JP4919101B2 - 増感色素の光励起により生じる光電流を用いた被検物質の特異的検出に用いられるセンサセルおよび測定装置 - Google Patents

Description

発明の分野
本発明は、光電流を用いて、核酸、外因性内分泌攪乱物質、抗原等の特異的結合性を有する被検物質を特異的に検出する方法に用いられる、センサセルおよび測定装置に関する。

背景技術
生体試料中のＤＮＡを解析する遺伝子診断法が、各種病気の新たな予防および診断法として、有望視されている。このようなＤＮＡ解析を簡便かつ正確に行う技術として、以下のものが提案されている。

被検体ＤＮＡを、これと相補的な塩基配列を有し、かつ蛍光物質を標識されたＤＮＡプローブとハイブリダイズさせ、その際の蛍光シグナルを検出する、ＤＮＡの分析方法が知られている（例えば、特許文献１（特開平７−１０７９９９号公報）および特許文献２（特開平１１−３１５０９５号公報）参照）。この方法にあっては、ハイブリダイゼーションによる二本鎖ＤＮＡの形成を色素の蛍光により検出する。

また、一本鎖に変性された遺伝子サンプルを、これに相補性を有する一本鎖の核酸プローブとハイブリダイゼーションさせた後、インターカレータ等の二本鎖認識体を添加して電気化学的に検出する方法が知られている（例えば、特許文献３（特許公報第２５７３４４３号）および非特許文献１（表面科学Vol. 24, No. 11. Pp. 671-676, 2003）参照）。この方法に使用されるセルは、セル容器に試料溶液を注入した後に電極を浸漬させる等のセンサセルの構築が行われるため、構築されたセンサセル内を電解液が流れる、いわゆるフローセル構造を有するものではない。

ところで、増感色素を用いて光から電気エネルギーを発生させる太陽電池が知られている（例えば、特許文献４（特開平１−２２０３８０号公報）参照）。この太陽電池は、多結晶の金属酸化物半導体を有し、かつその表面積に広範囲にわたり増感色素の層が形成されてなるものである。しかしながら、このような電極を生物化学的な分析に応用しようとする試みは未だなされていない。
特開平７−１０７９９９号公報 特開平１１−３１５０９５号公報 特許公報第２５７３４４３号 特開平１−２２０３８０号公報 表面科学Vol. 24, No. 11. Pp. 671-676, 2003

本発明者らは、被検物質とプローブ物質との直接または間接的な特異的結合を介して作用電極に増感色素を固定させ、この増感色素を光励起させて発生する光電流を検出することにより、被検物質を高感度で簡便かつ正確に検出および定量出来るとの知見を得ている。そして、本発明者らは、今般、増感色素の光励起により生じる光電流を用いた被検物質の特異的検出に用いられるセンサセルとして、電解液等が流れるための流路を設けたセルを使用することにより、上記方法による被検物質の測定精度をさらに向上でき、なおかつ洗浄等の各種処理を簡単に行えるとの知見を得た。

したがって、本発明は、増感色素の光励起により生じる光電流を用いた被検物質の特異的検出に用いられる、高い測定精度を有し、かつ洗浄等の各種処理を簡便に行えるセンサセルおよび測定装置を提供することをその目的としている。

そして、本発明による、増感色素の光励起により生じる光電流を用いた被検物質の特異的検出に用いられるセンサセルは、
導電性基材と、その上に設けられた、前記増感色素が光励起に応じて放出する電子を受容可能な電子受容物質を含んでなる電子受容層とを備えてなる作用電極と、
前記作用電極と対向して設けられる対電極と、
前記作用電極および対電極と組み合わせられることにより流路を構成するセル基材と、 前記作用電極、前記対電極、および前記セル基材の少なくともいずれか一つに形成される、前記流路に連通する供給口と、
前記作用電極、前記対電極、および前記セル基材の少なくともいずれか一つの、前記供給口と異なる位置に形成される、前記流路に連通する排出口と
を備えてなり、前記電子受容層および前記対電極が前記流路に露出してなるものである。

また、本発明による、増感色素の光励起により生じる光電流を用いた被検物質の特異的検出に用いられる測定装置は、
上記センサセルと、
前記作用電極と前記対電極との間を流れる電流を測定する電流計と
前記流路内への液の供給および停止を制御する送液手段と
を備えたものである。

センサセル
本発明によるセンサセルは、増感色素の光励起により生じる光電流を用いた被検物質の特異的検出に用いられるものである。図１および２に本発明のセンサセルの一例を示す。図１および２に示されるように、本発明のセンサセル１は、セル基材２と、作用電極３と、対電極４とを備えてなる。本発明においてセル基材とは、作用電極および対電極と組み合わせられることにより流路を構成する部材であれば限定されず、流路を構成するための溝または開口部を備えた部材であることができる。ここで、流路とは、電解液等の液を流し、かつ収容するための空間である。本発明に用いる作用電極は、導電性基材と、その上に設けられた電子受容層とを備えた電極であり、電子受容層側が流路に露出するように配置される。また、この作用電極は、光励起のための光を容易に電子受容層に照射できるように透光性を有しているのが好ましい。この作用電極は、そして、作用電極および対電極は互いに対向して、なおかつ、セル基材との組み合わせにより流路を形成するように設けられる。すなわち、図２に示されるように、流路２ａは、セル基材２、作用電極３、および対電極４によって区画されてなる。上記構成によれば、作用電極の電子受容層および対電極が互いに対向された状態で流路内に露出するので、流路内が電解液で満たされることによりこの組立物は光電流測定用のセンサセルとして機能することができる。

そして、作用電極、対電極、およびセル基材の少なくともいずれか一つには、流路に連通する供給口および排出口とがそれぞれ形成されることにより、流路内に電解液等の各種処理液を流すことができるようにされてなる。すなわち、図２に示されるように、電解液等の液が供給口２ｂからセンサセル内に供給され、流路２ａを流れた後、排出口２ｃから排出されることができる。したがって、本発明のセンサセルによれば、作用電極および対電極を備えたセンサセルを構築した後に、電気化学的測定のための電解液を流路に流し込むことができる。これにより、セル容器に電解液を注入した後に電極等の配置が行なわれる従来型のセンサセルにおいて起こりがちな、セル構築時における電解液の漏れを効果的に防止することが出来る。特に上記従来型のセンサセルにあっては、所定量の電解液を充填させたセル容器に電極を浸漬し、あるいは電極で電解液を挟持させなければならないため、電解液がこぼれたり、漏れたりする可能性がある。このような電解液の損失があると、測定毎にセンサセル内の電解液の量にばらつきが生じてしまい、測定精度を低下しかねない。これに対し、本発明のセンサセルによれば、セル内に電解液を隙間無く充填させ、かつ、セル内に充填された電解液の漏れを効果的に防止出来るので、セル内の電解液量を高い精度で一定に保つことができる。その結果、測定精度を向上させることが出来るものと考えられる。

さらに、本発明のセンサセルによれば、流路には電解液のみならず、センサセルに使用可能な各種処理液を流すことができる。例えば、被検物質を含む試料液、または試薬を含む試薬溶液を流路に流すことができる。また、測定後には洗浄液を流路に流すことができる。したがって、本発明のセンサセルによれば、サンプルの交換に伴う電解液の交換、被検物質を含む試料液の供給、試薬溶液の供給、洗浄液にセル内（特に作用電極）よる洗浄等の各種処理を、処理液を系内に流すだけという極めて簡単な手法により行うことが出来る。すなわち、測定に使用する試料液あるいは試薬溶液の電極への送液を自動的に行うことができるので、溶液と電極の接触時間の制御を容易に行うことができ、各測定間のバラツキを低減して測定精度を向上できる。
本発明の好ましい態様によれば、センサセルはフローセルとするのが好ましい。フローセルの採用により、容積を小さくすればするほど液交換が容易になり、溶液間の不要な混合を低減することができる。本発明のより好ましい態様によれば、異なる溶液に交換する際にはエアセグメントを入れて異なる溶液間の混合を防止するのが好ましい。このエアセグメントの導入は、空気を採り入れる分岐管を送液手段に設ける等、バルブ機構を適宜工夫することにより行うことができる。

本発明の好ましい態様によれば、図１および２に示されるように、セル基材２が、流路を構成するための溝２ａ、流路に連通する供給口２ｂおよび排出口２ｃを備えた基板であり、溝２ａの底部に対電極４が配置されるとともに、溝２ａが作用電極３で覆われてなるのが好ましい。すなわち、溝２ａが作用電極３で覆われることにより形成される空間が流路となる。これら供給口２ｂおよび排出口２ｃを介して電解液等の液を流路内に効率的に供給しかつ排出させることができる。

本発明の好ましい態様によれば、センサセルの最上部に、作用電極、対電極、および／またはセル基材に互いに密着させるように下方に押さえる押さえ部材を設けるのが好ましい。図１および２に示されるセンサセル１にあっては、作用電極３上に作用電極３をセル基材２に密着させるための押さえ部材５が載置されている。この押さえ部材を用いることにより、セルの各構成部材を押さえつけて密着させることができるので、電解液等の液の漏れを効果的に防止することができる。また、押さえ部材を設けることによって、作用電極を容易に着脱できるので、操作性やメンテナンス性に優れた装置を提供できる。

本発明の好ましい態様によれば、図１および２に示されるように、押さえ部材５が、光励起のための光を通すための開口部５ａをさらに備えてなるのが好ましい。また、開口部に代えて、透光性を有する部材からなる透光部を備えるものであってもよい。本発明の好ましい態様によれば、開口部または透光部を複数個設けて、複数スポットの被検物質をスポット毎に個別に光照射できるようにしてもよく、この場合、他のスポットへの光の漏洩を防ぐために、押さえ部材は開口部および透光部を除いて遮光性を有するのが好ましい。

本発明の好ましい態様によれば、図１および２に示されるように、押さえ部材５の開口部５ａまたは透光部の外側に光源６をさらに備えることができる。本発明に用いる光源としては、標識色素を光励起できる波長の光を照射できるものであれば限定されず、好ましい例としては、蛍光灯、ブラックライト、殺菌ランプ、白熱電球、低圧水銀ランプ、高圧水銀ランプ、キセノンランプ、水銀−キセノンランプ、ハロゲンランプ、メタルハライドランプ、ＬＥＤ（白色、青、緑、赤）、レーザー光、太陽光を用いることができ、より好ましくは、蛍光灯、白熱電球、キセノンランプ、ハロゲンランプ、メタルハライドランプ、ＬＥＤ（白色、青、緑、赤）、太陽光等を挙げることができる。また、必要に応じて、分光器やバンドパスフィルターを用いて特定波長領域の光のみを照射してもよい。本発明に用いる光源としては、光源位置が固定されたもののみならず、光源位置が作用電極の面に対して平行に移動可能なものも包含される。

本発明の好ましい態様によれば、作用電極と対電極との間隔が３〜３０００μｍであるのが好ましく、より好ましくは５〜２０００μｍであり、さらに好ましくは１０〜１０００μｍである。電極間の距離は酸化還元のサイクルを効率良く行わせるためには短い方が好ましいが、工作的な精度を確保するためには上記範囲内とすることが望ましい。また、いわゆるMEMS 的な製造方法を利用するのであれば、より近接した電極間距離とすることも可能である。

本発明の好ましい態様によれば、リード線３ａが作用電極３に電気的に接続され、作用電極外に延出されるとともに、リード線４ａが対電極４に電気的に接続され、対電極４外に延出されることにより、電気的な接続を容易に確保出来るように構成されることができる。

溝を備えたセル基材を使用したセンサセルの他の一例を図３に示す。図３に示されるセンサセル１０１は、流路を構成するための溝を備えたセル基材を用いる点で図１および２に示されるセンサセルと同様であるが、溝の底部には作用電極が配置される。具体的には、セル基材１０２は、流路を構成するための溝１０２ａ、流路に連通する供給口１０２ｂおよび排出口１０２ｃを備えた基板であり、溝１０２ａの底部に作用電極１０３が配置されるとともに、溝１０２ａが対電極１０４で覆われてなる。したがって、溝１０２ａが対電極１０４で覆われることにより形成される空間が流路となる。これら供給口１０２ｂおよび排出口１０２ｃを介して電解液等の液を流路内に効率的に供給しかつ排出させることができる。この態様のセンサセルによれば、作用電極およびセル基材を一体化させた状態で、サンプル交換等の取り扱いが可能となる。この態様にあっては、作用電極に光励起のための光が照射される必要があるので、セル基材は透光性を有する。

また、セル基材１０２上には押さえ部材１０５が載置されており、これにより、セル基材１０２および対電極１０４が互いに密着させるように下方に押さえられている。押さえ部材１０５は、セル基材の供給口１０２ｂおよび排出口１０２ｃに対応する位置に送液手段１０８を備えるとともに、作用電極１０３に対応する位置に光源１０６を備えてなる。さらに、リード線１０３ａが作用電極１０３に電気的に接続され、押さえ部材１０５内を経由して作用電極外に延出されるとともに、リード線１０４ａが対電極１０４に電気的に接続され、対電極１０４外に延出されることにより、電気的な接続が確保されている。

溝内に作用電極を備えたセル基材を使用したセンサセルの他の一例を図４に示す。図４に示されるセンサセル２０１は、溝２０２ａの底に作用電極２０３が配置されたセル基材２０２を用いる点で図３に示されるセンサセルと同様であるが、セル基材２０２および作用電極２０３の下方に光源２０６および送液手段２０８が配置されるとともに、セル基材２０２および作用電極２０３の上方に対電極２０４および押さえ部材２０５が配置されている。すなわち、光源は、透光性を有する透光性を有するセル基材の外側下方に配置される。このように光源を下方に配置することにより、光源およびそれを制御する機構の重量および大きさの制約が緩和されるので、光源の設計の自由度が高まる。したがって、この態様は、縦横方向に移動させる移動型光源等、複雑な制御を要する光源の使用に適する。

本発明の別の好ましい態様によるセンサセルを図５および６に示す。図５および６に示されるセンサセル１１にあっては、セル基材１２として、流路を構成するための開口部１２ａを備えたスペーサを用い、スペーサ１２が作用電極１３と対電極１４との間に挟持されてなる。すなわち、スペーサの開口部１２ａが作用電極１３および対電極１４で挟まれて形成される空間が流路となる。本発明に用いるスペーサは、作用電極と対電極との間隔を規定することができる、絶縁性を有する部材であれば限定されないが、効果的に液漏れを防止出来る点でパッキンを用いるのが好ましい。パッキンを構成する好ましい材料としては、シリコーンゴムシート、フッ素ゴム、天然ゴム、スチレン・ブタジエンゴム、ブタジエンゴム、エチレン・プロピレンゴム、ブチルゴム、ニトリルゴム、クロロプレンゴム、クロロスルフォン化ポリエチレンゴム、ウレタンゴム、アクリルゴム、ヒドリンゴム、水素化ニトリルゴム、多硫化ゴム、およびポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）が挙げられる。

本発明の好ましい態様によれば、図５および６に示されるように、対電極１４を裏面から支持する支持基材１７をさらに設けることにより、対電極の強度を補強するのが好ましい。

本発明の好ましい態様によれば、図５および６に示されるように、支持基材１７および対電極１４が、流路に連通する供給口１７ａ，１４ａおよび排出口１７ｂ，１４ｂを備えてなるのが好ましい。これら供給口および排出口を介して電解液等の液を流路内に効率的に供給しかつ排出させることができる。

本発明の好ましい態様によれば、図５および６に示されるセンサセル２１にあっては、作用電極１３上に、セル基材１２、作用電極１３、対電極１４、および支持基材１７を互いに密着させるように下方に押さえる押さえ部材１５が載置されている。この押さえ部材を用いることにより、セルの各構成部材を押さえつけて密着させることができるので、電解液等の液の漏れを効果的に防止することができる。また、作用電極および光源を押さえ部材の側に設けることにより、作用電極を容易に着脱できるので、操作性やメンテナンス性を向上できる。また、押さえ部材１５は、光励起のための光を通すための開口部１５ａをさらに備えてなる。また、開口部に代えて、透光性を有する部材からなる透光部を備えるものであってもよい。

本発明の好ましい態様によれば、図５および６に示されるように、押さえ部材１５の開口部上方１５ａに光源１６をさらに備えるものであることができる。本発明に用いる光源については、既に述べた通りである。

本発明の好ましい態様によれば、押さえ部材が、ねじ、バネ、および磁石からなる群から選択される少なくとも１種の固定手段をさらに備えてなり、固定手段を介して押さえ部材、作用電極、対電極、セル基材、および／または支持基材に着脱可能に固定されてなるのが好ましい。この結合手段を用いることにより、セルの各構成部材をより強力に密着させることができるので、電解液の漏れをより一層効果的に防止することができる。しかも、上記結合手段は容易に取り外し可能なものであるため、サンプル交換およびメンテナンスも容易に行うことができる。

本発明のさらに別の好ましい態様によるセンサセルを図７および８に示す。図７および８に示されるセンサセル１１１にあっては、押さえ部材として遮光性押さえ部材１１５を用い、作用電極１１３の電気的接続を確保するためのコンタクトプローブ１１９を支持基材１１７に設け、対電極１１４を支持基材１１７に固定するための固定手段１２０，１２１、さらには光源として移動型光源１１６が用いたこと以外は、図５および６に示されるセンサセルと同様の構成を基本的に有する。

図７および８に示される遮光性押さえ部材１１５は、開口部１１５ａを複数個有し、かつ開口部を除いて遮光性を有する部材であり、遮光性を有する公知の材料を用いて作製することができる。これにより、一つの開口部１１５ａに光源１１６により光を照射した際に、他の開口部１１５ａへの光の漏洩による照射対象以外の被検物質に起因する光電流の発生を有効に防止して、複数スポットの被検物質について正確に個別測定を行うことができる。つまり、複数の開口部１１５ａに対応する作用電極上の位置に電子受容層および／または被検物質１１３ａをスポット状に複数形成しておくことにより、一つのスポットのみを、他のスポットに影響を及ぼすことなく個別かつ正確に光照射し、その結果、スポット毎の正確な測定を行うことができる。

図７に示されるコンタクトプローブ１１９は、支持基材１１７の表面の対電極１１４と離れた位置に露出または突出して、作用電極１１３と電気的に接続可能に設けられ、支持基材１１７外に延出されてなる。すなわち、この支持基材外に延出されたコンタクトプローブの一端にリード線１１９を取り付けることにより、電気的な接続を確保することができる。図示例にあっては、コンタクトプローブ１１９は支持基材１１７を貫通して設けられており、一端が作用電極１１３と接触可能とされてなり、かつ多端にはリード線１１９が取り付けられる。このような態様によれば、装置を組み立てるだけで作用電極とリード線との電気的接続が容易に確保されるため、作用電極の交換の度に作用電極にリード線を配線する必要が無くなり、測定のための準備を簡便に行うことができる。本態様に用いるコンタクトプローブは電気的に接続可能なものであれば限定されず、市販のコンタクトプローブ、スプリングプローブを好ましく使用することができる。

図７に示される固定手段１２０，１２１は、対電極１１４の位置を固定するための手段であり、そのうち一つの固定手段１２０を介してリード線１２０ａが対電極１１４に電気的に接続される。図９に固定手段１２０の拡大図を示す。図９に示されるように、固定手段１２０は対電極１１４を高さ方向の位置を規制するための突起状の上部１２０ａと、対電極１１４の水平方向の位置を規制するための下部１２０ｂとを有し、下部１２０ｂにリード線１２２の一端が巻き付けられて固定されることにより、このリード線１２２が対電極１４４の端部に接触する。こうして、対電極１４４の位置を固定しながら、対電極１４４とリード線１２２との電気的接続を確保することができる。この固定手段を用いることにより対電極にリード線をはんだ付けしなくて済むため、グラッシーカーボン（ＧＣ）等のはんだ付けが不可能な材料であっても対電極として使用することが可能となる。

図７および８に示される移動型光源１１６は、作用電極１１３に対して平行方向に移動させるためのモータ等の駆動手段（図示せず）を備えた光源であり、押さえ部材１１５の複数個の開口部１１５ａ上を順次移動しながら個別に光照射可能とされてなる。これにより、複数スポットの被検物質についての正確な個別的測定を自動的に効率良く行うことができる。また、別の好適態様として、光源を移動型とする代わりに、作用電極が光源に対して相対移動するように、作用電極またはセル基材を作用電極に対して平行方向に移動させるための駆動手段をセンサセル中にさらに設けてもよい。さらに別の好適態様としては、光源を移動型とする代わりに、押さえ部材が、複数個の開口部または透光部の各々に対して、光照射が必要な時にのみ開放されるように制御される複数の遮光シャッターをさらに設けてもよい。あるいは別の好適態様として、光源を移動型とする代わりに、複数個の開口部または透光部の各々に対して複数個の光源を個別に設けてもよい。上記いずれの好適態様であっても、図７および８に示される態様と同様に、複数スポットの被検物質についての正確な個別的測定を自動的に効率良く行うことができる。

本発明の別の好ましい態様によるセンサセルを図１０および１１に示す。図１０および１１に示されるセンサセルは、支持基材１３７上に、その側面に供給口１３２ａおよび排出口１３２ｂを形成可能な程度の十分な高さを有するスペーサ１３２と、対電極１３４と、コンタクトプローブ１３９とが設けられた一体型のカートリッジとして構成されており、対電極１３４がこのカートリッジ内部（すなわちスペーサ１３２の開口部内）の支持基材上に、作用電極１３３がこのカートリッジ上（すなわちスペーサ１３２上）にそれぞれ配置され、その作用電極１３３上に押さえ部材１３５が配置される。そして、スペーサ１３２の側面の供給口１３２ａおよび排出口１３２ｂに対応する位置に送液手段１３８，１３８が配置されることで、これら供給口および排出口を介して電解液等の液を流路内に効率的に供給しかつ排出させることができる。また、コンタクトプローブ１３９が支持基材１３７を貫通して設けられており、一端が作用電極１３３と接触可能とされてなり、かつ多端にはリード線（図示せず）が取り付けられる。この態様によれば、スペーサ、対電極、および支持基材が一体化されたカートリッジ単位で取り扱うことができるので、サンプル交換の際には、作用電極を取り替えるだけで次の測定を行うことができ、操作が簡便となる。本発明の好ましい態様によれば、図１０および１１に示されるように、押さえ部材１３５が開口部１３５ａを有し、この開口部１３５ａの上方に光源１３６を設けることができる。

光電流を用いた被検物質の特異的検出
前述の通り、本発明のセンサセルは増感色素の光励起により生じる光電流を用いた被検物質の特異的検出に用いられるものである。この増感色素の光励起により生じる光電流を用いた被検物質の特異的検出方法について、以下に具体的に説明する。

この方法にあっては、まず、被検物質を含む試料液と、作用電極と、対電極とを用意する。本発明に用いる作用電極は、被検物質と直接または間接的に特異的に結合可能なプローブ物質を表面に備えた電極である。すなわち、プローブ物質は、被検物質と直接、特異的に結合する物質のみならず、被検物質を受容体蛋白質分子等の媒介物質に特異的に結合させて得られる結合体と特異的に結合可能な物質であってよい。次いで、増感色素の共存下、試料液を作用電極に接触させて、プローブ物質に被検物質を直接または間接的に特異的に結合させ、この結合により増感色素を作用電極に固定させる。増感色素は、光励起に応じて作用電極に電子を放出可能な物質であり、被検物質あるいは媒介物質に予め標識させておくか、あるいは被検物質およびプローブ物質の結合体にインターカレーション可能な増感色素を用いる場合には試料液に単に添加すればよい。

そして、作用電極と対電極とをセンサセル内において電解液に接触させた後、作用電極に光を照射して増感色素を光励起させると、光励起された増感色素から電子受容物質へ電子移動が起こる。この電子移動に起因して作用電極と対電極との間に流れる光電流を検出することにより、被検物質を高い感度で検出することができる。また、この検出電流は試料液中の被検試料濃度との高い相関関係を有しているので、測定された電流量または電気量に基づき被検試料の定量測定を行うことができる。

被検物質およびプローブ物質
本発明における被検物質としては、特異的な結合性を有する物質であれば限定されず、種々の物質であってよい。このような被検物質であれば、被検物質と直接または間接的に特異的に結合可能なプローブ物質を作用電極表面に担持させておくことにより、被検物質をプローブ物質に直接または間接的に特異的に結合させて検出することが可能となる。

すなわち、本発明にあっては、被検物質およびプローブ物質として互いに特異的に結合可能なものを選択することができる。すなわち、本発明の好ましい態様によれば、特異的な結合性を有する物質を被検物質とし、被検物質と特異的に結合する物質をプローブ物質として作用電極に担持させるのが好ましい。これにより、作用電極上に被検物質を直接、特異的に結合させて検出することができる。この態様における、被検物質およびプローブ物質の組合せの好ましい例としては、一本鎖の核酸および核酸に対して相補性を有する一本鎖の核酸の組合せ、ならびに抗原および抗体の組合せが挙げられる。

本発明のより好ましい態様によれば、被検物質を一本鎖の核酸とし、プローブ物質を核酸に対して相補性を有する一本鎖の核酸とするのが好ましい。プローブ物質は核酸に対して１５ｂｐ以上の相補性部分を有するのがより好ましい。この態様における被検物質の作用電極への特異的結合の工程を図１２（ａ）および（ｂ）に示す。これらの図に示されるように、被検物質としての一本鎖の核酸２１は、作用電極２３上に担持されたプローブ物質としての相補性を有する一本鎖の核酸２４とハイブリダイズされて、二本鎖の核酸２７を形成する。

被検物質としての一本鎖の核酸を含む試料液は、末梢静脈血のような血液、白血球、血清、尿、糞便、精液、唾液、培養細胞、各種臓器細胞のような組織細胞等の、核酸を含有する各種検体試料から、公知の方法により核酸を抽出して作製することができる。このとき、検体試料中の細胞の破壊は、例えば、振とう、超音波等の物理的作用を外部から加えて担体を振動させることにより行なうことができる。また、核酸抽出溶液を用いて、細胞から核酸を遊離させることもできる。核酸溶出溶液の例としては、ＳＤＳ、Triton-X、Tween-20のような界面活性剤、サポニン、ＥＤＴＡ、プロテア−ゼ等を含む溶液が挙げられる。これらの溶液を用いて核酸を溶出する場合、37℃以上の温度でインキュベ−トすることにより反応を促進することができる。

本発明のより好ましい態様によれば、被検物質とする遺伝子の含有量が微量である場合には、公知の方法により遺伝子を増幅した後検出を行なうのが好ましい。遺伝子を増幅する方法としては、ポリメラ−ゼチェインリアクション（ＰＣＲ）等の酵素を用いる方法が代表的であろう。ここで、遺伝子増幅法に用いられる酵素の例としては、ＤＮＡポリメラ−ゼ、Ｔａｑポリメラ−ゼのようなＤＮＡ依存型ＤＮＡポリメラ−ゼ、ＲＮＡポリメラ−ゼＩのようなＤＮＡ依存型ＲＮＡポリメラ−ゼ、Ｑβレプリカ−ゼのようなＲＮＡ依存型ＲＮＡポリメラ−ゼが挙げられ、好ましくは温度を調節するだけで連続して増幅を繰り返すことができる点で、Ｔａｑポリメラ−ゼを用いるＰＣＲ法である。

本発明の好ましい態様によれば、上記増幅時に特異的に核酸を増感色素で標識することが出来る。一般的には、ＤＮＡにアミノアリル修飾ｄUTPを取り込ませることにより行うことができる。この分子は未修飾の dUTP と同じ効率で取り込まれる。次のカップリング段階において、Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド（N-hydroxysuccinimide）により活性化された蛍光色素が修飾 dUTP と特異的に反応し、均一に増感色素で標識された被検物質が得られる。

本発明の好ましい態様によれば、上記のようにして得られた核酸の粗抽出液あるいは精製した核酸溶液をまず90〜98℃、好ましくは95℃以上の温度で熱変性を施し、一本鎖核酸を調製することができる。

本発明にあっては、被検物質とプローブ物質が間接的に特異的に結合するものであってもよい。すなわち、本発明の別の好ましい態様によれば、特異的な結合性を有する物質を被検物質とし、この被検物質と特異的に結合する物質を媒介物質として共存させ、この媒介物質と特異的に結合可能な物質をプローブ物質として作用電極に担持させるのが好ましい。これにより、プローブ物質に特異的に結合できない物質であっても、媒介物質を介して作用電極上に間接的に特異的に結合させて検出することができる。この態様における、被検物質、媒介物質、およびプローブ物質の組合せの好ましい例としては、リガンド、このリガンドを受容可能な受容体蛋白質分子、およびこの受容体蛋白質分子と特異的に結合可能な二本鎖の核酸の組合せが挙げられる。リガンドの好ましい例としては、外因性内分泌攪乱物質（環境ホルモン）が挙げられる。外因性内分泌撹乱物質とは、受容体蛋白質分子を介してＤＮＡに結合し、その遺伝子発現に影響して毒性を生じる物質であるが、本発明の方法によれば、被検物質によりもたらされる受容体等のタンパク質のＤＮＡに対する結合性を簡便にモニタリングすることができる。この態様における被検物質の作用電極への特異的結合の工程を図１３に示す。図１３に示されるように、被検物質としてのリガンド３０は、まず、媒介物質である受容体蛋白質分子３１に特異的に結合する。そして、リガンドが結合された受容体蛋白質分子３３が、プローブ物質としての二本鎖の核酸３４に特異的に結合する。

本発明の好ましい態様によれば、被検物質は二種以上であることができる。本発明の方法によれば、複数の増感色素を用いて、各増感色素毎に異なる励起波長の光を照射することにより、複数種類の被検物質を個別に検出することが可能である。

増感色素
本発明にあっては、被検物質の存在を光電流で検出するために、増感色素の共存下、プローブ物質に被検物質を直接または間接的に特異的に結合させて、該結合により増感色素を作用電極に固定させる。そのために、本発明にあっては、図１２（ａ）および図１３に示されるように被検物質２１あるいは媒介物質３１に予め増感色素２２，３２で標識しておくことができる。また、図１２（ｂ）に示されるように被検物質およびプローブ物質の結合体２７（例えばハイブリダイゼーション後の二本鎖核酸）にインターカレーション可能な増感色素２８を用いる場合には、試料液に増感色素を添加することにより、プローブ物質に増感色素を固定させることができる。

本発明に用いる増感色素は、光励起に応じて作用電極に電子を放出可能な物質であり、光源の照射による光励起状態への遷移が可能であり、かつ励起状態から作用電極に電子注入できる電子状態を採りうるものであればよい。したがって、用いる増感色素は、作用電極、特に電子受容層との間において上記電子状態をとることができるものであればよいことから、多種の増感色素が使用可能であり、高価な色素を使用する必要がない。

増感色素の具体例としては、金属錯体や有機色素が挙げられる。金属錯体の好ましい例としては、銅フタロシアニン、チタニルフタロシアニン等の金属フタロシアニン；クロロフィルまたはその誘導体；ヘミン、特開平１−２２０３８０ 号公報や特表平５−５０４０２３ 号公報に記載のルテニウム、オスミウム、鉄及び亜鉛の錯体（例えばシス−ジシアネート−ビス（２、２ ’−ビピリジル−４、４ ’−ジカルボキシレート）ルテニウム（II））があげられる。有機色素の好ましい例としては、メタルフリーフタロシアニン、９−フェニルキサンテン系色素、シアニン系色素、メタロシアニン系色素、キサンテン系色素、トリフェニルメタン系色素、アクリジン系色素、オキサジン系色素、クマリン系色素、メロシアニン系色素、ロダシアニン系色素、ポリメチン系色素、インジゴ系色素等が挙げられる。

二本鎖核酸にインターカレーション可能な増感色素の好ましい例としては、アクリジンオレンジ、エチジウムブロマイドが挙げられる。このような増感色素を用いる場合、核酸のハイブリダイゼーション後に試料液に添加するだけで増感色素で標識された二本鎖核酸が形成されるので、予め一本鎖の核酸を標識する必要が無い。

作用電極およびその製造
本発明に用いる作用電極は、上記プローブ物質を表面に備えた電極であり、プローブ物質を介して固定された増感色素が光励起に応じて放出する電子を受容可能な電極である。したがって、作用電極の構成および材料は、使用される増感色素との間で上記電子移動が生じるものであれば限定されず、種々の構成および材料であってよい。

本発明の好ましい態様によれば、作用電極が増感色素が光励起に応じて放出する電子を受容可能な電子受容物質を含んでなる電子受容層を有し、この電子受容層の表面にプローブ物質が備えられてなるのが好ましい。また、本発明のより好ましい態様によれば、作用電極が導電性基材をさらに含んでなり、この導電性基材上に電子受容層が形成されてなるのが好ましい。この態様の電極は図１２および１３に示される。図１２および１３に示される作用電極２３は、導電性基材２５と、この導電性基材上に形成され、電子受容物質を含んで成る電子受容層２６とを備えてなる。そして、電子受容層２６の表面にプローブ物質が担持される。

本発明における電子受容層は、プローブ物質を介して固定された増感色素が光励起に応じて放出する電子を受容可能な電子受容物質を含んでなる。すなわち、電子受容物質は、光励起された標識色素からの電子注入が可能なエネルギー準位を取り得る物質であることができる。ここで、光励起された標識色素からの電子注入が可能なエネルギー準位（Ａ）とは、例えば、電子受容性材料として半導体を用いる場合には、伝導帯（コンダクションバンド：CB）を意味し、電子受容性材料として金属を用いる場合には、フェルミ準位を意味し、電子受容性材料として有機物もしくはＣ６０等の分子状無機物を用いる場合には、最低非占有分子軌道（Lowest Unoccupied Molecular Orbital:LUMO）を意味する。すなわち、本発明に用いる電子受容物質は、このＡの準位が、増感色素のLUMOのエネルギー準位よりも卑な準位、換言すれば、増感色素のＬＵＭＯのエネルギー準位よりも低いエネルギー準位を有するものであればよい。

電子受容物質の好ましい例としては、シリコン、ゲルマニウムなどの単体半導体；チタン、スズ、亜鉛、鉄、タングステン、ジルコニウム、ハフニウム、ストロンチウム、インジウム、セリウム、イットリウム、ランタン、バナジウム、ニオブ、タンタル等の酸化物半導体；チタン酸ストロンチウム、チタン酸カルシウム、チタン酸ナトリウム、チタン酸バリウム、ニオブ酸カリウム等のペロブスカイト型半導体；カドミウム、亜鉛、鉛、銀、アンチモン、ビスマスの硫化物半導体；カドミウム、鉛のセレン化物半導体；カドミウムのテルル化物半導体；亜鉛、ガリウム、インジウム、カドミウム等のリン化物半導体；ガリウムヒ素、銅−インジウム−セレン化物、銅−インジウム−硫化物の化合物半導体；金、白金、銀、銅、アルミニウム、ロジウム、インジウム、ニッケル等の金属；ポリチオフェン、ポリアニリン、ポリアセチレン、ポリピロール等の有機物ポリマー；Ｃ６０、Ｃ７０等の分子状無機物が挙げられ、より好ましくは、シリコン、TiO₂、SnO₂、Fe₂O₃、WO₃、ZnO、Nb₂O₅、チタン酸ストロンチウム、酸化インジウム、CdS、ZnS、PbS、Bi₂S₃、CdSe、CdTe、GaP、InP、GaAs、CuInS₂、CuInSe、Ｃ６０であり、さらに好ましくは、TiO₂、ZnO、SnO₂、Fe₂O₃、WO₃、Nb₂O₅、チタン酸ストロンチウム、CdS、PbS、CdSe、InP、GaAs、CuInS₂、CuInSe₂であり、最も好ましくはTiO₂である。なお、上記の列挙した半導体は、真性半導体および不純物半導体のいずれであってもよい。

本発明の好ましい態様によれば、電子受容物質は半導体であるのが好ましく、より好ましくは酸化物半導体であり、さらに好ましくは金属酸化物半導体であり、最も好ましくはｎ型金属酸化物半導体である。この態様によれば、半導体のバンドギャップの利用により、色素から効率良く電子を取り出すことができる。また、多孔体あるいは表面の凹凸形状といった構造を有する半導体の使用により、表面積の大きい作用電極を作製することができ、プローブ固定化量を増加させることができる。

本発明の好ましい態様によれば、半導体の伝導帯の電位は、増感色素のＬＵＭＯの電位よりも低いことが好ましく、より好ましくは、増感色素のＬＵＭＯ＞半導体の伝導帯＞電解質の酸化還元電位＞増感色素のＨＯＭＯの関係を満たす電位である。このような関係にあることで、効率良く電子を取出すことが可能となる。

本発明の好ましい態様によれば、電子受容層が半導体からなる場合、層表面をカチオン化処理しても良い。カチオン化により、プローブ物質（ＤＮＡ，タンパク質など）を高い効率で電子受容層に吸着させることが可能となる。カチオン化は、例えばアミノシランなどのシランカップリング剤、カチオンポリマー、４級アンモニウム化合物、などを電子受容層表面に作用させることにより行うことができる。

また、本発明の別の好ましい態様によれば、電子受容物質として、インジウム-スズ複合酸化物（ＩＴＯ）またはフッ素がドープされた酸化スズ（ＦＴＯ）を用いることができる。ＩＴＯおよびＦＴＯは電子受容層のみならず導電性基材としても機能する性質を有するため、これらの材料を使用することにより導電性基材を用いることなく電子受容層のみで作用電極として機能させることができる。

電子受容物質として半導体または金属を用いる場合、その半導体または金属は単結晶および多結晶のいずれであってもよいが、多結晶体が好ましく、さらに緻密なものよりも多孔性を有するものが好ましい。これにより、比表面積が大きくなり、被検物質および増感色素を多く吸着させて、より高い感度で被検物質を検出することができる。したがって、本発明の好ましい態様によれば、電子受容層が多孔性を有しており、各孔の径が３〜１０００ｎｍであるのが好ましく、より好ましくは、１０〜１００ｎｍである。

本発明の好ましい態様によれば、電子受容層を導電性基材上に形成した状態での表面積は、投影面積に対して１０倍以上であることが好ましく、さらに１００倍以上であることが好ましい。この表面積の上限には特に限定されないが、通常１０００倍程度であろう。電子受容層を構成する電子受容物質の微粒子の粒径は、投影面積を円に換算したときの直径を用いた平均粒径で一次粒子として５〜２００ｎｍであることが好ましく、より好ましくは８〜１００ｎｍであり、さらに好ましくは２０〜６０ｎｍである。また、分散物中の電子受容性物質の微粒子（二次粒子）の平均粒径としては０．０１〜１００μmであることが好ましい。また、入射光を散乱させて光捕獲率を向上させる目的で、粒子サイズの大きな、例えば３００nm程度の電子受容物質の微粒子を併用して、電子受容層を形成してもよい。

本発明の好ましい態様によれば、作用電極が導電性基材をさらに含んでなり、電子受容層が導電性基材上に形成されてなるのが好ましい。本発明に使用可能な導電性基板としては、チタン等の金属のように支持体そのものに導電性があるもののみならず、ガラスもしくはプラスチックの支持体の表面に導電材層を有するものであってよい。この導電材層を有する導電性基板を使用する場合、電子受容層はその導電層上に形成される。導電材層を構成する導電材の例としては、白金、金、銀、銅、アルミニウム、ロジウム、インジウム等の金属；炭素、炭化物、窒化物等の導電性セラミックス；およびインジウム−スズ複合酸化物、酸化スズにフッ素をドープしたもの、酸化スズにアンチモンをドープしたもの、酸化亜鉛にガリウムをドープしたもの、または酸化亜鉛にアルミニウムをドープしたもの等の導電性の金属酸化物が挙げられ、より好ましくは、インジウム-スズ複合酸化物（ＩＴＯ）、酸化スズにフッ素をドープした金属酸化物（ＦＴＯ）である。ただし、前述した通り、電子受容層自体が導電性基材としても機能する場合にあっては導電性基材は省略可能である。また、本発明において、導電性基材は、導電性を確保できる材料であれば限定されず、それ自体では支持体としての強度を有しない薄膜状またはスポット状の導電材層も包含するものとする。

本発明の好ましい態様によれば、導電性基材が実質的に透明、具体的には、光の透過率が１０％以上であるのが好ましく、より好ましくは５０％以上であり、さらに好ましくは７０％以上である。また、本発明の好ましい態様によれば、導電材層の厚みは、０．０２〜１０μｍ程度であるのが好ましい。さらに、本発明の好ましい態様によれば、導電性基材の表面抵抗が１００Ω／ｃｍ^２以下であり、さらに好ましくは４０Ω／ｃｍ^２以下であるのが好ましい。導電性基材の表面抵抗の下限は特に限定されないが、通常０．１Ω／ｃｍ^２程度であろう。

導電性基材上への電子受容層の好ましい形成方法の例としては、電子受容物質の分散液またはコロイド溶液を導電性支持体上に塗布する方法、半導体微粒子の前駆体を導電性支持体上に塗布し空気中の水分によって加水分解して微粒子膜を得る方法（ゾル−ゲル法）、スパッタリング法、CVD法、PVD法、蒸着法などが挙げられる。電子受容物質としての半導体微粒子の分散液を作成する方法としては、前述のゾル−ゲル法の他、乳鉢ですり潰す方法、ミルを使って粉砕しながら分散する方法、あるいは半導体を合成する際に溶媒中で微粒子として析出させそのまま使用する方法等が挙げられる。このときの分散媒としては水または各種の有機溶媒（例えばメタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、ジクロロメタン、アセトン、アセトニトリル、酢酸エチル等）が挙げられる。分散の際、必要に応じてポリマー、界面活性剤、酸、もしくはキレート剤などを分散助剤として使用してもよい。

電子受容物質の分散液またはコロイド溶液の塗布方法の好ましい例としては、アプリケーション系としてローラ法、ディップ法、メータリング系としてエアーナイフ法、ブレード法等、またアプリケーションとメータリングを同一部分でできるものとして、特公昭５８−４５８９号公報に開示されているワイヤーバー法、米国特許２６８１２９４号、同２７６１４１９号、同２７６１７９１号等に記載のスライドホッパ法、エクストルージョン法、カーテン法、スピン法、スプレー法が挙げられる。

本発明の好ましい態様によれば、電子受容層が半導体微粒子からなる場合、電子受容層の膜厚が０．１〜２００μｍであるのが好ましく、より好ましくは０．１〜１００μｍであり、さらに好ましくは１〜３０μｍ、最も好ましくは２〜２５μｍである。これにより、単位投影面積当たりのプローブ物質および固定される増感色素量を増加して光電流量を多くするとともに、電荷再結合による生成した電子の損失をも低減することができる。また、導電性基材１m²当たりの半導体微粒子の塗布量は０．５〜４００gであるのが好ましく、より好ましくは５〜１００gである。

本発明の好ましい態様によれば、電子受容物質がインジウム-スズ複合酸化物（ＩＴＯ）または酸化スズにフッ素をドープした金属酸化物（ＦＴＯ）を含んでなる場合、電子受容層の膜厚が１ｎｍ以上であるのが好ましく、より好ましくは１０ｎｍ〜１μｍである。

本発明の好ましい態様によれば、半導体微粒子を導電性基材上に塗布した後に加熱処理を施すのが好ましい。これにより、粒子同士を電気的に接触させ、また、塗膜強度の向上や支持体との密着性を向上させることができる。好ましい加熱処理温度は、４０〜７００℃であり、より好ましくは１００〜６００℃である。また、好ましい加熱処理時間は１０分〜１０時間程度である。

また、本発明の別の好ましい態様によれば、ポリマーフィルムなど融点や軟化点の低い導電性基材を用いる場合にあっては、熱による劣化を防止するため、高温処理を用いない方法により膜形成を行うのが好ましく、そのような膜形成方法の例として、プレス、低温加熱、電子線照射、マイクロ波照射、電気泳動、スパッタリング、ＣＶＤ、ＰＶＤ、蒸着等の方法が挙げられる。

こうして得られた作用電極の電子受容層の表面にはプローブ物質が担持される。作用電極へのプローブ物質の担持は公知の方法に従い行うことができる。本発明の好ましい態様によれば、プローブ物質として一本鎖の核酸を用いる場合には、作用電極表面に酸化層を形成させておき、この酸化層を介して核酸プロ−ブと作用電極とを結合させることにより行うことができる。このとき、核酸プローブの作用電極への固定化は、核酸の末端に官能基を導入することにより行うことができる。これにより、官能基が導入された核酸プロ−ブはそのまま固定化反応により担体上に固定化されることができる。核酸末端への官能基の導入は、酵素反応もしくはＤＮＡ合成機を用いて行なうことができる。酵素反応において用いられる酵素としては、例えば、タ−ミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラ−ゼ、ポリＡポリメラ−ゼ、ポリヌクレオチドカイネ−ス、ＤＮＡポリメラ−ゼ、ポリヌクレオチドアデニルトランスフェラ−ゼ、ＲＮＡリガ−ゼを挙げることができる。また、ポリメラ−ゼチェインリアクション（ＰＣＲ法）、ニックトランスレ−ション、ランダムプライマ−法により官能基を導入することもできる。官能基は、核酸のどの部分に導入されてもよく、3'末端、5'末端もしくはランダムな位置に導入することができる。

本発明の好ましい態様によれば、核酸プローブの作用電極への固定化のため官能基として、アミン、カルボン酸、スルホン酸、チオール、水酸基、リン酸等が好適に使用できる。また、本発明の好ましい態様によれば、拡散プローブを作用電極に強固に固定化するためには、作用電極と拡散プローブの間を架橋する材料を使用することも可能である。そのような架橋材料の好ましい例としては、シランカップリング剤、チタネートカップリング剤や、ポリチオフェン、ポリアセチレン、ポリピロール、ポリアニリン等の導電性ポリマーが挙げられる。

本発明の好ましい態様によれば、核酸プロ−ブの固定化を物理吸着という、より簡単な操作で効率よく行うことも可能である。電極表面への核酸プロ−ブの物理吸着は、例えば、以下のように行なうことができる。まず、電極表面を、超音波洗浄器を用いて蒸留水およびアルコ−ルで洗浄する。その後、電極を核酸プロ−ブを含有する緩衝液に挿入して核酸プロ−ブを担体表面に吸着させる。

また、核酸プローブの吸着後、ブロッキング剤を添加することにより、非特異的な吸着を抑制することができる。使用可能なブロッキング剤としては、核酸プローブが吸着していない電子受容層表面のサイトを埋めることができ、かつ電子受容物質に対して化学吸着あるいは物理吸着等により吸着可能な物質であれば限定されないが、好ましくは化学結合を介して吸着可能な官能基を有する物質である。例えば、酸化チタンを電子受容層として用いる場合における好ましいブロッキング剤の例としては、カルボン酸基、リン酸基、スルホン酸基、水酸基、アミノ基、ピリジル基、アミド等の酸化チタンに吸着可能な官能基を有する物質が挙げられる。

本発明の好ましい態様によれば、作用電極上にプローブ物質が互いに分離された複数の領域毎に区分されて担持されてなり、光源による光照射が各領域に対して個別に行われるのが好ましい。これにより、複数の試料を一枚の作用電極上で測定することができるので、ＤＮＡチップの集積化等が可能となる。本発明のより好ましい態様によれば、作用電極上にプローブ物質が担持された、互いに分離された複数の領域がパターニングされており、光源から照射される光でスキャニングしながら、各領域の試料について被検物質の検出または定量を一度の操作で連続的に行うことが好ましい。

本発明のより好ましい態様によれば、作用電極上の互いに分離された複数の領域の各領域に複数種類のプローブ物質を担持させることができる。これにより、領域の個数に、各領域毎のプローブ物質の種類数を乗じた数の、多数のサンプルの測定を同時に行うことができる。

本発明のより好ましい態様によれば、作用電極上の互いに分離された複数の領域の各領域毎に異なるプローブ物質を担持させることができる。これにより、区分された領域の数に相当する種類数のプローブ物質を担持させることができるので、多種類の被検物質の測定を同時に行うことができる。この態様は、各領域毎に異なる被検物質の分析が可能なため、一塩基多型の解析（ＳＮＰｓ）の多項目解析に好ましく利用することができる。

対電極
本発明に用いる対電極は、電解液に接触させた場合に作用電極との間に電流が流れることができるものであれば特に限定されず、金属もしくは導電性の酸化物を蒸着したガラス、プラスチック、セラミックス等が使用可能である。また、対電極としての金属薄膜を５μｍ以下、好ましくは３ｎｍ〜３μｍの範囲の膜厚になるように、蒸着やスパッタリングなどの方法により形成して作成することもできる。対電極に使用可能な材料の好ましい例としては、白金、金、パラジウム、ニッケル、カーボン、ポリチオフェン等の導電性ポリマー、酸化物、炭化物、窒化物等の導電性セラミックス等が挙げられ、より好ましくは、白金、カーボンであり、最も好ましくは白金である。これらの材料は電子受容層の形成方法と同様の方法により薄膜形成が可能である。

測定方法および装置
本発明のセンサセルを用いた測定方法にあっては、先ず、増感色素の共存下、試料液を作用電極に接触させて、プローブ物質に被検物質を直接または間接的に特異的に結合させ、この結合により増感色素を前記作用電極に固定させる。

本発明の好ましい態様によれば、増感色素で予め標識された一本鎖の核酸を被検物質とする場合、プローブ物質である一本鎖核酸との間でハイブリダイゼーション反応を行なうことができる。ハイブリダイゼーション反応の好ましい温度は３７〜７２℃の範囲であるが、その最適温度は使用するプロ−ブの塩基配列や長さ等により異なる。

本発明の別の好ましい態様によれば、被検物質およびプローブ物質の結合体（例えばハイブリダイゼーション後の二本鎖核酸）にインターカレーション可能な増感色素を用いる場合には、試料液に増感色素を添加することにより結合体を特異的に増感色素で標識することができる。

こうして被検物質が増感色素と共に固定された作用電極を、対電極と共に電解液に接触させ、作用電極に光を照射して増感色素を光励起させ、光励起された増感色素から作用電極への電子移動に起因して作用電極と対電極との間に流れる光電流を検出する。その際のセンサセルとして、本発明のセンサセルを使用する。

図１および２に示されるセンサセルを用いた測定方法の一例について説明する。先ず、セル基材２、被検物質が増感色素と共に固定された作用電極３、および対電極４を用いて、図２に示されるセル構造となるように組み立てる。このとき、作用電極３は、電子受容層側を電解液に接触させるように配置される。こうして、セル基材２の溝２ａの上面が作用電極３により覆われて形成された空間が流路として機能する。なお、対電極４はセル基材の溝２ａの底部に配置されている。そして、セル基材の供給口２ｂおよび排出口２ｃには送液ポンプおよび逆止弁等の送液手段８が設けられ、測定に先立ち、電解液が流路内に充填された後、送液を停止する。その結果、測定時には、流路内に一定量の電解液が確実に充填されていることになる。すなわち、本発明のセンサセルによれば、セル内に電解液を隙間無く充填させ、かつ、セル内に充填された電解液の漏れを効果的に防止出来るので、セル内の電解液量を高い精度で一定に保つことができ、測定精度を向上させることが出来る。

本発明において用いる電解液は、電解質、溶媒、および所望により添加物を含んでなるものであることができる。電解質の好ましい例としては、ヨウ化物単独、あるいはＩ_２とヨウ化物の組み合わせ（ヨウ化物としてはＬｉＩ、ＮａＩ、ＫＩ、ＣｓＩ、ＣａＩ_２などの金属ヨウ化物、あるいはテトラアルキルアンモニウムヨーダイド、ピリジニウムヨーダイド、イミダゾリウムヨーダイドなど４級アンモニウム化合物のヨウ素塩など）；臭化物単独、あるいはＢｒ_２と臭化物の組み合わせ（臭化物としてはＬｉＢｒ、ＮａＢｒ、ＫＢｒ、ＣｓＢｒ、ＣａＢｒ_２などの金属臭化物、あるいはテトラアルキルアンモニウムブロマイド、ピリジニウムブロマイドなど４級アンモニウム化合物の臭素塩など）；フェロシアン酸塩−フェリシアン酸塩やフェロセン−フェリシニウムイオンなどの金属錯体；ポリ硫化ナトリウム、アルキルチオール−アルキルジスルフィドなどのイオウ化合物；ビオロゲン色素；ヒドロキノン−キノン等が挙げられ、より好ましくは、Ｉ_２とＬｉＩやピリジニウムヨーダイド、イミダゾリウムヨーダイドなど４級アンモニウム化合物のヨウ素塩を組み合わせた電解質である。上述した電解質は混合して用いてもよい。また、電解質は、酸化還元電位が増感色素のＨＯＭＯよりも高いことが好ましい。

本発明の好ましい態様によれば、電解液の電解質濃度は０．１〜１５Ｍであるのが好ましく、より好ましくは０．２〜１０Ｍである。また、電解質にヨウ素を添加する場合における、好ましいヨウ素の添加濃度は０．０１〜０．５Ｍである。

好ましい溶媒の例としては、水、アルコール（メタノール、エタノール等）、非プロトン性の極性溶媒（例えばアセトニトリルなどのニトリル類、炭酸プロピレンや炭酸エチレンなどのカーボネート類、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、スルホラン、１，３−ジメチルイミダゾリノンや３−メチルオキサゾリジノン、ジアルキルイミダゾリウム塩などの複素環化合物、等）が挙げられる。電子受容層に酸化物半導体を用いた系において、電解質にヨウ化物、溶媒に非プロトン性の極性溶媒を用いた場合、検知精度が高くなり、ＤＮＡの一塩基多型（ＳＮＰｓ）の解析を行なうことが可能となる。

図２に示されるように作用電極３の上方には光源６が押さえ部材５を介して配置される。本発明に用いる光源については、既に述べた通りである。

本発明の好ましい態様によれば、互いに異なる光波長で励起可能な二種以上の増感色素を用いて複数種類の被検物質を個別に検出する場合、光源から波長選択手段を介して特定波長の光を照射することにより、複数の色素を個別に励起することが可能である。波長選択手段の例としては、分光器、色ガラスフィルター、干渉フィルター、バンドパスフィルター等が挙げられる。また、増感色素の種類に応じて異なる波長の光を照射可能な複数の光源を用いてもよく、この場合の好ましい光源の例としては、特定波長の光が照射されるレーザー光やLEDを用いてもよい。また、作用極に光を効率よく照射するため、石英、ガラス、液体ライトガイドを用いて導光してもよい。

図２に示されるように、作用電極３および対電極４間にはリード線３ａおよび４ａを介して電流計９が接続され、光照射により系内を流れる光電流が電流計により測定される。これにより、被検物質を検出することができる。その際の電流値は作用電極上にトラップされた増感色素の量を反映する。例えば、被検物質が核酸の場合、相補性のある核酸間で形成された二本鎖の量が、電流値となり反映される。したがって、得られた電流値から被検物質を定量することができる。したがって、本発明の好ましい態様によれば、電流計が、得られた電流量または電気量から試料液中の被検物質濃度を算出する手段をさらに備えてなるのが好ましい。

本発明の好ましい態様によれば、光電流を検出する工程が、電流値を測定し、得られた電流値または電気量から試料液中の被検物質濃度を算出することができる。この被検物質濃度の算出は、予め作成された被検物質濃度と電流値または電気量との検量線と、得られた電流値または電気量とを対比することにより行うことができる。本発明の方法にあっては、電流値は作用電極上にトラップされた増感色素の量が反映されるので、被検物質濃度に対応した正確な電流値が得られるため、定量測定に適する。

本発明の別の好ましい態様によれば、予め増感色素で標識された被検物質を競合物質として用いて、増感色素で標識されていない、プローブ物質に特異的に結合可能な第二の被検物質を定量することができる。第二の被検物質はプローブ物質に標識済被検物質よりも特異的に結合しやすい性質を有するのが好ましい。これら二種類の被検物質を競合させてプローブ物質に特異的に結合させると、検出される電流値と第二の被検物質の濃度との間に相関関係が得られる。つまり、色素標識されていない第二の被検物質の数が増加するにつれ、プローブ物質に特異的に結合する競合物質の数が減少するため、第二の被検物質濃度の増加につれて、検出電流値が減少する検量線を得ることができる。したがって、増感色素で標識されていない第二の被検物質の検出および定量が可能となる。

本発明のより好ましい態様によれば、被検物質および第二の被検物質が抗原であり、プローブ物質が抗体であるのが好ましい。この態様における被検物質および第二の被検物質のプローブ物質への固定化工程を図１４に示す。図１４に示されるように、増感色素で標識された抗原４１と、色素標識されていない抗原４２とが競合して抗体４３に特異的に結合する。したがって、色素標識されていない抗原４２が増加するにつれ、抗体に特異的に結合する色素標識された抗原４３が減少するため、第二の被検物質濃度の増加につれて、検出電流値が減少する検量線を得ることができる。

本発明の方法および装置の好ましい実施態様の一例として、フロー型測定用セルを用いた測定方法および装置について説明する。図１５に、装置の全体構造を示す。図６に示される装置５０は、フロー型測定用セル５１と、光源５２と、電解液タンク５３と、洗浄液タンク５４と、供給ポンプ５５と、電流計５６と、排出ポンプ５７とを備えてなる。フロー型測定用セル５１は、作用電極５８と、作用電極に対向する対電極５９とを備えてなり、作用電極５８および対電極５９の間に、電解液または洗浄液を収容しかつ流すことができる流路が形成される。すなわち、供給ポンプ５５により測定用セル５１内に供給された電解液または洗浄液は、作用電極５８および対電極５９に接触しながら流路を通過した後、排出ポンプ５７により測定用セル５１外に排出されるように構成されている。これら一連の動作の制御および光電流値の解析は図示しない制御解析装置により行われることができる。

以下の実施例によって本発明をさらに詳細に説明する。なお、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

例１：作用電極の作製
まず、以下の配合を有する原料を自動乳鉢を用いて充分に混合した後、１５０℃で６時間乾燥させて混合物を得た。
α−テルピネオール ６０重量％
２−（２−ブトキシエトキシ）エタノール １５重量％
エチルセルロース ２５重量％

得られた混合物０．５ｇに粒状酸化チタン（日本エアロゾル社製Ｐ２５、平均粒径２０〜２５ｎｍ）１ｇを添加して混合した後、先に得られた混合物０．５ｇをさらに添加して混合した。その後、α−テルピネオールを加えて再度混合して、ペーストを得た。これら一連の混合は自動乳鉢を用いて合計３時間行った。

フッ素ドープされたＳｎＯ_２膜が形成されたガラス基板（旭硝子製）の縁枠を幅約６３μｍのテープでマスキングし、上記ペーストをスキージ印刷した後、６０℃で２時間乾燥させた。得られたガラス基板を焼成炉内に入れ、約１７分間かけて５００℃まで炉内温度を上昇させ、この温度で３０分間保持した後、放冷した。炉内温度が１００℃に達した時点でガラス基板をエタノールに浸漬した。こうして、酸化チタンを含んでなる電子受容層が形成された作用電極を得た。

次いで、１０５−ＮＨ_２−ＡＡＣＧＴＣＧＴＧＡＣＴＧＧＧの塩基配列を有するＮＨ_２修飾ＤＮＡをバッファ（３Ｘ ＳＳＣ）に溶解して、２８６μＭのＮＨ_２修飾ＤＮＡ溶液を調製した。この溶液を、予め９５℃で３分間保持した後、氷上で冷却させることにより、変性させておいた。

先に得られた作用電極の電子受容層上に、５ｍｍ×５ｍｍ角の大きさの開口部が形成された、厚さ７００μｍのシリコンシールを載置した。この開口部に２８６μＭのＮＨ_２修飾ＤＮＡ溶液３５μｌ注入した。このとき、ピペットチップの先端を用いて、シリコンシールの開口部の四隅まで充分にＤＮＡ溶液が行き渡るようにした。続いて、ＤＮＡ溶液中に気泡が極力入らないようにガラス板で真上から覆い、湿らせた紙等で蒸気圧が調整されたプラスチック容器に収容した。この容器中に６０℃で２時間保持して、ＮＨ_２修飾ＤＮＡをインキュベートした。その後、ＤＮＡ溶液を除去し、流水で軽く電極表面を洗浄した後、空気を吹き付けて残水を飛散させた。こうして、プローブ物質が担持された作用電極を得た。

例２：ローダミン修飾ＤＮＡの検出
１０５−Ｒｈｏ−ＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣＧＴＴの塩基配列を有するローダミン修飾ＤＮＡをバッファ（２Ｘ ＳＳＣ、０．０３％ ＳＤＳ）に溶解して、２８．６μＭおよび２８６μＭの各濃度を有するローダミン修飾ＤＮＡ溶液を作製した。
例１で使用したものと同様のシリコンシールを作用電極表面に載置し、各濃度のローダミン修飾ＤＮＡ溶液を３５μｌずつ、開口部に注入した。溶液中に気泡が極力入らないようにガラス板で真上から覆い、湿らせた紙等で蒸気圧を調整したプラスチック容器に入れた。こうして、６０℃で一晩（１２時間）インキュベートさせて、ハイブリダイゼーションを行った。

こうしてハイブリダイゼーションが施された作用電極を洗浄液に浸し、ゆっくりと揺らしながら洗浄した。洗浄液としては下記表に示されるものを使用し、各洗浄液について下記表に示される洗浄時間、洗浄回数、および温度で洗浄を行った。なお、洗浄液を変更する毎に洗浄容器を交換した。

さらに、作用電極をエタノールで軽く液中で上下させることにより、２回洗浄を行った。２回目の洗浄後は紙等で拭き取らずに、素早く空気を吹き付けて残水を飛散させた。

こうして得られた作用電極と、対電極としての白金電極とを用いて、センサセルを以下のようにして組み立てた。
まず、白金電極として、ガラス基板上に白金薄膜をスパッタリングにより形成したものを用意した。白金電極の白金膜上に、厚さ５００μｍのシリコンシートを載置した。このシリコンシートは作用電極と対電極との接触による短絡を防ぐためのスペーサーである。このとき、白金電極の白金で被膜された端部にリード線を接続して、電流を取り出し可能に構成した。作用電極もリード線を介して電流計と接続した。
電解液として、体積比が８：２のエチレンカーボネートとアセトニトリルの混合溶媒にヨウ素０．０５Ｍとテトラプロピルアンモニウムヨーダイド０．５Ｍを溶解した混合液を用意した。この電解液を白金電極に５μＬ滴下した後、作用電極をその電子受容層が白金電極と対向するように、載置した。こうして、スペーサーおよび電解液を作用電極および対電極とで挟持されてなる、サンドイッチ型のセンサセルを得た。

作用電極のリード線と対電極のリード線とを電流計（ＡＬＳモデル８３２Ａ、ディアル電気化学アナライザー）に接続した。光源（林時計社製、ＬＡ−２５０ＸＥ）から液体ライトガイドを用いて導光し、紫外線カットフィルター（Y-43、旭テクノグラス）を介して作用電極表面の１．５ｃｍ上方から白色光を３０秒間作用電極表面に照射した。このとき、作用電極と対電極との間に流れる電流値を電流計により経時的に測定した。

図１６に２８．６μＭローダミン修飾ＤＮＡ溶液を用いた場合の検出電流の経時変化を、図１７に２８６μＭローダミン修飾ＤＮＡ溶液を用いた場合の検出電流の経時変化を示す。これらの図に示されるように、増感色素で標識づけられたＤＮＡと、これと相補性を有するＤＮＡとをハイブリダイゼーションさせると、光の照射により大きな電流が流れることが分かる。

また、２８．６μＭおよび２８６μＭの各ローダミン修飾ＤＮＡ溶液を用いた場合について、電流値が定常状態になった時点における電流値を別途測定したところ、図１６に示される通りの結果が得られた。また、参照のため、ローダミン修飾ＤＮＡの固定化を行わなかった場合についても同様にして測定を行った。その結果も図１８に併せて示す。図１８に示されるように、ローダミン修飾ＤＮＡの濃度に依存して電流値が変化した。したがって、本発明の方法によれば定量分析が可能なことが分かる。

例３：プローブ物質を担持させない作用電極を使用した測定
また、比較のため、例１で作製された、ＮＨ_２修飾ＤＮＡを担持させる前の、酸化チタンを含んでなる電子受容層のみが形成された作用電極を用いてセンサセルを構成して、例２と同様に測定を行った。図１６に２８．６μＭローダミン修飾ＤＮＡ溶液を用いた場合の検出電流の経時変化を、図１７に２８６μＭローダミン修飾ＤＮＡ溶液を用いた場合の検出電流の経時変化を示す。これらの図に示されるように、紫外線カットフィルターで除去できなかった若干量の紫外線によって酸化チタン自身が励起され、光電流が観測されるものの、ローダミン修飾ＤＮＡ溶液を用いた例２の場合と比べて、光電流は著しく低かった。

例４：作用電極にブロッキングを施した場合の測定
例１と同様にして、プローブ物質が担持された作用電極を得た。この電極表面に例１で使用したものと同様のシリコンシールを再度載置して、開口部にブロッキング剤として１０μＭのジエタノールアミン３５μｌを注入した。ブロッキング剤中に気泡が極力入らないようにガラス板で真上から覆い、湿らせた紙等で蒸気圧を調整したプラスチック容器に入れた。そして、６０℃で３０分間保持して、ブロッキング剤をインキュベートした。電極表面を再度流水で軽く洗浄した後、空気を吹き付けて残水を飛散させた。

こうしてプローブ物質がブロッキングされた作用電極を用いて、例２と同様にして、ローダミン修飾ＤＮＡのインキュベーションによるハイブリダイゼーション、および光電流測定を行った。その結果は図１６および図１７に示される通りであった。これらの図に示されるように、ブロッキングが施された作用電極を用いた場合には、それが施されない例２の場合と比べて、著しく電流値が低下した。

例５：競合物質ＰＮＡとの共存下におけるローダミン修飾ＤＮＡの検出
１０５−Ｒｈｏ−ＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣＧＴＴの塩基配列を有するローダミン修飾ＤＮＡと、競合物質として１０５−ＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣＧＴＴＴの塩基配列を有するＰＮＡとをバッファ（２Ｘ ＳＳＣ、０．０３％ ＳＤＳ）に溶解して、２８．６μＭローダミン修飾および２００μＭ ＰＮＡ含有溶液と、２８６μＭローダミン修飾および２００μＭ ＰＮＡ含有溶液とを作製した。
この試料溶液を用いたこと以外は、例２と同様にして、ローダミン修飾ＤＮＡのインキュベーションによるハイブリダイゼーション、および光電流測定を行った。その結果は図１６および図１７に示される通りであった。これらの図に示されるように、ハイブリダイゼーション時に競合すると考えられる塩基配列を有するＰＮＡを共存させた場合、ＰＮＡが共存しない例２の場合と比べて、電流値が低下した。

例６：遮光性押さえ部材を用いた複数スポットにおける被検物質の個別測定
（１） 色素標識プローブＤＮＡの準備
色素標識されたプローブＤＮＡとして、３’末端をＣｙ５で標識された、以下の塩基配列を有する１５塩基の核酸塩基（Ｃｙ５標識ｓｓＤＮＡ、プロリゴ社製）を用意した。
色素標識プローブＤＮＡ（Ｃｙ５標識ｓｓＤＮＡ）：
５’ＮＨ_２−ＡＡＣＧＴＣＧＴＧＡＣＴＧＧＧ−Ｃｙ５−３’

（２） 作用電極の作製および色素標識プローブＤＮＡの担持
まず、チタニア微粉末（昭和タイタニウム社製、Ｆ２、平均粒径６０ｎｍ、アナターゼ：ルチル＝４：６）１ｇと、以下の配合を有する有機ビヒクル１ｇとを自動乳鉢で混練しながら、徐々に溶媒（αテルピネオール：ブチルカルビトール＝重量比６０：４０）１ｇを添加して、酸化チタンペーストを得た。これら一連の混合は合計５時間行われた。
α−テルピネオール ６５重量％
ブチルカルビトール １５重量％
ポリビニルブチラール ２０重量％

フッ素ドープされた酸化スズ（Ｆ−ＳｎＯ_２：ＦＴＯ）コートガラス（エイアイ特殊硝子社製、Ｕ膜、シート抵抗：１５Ω／□）の導電面上を金属メタルスクリーンマスクでマスキングし、上記ペーストを用いて、図１９に示されるように直径３ｍｍの円形スポット膜を２ｍｍ間隔で６箇所形成した。得られた膜を６０℃で３時間乾燥させた後、５００℃で３０分間焼成を行い、酸化チタン多孔質膜を電子受容層として備えた図１９に示される作用電極を得た。こうして得られた作用電極にＢＬＢランプで一晩紫外線照射を施し、汚れおよび残存有機物の除去を行った。

次いで、色素標識プローブＤＮＡとしてＣｙ５標識ｓｓＤＮＡを５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）に溶解させて、Ｃｙ５標識ｓｓＤＮＡ濃度が０μＭ、１μＭ、および１０μＭの水溶液を調製した。この溶液を、予め９５℃で５分間保持した後、直ちに氷上で１０分間以上冷却させることにより、熱変性させておいた。

先に得られた作用電極の電子受容層上に、スペーサー用穴あきテープ（穴の直径：３ｍｍ、スポット数；６、厚さ：５０μｍ）を貼り、ピンセットの先を用いてテープ接着面に残存する空気を除去した。このテープ上に、直径３ｍｍの大きさの開口部が６箇所形成されたシリコンシート（厚さ：１ｍｍ）を載置して密着させた。この開口部に先に調製した各濃度のＣｙ５標識ｓｓＤＮＡ溶液を３μｌ装填した。なお、図１９に示されるように６箇所のスポットには番号がそれぞれ付されており、各スポットに装填したＣｙ５標識ｓｓＤＮＡ溶液の濃度は下記表２の通りとした。

このとき、ピペットチップの先端を用いて、シリコンシールの開口部の四隅まで充分にＤＮＡ溶液が行き渡るようにした。続いて、ＤＮＡ溶液中に気泡が極力入らないようにガラス板で真上から蓋をして、湿らせた紙等で蒸気圧が調整されたプラスチック容器に収容した。この容器中に５０℃で一晩保持して、Ｃｙ５標識ｓｓＤＮＡをインキュベートした。その後、ＤＮＡ溶液を除去し、流水で軽く電極表面を洗浄した後、空気を吹き付けて残水を飛散させた。こうして、色素標識プローブＤＮＡが担持された作用電極を得た。

こうして色素標識プローブＤＮＡが担持された作用電極を洗浄液に浸し、ゆっくりと揺らしながら洗浄した。洗浄液としては下記表３に示されるものを使用し、各洗浄液について下記表に示される洗浄時間、洗浄回数、および温度で洗浄を行った。なお、洗浄液を変更する毎に洗浄容器を交換した。さらに、作用電極を水で５秒間洗い流し、素早く空気を吹き付けて残水を飛散させた。

（３）測定用セルの組み立て
こうして得られた作用電極と、対電極としての白金電極とを用いて、図７および図８に示されるような測定用セルを以下のようにして組み立てた。
まず、白金電極として、厚さ１ｍｍのガラス基板上に、密着性確保のためのクロム層を介して、白金薄膜をスパッタリングにより形成したものを用意した。作用電極と白金対電極と対向させ、その間に膜厚が５００μｍのシリコンシートを挿入した。シリコンシートは、両電極間に接触による短絡を防止し、電解液を充填するための空間を作り出すためのものであり、全スポットを包含するのに十分な大きさの開口部を有しており、この開口部が送液された電解液が溜まる流路を構成する。作用電極は電気的に接触しているスプリングプローブを介して、白金電極は端部に接続されたリード線を介して、それぞれポテンシオスタット（ビー・エー・エス株式会社 ALS Modl832A）に接続した。作用電極上には、図２０に示されるような６つの開口スポットが形成された遮光性の押さえ部材を載置して、更にその上に光源移動用アリ式ステージ（駿河精機社製、B05-41M）を介して赤色レーザー光源（オーディオテクニカ製、SU-31：波長635nm）を取り付けた。こうして、スペーサーおよび電解液を作用電極および対電極とで挟持されてなる、サンドイッチ型の測定用セルを得た。
次いで、電解液として、体積比が４：６のアセトニトリルと炭酸エチレンの混合溶媒にヨウ素０．０６Ｍとテトラプロピルアンモニウムヨーダイド０．６Ｍを溶解した混合液を用意した。この電解液が作用電極と白金電極との間に充填させた。

（４）光電流の測定
光源移動用アリ式ステージに固定した赤色レーザーからなる移動型光源を用いて作用電極表面の３ｃｍ上方から、各スポット毎に個別に光を照射して、作用電極と白金対電極の間に流れる電流を経時的に測定した。電流値の測定は１８０秒間行ったが、光の照射は電流の測定開始６０秒後から６０秒間のみ行った。観測した光電流は１２０秒後の光電流値から１８０秒後の光電流値を差し引くことで補正を行った。

その結果、各スポット毎の光照射の際に検出した光電流は図２１に示される通りであった。図２１に示されるように、各スポットを光照射した際に検出された光電流の値は、光照射したスポットに装填したＣｙ５標識ｓｓＤＮＡ水溶液の濃度と高い相関性を有していることが分かる。すなわち、各スポットを光照射した際に、押さえ部材の遮光性によって、照射対象以外のスポットの被検試料への光の漏洩が有効に防止され、照射対象以外のスポットに起因する電流がほとんど無い、照射スポットにのみ起因する極めて精度の高い検出電流が得られた。

例７：自動ステージを用いた複数スポットにおける被検物質の個別測定
（１） 色素標識プローブＤＮＡの準備
色素標識されたプローブＤＮＡとして、３’末端をＣｙ５で標識された、以下の塩基配列を有する１５塩基の核酸塩基（Ｃｙ５標識ｓｓＤＮＡ、プロリゴ社製）を用意した。
色素標識プローブＤＮＡ（Ｃｙ５標識ｓｓＤＮＡ）：
５’ＮＨ_２−ＡＡＣＧＴＣＧＴＧＡＣＴＧＧＧ−Ｃｙ５−３’

（２） 作用電極の作製および色素標識プローブＤＮＡの担持
フッ素をドープした酸化スズ（Ｆ−ＳｎＯ_２：ＦＴＯ）コートガラス（エイアイ特殊硝子社製、Ｕ膜、シート抵抗：１５オーム／□）を、アセトン、０．１容量％ Ｔｗｅｅｎ２０を含む超純水、さらには超純水中でそれぞれ１５分間の超音波洗浄を施して、汚れおよび残存有機物の除去を行った。このガラスを５Ｍの水酸化ナトリウム水溶液中で１５分間振盪させた。その後、水酸化ナトリウムを除去するため、超純水中での５分間の振盪を水を入れ替えて３回行った。このガラスを取り出して空気を吹き付けて残水を飛散させた後、無水メタノールに浸漬させて脱水した。

一方、溶媒としての９５％メタノール５％超純水に３−アミノプロピルトリメトキシシラン（ＡＰＴＭＳ）を２容量％となるように加え、室温下で５分間の攪拌を行うことにより、カップリング処理用の溶液を調製した。このカップリング処理用溶液に上記ガラスを浸漬させ、ゆっくりと１５分間振盪させた。それからガラスを取り出し、メタノール中で１０回ほど振盪させて余剰なカップリング処理用溶液を除く操作を、メタノールを３回換えて行った。その後、１１０℃で３０分間保持してカップリング剤をガラスと結合させた。室温下で冷却した後、１５ｍｍ平方内に直径１ｍｍの大きさの開口部が１ｍｍの間隔で４９スポット形成されたＰＤＭＳシート（厚さ：１．５ｍｍ）を載置して密着させた。

続いて、２×ＳＳＣに溶かして１μＭに調製したＣｙ−５標識ｓｓＤＮＡ（３０ｍｅｒ）を９５℃で５分間保持した後、直ちに氷上に移して１０分間保持してＤＮＡを変性させ、先に用意したガラス上のＰＤＭＳシートの４９開口部に２μｌずつ充填した。これを７５℃で１時間保持して溶媒を蒸発させた後、ＰＤＭＳシートを剥がし、ＵＶクロスリンカー（ＵＶＰ社ＣＬ−１０００型）で１２０ｍＪの紫外光を照射した。こうして、Ｃｙ−５標識ｓｓＤＮＡを４９個のスポット毎に固定化した図２２に示される作用電極を得た。

得られた作用電極を超純水中で１０回ほど振盪させてＳＳＣ成分（ＮａＣｌとクエン酸ナトリウム）を除く操作を、超純水を２回換えて行った。それから沸騰水に２分間浸漬させ、取り出してから空気を吹き付けて残水を飛散させた。続いて４℃の無水エタノールに１分間浸漬させて脱水し、空気を吹き付けて残エタノールを飛散させた。

（３）測定用セルの組み立て
こうして得られた作用電極を図１５に示されるフロー型測定セルに組み込み、フロー型測定セル上には光源自動移動用ＸＹステージを取り付けた。なお、光源を移動させる代わりに、セルを移動させる構成であってもよいのは言うまでもない。ＸＹステージは、測定対象とするスポットに任意に位置決めすることができるように、位置きめ制御機能を持つ制御解析装置と接続される。また、センサ出力電流を測定するための高感度な電流計も同時に制御解析装置と接続され、測定するスポットの位置決めと同期して、センサ出力データを取り込むことができるようにした。測定セルは、作用電極と白金対電極とを対向させ、その間に接触に膜厚が５００μｍのシリコンシートを挿入することにより作製した。すなわち、シリコンシートには全スポットが入る十分な大きさの開口部が形成されており、この開口部に送液された電解液が溜まり、作用電極上に固定化されたＤＮＡと接触する構造となっている。電解液としては、アセトニトリル溶媒にテトラプロピルアンモニウムヨーダイド１００ｍＭを溶解した溶液を用いた。作用電極および対電極と高感度な電流計との電気的な接続はスプリングプローブを介して行った。

（４）光電流の測定
自動移動用ＸＹステージに固定した移動型光源により、作用電極表面の上方から直径１ｍｍ未満の励起光を４９スポット（間隔１ｍｍ）に照射して、各スポットについて作用電極と白金対電極の間に流れる電流を経時的に測定した。光源としては、出力２０ｍＷ程度の赤色半導体を用いたが、さらにセンサ出力を大きくするために大きい出力または緑や青色等短波長のレーザーを用いてもよい。このとき、自動移動用ＸＹステージにより、図２２に矢印で示される順序に従ってスポットを順次走査し、同時にスポットでの電流出力を制御装置に接続された高感度電流計を介して制御装置に記憶させた。このように記憶された各スポットの電流出力から、必要に応じて出力の平均処理等をさらに行ってもよい。スポットの走査は、各スポットで停止させることなく連続的にデータを取り込み、このデータから各スポットのデータの算出を行ったが、各スポットで停止させながら間欠的にデータを取ってもよい。

得られた光電流波形は図２３に示される通りであった。なお、図２３において楕円で囲った部分の拡大図を図２４に示す。図２３および２４に示されるように、自動移動ステージを用いて、５秒間という短い光照射時間で。同一基板上の複数スポットに固定化された１本鎖ＤＮＡ−Ｃｙ５に起因する光電流を高い再現性で検出できることが分かる。

本発明のセンサセルの一例を示す図であり、組み立て前の状態を示す図である。 図１に示されるセンサセルの組み立て後の状態を示す図である。 本発明のセンサセルの他の一例を示す図である。 本発明のセンサセルの他の一例を示す図である。 本発明のセンサセルの他の一例を示す図であり、組み立て前の状態を示す図である。 図４に示されるセンサセルの組み立て後の状態を示す図である。 本発明のセンサセルの他の一例を示す図であり、組み立て前の状態を示す図である。 図７に示されるセンサセルの組み立て後の状態を示す図である。 図７に示されるセンサセルの対電極および固定手段の拡大図である。 本発明のセンサセルの他の一例を示す図であり、組み立て前の状態を示す図である。 図１０に示されるセンサセルの組み立て後の状態を示す図である。 被検物質が一本鎖の核酸であり、プローブ物質が前記核酸に対して相補性を有する一本鎖の核酸である場合における、被検物質のプローブ物質への固定化工程を示す図であり、（ａ）は被検物質が予め増感色素で標識されてなる場合を、（ｂ）は二本鎖の核酸にインターカレーション可能な増感色素を添加した場合をそれぞれ示す。 被検物質がリガンドであり、媒介物質が受容体蛋白質分子であり、プローブ物質が二本鎖の核酸である場合における、被検物質のプローブ物質への固定化工程を示す図である。 互いに競合する特異的結合性を有する被検物質および第二の被検物質が抗原であり、プローブ物質が抗体である場合の、被検物質のプローブ物質への固定化工程を示す図である。 フロー型測定用セルを用いた装置の一例を示す図である。 例２〜５において得られた、２８．６μＭローダミン修飾ＤＮＡ溶液を試料液とし手用いた場合の検出電流の経時変化を示す図である。 例２〜５において得られた、２８６μＭローダミン修飾ＤＮＡ溶液を試料液として用いた場合の検出電流の経時変化を示す。 例２において得られた、０μＭ、２８．６μＭ、および２８６μＭの各濃度のローダミン修飾ＤＮＡ溶液を試料液として用いた場合の、定常状態にある検出電流を示す図である。 例６において使用された遮光性押さえ板を示す図である。 例６において使用された作用電極を示す図である。 例６において得られた、各スポット作用電極における、検出電流の値を示す図である。 例７において作製された複数スポット作用電極を示す図である。 例７において得られた各スポットについて連続的に測定された光電流波形である。 図２３において楕円で囲まれた部分の光電流波形を拡大した図である。

Claims (24)

1. 増感色素の光励起により生じる光電流を用いた被検物質の特異的検出に用いられるセンサセルであって、
   導電性基材と、その上に設けられた、前記増感色素が光励起に応じて放出する電子を受容可能な電子受容物質を含んでなる電子受容層とを備えてなる作用電極と、
   前記作用電極と対向して設けられる対電極と、
   前記作用電極および対電極と組み合わせられることにより流路を構成するセル基材と、
   前記作用電極、前記対電極、および前記セル基材の少なくともいずれか一つに形成される、前記流路に連通する供給口と、
   前記作用電極、前記対電極、および前記セル基材の少なくともいずれか一つの、前記供給口と異なる位置に形成される、前記流路に連通する排出口と
   前記電子受容層上に担持される、前記被検物質と直接または間接的に特異的に結合可能なプローブ物質と
   前記作用電極、前記対電極、および／または前記セル基材を互いに密着させるように押さえる押さえ部材とを備えてなり、
   前記導電性基材が透明であり、
   前記電子受容層が透光性を有し、
   前記電子受容層および前記対電極が前記流路に露出してなる、センサセル。
2. 前記セル基材が、前記流路を構成するための溝を備えた部材である、請求項１に記載のセンサセル。
3. 前記セル基材が、前記溝、前記供給口、および前記排出口とを備えた基板であり、該溝の底部に前記対電極が配置されるとともに、前記溝が前記作用電極で覆われてなる、請求項２に記載のセンサセル。
4. 前記セル基材が、前記溝、前記供給口、および前記排出口を備えた、透光性を有する基板であり、該溝の底部に前記作用電極が配置されるとともに、前記溝が前記対電極で覆われてなる、請求項２に記載のセンサセル。
5. 前記セル基材が、流路を構成するための開口部を備えたスペーサであり、該スペーサが前記作用電極と前記対電極との間に挟持されてなる、請求項１に記載のセンサセル。
6. 前記対電極を裏面から支持する支持部材をさらに備えた、請求項５に記載のセンサセル。
7. 前記支持基材および前記対電極が、前記供給口および前記排出口とを備えてなる、請求項６に記載のセンサセル。
8. 前記押さえ部材が、センサセルの最上部に、前記作用電極、前記対電極、および／または前記セル基材を互いに密着させるように下方に押さえる押さえ部材である、請求項１〜７のいずれか一項に記載のセンサセル。
9. 前記押さえ部材が、ねじ、バネ、および磁石からなる群から選択される少なくとも一種の固定手段をさらに備えてなり、該固定手段を介して、前記押さえ部材、前記作用電極、前記対電極、前記セル基材、および／または前記支持部材とが互いに着脱可能に固定されている、請求項６〜７のいずれか一項に記載のセンサセル。
10. 前記押さえ部材が、光励起のための光を通すための開口部または透光部をさらに備えてなる、請求項１〜９のいずれか一項に記載のセンサセル。
11. 前記押さえ部材が前記開口部および透光部を除いて遮光性を有する、請求項１０に記載のセンサセル。
12. 前記押さえ部材の前記開口部または透光部の外側に光源をさらに備えた、請求項１０〜１１のいずれか一項に記載ののいずれか一項に記載のセンサセル。
13. 前記押さえ部材が、前記作用電極に対応する位置に光励起のための光源をさらに備えた、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のセンサセル。
14. 前記透光性を有する基板の外側に光源をさらに備えた、請求項４に記載のセンサセル。
15. 前記光源が、該光源を前記作用電極に対して平行方向に移動させるための駆動手段をさらに備えた移動型光源である、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載のセンサセル。
16. 前記押さえ部材が、前記開口部または透光部を複数個有し、
    前記光源が、該光源を前記作用電極に対して平行方向に移動させるための駆動手段をさらに備えた移動型光源であり、
    前記移動型光源が、前記複数個の開口部または透光部を順次移動しながら個別に光照射可能なものである、請求項１１に記載のセンサセル。
17. 前記押さえ部材が、前記開口部または透光部を複数個有し、
    前記センサセルが、前記作用電極が前記光源に対して相対移動するように、前記作用電極または前記セル基材を前記作用電極に対して平行方向に移動させるための駆動手段をさらに備えた、請求項１１に記載のセンサセル。
18. 前記押さえ部材が、前記開口部または透光部を複数個有し、
    前記押さえ部材が、前記複数個の開口部または透光部の各々に対して、光照射が必要な時にのみ開放されるように制御される複数の遮光シャッターをさらに備えた、請求項１１に記載のセンサセル。
19. 前記押さえ部材が、前記開口部または透光部を複数個有し、
    前記複数個の開口部または透光部の各々に対して複数個の前記光源が個別に設けられる、請求項１１に記載のセンサセル。
20. 前記作用電極と前記対電極との間隔が３〜３０００μｍである、請求項１〜１９のいずれか一項に記載のセンサセル。
21. 前記電子受容物質が、酸化チタン、酸化亜鉛、酸化スズ、酸化ニオブ、チタン酸ストロンチウム、酸化インジウム、インジウム-スズ複合酸化物（ＩＴＯ）、フッ素がドープされた酸化スズ（ＦＴＯ）からなる群から選択される少なくとも一種である、請求項１〜２０のいずれか一項に記載のセンサセル。
22. 前記プローブ物質が、前記電子受容層上の、互いに分離された複数の領域毎に区分されて担持されてなる、請求項１９〜２１のいずれか一項に記載のセンサセル。
23. 増感色素の光励起により生じる光電流を用いた被検物質の特異的検出が、
    被検物質を含む試料液を用意し、
    該被検物質と直接または間接的に特異的に結合可能なプローブ物質を前記作用電極の表面に固定させ、
    増感色素の共存下、前記試料液を前記作用電極に接触させて、前記プローブ物質に前記被検物質を直接または間接的に特異的に結合させ、該結合により前記増感色素を前記作用電極に固定させ、
    前記作用電極と前記対電極とを前記電解液に接触させ、そして、
    前記作用電極に光を照射して前記増感色素を光励起させ、該光励起された増感色素から前記作用電極への電子移動に起因して前記作用電極と前記対電極との間に流れる光電流を検出すること
    を含んでなる工程により行われる、請求項１〜２２のいずれか一項に記載のセンサセル。
24. 増感色素の光励起により生じる光電流を用いた被検物質の特異的検出に用いられる測定装置であって、
    請求項１〜２２のいずれか一項に記載されるセンサセルと、
    前記作用電極と前記対電極との間を流れる電流を測定する電流計と
    前記流路内への液の供給および停止を制御する送液手段と
    を備えた、測定装置。

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