JP2005221390A - 電気化学発光電極 - Google Patents

Abstract

【課題】 安定した発光強度が得られ、しかも、中性条件下であっても強い発光強度が得られる電気化学発光に使用される電気化学発光電極および電気化学発光測定方法を提供する。
【解決手段】 ルミノールまたはルミノール誘導体を含む液体試料の電気化学発光に使用される電極１であって、前記電極１が、導電体を含む電極本体部１ａと、前記電極本体部１ａの表面を被覆したカチオン性ポリマーを含む被覆部１ｂとを有する。これにより、前記被覆部１ｂが正電荷に帯電し、前記電極１の表面近傍の液体試料のｐＨが電気化学発光に最適なアルカリ性に近くなる。
【選択図】 図１

Description

本発明は、電気化学発光物質を含む液体試料の電気化学発光に使用される電気化学発光電極および電気化学発光測定方法に関し、特に、ルミノール等の電気化学発光物質に関するものである。

従来、生化学物質の定量方法としては、生化学物質の酸化酵素反応により生じる過酸化水素を定量する方法が一般的である。そして、この過酸化水素の簡便で高感度な定量法として、ルミノールと過酸化水素の反応により生じる化学発光を利用する化学発光法が知られている。しかしながら、このルミノールの化学発光法は、ルミノール、過酸化水素および触媒（重金属イオン、ヘムタンパク質など）の水溶液を混合した時点で反応（発光）が開始される。そのため、発光強度が混合状態や触媒の劣化状態に影響されるため、発光強度が安定しないという問題があった。

この問題を解決するために、触媒の代わりに電極を用いる電気化学発光法が知られている。この電気化学発光法に使用される発光装置および発光測定方法としては、特許文献１に、ルミノールおよび過酸化水素を含有する水溶液に作用電極、対電極および参照電極を設け、これらの電極間に電位を印加することにより、アノードとして働く作用極において電気化学発光を起こさせる発光装置が提案されている。また、作用電極の電位を、参照電極を用いて水の電気分解によりガス状酸素が発生する電位未満に制御して、電気化学発光を測定する発光測定方法が提案されている。この発光装置および発光測定方法においては、ルミノールと過酸化水素の混合溶液を完全混合状態で反応させることが可能であるため、発光強度が安定化するという利点がある。
特開平５−７９９８９号公報（段落０００２、０００５、図１）

しかしながら、前記発光装置および発光測定方法においては、アルカリ条件下（ｐＨ≒１１）では強い発光強度が得られるが、酵素反応に最適な中性条件下では発光強度が弱いという問題があった。

そこで、本発明では、前記した問題を解決し、安定した発光強度が得られ、しかも、中性条件下であっても強い発光強度が得られる電気化学発光に使用される電気化学発光電極および電気化学発光測定方法を提供することを目的とする。

前記課題を解決するために請求項１の発明は、ルミノールまたはルミノール誘導体を含む液体試料の電気化学発光に使用される電極であって、前記電極が、導電体を含む電極本体部と、前記電極本体部の表面を被覆したカチオン性ポリマーを含む被覆部とを有する電気化学発光電極として構成したものである。

前記構成において、電極本体部の表面をカチオン性ポリマーで被覆することにより、電気化学発光装置の電極間に電位を印加した際に、電極の表面近傍の液体試料のｐＨが高くなり、ルミノールまたはルミノール誘導体の電気化学発光反応が促進される。

前記課題を解決するために請求項２の発明は、前記被覆部が、前記カチオン性ポリマーを前記電極本体部の表面に吸着させたものである電気化学発光電極として構成したものである。

前記構成において、カチオン性ポリマーが吸着により電極本体部に被覆されることにより、カチオン性ポリマーが電気的に電極本体部の表面に結合される。そのため、電極の表面近傍の液体試料のｐＨをアルカリ性に近くするのに十分な量のカチオン性ポリマーが電極本体部に結合され、電極間に電位を印加した際に、ルミノールまたはルミノール誘導体の電気化学発光反応がさらに促進される。

前記課題を解決するために請求項３の発明は、前記カチオン性ポリマーが、ポリエチレンイミンである電気化学発光電極として構成したものである。

前記構成において、カチオン性ポリマーがポリエチレンイミンであることにより、正電荷に荷電した分子鎖の短いモノマーでポリマーが構成され、ポリマーの荷電密度が高くなる。それにより、電極の表面近傍の液体試料のｐＨがよりアルカリ性に近くなり、電極間に電位を印加した際に、ルミノールまたはルミノール誘導体の電気化学発光反応がさらに促進される。

前記課題を解決するために請求項４の発明は、ルミノールまたはルミノール誘導体を含む液体試料の電気化学発光を測定する測定方法であって、前記液体試料を発光装置に供給する第１工程と、前記発光装置に設けられた２つ以上の電極間に電位を印加し、前記液体試料に電気化学発光を起こさせる第２工程と、前記電気化学発光を測定する第３工程とを含み、前記第２工程において、前記電極のうち作用電極となる電極の表面近傍の液体試料のｐＨをアルカリ性に制御する電気化学発光測定方法として構成したものである。

前記構成において、作用電極の表面近傍の液体試料のｐＨをアルカリ性に制御することにより、ルミノールまたはルミノール誘導体の電気化学発光反応が促進される。

本発明によれば、電極本体部の表面をカチオン性ポリマーで被覆することにより、安定した発光強度が得られ、しかも、中性条件の液体試料であっても、強い発光強度が得られ、酵素反応を利用して高感度な生化学物質の定量を簡便に行うことができる電気化学発光電極を得ることができる。

また、吸着によりカチオン性ポリマーを被覆することにより、より安定した発光強度が得られ、しかも、中性条件の液体試料であっても、より強い発光強度が得られる電気化学発光電極を得ることができる。

さらに、カチオン性ポリマーがポリエチレンイミンであることにより、より一層安定した発光強度が得られ、しかも、中性条件の液体試料であっても、より一層強い発光強度が得られる電気化学発光電極を得ることができる。

本発明によれば、作用電極の表面近傍の液体試料のｐＨをアルカリ性に制御することにより、安定した発光強度が得られ、しかも、中性条件の液体試料であっても、強い発光強度が得られ、酵素反応を利用して高感度な生化学物質の定量を簡便に行うことができる電気化学発光測定方法を得ることができる。

本発明の実施形態について、図面を参照しながら詳細に説明する。図１（ａ）は電気化学発光電極の構成を模式的に示す断面図、（ｂ）は（ａ）の他の形態を模式的に示す断面図、図２（ａ）は電気化学発光電極を使用した発光装置の正面図、（ｂ）は（ａ）のＸ−Ｘ線での断面図、図３は発光装置を使用した発光測定システムの概略図である。

本発明の電気化学発光電極（以下、電極と称す）は、ルミノールまたはルミノール誘導体を含む液体試料の電気化学発光に使用されるものである。

ここで、ルミノール（以下の化学式（１）参照）またはルミノール誘導体は、活性化酸素の存在下における電解酸化により化学発光を起こす電気化学発光物質である。そして、ルミノール誘導体としては、例えば、イソルミノール、イソルミノールのアミノ基をアルキル化したＮ−アミノブチル−Ｎ−エチルイソルミノール、Ｎ−アミノヘキシル−Ｎ−エチルイソルミノール、またはイソルミノールのアミノ基をアセチル化したＮ−アミノブチル−Ｎ−エチルイソルミノールヘミスクシネート等が挙げられる。しかしながら、電解酸化によりアミノフタル酸ジアニオン（以下の化学式（２））が生成されれば、前記誘導体に限定されない。本発明においては、その発光効率がよく、価格が安いことから、ルミノールが好ましい。

また、活性化酸素とは、原子状酸素、過酸化水素状態の酸素、その他の電気化学的反応によって発生する活性状態の酸素および酸化物等を意味する。このような活性化酸素は、例えば、液体試料にあらかじめ過酸化水素を添加することにより生じる過酸化水素状態の酸素、または、液体試料が体液等の生体物質である場合には、グルコースオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ等の酵素反応によって生成する過酸化水素状態の酸素である。

また、本発明の電極は、発光装置の内部に設けられた作用電極として使用されるものである。そして、発光装置は、後記のように、ルミノールまたはルミノール誘導体（以下、ルミノール誘導体と称す）を含有する液体試料に作用電極と対電極とを設け、これらの電極間に電位を印加することにより、アノードとして働く作用電極においてルミノール誘導体に電気化学発光を起こさせるものである。

図１（ａ）に示すように、電極１は、電極本体部１ａと、前記電極本体部１ａの表面を被覆した被覆部１ｂとを有する。そして、前記したように、電極１はルミノール誘導体に電気化学発光を起こさせるアノードとしての作用電極である。以下、その構成について説明する。
（電極本体部１ａ）
電極本体部１ａは導電体を含むもので構成される。また、後記する発光装置１０（図２参照）へ組み込んだ際の他の部品との接続のために、例えば、緩衝板１２、１３（図２（ｂ）参照）と接する部分を非導電体で構成してもよい。ここで、導電体としては、ＩＴＯ、酸化スズ等の金属酸化物、白金、金、パラジウム、ニッケル、ステンレス等の金属およびグラッシーカーボン、グラファイト等の炭素が挙げられる。また、後記するカチオン性ポリマーを含む被覆部１ｂとの結合のしやすさから、その表面が負電荷に荷電しているＩＴＯ、酸化スズ等の金属酸化物で構成された電極本体部１ａが好ましい。また、金属、炭素からなる導電体の表面に酸化物層を形成した電極本体部１ａを使用することも可能である。

また、電極１は、図２に示す発光装置１０において作用電極１’として使用される。そして、作用電極１’に電位を印加した際に、その表面近傍でルミノール誘導体の電気化学発光が起きる。この電気化学発光の発光強度は、作用電極１’、光透過窓１１ａを通して測定される。そのため、電極本体部１ａ（作用電極１’）が透明な導電体で構成されていることが好ましい。

また、電極本体部１ａの形状は、例えば、板状、膜状、網状、スリット状、くし状、パイプ状であって、後記する発光装置１０に組み込むことが可能であれば特に限定されない。

（被覆部１ｂ）
前記電極本体部１ａの表面を被覆する被覆部１ｂは、カチオン性ポリマーを含むもので、正電荷に荷電している。被覆部１ｂが正電荷に荷電していることにより、電極本体部１ａの表面近傍に存在する液体試料のｐＨが高くなり、液体試料に含まれている前記ルミノール誘導体の電気化学発光が促進され、その発光強度が強くなる。また、被覆部１ｂが正電荷に帯電していることにより、表面が負電荷に帯電した金属酸化物からなる電極本体部１ａと電気的に結合されることとなる。また、後記するように、カチオン性ポリマー表面をアニオン性ポリマー（被覆部１ｃ）でさらに被覆してもよい。

カチオン性ポリマーとしては、ポリエチレンイミン、ポリビニルアミン、ポリアリルアミン、ポリアミノ酸等が挙げられ、特に、ポリエチレンイミンが好ましい。ポリエチレンイミンは正電荷の荷電密度が高いため、前記電極本体部１ａの表面近傍のｐＨをより高くすることができ、前記ルミノール誘導体の発光強度が最も強くなるアルカリ性（ｐＨ＝１１）に近づけることが可能となる。

ポリエチレンイミンの平均分子量は１０００〜１００００００が好ましく、１００００〜１０００００がより好ましい。平均分子量が１０００未満または１００００００を超えると、ポリエチレンイミンが電極本体部１ａに結合されず、被覆部１ｂが形成されにくい。

カチオン性ポリマーの被覆方法としては、電極本体部１ａへの吸着、グラフトが挙げられる。被覆作業の簡便性から、吸着が好ましい。吸着方法は、例えば、カチオン性ポリマーを緩衝液に溶解したポリマー溶液を作製し、このポリマー溶液に電極本体部１ａを所定時間（例えば、１〜３０分）浸漬する方法が挙げられる。この浸漬により、カチオン性ポリマーが電極本体部１ａに電気的に結合する。グラフト方法は、例えば、電極本体部１ａを（クロロメチル）フェニルトリメトキシシラン等で表面修飾し、ジメチルジチオカルバミド酸ナトリウム等の開始剤を固定し、この開始剤が固定化された電極本体部１ａの表面でカチオン性モノマーをリビングラジカル重合させて、カチオン性ポリマーのグラフト鎖を電極本体部１ａの表面に導入する方法が挙げられる。このリビングラジカル重合により、カチオン性ポリマーのグラフト鎖が電極本体部１ａの表面に化学的に結合する。

被覆部１ｂの厚みは、１〜５０ｎｍが好ましく、５〜２０ｎｍがより好ましい。厚みが１ｎｍ未満であると、被覆部１ｂの荷電密度が低くなり、電極本体部１ａ（電極１）の表面近傍のｐＨが高くならず、ルミノール誘導体の発光強度が弱くなる。また、厚みが５０ｎｍを超えると、表面近傍のｐＨに変化はなく、被覆部１ｂの形成に長時間を要し、電極１の製造コストが高くなり、実用性に欠ける。

図１（ｂ）に本発明に係る電極１の他の形態を示す。電極１は、電極本体部１ａと、前記電極本体部１ａの表面を被覆した被覆部１ｂと、前記被覆部１ｂの表面をさらに被覆する被覆部１ｃを有する。以下、構成について説明する。ただし、電極本体部１ａ、被覆部１ｂは前記と同様であるので、説明を省略する。

（被覆部１ｃ）
前記被覆部１ｂの表面をさらに被覆する被覆部１ｃは、アニオン性ポリマーを含むもので、負電荷に荷電している。被覆部１ｃが負電荷に荷電していることにより、液体試料中に含まれる緩衝アニオンが被覆部１ｂに引き寄せられることを防止し、被覆部１ｂのｐＨ上昇効果が、緩衝アニオンによって阻害されるのを防止する効果がある。また、液体試料中に含まれるアニオン性物質（還元剤）、例えば、液体試料が体液である場合にはアスコルビン酸や尿酸等が被覆部１ｂに引き寄せられることを防止し、電気化学発光反応が、アニオン性物質によって阻害されるのを防止する効果がある。ここで、アニオン性ポリマーとしては、例えば、ポリアクリル酸、ポリエステル、ポリアミド等が挙げられる。アニオン性ポリマーの分子量は１０００〜１００００００が好ましい。前記範囲外の分子量では、被覆部１ｃが形成しにくい。また、被覆部１ｃの厚みは１〜５０ｎｍが好ましい。厚みが１ｎｍ未満であると緩衝アニオン、アニオン性物質の排除効果が低くなり、厚みが５０ｎｍを超えると、緩衝アニオン、アニオン性物質の排除効果に変化はなく、被覆部１ｃの形成に長時間を要し、電極１の製造コストが高くなり、実用性に欠ける。また、被覆部１ｃの形成方法は前記被覆部１ｂと同様である。なお、被覆部１ｃが形成されても、この被覆部１ｃを構成するポリマーと被覆部１ｂを構成するポリマーが交じり合うことはないので、被覆部１ｂの正電荷は維持され、被覆部１ｂの分子鎖間に存在する液体試料のｐＨが高くなり、液体試料に含まれるルミノール誘導体の電気化学発光が促進され、その発光強度は強くなる。

また、液体試料として生化学物質を含む体液等を使用し、その生化学物質の酵素反応により生じる過酸化水素を定量する際には、前記被覆部１ｃを介して酵素を固定化してもよい。ここで、酵素とは、例えば、グルコースオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、コレステロールエステルヒドラーゼ、ホスホリパーゼＤ、アシルＣｏＡ合成酵素、Ｌ，Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、ビルビン酸オキシダーゼ、ウリカーゼ、ポリアミンオキシダーゼ、クレアチニナーゼ等である。なお、前記酵素を被覆部１ｃを介して電極本体部１ａに固定化する代わりに、液体試料にあらかじめ添加、または、液体試料とは別に発光装置１０（図２参照）に添加してもよい。

つぎに、本発明の電極が使用される発光装置の一例について説明する。図２（ａ）、（ｂ）に示すように、測定器１０は、光透過窓１１ａを表面のほぼ中央部に設けた上部プレート１１と、上部反応流路１５ａ、下部反応流路１５ｃおよび排出流路１５ｄが内部に設けられた下部プレート１４と、上部プレート１１と下部プレート１４に挟持されるように配置された本発明の電極が使用された作用電極１’とを備える。また、下部プレート１４と作用電極１’との間に、上部反応流路１５ａおよび下部反応流路１５ｃと連通する中央反応流路１５ｂが設けられた緩衝板１３が挟持されるように配置され、下部反応流路１５ｃに参照電極４、排出流路１５ｄに対電極２が設けられている。また、上部プレート１１と作用電極１’との間に、光透過窓１１ａに対応する位置に開口が設けられた緩衝板１２が配置されてもよい。そして、作用電極１’、対電極２および参照電極４には電位を印加するためのリード線１６が接続され、上部反応流路１５ａには液体試料３を供給するためのチューブ１７が接続され、排出流路１５ｃ（対電極２）には液体試料３を排出するためのチューブ１７ａが接続されている。なお、ここで、対電極２は作用電極１’の電位を設定するためのもので、材質および形状は前記電極本体部１ａ（作用電極１’）と同様なものが使用される。また、参照電極４はポテンシオスタット１０１（図３参照）を介して作用電極１’の電位を制御するもので、水素電極、銀−塩化銀電極、カロメル電極などが使用される。また、作用電極１’は、緩衝板１２、１３と接する面に非導電体で構成される部分を設けてもよい。

また、前記発光装置１０が使用される発光測定システム１００の一例について説明する。図３に示すように、発光測定システム１００は、発光装置１０と、発光装置１０の作用電極１’と対電極２との間に電位を印加するためのポテンシオスタット（関数発生器付き）１０１と、発光装置１０の作用電極１’での電気化学発光の強度を測定するためのフォトカウンタ１０４、電圧供給器１０５を接続した光電子増倍管１０３とを備える。また、発光装置１０には、液体試料３を供給するポンプ１０２と、排出された液体試料３を貯留するドレイン１０６がチューブ１７ａを介して接続されている。

つぎに、本発明に係る電気化学発光の測定方法について、前記電極１、発光装置１０、発光測定システム１００を使用した一例で説明する。図２、図３に示すように、
（１）第１工程
液体試料３を、ポンプ１０２を用いて、チューブ１７を介して発光装置１０内に連続供給する。発光装置１０内に供給された液体試料３は、上部反応流路１５ａ、中央反応流路１５ｂ、下部反応流路１５ｃを流れ、排出流路１５ｃを通って、チューブ１７ａを介してドレイン１０６に排出される。
（２）第２工程
発光装置１０の参照電極４の電位を参照して、発光測定システム１００のポテンシオスタット（関数発生器付き）１０１から、発行装置１０の作用電極１’と対電極２との間に、所定のパルス状の電位を印加する。ここで、発光装置１０の中央反応流路１５ｂ内の液体試料３は、作用電極１’に被覆されたカチオン性ポリマーの正電荷により、作用電極１’の表面近傍の液体試料３のｐＨのみが高くなり（アルカリ性になり）、その表面近傍以外の液体試料３のｐＨは維持される。作用電極１’の表面近傍で液体試料３の電気化学発光が起き、液体試料３の高いｐＨ（アルカリ性）により、その発光強度は強いものとなる。
（３）第３工程
作用電極１’の表面近傍で起きた電気化学発光を、発光装置１０の光透過窓１１ａを通して、発光測定システム１００の光電子増倍管１０３で検出する。光電子増倍管１０３で検出、増倍された光電子を、フォトカウンタ１０４で計測し、発光強度を測定する。

このように構成されることにより、安定した発光強度が得られ、しかも、中性条件の液体試料であっても、強い発光強度が得られ、酵素反応を利用して高感度な生化学物質の定量を簡便に行うことができる電気化学発光電極および電気化学発光測定方法を得ることができる。

本発明の効果を確認した実施例について説明する。実施例１、２は本発明に係る電極、比較例１、２は従来の電極である。

（実施例１）
（１）液体試料の調整
１．０ｍＭルミノール、所定濃度（０、１０、２０、３０μＭ）の過酸化水素および０．１ＭＴｒｉｓ−塩酸緩衝溶液の混合水溶液をｐＨ＝７．４に調製したものを液体試料とした。
（２）表面被覆電極の作製
インジウム−スズ酸化物（ＩＴＯ）電極を、ポリエチレンイミン（分子量７００００）を１質量％含むホウ酸緩衝溶液（ｐＨ＝８．０）に１５分間浸し、ポリエチレンイミンをＩＴＯ電極の表面に吸着させた表面被覆電極を作製した。
（３）発光強度の測定
図２に示すように、前記表面被覆電極を作用電極１’として使用し、発光装置１０を作製した。ここで、対電極２としてはステンレス管を、参照電極４としては銀−塩化銀電極を使用した。発光装置１０を使用して、図３に示すような発光測定システムで、ルミノールの発光強度を測定した。ここで、作用電極−対電極間に印加するパルス状の電位は、１．０Ｖの電位を３秒、０Ｖを３秒とした。所定濃度の過酸化水素に対応するルミノールの発光強度の測定結果を表１に示す。

（比較例１）
作用電極１’としてＩＴＯ電極（未被覆電極）を使用した以外は実施例１と同様とした。そして、ルミノールの発光強度の測定結果を表１に示す。

（実施例２）
Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝溶液の代わりに０．１Ｍリン酸緩衝溶液を使用した混合水溶液をｐＨ＝７．４に調製したものを液体試料とした以外は、実施例１と同様とした。そして、ルミノールの発光強度の測定結果を表２に示す。

（比較例２）
Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝溶液の代わりに０．１Ｍリン酸緩衝溶液を使用した混合水溶液をｐＨ＝７．４に調製したものを液体試料とした以外は、比較例１と同様とした。そして、ルミノールの発光強度の測定結果を表２に示す。

表１、２の結果より、電極表面に被覆部を有する実施例１、２の電極では、安定した発光強度が得られ、しかも、中性（ｐＨ＝７．４）の液体試料下でも、電極表面に被覆部を有さない比較例１、２の電極に比べて強い発光強度が得られることが確認された。

（ａ）は本発明に係る電気化学発光電極の構成を模式的に示す断面図、（ｂ）は（ａ）の他の形態を模式的に示す断面図である。 （ａ）は電気化学発光電極を使用した発光装置の正面図、（ｂ）は（ａ）のＸ−Ｘ線での断面図である。 発光装置を使用した発光測定システムの概略図である。

符号の説明

１ 電極
１’ 作用電極
１ａ 電極本体部
１ｂ、１ｃ 被覆部

Claims (4)

1. ルミノールまたはルミノール誘導体を含む液体試料の電気化学発光に使用される電極であって、
   前記電極が、導電体を含む電極本体部と、前記電極本体部の表面を被覆したカチオン性ポリマーを含む被覆部とを有することを特徴とする電気化学発光電極。
2. 前記被覆部が、前記カチオン性ポリマーを前記電極本体部の表面に吸着させたものであることを特徴とする請求項１に記載の電気化学発光電極。
3. 前記カチオン性ポリマーが、ポリエチレンイミンであることを特徴とする請求項１または２に記載の電気化学発光電極。
4. ルミノールまたはルミノール誘導体を含む液体試料の電気化学発光を測定する測定方法であって、
   前記液体試料を発光装置に供給する第１工程と、
   前記発光装置に設けられた２つ以上の電極間に電位を印加し、前記液体試料に電気化学発光を起こさせる第２工程と、
   前記電気化学発光を測定する第３工程とを含み、
   前記第２工程において、前記電極のうち作用電極となる電極の表面近傍の液体試料のｐＨをアルカリ性に制御することを特徴とする電気化学発光測定方法。

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