM)混合，将混合物转移到一个干净的离心管中，37℃避光振摇3h，得到具有茎环结构的hairpin DNA溶液；
(2)电极预处理
将金电极(Au)打磨至镜面，再放入超声波清洗器中，依次用超纯水、70％(v/v)乙醇溶液、超纯水清洗，氮气吹干，备用；
(3)电极的修饰
①将5μL hairpin DNA溶液(2μM)滴加到电极表面，在室温下放置过夜，然后用超纯水滴洗电极表面；
②将步骤①的电极(hairpin DNA/Au)浸泡在300μL MCH溶液(2mM)中，在37℃下反应30min，以阻断非特异性结合点，分别用70％(v/v)乙醇溶液和超纯水仔细清洗电极，并用氮气吹干；
③将10μL待检测样品溶液(含tDNA)滴加到步骤②电极(MCH/hairpin DNA/Au)表面，在37℃下孵育90min，然后用DEPC水适当清洗电极，以去除未反应的寡核苷酸；
④将步骤③的电极(tRNA/MCH/hairpin DNA/Au)浸入300μL点击化学反应溶液中，在37℃下孵育40min，并用DEPC水清洗电极；
⑤将步骤④的电极(PBIB/tRNA/MCH/hairpin DNA/Au)放置放入ARGET-ATRP反应溶液中，在37℃下孵育60min，分别用DMSO和DEPC水清洗电极；
⑥在37℃下将步骤⑤的电极(NAS/PBIB/tRNA/MCH/hairpin DNA/Au)浸入300μL鲁米诺溶液中孵育160min；
⑦将步骤⑥的电极(鲁米诺/NAS/PBIB/tRNA/MCH/hairpin DNA/Au)放置在H2O2溶液(10mM)中测定其发光强度。
其中，点击化学反应溶液是由PBIB溶液(10mM)、AA溶液(2mM)和CuSO4/BPDS溶液等体积混合制备而成。其中，CuSO4/BPDS溶液是由CuSO4溶液(2mM)和BPDS溶液(2mM)等体积混合制备而成。
ARGET-ATRP反应溶液是由体积比7:1:1:1的DEPC水、AA溶液(2mM)、CuBr2/ME6TREN溶液(10mM)和NAS溶液(10mM)混合制备而成。
实施例3：可行性验证
为了证明本发明检测tRNA的可行性，本研究检测了不同修饰电极的ECL信号。图2A表明，如果在电极的逐步修饰过程中不加入hairpin DNA(曲线b)、tRNA(曲线c)、PBIB(曲线d)、NAS(曲线e)或鲁米诺(曲线f)，则检测不到明显的ECL信号。如果在修饰电极的过程中没有加入hairpin DNA，tRNA就不能被捕获，所以hairpin DNA的发夹结构就不能被打开。之后，ATRP引发剂(PBIB)不能通过CuAAC反应附着在hairpin DNA上，ATRP不能顺利进行，最后导致鲁米诺不能附着在电极上。同样地，如果分别缺少tRNA、PBIB或NAS，鲁米诺也不会附着在电极表面。自然，如果不加入鲁米诺，ECL信号就不会被检测到。相反，当所有上述成分在连续修饰过程中被添加到电极表面时，可以清楚地观察到一个强烈的峰值(曲线a)。这表明鲁米诺被成功地附着在电极表面。上述结果清楚地表明，在点击化学与ARGET-ATRP的基础上构建本发明方法用于检测tRNA是可行的。
实施例4：表征
循环伏安法(CVs)可用于表征全修饰电极的构建过程。图2B展示了逐步修饰电极的CV曲线。在裸金电极上获得了5mM[Fe(CN)6]3-/4-氧化还原峰(曲线a)。这主要由于电极光滑表面的电子的快速转移。当hairpin DNA被自组装在电极表面时，峰值电流明显减小(曲线b)。当MCH固定在改性电极上时，电极表面的非特异性位点被阻断，导致峰值电流进一步减小(曲线c)。从曲线d可以看出，当形成tRNA/hairpin DNA杂交体时，峰值电流再次减小。当ATRP引发剂(PBIB)通过CuAAC反应与hairpin DNA结合后，由于空间位点电阻的增加，峰值电流继续减小(曲线e)。在ARGET-ATRP之后，峰值电流随之减小(曲线f)，这表明聚合物在电极表面成功合成。最后，随着鲁米诺在电极表面的出现，氧化还原峰的峰值电流再次减小(曲线g)，这是由于空间电位的持续增加导致电荷转移率的进一步减小。
电化学阻抗谱(EIS)也可以灵敏地监测电极表面发生的细微变化。图3显示了在含有0.1M KNO3的5mM[Fe(CN)6]3-/4-电解质溶液的连续制备过程中逐步收集的同一电极的EIS谱图。由于电极界面和溶液之间发生的快速电荷转移，裸电极获得最小的Rct(～54.5Ω，曲线a)。随着hairpin DNA和MCH在电极上一步步被修饰，Rct逐渐增加(～210Ω和～337.8Ω，曲线b-c)，这是由于hairpin DNA和MCH的自组装分子层的障碍造成的。在hairpin DNA捕获tRNA后，Rct增加到～612.8Ω(曲线d)，这一结果主要是由于tRNA的磷酸基团和[Fe(CN)6]3-/4-之间的静电排斥。随着PBIB通过CuAAC反应引入电极表面，Rct进一步增加(～1507Ω，曲线e)。然后，在ARGET-ATRP之后，Rct明显增加，这是因为通过ARGET-ATRP形成的NAS聚合物链是疏水性的(～3056Ω，曲线f)。最后，当鲁米诺附着在聚合物链上时，Rct增加到～3548Ω(曲线g)，这是由于鲁米诺的导电性差，在一定程度上阻碍了电荷转移。CVs和EIS的结果表明，本发明全修饰电极的构建过程是成功的。
使用原子力显微镜(AFM)观察了改性金电极的形貌变化。在ARGET-ATRP反应前后，金电极的表面高度发生了显著的变化。结果如图4所示：在引发ARGET-ATRP之前，金电极的表面高度为9.2nm。而在ATRP发生后，它增加到29.2nm。这是因为在ARGET-ATRP之后，大量的聚合物被接枝在金电极的表面。
此外，利用水接触角(WCA)研究了金电极在逐步修饰过程中表面亲水性的变化。如图5所示，因为金电极的表面是疏水性的，所以裸电极的WCA为97.3°(图5A)。当hairpin DNA自组装在金电极上时，WCA下降到74.3°(图5B)，这是由于hairpin DNA含有亲水基团。在电极表面引入MCH后，WCA继续下降，这是因为MCH中存在亲水羟基(图5C)。在电极表面加入tRNA后，WCA进一步降低到61.1°(图5D)。这可以解释为hairpin DNA/tRNA混合体的形成。然而，WCA随着PBIB在电极上的出现而增加(图5E)，这是由于CuAAC反应在电极表面形成的三唑结构导致的亲水性的恶化。在ARGET-ATRP之后，WCA进一步增加(图5F)，表明在电极表面形成了NAS的疏水链。之后，随着大量的鲁米诺被引入电极，由于鲁米诺的疏水性，WCA增加到96°(图5G)。
上述表征结果说明本发明全修饰电极构建成功。
实施例5：检测条件优化
为了达到最佳分析性能，本发明研究了ARGET-ATRP单体的浓度，鲁米诺的浓度和反应时间对ECL强度的影响。
(1)NAS浓度的优化
在ARGET-ATRP中，ATRP单体NAS的浓度是一个关键因素，对聚合物的聚合效率有不可忽视的影响。因此，对NAS的浓度进行了优化。图6A显示，随着NAS的浓度从2mM增加到10mM，ECL强度逐渐增加，并在10mM时达到最大值。此后，ECL强度没有明显变化，表明随着反应时间的延长，空间位阻增大阻碍了链的继续增长。在随后的实验中，NAS的浓度选为10mM。
(2)鲁米诺浓度的优化
如图6B所示，ECL强度随着鲁米诺浓度的增加而上升，在20mM时达到最大值，之后趋于平稳。增加孵育时间并没有导致信号的增加，因为鲁米诺几乎完全与可用的NAS聚合链相连。因此，鲁米诺的浓度选为20mM。
(3)鲁米诺反应时间的优化
从图6C可以看出，随着鲁米诺反应时间的延长，ECL强度逐渐增加，并在160min达到峰值。进一步延长反应时间，ECL强度不再变化，表明鲁米诺与NAS侧链的反应达到饱和。因此，鲁米诺的最佳反应时间选为160min。
实施例6：分析性能
根据实施例5条件优化所得出的最佳实验条件，检测一系列tRNA浓度的ECL强度。如图7A所示，ECL强度随着tRNA浓度的增加而加强。从图7B可以看出，在0.1pM到10nM的范围内，ECL的强度与tRNA浓度的对数之间存在明确的线性关系。线性方程为：I＝2417.828lg[CtRNA/pM]+3824.423(R2＝0.997)，其中I代表ECL强度，CtRNA是tRNA浓度(pM)。而检测限(LOD)为6.61fM(S/N＝3)。与几种检测植物病毒的方法对比，
本发明具有更广泛的检测范围和更低的LOD。如下表所示：
实施例7：选择性、重现性和稳定性能力
在最佳实验条件下，将本发明试剂盒对tRNA、SBM、TBM和NC的ECL响应强度进行比较。如图8所示，与tRNA响应的ECL强度相比，SBM、TBM的ECL响应值分别下降了83.43％和86.19％。而与NC相比，tDNA的ECL强度约高11倍。上述结果表明，本发明试剂盒具有良好的选择性，这是由于RNA和DNA之间碱基互补配对的原理。此外，利用组内和组间实验评估了该策略的重现性。结果表明，组内和组间的RSD分别为3.15％和3.72％(n＝5)，表明所提出的策略具有良好的重现性。同时，通过比较全修饰电极在4℃下储存14天后的反应信号与新制备全修饰电极的响应强度，评估了检测方法的稳定性。储存电极的ECL反应是新制备电极的93.08％(n＝3)。该结果表明，本发明基于点击化学与ARGET-ATRP检测tRNA的方法具有优异的稳定性。
实施例8：回收实验
通过对从健康地黄叶中提取的总RNA中进行加标回收试验，评估了该策略在真实样品中的应用潜力。总RNA除了被稀释100倍外，没有进行任何处理。在提取的总RNA中分别加入1000pM、100pM和10pM的tRNA来制备样品。下表列出了分析的结果。样品的回收率在96.21％到103.82％之间，RSD小于4.906％(n＝3)，这表明本发明方法具有在实际样品中测定tRNA的潜力。
序列表
<110> 河南中医药大学
<120> 基于点击化学和ARGET-ATRP放大策略的电致化学发光检测试剂盒及方法
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1
ccacgcagac acacgctcac acctccgtgg 30
<210> 2
<211> 20
<212> RNA
<213> 烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus )
<400> 2
gaggugugag cgugugucug 20
<210> 3
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列()
<400> 3
gaggugugag caugugucug 20
<210> 4
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列()
<400> 4
gaggcgugag cauguguaug 20
<210> 5
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列()
<400> 5
aucacuccga ucacgcgagc 20
Claims (7)
1.一种基于点击化学和ARGET-ATRP放大策略的电致化学发光检测试剂盒，其特征在于，包括以下原料：金电极、hairpin DNA、TCEP、6-巯基-1-己醇（MCH）、鲁米诺、2-溴异丁酸炔丙酯（PBIB）、抗坏血酸（AA）、CuSO4、水合红菲绕啉二磺酸钠（BPDS）、CuBr2/ME6TREN、N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺（NAS）、DEPC水、H2O2；
hairpin DNA的序列为：
5′-SH-(CH2)6-CCACGCAGACACACGCTCACACCTCCGTGG-N3-3′；
试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
①将hairpin DNA溶液滴加到金电极表面，在室温下放置过夜，清洗；
②将步骤①的电极浸泡在MCH溶液中，反应，清洗，吹干；
③将待检测样品溶液滴加到步骤②电极表面，孵育，洗涤；
④将步骤③的电极浸入点击化学反应溶液中，孵育，清洗；
⑤将步骤④的电极放置放入ARGET-ATRP反应溶液中，孵育，清洗；
⑥将步骤⑤的电极浸入鲁米诺溶液中孵育；
⑦将步骤⑥的电极放置在H2O2溶液中测定其发光强度；
点击化学反应溶液是由PBIB溶液、AA溶液和CuSO4/BPDS溶液等体积混合制备而成；其中，CuSO4/BPDS溶液是由CuSO4溶液和BPDS溶液等体积混合制备而成；ARGET-ATRP反应溶液是由体积比7:1:1:1的DEPC水、AA溶液、CuBr2/ME6TREN溶液和NAS溶液混合制备而成。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，还包括超纯水、乙醇、DMSO。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，部分原料使用时需配制成溶液，其中，hairpin DNA溶液的浓度为2 μM，TCEP溶液浓度为10 mM，MCH溶液的浓度为2 mM，鲁米诺溶液的浓度为20 mM，PBIB溶液的浓度为10 mM，AA溶液的浓度为2 mM，CuSO4溶液的浓度为2mM，BPDS 溶液的浓度为2 mM，CuBr2/ME6TREN溶液的浓度为10 mM，NAS溶液的浓度为10 mM，H2O2溶液的浓度为10 mM。
4.一种检测烟草花叶病毒RNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：
①将hairpin DNA溶液滴加到金电极表面，在室温下放置过夜，清洗；
②将步骤①的电极浸泡在MCH溶液中，反应，清洗，吹干；
③将待检测样品溶液滴加到步骤②电极表面，孵育，洗涤；
④将步骤③的电极浸入点击化学反应溶液中，孵育，清洗；
⑤将步骤④的电极放置放入ARGET-ATRP反应溶液中，孵育，清洗；
⑥将步骤⑤的电极浸入鲁米诺溶液中孵育；
⑦将步骤⑥的电极放置在H2O2溶液中测定其发光强度；
hairpin DNA的序列为：
5′-SH-(CH2)6-CCACGCAGACACACGCTCACACCTCCGTGG-N3-3′；
hairpin DNA溶液的制备方法为：
（1）将hairpin DNA加热保温后，冷却；
（2）加入等体积TCEP溶液，避光振摇，得到具有茎环结构的hairpin DNA溶液；
其中，hairpin DNA的加热温度为95℃，加热时间为10 min，加热速度为1.6℃/s，冷却至25℃；
点击化学反应溶液是由PBIB溶液、AA溶液和CuSO4/BPDS溶液等体积混合制备而成；其中，CuSO4/BPDS溶液是由CuSO4溶液和BPDS溶液等体积混合制备而成；ARGET-ATRP反应溶液是由体积比7:1:1:1的DEPC水、AA溶液、CuBr2/ME6TREN溶液和NAS溶液混合制备而成。
5.根据权利要求4所述检测烟草花叶病毒RNA的方法，其特征在于，先将金电极进行预处理，预处理方法为：将金电极打磨至镜面，清洗，吹干，备用。
6.根据权利要求4所述检测烟草花叶病毒RNA的方法，其特征在于，步骤②的反应温度为37℃，时间为30~60 min；步骤③的孵育温度为37℃，时间为90~120 min；步骤④的孵育温度为37℃，时间为40~60 min；步骤⑤的孵育温度为37℃，时间为60~90 min；步骤⑥的孵育温度为37℃，时间为160~240 min；步骤（2）避光振摇温度为37℃，时间为3～6h。
7.一种如权利要求1所述试剂盒在烟草花叶病毒检测中的应用。
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