JP5172606B2 - 被検物質の特異的検出方法および装置、ならびに検査チップ - Google Patents

被検物質の特異的検出方法および装置、ならびに検査チップ Download PDF

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Description

本発明は、試料中から核酸やタンパク質等の被検物質を検出するための特異的検出方法および装置、ならびに検査チップに関する。
疾病の臨床検査や診断では、生体試料中に含まれる疾病由来の遺伝子やタンパク質等を、遺伝子検出法や免疫学的検出法で検出している。具体的には、イムノクロマト法、ラテックス凝集法、酵素免疫法、化学発光免疫法、遺伝子増幅PCR法等が挙げられる。しかし、これらの検出方法は簡易性、迅速性、およびコストのいずれかの観点からも改善の余地がある。
そこで、増感色素の光励起により生じる電流を、被検物質の検出に利用する方法が提案されている（特許文献１）。この方法はまず、電極上に半導体層（電子受容層）を形成し、この半導体層上に被検物質と結合可能なプローブ物質を固定する。次に、増感色素で修飾された被検物質をプローブ物質で捕捉した後、増感色素を励起させる光を、被検物質を修飾している増感色素に照射する。この結果、被検物質を修飾している増感色素から電子が放出され、放出された電子が半導体層に受容されることに起因して生じた電流を検出する。
国際公開第２００７/０３７３４１号パンフレット
しかしながら、従来の方法では電流の検出効率が低いために、被検物質の検出感度の向上が望まれていた。
したがって、本発明は、被検物質の検出感度を向上させることができる特異的検出方法および装置、ならびに検査チップを提供することを目的とする。
本発明の第１の観点に係る被検物質の特異的検出方法（以下、単に検出方法ともいう）は、光励起により電子を生じる修飾物質で修飾された被検物質を検出する方法であって、
半導体層を備えている作用電極と、前記被検物質を捕捉可能でありかつ前記半導体層上に固定されるプローブと、導電性材料からなる対極と、電解質を還元するための還元電極と、を備えている検査チップに前記被検物質を含む試料を適用し、前記プローブによって前記被検物質を捕捉する工程と、
前記作用電極、前記対極、および前記還元電極に電解質を含む電解質媒体を接触させた状態で、前記プローブによって捕捉された前記被検物質を修飾している修飾物質に当該修飾物質を励起させる光を照射する工程と、
前記光によって励起された修飾物質から前記作用電極への電子の移動により前記作用電極と前記対極との間を流れる電流を測定する工程と、
前記電解質媒体に含まれている電解質を前記還元電極によって還元する工程と、
を含むことを特徴としている。
この検出方法によれば、検査チップに設けられた還元電極により電解質を還元することによって電解質の還元反応を促進することができ、これにより作用電極と対極との間を流れる電流を増大させ、被検物質の検出感度を高めることができる。
前記検出方法において、前記還元電極によって前記電解質を還元する工程は、前記還元電極に電位を印加した状態で行うように構成してもよく、その電位は、前記対極を基準として−０．５Ｖ以上０Ｖ未満としてもよい。このように還元電極に電位を印加することによって、電解質の還元反応をより促進することが可能となる。
また、前記還元電極が、前記電解質を還元可能な自然電位に保持されている場合には、積極的に電源等によって電位を印加しなくても、還元電極の存在だけで電解質の還元を促進することが可能である。
前記プローブは、核酸、タンパク質またはペプチドであってもよい。また、前記電解質はヨウ素またはヨウ化物であってもよい。
本発明の第２の観点に係る被検物質の特異的検出装置（以下、単に検出装置ともいう）は、光励起により電子を生じる修飾物質で修飾された被検物質を検出する検出装置であって、
半導体層を備えている作用電極と、前記被検物質を捕捉可能でありかつ前記半導体層上に固定されるプローブと、導電性材料からなる対極と、前記作用電極および前記対極に接触される電解質媒体に含まれた電解質を還元するための還元電極と、を備えている検査チップを、受入可能に構成された検査チップ受入部と、
前記検査チップ受入部に受け入れられた前記検査チップ内の被検物質を修飾している修飾物質に当該修飾物質を励起させる光を照射する光源と、
前記還元電極に電位を印加するための電位印加部と、
前記光源から照射された光によって励起された色素から前記作用電極への電子の移動により前記作用電極と前記対極との間を流れる電流を測定する電流測定部と、
を備えていることを特徴としている。
この構成によれば、検査チップに設けられた還元電極に電位を印加することによって電解質の還元反応を促進することができ、これにより作用電極と対極との間を流れる電流を増大して、被検物質の検出感度を高めることができる。
本発明の第３の観点に係る検査チップは、光励起により電子を生じる修飾物質で修飾された被検物質を検出するための検査チップであって、
半導体層を備えている作用電極と、
前記被検物質を捕捉可能でありかつ前記半導体層上に固定されるプローブと、
導電性材料からなる対極と
前記作用電極および前記対極に接触される電解質媒体に含まれた電解質を還元するための還元電極と、を備えていることを特徴としている。
この構成によれば、検査チップに設けられた還元電極によって電解質の還元反応を促進することができ、これにより作用電極と対極との間を流れる電流値を増大させて、被検物質の検出感度を高めることができる。
本発明の第３の観点に係る検査チップにおいて、前記還元電極は、複数の線状部材が並列して配置された形状からなる電極であってもよい。
本発明の検出方法および装置、ならびに検査チップによれば、被検物質の検出感度を向上させることができる。
以下、図面を参照して本発明の検出方法および装置、ならびに検査チップについての実施の形態について説明する。
〔検出装置の構成〕
図１は、本発明の一実施の形態に係る検出装置を示す斜視図である。この検出装置１は、生体細胞から採取され、または人工的に合成された核酸やタンパク質、ペプチド等の特異的結合性を有する被検物質を検出するための装置である。この検出装置１としては、例えば子宮頸癌の原因ウィルスであるヒトパピローマウィルス（以下、ＨＰＶという）のｍＲＮＡを検体試料中から検出するためのＨＰＶ検出装置が一例として挙げられる。
本実施の形態の検出装置１は、検査チップ４が挿入されるチップ受入部３と、検出結果を表示するディスプレイ２とを備えている。検査チップ４は試料注入口１１を備え、この試料注入口１１から検体試料を注入することで、検体試料中の色素で修飾された被検物質を捕捉する機能を有している。また、検査チップ４は使い捨てとされている。
図２は、検出装置の構成を示すブロック図である。検出装置１は、光源５と、電流計（電流測定部）６と、電源（電位印加部）９と、Ａ／Ｄ変換部７と、制御部８と、ディスプレイ２とを備えている。
光源５は、検査チップ４で捕捉された被検物質を修飾している色素に光を照射し、色素を励起させる。電流計６は、励起された色素から放出される電子に起因して検査チップ４内を流れる電流を測定する。電源９は、検査チップ４に設けられた電極に対して所定の電位を印加する。Ａ／Ｄ変換部７は、電流計６によって測定された電流値をデジタル変換する。制御部８は、ＣＰＵ，ＲＯＭ，およびＲＡＭ等から構成され、光源５、電流計６、電源９、およびディスプレイ２の動作を制御する。また、制御部８は、Ａ／Ｄ変換部７でデジタル変換された電流値を予め作成された電流値と被検物質の量との関係を示す検量線に基づき、検体試料中の被検物質の量を概算する。ディスプレイ２は、制御部８で概算された検体試料中の被検物質の量を表示する。
次に、本発明の一実施の形態に係る被検物質検出用の検査チップ４の構成と、この検査チップ４を用いた被検物質の特異的検出方法について説明する。
〔検査チップの構成〕
図３は、本実施の形態に係る検査チップ４の斜視図、図４は、検査チップ４の断面図である。検査チップ４は、上基板１３と、上基板１３の下方に設けられた下基板１４と、上基板１３と下基板１４とに挟まれた間隔保持部材１２とを備えている。
図５は、上基板１３を下面側から見た平面図である。上基板１３は矩形状に形成され、上基板１３の表面（下面）には、作用電極２１と、作用電極２１に接続されている電極リード２２とが形成されている。作用電極２１はほぼ四角形状に形成されて上基板１４の一側部（図５の左側）に配置され、電極リード２２は作用電極２１から上基板１４の他側部（図５の右側）に向けて延びている。
図６は、下基板１４を上面側からみた平面図である。下基板１４は、上基板１３と略同一寸法の矩形状に形成され、下基板１４の表面（上面）には、対極２４と、この対極に接続された電極リード２５と、還元電極２６と、この還元電極２６に接続された電極リード２７と、参照電極２８と、この参照電極２８に接続された電極リード２９とが形成されている。
還元電極２６は、細長い線状部が並列して配置された「くし形」に形成され、その全体の外形がほぼ四角形状に形成され、下基板１４の一側部（図６の右側）に配置されている。還元電極２６の電極リード２７は、還元電極２６から下基板の他側部（図６の左側）に向けて延びている。
対極２４と、参照電極２８とは、還元電極２６を間に挟んでその両側に配置されている。対極２４の電極リード２５と参照電極２８の電極リード２９とは、それぞれ下基板１４の一側部から他側部へ向けて延びている。還元電極２６、対極２４、および参照電極２８の各電極リード２７，２５，２９は、下基板１４の他側部において互いに並列するように配置されている。
図３および図４に示すように、上基板１３と下基板１４とは、各々に形成された電極部分が上下方向に対向するように、一側部において重複して配置されている。そして、上基板１３と下基板１４とが重複（対向）する部分には間隔保持部材１２が介在している。上基板１３と下基板１４とに形成された電極リード２２，２５，２７，２９は、上基板１３と下基板１４とが重複する部分からはみ出して外部に露出している。
図５および図６に示すように、間隔保持部材１２は、矩形の環状体形状に形成され、絶縁体であるシリコーンゴムからなっている。この間隔保持部材１２は、作用電極２１と、還元電極２６、対極２４、および参照電極２８とが互いに対向する領域を取り囲むように配置されている。上基板１３と下基板１４との間にはシリコーンゴム１２の厚さｔに相当する間隔が形成され、これによって各電極２１，２４，２６，２８の間には検体試料や電解液を収容するための空間３０（図４参照）が形成されている。上基板１３に形成された試料注入口１１は、当該空間３０内に検体試料や電解液を注入することが可能なように上基板１３を貫通して形成されている。
なお、本実施の形態では、上基板１３の表面に作用電極２１を形成し、下基板１４の表面に対極２４と還元電極２６と参照電極２８とを形成しているが、作用電極２１，対極２４，還元電極２６，参照電極２８の配置関係は、各電極が他の電極と接触せずに間隔保持部材１２の枠内に配置されている限り、特に制限されない。例えば、同一基板上に、作用電極２１と、対極２４と、還元電極２６と、参照電極２８とが配置されていても良い。
図７は、検査チップ４を模式的に表した概略図である。作用電極２１は、上基板１３の表面に形成された導電層３２と、この導電層３２の表面に形成された電子受容層（半導体層；半導体電極）３３とから構成されている。電子受容層３３は、被検物質４２を修飾する色素４１が光励起に応じて放出する電子を受容可能な物質を含んでいる。また、作用電極２１の電極リード２２は、導電層３２に接続されている。
本実施の形態における上基板１３は、二酸化ケイ素（ＳｉＯ2）により形成されている。導電層３２および電極リード２２は、酸化インジウムスズ（ＩＴＯ）とアンチモンドープ酸化スズ（ＡＴＯ）とからなる２層構造とされ、スパッタ法等により上基板１３上に形成されている。また、電子受容層３３は、酸化物半導体である酸化チタン（ＴｉＯ2）により構成され、スパッタ法等によって導電層３２上に形成されている。
上基板１３、導電層３２、電極リード２２、および電子受容層３３の材質は一例であり、上述のものに限定されない。例えば、導電層３２は、白金、金、銀、銅等の金属、導電性セラミックス、金属酸化物等から形成することができる。電子受容層３３は、色素４１の励起によって放出される電子を受容できるエネルギー準位を取り得る物質であればよく、シリコン、ゲルマニウム等の単体半導体、硫化カドミウム（ＣｄＳ）等の化合物半導体、および有機半導体等から形成することができる。
また、電子受容層３３自体がＩＴＯやＡＴＯ等の導電性材料から構成されている場合には、電子受容層３３によって導電層３２を兼ねることも可能である。
なお、本実施の形態では、電子受容層３３の表面には蒸着等によって金属膜（金属層）（図示略）が形成されている。本実施の形態の金属膜は金（Ａｕ）とされているが、後述のプローブ３４と結合できる金属であれば特に限定されるものではなく、白金、銀、パラジウム、ニッケル、水銀、または銅等であってもよい。また、電子受容層３３の表面に金属膜を形成する方法として、スパッタ法、インプリント、スクリーン印刷、メッキ処理、またはゾルゲル法等を用いてもよい。
電子受容層３３上（金属膜上）には、色素４１で修飾された被検物質４２を捕捉するためのプローブ３４が固定されている。プローブ３４は、被検物質４２と特異的に結合可能な物質、例えば核酸、タンパク質、またはペプチドからなる。また、プローブ３４は、電子受容層３３上に設けられた金属膜と共有結合により強固に固定されている。
被検物質４２を修飾する色素４１としてはルテニウム錯体が用いられており、この色素４１は、被検物質４２にペプチド結合される。しかしながら、色素４１は、光源５（図２参照）によって励起され、電子を放出する物質であれば特に限定されるものではなく、例えば、金属錯体、有機色素および量子ドット等を用いることができる。光励起により電子を放出する物質の具体例としては、金属フタロシアニン、オスミウム錯体、鉄錯体、亜鉛錯体、９−フェニルキサンテン系色素、シアニン系色素、メタロシアニン系色素、キサンテン系色素、トリフェニルメタン系色素、アクリジン系色素、オキサジン系色素、クマリン系色素、メシロアニン系色素、ロダシアニン系色素、ポリメチン系色素、ポルフィリン系色素、フタロシアニン系色素、ローダミン系色素、キサンテン系色素、クロロフィル系色素、エオシン系色素、マーキュロクロム系色素、インジゴ系色素、およびセレン化カドミウム等を挙げることができる。
下基板１４は、二酸化ケイ素（ＳｉＯ2）により形成されている。また、対極２４、還元電極２６、および参照電極２８は、白金（Ｐｔ）によって形成され、スパッタ法により下基板１４上に設けられている。ただし、これら電極２４，２６，２８は、金、銀、銅、炭素、アルミニウム、ロジウム、インジウム等の金属や、酸化物半導体、導電性セラミックス等から構成することもでき、後述する電解液に対して安定であれば特に材質は限定されない。また酸化物半導体上に白金をスパッタ法により付着させたもの、またはＴｉＯ2(導電性セラミックス)上に金を蒸着により付着させた多層電極でもよい。
〔検出装置を用いた検出方法〕
以上に説明した検出チップ４を用い、検出装置１により被検物質を検出する方法について説明する。
図８は、ユーザにより検体試料を検出チップ４に注入する手順を示すフローチャートであり、図９は、検出装置１の検出動作手順を示すフローチャートである。
図８において、ステップＳ１でユーザは検体試料を検査チップ４の試料注入口１１から注入する。この検体試料に含まれる被検物質４２は予め色素４１で修飾されており、図７に示すように、作用電極２１の電子受容層３３に固定されたプローブ３４によって捕捉（核酸の場合にはハイブリダイゼーションと称呼されることもある）される。
ステップＳ２において、ユーザは、検査チップ４内の溶液を試料注入口１１より排出し、ハイブリダイゼーション洗浄液で検査チップ４内を洗浄する。プローブ３４は電子受容層３３の表面に設けられた金属膜との共有結合によって強固に固定されているため、ハイブリダイゼーション反応時および検体試料の洗浄時に、プローブ３４が電子受容層３３から剥離してしまうのを防止することができる。
ステップＳ３において、ユーザは、試料注入口１１から電解液を注入する。この電解液は、例えば電解質としてヨウ素、支持電解質塩としてテトラプロピルアンモニウムクロライド（ＮＰｒ４Ｃｌ）、および溶媒としてアセトニトリル（ＡＮ）と炭酸エチレン（ＥＣ）とを体積比で６：４に混合した有機溶媒を含んだものを用いることができる。検査チップ４内に電解液を注入すると、電解液中のヨウ素が、電子受容層３３上の金属膜（Ａｕ）を溶解させ、プローブ３４は電子受容層３３上に配置される。これにより後工程で説明する光照射により励起された色素４１から放出される電子は、効率よく電子受容層３３に受容される。
なお、本実施の形態では、プローブの固定は金属膜を利用したが、プローブを電子受容層上に強固に固定できればよく、例えばアミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）などのシランカップリング剤を用いてもよい。
その後、ユーザは検出装置１のチップ受入部３（図１参照）に検査チップ４を挿入し、ディスプレイ２上で測定開始の指示を行う。
検査装置１に供給された検査チップ４は、図７に示すように、その電極リード２２，２５，２７，２９が電流計６や電源９に接続される。電源９は、第１の電源９Ａと、第２の電源９Ｂとからなり、第１の電源９Ａは参照電極２８を基準として作用電極２１に０Ｖの電位を印加し、第２の電源９Ｂは参照電極２８を基準として還元電極２６に−０．３Ｖの電位を印加する（図９のステップＳ４）。
なお、本実施の形態において、参照電極２８は省略することが可能であり、この場合、第１，第２の電源９Ａ，９Ｂは、それぞれ対極２４を基準として作用電極２１に０Ｖ，還元電極２６に−０．３Ｖの電位を印加する。また、作用電極２１および還元電極２６に印加する電位の値は、適宜変更することができ、後述する電解質の酸化還元が十分に行われる場合には必ずしも各電極２１，２６には電位を印加しなくてもよい。
図９のステップＳ５において、光源５は、被検物質４２を修飾している色素４１に光を照射し、色素４１を励起させる。本実施の形態では、光源５はレーザー光を発するものとされ、上基板１３の外面（電子受容層３３とは反対側の面）からレーザー光を照射する。レーザー光によって励起された色素４１は電子を放出し、放出された電子は電子受容層３３に受容される。その結果、作用電極２１と対極２４との間には電解液を介して電流（光電流）が流れる。
ステップＳ６において、色素４１から電子受容層３３への電子の移動に起因して、作用電極２１と対極２４との間に流れる電流を電流計６で測定する。電流計６で測定された電流値は、色素の個数と高い相関性を有しているので、測定された電流値に基づき、被検物質４２の定量測定を行うことができる。
ここで、作用電極２１と対極２４との間の電流の流れ（電子の受け渡し）の原理について、図７を参照して説明する。光励起によって色素４１が電子を放出すると、電解液４３中のヨウ素（Ｉ-）は色素４１に対して電子を受け渡し、次式に示すように酸化され、（Ｉ3 -）となる。
式：３Ｉ- ⇔ Ｉ3 - ＋ ２ｅ-
一方、酸化によって生じた電解液４３中の（Ｉ3 -）は自然拡散によって対極２４へ移動し、対極２４から電子を受け取ることによって可逆的に（Ｉ-）に還元される。このようにして電解質の酸化還元が繰り返し行われ、作用電極２１と対極２４との間に電流が流れる。
前記のような酸化還元反応が繰り返し行われると、色素４１に電子を受け渡すことができる（Ｉ-）の濃度が低下していき、対極２４から作用電極２１への電子の流れが小さくなり、被検物質の検出感度が低下することがある。そのため、本実施の形態では、対極２４とは別に検査チップ４内に還元電極２６を設け、電解液４３中の（Ｉ3 -）に対して還元電極２６から電子を受け渡すことによって可逆的に（Ｉ-）に還元している。これによって（Ｉ3 -）の還元反応が促進され、（Ｉ-）の濃度を上昇させて作用電極２１と対極２４との間を流れる電流を増大させることにより、被検物質４２の検出精度を高めることが可能となっている。
図９のステップＳ７において、Ａ／Ｄ変換部７によってデジタル変換された電流値が制御部８に入力される。次に、制御部８で、予め作成された光電流値と被検物質４２の量との関係を示す検量線に基づき、デジタル変換された光電流値から検体試料中の被検物質４２の量を概算する。そして、概算された被検物質４２の量をディスプレイ２に表示するための検出結果画面を作成する。
そして、ステップＳ８において、制御部８によって作成された検出結果画面がディスプレイ２上に送信され、ディスプレイ２に表示され、処理が終了する。
前記実施の形態において、光源５は、色素４１を励起させるものであればレーザー光を発するものに限定されず、例えば、発光ダイオード（ＬＥＤ）、無機エレクトロルミネッセンス素子、有機エレクトロルミネッセンス素子等を用いることもできる。また、ハロゲンランプ、キセノンランプなどの白色光源や、白色光源と光学フィルターを組み合わせた励起光源でも良い。
各電極２１，２４，２６，２８は、電解液を介して互いに接触していればよいため、必ずしも異なる基板１３，１４上に形成されていなくてもよく、同一基板に形成されていてもよい。また、還元電極２６は、「くし形」に限定されるものではなく、平板状であってもよい。ただし、「くし形」に形成することによって、エッジ部分等の構造を因子として、電解質の還元効率を向上させることが可能となる。
〔実験１；還元電極による効果の検証〕
上述のような還元電極による効果を検証するために次のような実験を行った。この実験は、電解質の還元のために還元電極を使用した場合（実施例）と、還元電極を使用しない場合（比較例）とで、作用電極と対極との間の光電流値を測定し、両者の比較を行うことによって還元電極の有効性を検証するものである。
（電極の作製）
まず、本実験で使用する電極の作製について説明する。実施例および比較例において使用する作用電極は、二酸化ケイ素（ＳｉＯ2）で形成された基板の表面に、導電層と電子受容層とを兼ねた酸化インジウムスズ（ＩＴＯ；厚さ２００ｎｍ）およびアンチモンドープ酸化スズ（ＡＴＯ；厚さ１００ｎｍ）からなる２層の薄膜をスパッタ法により形成し、さらに電子受容層の表面に金（厚さ１０ｎｍ）からなる金属膜を真空蒸着法によって形成することによって作製した。
また、実施例の対極、還元電極、および参照電極は、二酸化ケイ素（ＳｉＯ2）からなる基板上に白金（Ｐｔ）からなる薄膜をスパッタ法によって形成することによって作製した。一方、比較例は、基板上に対極および参照電極のみを形成したものを使用した。
（プローブ物質の固定）
作用電極の電子受容層上（金属膜上）に、チオール基を有するＤＮＡ（２４ｂａｓｅ）からなるプローブを固定させた。この作業は、ＤＮＡ（２４ｂａｓｅ）を分散させた水溶液に作用電極を一定時間（約１４時間）浸漬し、水洗、乾燥させて行った。これにより、ＤＮＡのチオール基と電子受容層上の金属膜であるＡｕとの共有結合で、金属膜上にプローブが固定された。
（被検物質の調製）
被検物質として、プローブと相補的な塩基配列を含むＤＮＡに色素を結合させたものを作製した。色素は、ルテニウム錯体（商品名：Pulsar650、バイオサーチテクノロジーズジャパン社製）を使用し、ＤＮＡにルテニウム錯体をペプチド結合させた。
（被検物質とプローブとのハイブリダイゼーション）
ハイブリダイゼーション反応により、色素で修飾された被検物質を作用電極上のプローブで捕捉した。この作業は、作用電極上に色素で修飾したＤＮＡを注入し、所定温度（約４５℃）で加熱するとともに一定時間（約１時間）静置することによって行った。
（電解液の調製）
電解液は、溶媒としてアセトニトリル（ＡＮ）と炭酸エチレン（ＥＣ）とを体積比で６：４に混合したものに、支持電解質塩として０．６Ｍのテトラプロピルアンモニウムクロライド（ＮＰｒ４Ｃｌ）と、電解質として０．０６Ｍのヨウ素を溶解させて調製した。
（光電流の測定）
作用電極の電子受容層（金属膜）の周囲を間隔保持部材であるシリコーンゴム（厚さ０．２ｍｍ）で囲み、このシリコーンゴムによって形成された空間に８μＬの電解液を注入した。そして、電解液が注入された作用電極を、上方から対極、参照電極、および還元電極が形成された基板で密封した。これにより、作用電極、対極、参照電極、および還元電極を電解液に接触させた。
実施例の還元電極および作用電極には、電源によってそれぞれ参照電極を基準として−０．３Ｖ、０Ｖの電圧を印加した。一方、比較例では、作用電極に参照電極を基準として０Ｖの電圧を印加した。
そして、作用電極のプローブを固定した面とは反対側から光源によって光を照射した。
光源には、色素を励起させることができる特定の波長（波長約４７３ｎｍ、強度約１３ｍＷ）のレーザー光を発光するものを用い、これを所定の周期（１Ｈｚ）で点滅（ｏｎ・ｏｆｆ）させた。また、作用電極２１と対極２４との間を流れる光電流の測定値として、レーザー光の点滅（ｏｎ・ｏｆｆ）により増減する光電流を電流計で観測するとともに、その光電流の増加量を求めた。
（測定結果）
図１０は、実験１において作用電極と対極との間を流れる光電流の値を測定した結果を示すグラフである。この図において、ハッチングを施したグラフが還元電極を使用した場合（実施例）であり、白抜きのグラフが還元電極を使用しない場合（比較例）である。また、実施例と比較例との双方について、プローブと被検物質とをハイブリダイズさせる工程を行った場合（図中左側のグラフ）と、行わなかった場合（図中右側のグラフ）の光電流値の測定結果も示している。プローブと被検物質とをハイブリダイズさせる工程を行わなかった場合、電極自体が光源の光照射によって励起され、作用電極と対極との間には電極由来の電流が流れ、ノイズとなる。
実施例において、プローブと被検物質とをハイブリダイズさせる工程を行った場合の光電流値は３７．０ｎＡであったのに対して、比較例においてプローブと被検物質とをハイブリダイズさせる工程を行った場合の光電流値は２４．０ｎＡであった。したがって、実施例のように還元電極を備えると、作用電極と対極との間の光電流値が増大し、被検物質の検出感度が向上することが分かる。
また、実施例において、プローブと被検物質とをハイブリダイズさせる工程を行わなかった場合の光電流値は２３．８ｎＡであり、比較例において、ハイブリダイズさせる工程を行わなかった場合の光電流値は１６．４ｎＡであった。したがって、実施例と比較例とのＳ／Ｎを比較すると、実施例ではＳ／Ｎ＝３７．０／２３．８＝１．５５となり、比較例ではＳ／Ｎ＝２４．０／１６．４＝１．４６となる。つまり、実施例では、Ｓ／Ｎの値が高まり、被検物質の検出精度が向上することが分かる。
〔実験２；光電流値の時間的変化の検証〕
この実験では、作用電極で検出される光電流値の時間的変化を測定した。
（電極の作製）
図１１に示すように、作用電極は、二酸化ケイ素（ＳｉＯ2）で形成された基板の表面に、酸化インジウムスズ（ＩＴＯ；厚さ２００ｎｍ）およびアンチモンドープ酸化スズ（ＡＴＯ；厚さ１００ｎｍ）の２層からなる導電層をスパッタ法により形成し、導電層の表面に、二酸化チタン（ＴｉＯ2）からなる電子受容層を形成することによって作製した。
対極、参照電極、および還元電極は実験１と同様に作製した。
（被検物質の調製）
本実験では、電子受容層３３の表面にプローブを固定せず、色素を修飾した被検物質（ＤＮＡ）を直接的に固定した。この固定には、核酸が有するチオール基とＴｉＯ2との結合、および燐酸基とＴｉＯ2との結合を利用した。
色素は、実験１と同様にルテニウム錯体（商品名：Pulsar650、バイオサーチテクノロジーズジャパン社製）を使用し、被検物質としてのＤＮＡにルテニウム錯体をペプチド結合させた。
（電解液の調製）
電解液は、実験１と同様に調製した。
（光電流の測定）
実験１と同様に、作用電極および還元電極には、それぞれ参照電極を基準として０Ｖ、−０．３Ｖの電位を印加した。そして、実験１と同様の光源によって、レーザー光を１Ｈｚ周期で点滅し、作用電極の電子受容層とは反対側の面に照射した。
（測定結果）
図１２は、実験２において作用電極で検出された光電流値の経時的変化を示すグラフである。作用電極で検出される光電流は、光源の点滅によって増減する。そして、光源ｏｆｆからｏｎまでの増加量Ｌは、時間の経過と共に増大していることが分かる。これは、還元電極の存在によって、電解液中の電解質、すなわちヨウ素の還元量が徐々に増えることに基づいていると考えられる。
また、図１３は、実験２において作用電極において検出された光電流値と、還元電極において検出された電流値とを示すグラフである。それぞれの値は、図１２における電流値の増加量Ｌをとったものである。
この実験から、測定開始直後（グラフ左端）では作用電極における光電流値や還元電極における電流値は小さいが、時間の経過によっていずれも漸増していることが分かる。これは、測定開始直後は、還元電極に所定の電位を印加しても直ちに還元される電解質は少なく、光電流値にはすぐに反映されないが、時間が経過すると還元電極による還元反応が徐々に活発になると考えられるからである。したがって、被検物質の検出感度を高めるには、測定開始からある程度の時間の経過が必要であることが分かる。
また、測定開始直後（グラフ左端）の光電流値は、還元電極の影響をほとんど受けていないと考えられることから、還元電極がない場合の光電流値とほぼ等しい値であると推定することができる。そして、このように推定される光電流値は約２５ｎＡであり、約２０秒後の光電流値は約４３ｎＡであることから、還元電極の存在によって約１．７倍の光電流値を取り出すことが可能であると考えられる。
〔実験３；還元電極に印加する電位の検討（Ｉ）〕
この実験では、電源によって還元電極に印加する電位を検討するため、電解液の電気化学的挙動を示すサイクリックボルタモグラムの測定を行った。
この実験には、電解液として実験１および２と同様のものを用い、電極として白金（Ｐｔ）により形成されたものを用いた。また、電極の形状は、図６に示す還元電極２６と同様の「くし形」電極（５μｍ幅の線状部を１０μｍピッチで設けたもの）と、電極表面に複数の穴（ウェル）を備えた「ウェル形」電極（穴径３μｍの穴を１０μｍピッチで形成したもの）との２種類を用いた。
図１４は、実験３において電解液のサイクリックボルタモグラムの測定結果を示すグラフである。電極には、負に大きな電位（図１４の左側）から正に大きな電位（図１４の右側）へと印加し、これを６サイクル測定した。電位の掃引速度は１０ｍＶ／ｓとした。
この結果から、電極に印加する電位が概ね０Ｖよりも小さい場合にマイナス電流、すなわち還元電流が検出されていることが分かる。また、「くし形」、「ウェル形」の双方において還元電流が効果的に流れていると考えられる電位は−０．５Ｖ以上０Ｖ未満の範囲であり、この範囲に還元電極の電位を設定すれば、好適に電解質の還元反応を促進することができると考えられる。
〔実験４；還元電極２６に印加する電位の検討（II）〕
この実験では、実験３の測定結果をふまえ、還元電極に印加する電位を所定の範囲で変化させながら光電流値の測定を行った。
（電極の作製）
作用電極は、二酸化ケイ素（ＳｉＯ２）からなる基板上に酸化インジウムスズ（ＩＴＯ；厚さ２００ｎｍ）からなる電子受容層を形成し、エタノール（ＥｔＯＨ）中で所定時間（約１０分）の超音波洗浄を行った。ついで、１％ＡＰＴＥＳ溶液（溶媒：トルエン）に作用電極を１時間浸漬し、トルエンで余分なＡＰＴＥＳを洗い流した。
対極、作用電極、および還元電極は実験１と同様に作製した。
（被検物質の調製）
１０μＭの色素で修飾されたＤＮＡを４μＬ作用電極上に滴下し、カバーガラスで密封した状態で所定時間（約１８時間）、所定の温度（約３７℃）で浸漬固定した。ついで、作用電極を超純水により洗浄した。
（光電流の測定）
まず、作用電極上に実験３と同様の電解液（約８μＬ）を注入した。
さらに、作用電極上には、直径約１０μｍのシリカビーズを分散させて設けた。このシリカビーズは、実験１で用いたシリコーンゴムの代替となるものであり、作用電極と、対極、参照電極、および還元電極（以下、対極等ともいう）との間に電解液を注入するための空間を形成するものである。実験１では、作用電極と対極等との間隔はシリコーンゴムによって約０．２ｍｍに設定されていたが、本実験では、作用電極と対極等との間隔がシリカビーズの直径である約１０μｍに設定された。
ついで、電解液が注入された作用電極を、上方から対極、参照電極、および還元電極が形成された基板で密封した。これにより、作用電極、対極、参照電極、および還元電極を電解液に接触させた。
ついで、作用電極に、電源によって参照電極を基準として０Ｖの電位を印加した。そして、還元電極に、参照電極を基準として０Ｖから−０．５Ｖの範囲の電位を経時的に変化させながら印加した。また、作用電極のプローブを固定した面とは反対側に、光源によって光を照射した。光源には、色素を励起させることができる特定の波長（波長約４８８ｎｍ、強度約１３ｍＷ）のレーザー光を発光するものを用いた。
そして、光照射によって作用電極と対極との間を流れる光電流を電流計により測定した。
（測定結果）
図１５は、実験４において還元電極に印加する電位の変化に応じた光電流値を測定した結果を示すグラフである。還元電極には、グラフの左側から右側へ向かう順番で、所定の時間間隔（約１分）ごとに０Ｖ〜−０．５Ｖの範囲で電位を変化させながら印加している。ただし、左端と右から２番目の白抜きのグラフは、還元電極に対して電圧を印加しなかった場合の光電流値を示し、その他のハッチングを施したグラフは、還元電極に対して電位を印加した場合の光電流値を示している。
図１５に示すように、測定開始直後は、還元電極に電圧を印加しておらず、そのときの光電流値は３．４１ｎＡであった。その後、還元電圧に印加する電位を約１分ごとに負の方向へ大きくしていくと、還元反応が促進されることよって光電流値は徐々に上昇していることが分かる。特に、−０．２Ｖから−０．３Ｖへ電位が変化したときには、１ｎＡ以上の大きな光電流値の上昇が見られる。
還元電極に−０．３Ｖの電位を印加したのち、一旦、還元電極への電位の印加を止め、その後、約１２分経過してから還元電極に再び−０．５Ｖの電位を印加した。−０．５Ｖの電位を印加することにより、光電流がさらに上昇していることが分かる。したがって、本実験から、還元電極に印加する電位が０Ｖ未満−０．５Ｖ以上の範囲であれば、いずれの電位においても好適に光電流値を上昇させ、被検物質の検出感度を高めることが可能であることが分かる。
一方、還元電極に印加する電位を−０．５Ｖよりもさらに負の方向に大きくすると、電解質や被検物質としてのＤＮＡ、またはプローブとしてのＤＮＡの電気分解反応が起こり、測定結果が不安定になる可能性がある。
なお、図１５において、電位を−０．３Ｖから−０．５Ｖに変化させる過程で電位の印加を止めているが、この間にも光電流値は増大している（右から２番目の白抜きのグラフ）。これは、電位の印加を止めるまでの段階で、還元電極によって還元反応が促進され、電解液中の（Ｉ-）の濃度が高められているためと考えられる。
〔実験５；電極間の間隔の検討〕
本実験では、作用電極と対極等との間隔を実験１とは異ならせた状態で光電流値を測定し、作用電極と対極等との間隔と光電流値の関係について検討した。具体的には、作用電極と対極等との間に約２００ｎｍの間隔を形成した状態で光電流を測定し、この測定値を、約２００μｍの間隔を形成した場合の光電流の測定値と比較した。
（作用電極の作製および被検物質の調製）
作用電極の作製および被検物質の調製は、前記実験４と同様に行った。
（対極、還元電極、および参照電極の作製）
還元電極は、実験３で使用した「ウェル形」電極（穴径３μｍの穴を１０μｍピッチで形成したもの）と同様に作製した。また、対極、還元電極、および参照電極は、実験１と同様に、二酸化ケイ素（ＳｉＯ2）からなる基板上に白金（Ｐｔ）からなる薄膜をスパッタ法によって形成した。
（電解質の調製）
電解液は、溶媒としてアセトニトリル（ＡＮ）と炭酸エチレン（ＥＣ）とを体積比で６：４に混合したものに、支持電解質塩として０．６Ｍのテトラプロピルアンモニウムヨーダイド（ＮＰｒ４ｌ）と、電解質として０．０６Ｍのヨウ素とを溶解させて調製した。
（光電流の測定）
まず、作用電極上に電解液（約１μＬ）を滴下した。そして、作用電極上に、直径約２００ｎｍのシリカビーズを分散させた状態で設けた。このシリカビーズによって、作用電極と対極等との間に電解液を注入するための間隔（空間）を形成した。実験１では、シリコーンゴムにより形成される間隔は約２００μｍ（０．２ｍｍ）であったが、本実験ではシリカビーズにより形成される間隔がシリカビーズの直径である約２００ｎｍとなった。
電解液が注入された作用電極を、上方から対極、参照電極、および還元電極が形成された基板で密封した。これにより、作用電極、対極、参照電極、および還元電極を電解液に接触させた。
作用電極には、参照電極を基準として０Ｖの電位を印加し、還元電極には、参照電極を基準として−０．１Ｖの電位を印加した。また、作用電極のプローブを固定した面とは反対側に対して光源から光を照射した。光源には、色素を励起させることができる特定波長（波長約４８８ｎｍ、強度約１３ｍＷ）のレーザー光を発光した。
そして、光照射によって作用電極と対極との間を流れる光電流を電流計により測定した。
（測定結果）
図１６は、実験５において、作用電極と対極との間を流れる光電流の測定結果を示すグラフである。図１６において、左端の白抜きグラフは、厚さ約２００μｍのシリコーンゴムを用い、さらに還元電極に電位を印加しなかった場合の光電流の測定結果を示す。また、直径約２００ｎｍのシリカビーズを用いた場合の光電流の測定を３回行い、各測定結果を図１６のＮｏ．１〜Ｎｏ．３に示した。Ｎｏ．１〜Ｎｏ．３の各測定においては、還元電極に電位を印加した場合としない場合との２つのパターンで光電流を測定し、その測定結果をそれぞれハッチングを施したグラフと白抜きのグラフに示した。
Ｎｏ．１〜Ｎｏ．３に示す測定結果において、還元電極に電位を印加した場合と、印加しない場合とを比較すると、前者の方が光電流値が高くなっている。したがって、還元電極に電位を印加することによって電解質の還元反応が促進されていると判断できる。また、作用電極と対極等との間隔が２００μｍの場合と２００ｎｍの場合とを比較すると、前者の測定値が２１．８ｎＡであるのに対して、後者の測定値は３３．１ｎＡ（Ｎｏ．１）であり、還元電極に電位を印加していなくても光電流値は約１．５倍に増大している。したがって、作用電極と対極等との間隔は小さいほど効果的であることが分かる。また、還元電極にはあえて電位を付与しなくても、自然電位の状態で電解質を還元可能な電位に保持される材質の電極（本実験では白金）であれば、還元電極として使用可能であることが分かる。
なお、上述の各実験で使用した電極、電解液、光源等の構成は、実施の形態における検査チップや検査装置および方法に適用することが可能である。
本発明の一実施の形態に係る検出装置を示す斜視図である。 図１に示される検出装置の構成を示すブロック図である。 本発明の一実施の形態に係る検査チップを示す斜視図である。 図３に示される検査チップを示す断面図である。 図３に示される検査チップの上基板を下面側から見た平面図である。 図３に示される検査チップの下基板を上面側からみた平面図である。 図３に示される検査チップを模式的に表した概略図である。 ユーザにより検体試料を検出チップに注入する手順を示すフローチャートである。 検出装置の検出動作手順を示すフローチャートである。 実験１において、作用電極と対極との間を流れる光電流の測定結果を示すグラフである。 実験２で使用した作用電極を模式的に示す概略図である。 実験２において、作用電極で検出された光電流値の経時的変化を示すグラフである。 実験２において、作用電極において検出された光電流と、還元電極において検出された電流とを示すグラフである。 実験３において、電解液のサイクリックボルタモグラムの測定結果を示すグラフである。 実験４において、還元電極に印加する電位の変化に応じた光電流の測定結果を示すグラフである。 実験５において、作用電極と対極等との間の間隔を変化させた場合の光電流の測定結果を示すグラフである。
符号の説明
１ 検出装置
３ 検査チップ受入部
４ 検査チップ
５ 光源
６ 電流計（電流測定部）
９ 電源（電位印加部）
２１ 作用電極
２４ 対極
２６ 還元電極

Claims (9)

  1. 光励起により電子を生じる修飾物質で修飾された被検物質を検出する方法であって、
    半導体層を備えている作用電極と、前記被検物質を捕捉可能でありかつ前記半導体層上に固定されるプローブと、導電性材料からなる対極と、電解質を還元するための還元電極と、を備えている検査チップに前記被検物質を含む試料を適用し、前記プローブによって前記被検物質を捕捉する工程と、
    前記作用電極、前記対極、および前記還元電極に電解質を含む電解質媒体を接触させた状態で、前記プローブによって捕捉された前記被検物質を修飾している修飾物質に当該修飾物質を励起させる光を照射する工程と、
    前記光によって励起された修飾物質から前記作用電極への電子の移動により前記作用電極と前記対極との間を流れる電流を測定する工程と、
    前記電解質媒体に含まれている電解質を前記還元電極によって還元する工程と、
    を含む被検物質の特異的検出方法。
  2. 前記還元電極によって前記電解質を還元する工程が、前記還元電極に電位を印加した状態で行われる請求項１に記載の被検物質の特異的検出方法。
  3. 前記還元電極によって前記電解質を還元する工程が、前記対極を基準として−０．５Ｖ以上０Ｖ未満の電位を前記還元電極に印加した状態で行われる請求項１に記載の被検物質の特異的検出方法。
  4. 前記還元電極が、前記電解質を還元可能な自然電位に保持されている請求項１に記載の被検物質の特異的検出方法。
  5. 前記プローブは、核酸、タンパク質またはペプチドである請求項１〜４のいずれか１つに記載の被検物質の特異的検出方法。
  6. 前記電解質はヨウ素またはヨウ化物である請求項１〜５のいずれか１つに記載の被検物質の特異的検出方法。
  7. 光励起により電子を生じる修飾物質で修飾された被検物質を検出する検出装置であって、
    半導体層を備えている作用電極と、前記被検物質を捕捉可能でありかつ前記半導体層上に固定されるプローブと、導電性材料からなる対極と、前記作用電極および前記対極に接触される電解質媒体に含まれた電解質を還元するための還元電極と、を備えている検査チップを、受入可能に構成された検査チップ受入部と、
    前記検査チップ受入部に受け入れられた前記検査チップ内の被検物質を修飾している修飾物質に当該修飾物質を励起させる光を照射する光源と、
    前記還元電極に電位を印加するための電位印加部と、
    前記光源から照射された光によって励起された修飾物質から前記作用電極への電子の移動により前記作用電極と前記対極との間を流れる電流を測定する電流測定部と、
    を備えている被検物質の特異的検出装置。
  8. 光励起により電子を生じる修飾物質で修飾された被検物質を検出するための検査チップであって、
    半導体層を備えている作用電極と、
    前記被検物質を捕捉可能でありかつ前記半導体層上に固定されるプローブと、
    導電性材料からなる対極と
    前記作用電極および前記対極に接触される電解質媒体に含まれた電解質を還元するための還元電極と、を備えている検査チップ。
  9. 前記還元電極は、複数の線状部材が並列して配置された形状からなる電極である請求項８に記載の検査チップ。
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